CN101268186B

CN101268186B - 新的内切核糖核酸酶

Info

Publication number: CN101268186B
Application number: CN2006800346234A
Authority: CN
Inventors: 鸟田雅光; 高山正范; 浅田起代藏; 加藤郁之进
Original assignee: Takara Bio Inc
Current assignee: Takara Bio Inc
Priority date: 2005-09-21
Filing date: 2006-09-08
Publication date: 2011-08-03
Anticipated expiration: 2026-09-08
Also published as: US7745190B2; JP4889647B2; WO2007034693A1; JPWO2007034693A1; CN101268186A; US20090047709A1; EP1947177A4; EP1947177A1

Abstract

新的表现内切核糖核酸酶活性的多肽；编码该多肽的核酸；含有该核酸的重组DNA；通过用该重组DNA转化获得的转化体；生产该多肽的方法，其特征在于包括培养该转化体以及从培养物收集该多肽的步骤；生产单链RNA片段的方法，其特征在于包括使该多肽作用于单链RNA的步骤；和使单链RNA片段化的方法。

Description

新的内切核糖核酸酶

技术领域

本发明涉及新的序列特异性内切核糖核酸酶，其用于遗传工程领域。

背景技术

已报道，有几种原核质粒具有杀伤其中质粒已掉落的宿主的分离后杀伤(post-segregation killing)(PSK)功能以将质粒维持在宿主中。这样的质粒具有毒素-抗毒素基因。抗毒素与细胞中的毒素结合以使得毒素失活。该抗毒素容易被蛋白酶降解。蛋白酶使抗毒素降解导致稳定毒素的激活(非专利文献1)。这样的毒素-抗毒素基因也存在于大多数原核生物的染色体中。它们对各种应激起反应并且在程序性细胞死亡中发挥作用。尽管这些毒素的功能尚未完全证实，但是已有暗示CcdB和ParE可能控制复制靶向DNA促旋酶，且RelE和Doc可能控制转录(非专利文献1和2)。

大肠杆菌(Escherichia coli)中存在至少五种毒素RelE、ChpAK(MazF)、ChpBK、YoeB和YafQ(非专利文献2)。Christensen等人已报道，RelE是一种识别特定三核苷酸密码子的以核糖体依赖性方式切割mRNA的内切核糖核酸酶(非专利文献3和4)。此外，Christensen等人已报道，ChpAK、ChpBK和YoeB也是以核糖体和密码子依赖性方式切割mRNA的内切核糖核酸酶(非专利文献5和6)。

Inouye等人已经证明，MazF(ChpAK)是一种识别特定核苷酸ACA的以核糖体非依赖性方式切割mRNA的内切核糖核酸酶(非专利文献7和8)。Munoz-Gomez等人已报道，mazF对RNA的切割特异于NAC(非专利文献9)。Inouye等人已经证明，质粒R100中的PemK是一种识别特定核苷酸UAH(H是C、A或U)以切割mRNA的内切核糖核酸酶(专利文献1，非专利文献10)。如上所述，已提示，RelE或PemK家族的毒素可能是以核苷酸特异性方式切割mRNA的内切核糖核酸酶。具体地，PemK家族的毒素可能是识别特定核苷酸的以核糖体非依赖性方式切割mRNA的内切核糖核酸酶。PemK家族的许多毒素存在于原核生物中，并且对它们序列的比较已经有了广泛的研究(非专利文献1和11)。

Anantharaman等人已经通过基于毒素的遗传信息和已完成基因组分析的生物的遗传信息来进行基因相邻分析，对毒素作了系统发生分类，并从功能未知的蛋白预测了毒素样蛋白(非专利文献12)。此外，通过分析已经提示，不仅RelE和PemK，而且Doc家族的蛋白质以及具有PIN结构域的蛋白质都具有核糖核酸酶活性。在堀越氏火球菌(Pyrococcus horikoshii)中已经发现了一种PemK家族毒素(非专利文献13)。

至于以序列特异性方式切割核酸的酶，已经发现并在遗传工程领域中广泛使用了许多切割双链DNA的限制酶。至于以序列特异性方式切割单链RNA的酶，已经发现了在G核苷酸处特异性切割的核糖核酸酶T1，并已将其用于遗传工程(非专利文献14)。识别单链RNA中多个核苷酸并对其进行特异性切割的酶的数目仍然很少。在遗传工程领域需要开发这样的内切核糖核酸酶。如果发现了特异性识别并切割三核苷酸(如同MazF)或多于三核苷酸的序列的内切核糖核酸酶，则认为该内切核糖核酸酶将是遗传工程领域中有用的酶。

专利文献1：WO 2004/113498

非专利文献1：J.Bacteriol.，182：561-572(2000)

非专利文献2：Science，301：1496-1499(2003)

非专利文献3：Molecular Microbiol.，48：1389-1400(2003)

非专利文献4：Cell，122：131-140(2003)

非专利文献5：J.Mol.Biol.，332：809-819(2003)

非专利文献6：Molecular Microbiol.，51：1705-1717(2004)

非专利文献7：Molecular Cell，12：913-920(2003)

非专利文献8：J.Biol.Chem.，280：3143-3150(2005)

非专利文献9：FEBS Letters，567：316-320(2004)

非专利文献10：J.Biol.Chem.，279：20678-20684(2004)

非专利文献11：J.Mol.Microbiol.Biotechnol.，1：295-302(1999)

非专利文献12：Genome Biology，4：R81(2003)

非专利文献13：Nucleic Acids Research，33：966-976(2005)

非专利文献14：Methods in Enzymology，341：28-41(2001)

发明内容

本发明所解决的问题

本发明是在考虑到上述现有技术而作出的。本发明的主要目的是寻找新的序列特异性内切核糖核酸酶，鉴定该新的序列特异性内切核糖核酸酶的切割序列特异性，以及提供其在遗传工程中的用途。

解决问题的方法

本发明人已经筛选了序列特异性内切核糖核酸酶，并发现由堀越氏火球菌中的PH1182基因编码的多肽是新的序列特异性内切核糖核酸酶。此外，本发明人已经鉴定了该酶的切割序列特异性。因此，本发明已经完成。

本发明涉及：

具有序列特异性内切核糖核酸酶活性的多肽，其由SEQ IDNO：1的氨基酸序列或在所述序列中缺失、添加、插入或取代一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列表示；

编码[1]的多肽的核酸；

[2]的核酸，其具有SEQ ID NO：2的核苷酸序列；

能够在严格条件下与[2]或[3]的核酸杂交并编码具有序列特异性内切核糖核酸酶活性的多肽的核酸；

含有[2]至[4]中任一核酸的重组DNA；

用[5]的重组DNA转化的转化体；

生产[1]的多肽的方法，所述方法包括培养[6]的转化体并从培养物中收集具有序列特异性RNA切割活性的多肽；

生产单链RNA降解产物的方法，该方法包括允许[1]的多肽作用于单链RNA；和

降解单链RNA的方法，该方法包括允许[1]的多肽作用于单链RNA。

发明效果

本发明实现了寻找新的序列特异性内切核糖核酸酶，对该新的序列特异性内切核糖核酸酶的切割序列特异性的鉴定，以及提供其在遗传工程中的用途。

本发明最佳实施方式

1.本发明的多肽

本发明的多肽由SEQ ID NO：1的氨基酸序列，或者在所述氨基酸序列中缺失、添加、插入或取代一个或多个氨基酸残基并表现序列特异性内切核糖核酸酶活性的氨基酸序列所表示。

本发明多肽所具有的活性是特异于单链RNA的内切核糖核酸酶活性。该活性使得能够将位于含有核糖核苷酸作为组成核苷酸的单链核酸中的核糖核苷酸3′的磷酸二酯键水解。用上述活性水解的核酸产生下述物质：带有羟基的3′末端，和带有磷酸基团的5′末端；带有磷酸基团的3′末端和带有羟基的5′末端；或带有2′，3′-环磷酸的5′末端和羟基。

具有至少一个核糖核苷酸分子的核酸可用作本发明多肽的底物。其实例包括但不限于，RNA、含有脱氧核糖核苷酸的RNA和含有核糖核苷酸的DNA。该底物可包含不同于正常核酸所含有的核苷酸的核苷酸(例如，脱氧次黄苷、脱氧尿苷或羟甲基脱氧尿苷)，只要它不抑制本发明多肽的作用。

本发明多肽特异性作用于单链核酸。它不能切割双链核酸，比如双链RNA或RNA-DNA杂交体。

本发明多肽具有以核苷酸序列特异性方式切割核酸的活性。尽管无意于限制本发明，但若存在序列5′-UGG-3′、5′-UUG-3′、5′-UGA-3′、5′-AGG-3′或5′-AAG-3′，它将水解位于该序列中第一个残基3′的磷酸二酯键。例如，该活性可以用寡核糖核苷酸DGC001(SEQ ID NO：7)作为底物确认为将介于该寡核糖核苷酸中第7和第8位核苷酸之间的磷酸二酯键水解的活性。本发明多肽的内切核糖核酸酶活性在无核糖体存在下表现。因此，它是核糖体非依赖性活性。

可以通过，例如，利用单链RNA作为底物，来测量本发明多肽的单链RNA-特异性内切核糖核酸酶活性。具体地说，该测量可以通过下述来实现，允许对多肽进行作用于单链RNA的活性的测量，所述单链RNA是用RNA聚合酶从DNA模板合成得到或者化学合成的，以及测定RNA切割的存在。例如，可以用电泳(琼脂糖凝胶、丙烯酰胺凝胶等)来确认RNA降解。对作为底物的RNA附着适当标记(例如，放射性同位素、荧光底物)有利于对电泳后降解产物的检测。

本发明多肽包括，由在SEQ ID NO：1的氨基酸序列中缺失、添加、插入或取代一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列所示的多肽，只要该多肽表现以序列特异性方式水解单链RNA的内切核糖核酸酶活性。这样的突变多肽的例子包括与SEQ ID NO：1的多肽具有50％或更大、优选70％或更大、更优选90％或更大同源性的多肽。这样的突变多肽包括在本发明内，即使它识别和切割不同于由SEQ ID NO：1氨基酸序列所示多肽所识别和切割的序列。

该多肽可以具有对该活性并非必不可少的肽区域。例如，附着有下述的多肽也包括在本发明多肽内，只要该多肽表现单链RNA特异性RNA切割活性：提高翻译效率的肽；有利于多肽纯化的肽(例如，组氨酸标签，谷胱甘肽-S-转移酶，麦芽糖结合蛋白)；或提高表达效率的蛋白质(例如，蛋白伴侣)。

2.编码本发明多肽的核酸

本发明提供编码具有序列特异性内切核糖核酸酶活性的多肽的核酸。这样的核酸包括但不限于，由SEQ ID NO：1的氨基酸序列，或由在所述序列中缺失、添加、插入或取代一个或多个，例如一至十个氨基酸残基的氨基酸序列所示的编码具有序列特异性内切核糖核酸酶活性的多肽的核酸。在SEQ ID NO：1的氨基酸序列中缺失、添加、插入或取代一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列的例子包括与SEQ ID NO：1的多肽具有50％或更大、优选70％或更大、更优选90％或更大同源性的氨基酸序列。

此外，本发明核酸包括在严格条件能够与这样的核酸杂交的编码具有序列特异性内切核糖核酸酶活性的多肽的核酸。严格条件的例子在J.Sambrook等人(eds.)，Molecular Cloning：A Laboratory Manual2nd ed.，1989，Cold Spring Harbor Laboratory中有描述。具体地说，在示例条件下，在含有0.5％SDS、5×Denhardt′s溶液以及0.01％变性鲑精DNA的6×SSC中与探针于65℃温育12至20小时。例如，通过于37℃下在含有0.5％SDS的0.1×SSC中洗涤除去非特异性结合的探针后可以检测与探针杂交的核酸。

例如，编码本发明多肽的核酸可按照下述获得。

在氨基酸序列方面与具有识别特异性核酸序列并切割mRNA的内切核糖核酸酶活性的毒素(例如，MazF或PemK)具有同源性的基因是编码具有序列特异性核糖核酸酶活性的多肽的核酸候选物。例如，这样的候选基因可以在细菌基因组中找到。已经在堀越氏火球菌中找到了一种PemK家族的毒素。

例如，可以用基于核苷酸序列信息设计的引物通过PCR从细菌基因组分离候选基因。如果完整的核苷酸序列是已知的，则可以用DNA合成仪来合成候选基因的完整序列。

可以用被整合有候选基因的表达载体转化的适宜宿主(例如大肠杆菌)从候选基因表达蛋白质。由于降解宿主RNA的序列特异性核糖核酸酶的表达对于宿主可是致死的，所以必须在诱导前严格抑制候选基因的表达。例如，优选利用比如采用T7聚合酶启动子的pET系统(Novagen)，或者作为冷激表达控制系统的pCold系统(Takara Bio)这样的表达系统。为方便地从候选基因纯化表达产物，有利的是将利于纯化的肽(例如，组氨酸标签)附着到表达产物上。为此，作为表达载体，可以使用包含编码这样的肽的区域的表达载体。

可以根据上述采用单链RNA作为底物的方法测量内切核糖核酸酶活性。通过使用作为模板的经过切割的RNA、与RNA互补的引物以及逆转录酶进行引物延伸可以鉴定切割位点。由于引物延伸中，延伸反应终止于切割位点，所以可以通过使用电泳确定延伸链的链长度来鉴定切割位点。可通过化学合成具有任意序列的寡核糖核苷酸，允许候选基因表达产物对其发生作用，以及使用变性丙烯酰胺凝胶等来确定切割的存在来进一步严格鉴定核苷酸序列特异性。

3.生产本发明多肽的方法

例如，本发明多肽可以通过(1)从生产本发明多肽的微生物培养物纯化或(2)从含有编码本发明多肽的核酸的转化体培养物纯化来生产。

生产本发明多肽的微生物的例子包括但不限于火球菌属(Pyrococcus)的细菌。例如，本发明多肽可获自堀越氏火球菌，优选堀越氏火球菌ATCC700860。可以在适宜微生物生长的条件下培养该微生物。可以用常规用于蛋白质纯化的方法纯化在细胞或培养物中产生的目的多肽，所述方法例如细胞裂解、通过沉淀分级分离(例如，硫酸铵沉淀)、各种层析(离子交换层析、亲和层析、疏水层析、分子筛层析)或其组合。

本发明多肽可获自用包含编码本发明多肽的核酸的重组 DNA转化的转化体。优选地，重组DNA中多肽-编码核酸的上游可操作地连接有适宜的启动子。由于本发明多肽能够发挥对宿主的致死作用，所以优选启动子或者包含启动子的表达系统能够严格控制从编码本发明多肽的核酸的转录。这样的系统的例子有pET系统或pCold系统。

重组DNA可按照原样转化进作为宿主的细胞。作为选择，重组DNA也可以被插入适宜的载体(例如，质粒载体、噬菌体载体或病毒载体)中进行转化。重组DNA可以整合进宿主染色体。对于被转化的宿主没有特别的限制。例如，可以使用通常用于重组DNA领域的宿主(例如，大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、酵母、丝状真菌、植物、动物、植物培养细胞、动物培养细胞)。

由这样的转化体产生的本发明多肽可以用上述纯化方法纯化。如果编码本发明多肽的核酸编码具有利于纯化附着于其上的多肽的肽的多肽，则将使该纯化大大便利。根据常规程序利用相应于附着肽的纯化方法可以得到高纯度的多肽(例如，用于组氨酸标签的金属螯合树脂、用于谷胱甘肽-S-转移酶的谷胱甘肽-固定化树脂)。

4.用本发明多肽降解单链RNA

通过用本发明多肽降解单链RNA可产生RNA降解产物。由于本发明多肽可以以核苷酸序列特异性方式切割RNA，所以所产生的RNA降解产物的平均链长度与由被该多肽识别的核苷酸序列的出现频率相关。因此，本发明提供具有特定链长度分布的RNA降解产物。此外，有可能利用序列特异性切除RNA中的特定区域。

此外，有可能用本发明多肽选择性降解单链RNA。在本发明的一种实施方案中，有可能通过在蛋白质合成系统(例如，无细胞翻译系统或转化体)中利用本发明多肽降解mRNA来抑制蛋白质的合成。这种情况下，如果将已通过人工制备而不含被本发明多肽识别的核苷酸序列的编码目的蛋白的mRNA置于该系统中，则仅mRNA躲过降解，并且在该系统中特异性产生目的蛋白。该实施方案尤其可用于生产高纯度蛋白。

实施例

以下实施例更加详细地阐述了本发明，但是并不构成对本发明范围的限制。

在此处所述程序中，基本程序按照J.Sambrook等人(eds.)，Molecular Cloning：A Laboratory Manual 3rd ed.，2001，Cold Spring HarborLaboratory中所述进行。

实施例1：从堀越氏火球菌ATCC700860分离PH1182，并构建表达质粒从NCBI数据库(登记号NP 143082和NC 000961)获得在堀越氏火球菌ATCC700860-来源的PH1182基因中编码的多肽氨基酸序列及其核苷酸序列。根据PH1182的核苷酸序列的信息合成用于PCR扩增编码完整多肽的DNA区域的引物PH1182-F(SEQ ID NO：3)和引物PH1182-R(SEQ ID NO：4)。

堀越氏火球菌ATCC700860基因组DNA获自ATCC(ATCCNo.700860D)。用Pyrobest DNA聚合酶(Takara Bio)和50ng来自堀越氏火球菌ATCC700860的基因组DNA以及引物PH1182-F和PH1182-R进行PCR以得到437-bp扩增的DNA片段。该扩增的片段用限制酶NdeI和XhoI消化，并进行琼脂糖凝胶电泳，且从凝胶中回收416-bp DNA片段。

用pCold TF(Takara Bio)构建表达载体。为了在基因克隆后在紧随PH1182基因3′末端的XhoI位点之后导入终止密码子，用限制酶XhoI和XbaI消化pCold TF DNA，并通过与构建体pCold TFb相连向其中插入由两个合成寡核苷酸STPU1(SEQ ID NO：5)和STPL2(SEQ IDNO：6)组成的接头。通过将416-bp DNA片段与已用限制酶NdeI和XhoI消化的pCold TFb相连得到重组质粒。用该重组质粒转化大肠杆菌JM109。从如上述获得的转化体克隆制备质粒，并确认核苷酸序列。然后，将该质粒命名为表达载体pCold TF-PH1182。

插入表达载体pCold TF-PH1182中的编码堀越氏火球菌ATCC700860来源的PH1182多肽的核苷酸序列和该多肽的氨基酸序列分别示于SEQ ID NOS：2和1。在用表达载体pCold TF-PH1182表达的多肽中，由488个氨基酸残基组成的包括六个组氨酸残基和432个氨基酸残基的引发因子多肽在内的多肽附于氨基酸序列SEQ ID NO：1多肽的N末端。此外，C末端附有两个氨基酸残基Leu-Glu。

实施例2：制备堀越氏火球菌ATCC700860来源的PH1182多肽

用从实施例1获得的表达载体pCold TF-PH1182转化大肠杆菌BL21(DE3)(Novagen)以得到用于表达的大肠杆菌pCold TF-PH1182/BL21(DE3)。在5ml含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中于37℃培养大肠杆菌细胞。OD600nm达到0.5时，于15℃下温育30分钟，加入终浓度为1mM的IPTG(Takara Bio)以诱导多肽表达，且于15℃继续培养24小时。24小时后终止培养，且通过离心收集细胞。将细胞悬浮于300μl裂解缓冲液(50mM NaH₂PO₄，300mM NaCl，10mM咪唑，pH 8.0)中，并用超声发生器(sonicator)(Handy sonic，Tomy)破坏细胞。向通过离心收集的上清液中加入20μl Ni-NTA琼脂糖(Qiagen)，且允许混合物于4℃保持30分钟。用100μl洗涤缓冲液(50mMNaH₂PO₄，300mM NaCl，20mM咪唑，pH 8.0)洗涤通过离心收集的沉淀两次。洗涤之后，将沉淀悬浮于20μl洗脱缓冲液(50mM NaH₂PO₄，300mM NaCl，250mM咪唑，pH 8.0)中。通过离心收集上清液。再重复相同的洗脱程序两次。得到总计60μl的含有PH1182多肽的样品。对部分样品进行SDS-PAGE以确认该样品含有预期大小的多肽。样品中PH1182蛋白的浓度为约25ng/μl。

实施例3：以寡核糖核苷酸为底物鉴定PH1182多肽的核苷酸序列特异性

合成寡核糖核苷酸，并进行切割测定以研究获自实施例2的PH1182多肽的核糖核酸酶活性的核苷酸序列特异性。

合成了SEQ ID NOS：7-17的十一个寡核糖核苷酸作为底物。于37℃下温育5-μl由10μM寡核糖核苷酸之一、5ng/μl获自实施例2的PH1182多肽和10mM Tris-HCl(pH 7.5)组成的反应混合物30分钟。将反应产物在20％变性丙烯酰胺凝胶(20％丙烯酰胺、7M脲、0.5×TBE缓冲液)上电泳。用SYBR GREEN II(Takara Bio)染色后，用荧光图像分析仪FMBIO II Multiview(Takara Bio)分析荧光图像。各寡核糖核苷酸的切割模式示于表1。

此外，鉴于各寡核糖核苷酸的切割的存在，通过比较切割位点周围的核苷酸序列估计了序列特异性。结果示于表2。

基于上述结果显示，PH1182多肽优先识别序列5′-UGG-3′、5′-UUG-3′、5′-UGA-3′、5′-AGG-3′或5′-AAG-3′以水解位于该序列中第一个残基3′的磷酸二酯键。已显示，PH1182多肽是具有完全不同于MazF 的核苷酸序列特异性的内切核糖核酸酶。

表1

名称	核苷酸序列和切割位点 (/代表切割位点)	切割 PH1182
			DGC001 MRI017 ABC007 MRI023 MRI002 MRI014 MRI027 MRI031 ABC001 ABC017 ABC018	GCA / GGUU / GGUUUACAUUAAUU GUU / UGUUAUGUUUCUUA U / GGUUCUU UAU / GAAUAU / GAUCUCAAAUUU AUCUACA / GGGAUCUCCUAUCUACUAU / GGGG AA / AGUCUAAACGCUA / AGCUCUAAAA GGACUCGCCGGAACUCUGCACU / UGA GGGGCUCGCCUUACA / AGCGAU / U / GGGGUGUGUUCCUUUAUU / UGUGUUACUU / U / GGGC GCAGAGUUCAAA / AGCCCUUUU GGAGUCGUAGCUGCAGUAUUU AUACUGCAGCUACGACUCCUU	+ + + + + + + + + - -

表2-1

名称	核苷酸序列	切割 PH1182
			DGC001(1) MRI017(1) MRI023(1) MRI027(1) MRI031(1) MRI017(2) MRI014(1) MRI031(2) ABC007(1) ABC007(2) DGC001(2) MRI023(2) MRI002(1) MRI002(2) MRI027(2) ABC001(1) MRI014(2) MRI027(3) MRI017(3) ABC018(1)	U U/G G A U/G G A U/G G U/U/G G U/U/G G U U/U G C U/U G U U/U G A U/G A A U/G A C A/G G C A/G G A A/A G U A/A G C A/A G A A/A G C C G G G G G G U A U G A C U G	+ + + + + + + + + + + + + + + + - - - -

表2-2

切割位点：切割位点以/表示。

工业实用性

本发明提供新的序列特异性内切核糖核酸酶。由于该酶可识别和切割RNA中的特定序列，所以其可用于分析RNA分子，制备RNA片段，通过切割细胞内RNA来控制细胞(例如，抑制蛋白质合成)等。

无文本序列表

SEQ ID NO：3；扩增编码PH1182蛋白质的DNA片段的PCR引物PH1182-F。

SEQ ID NO：4；扩增编码PH1182蛋白质的DNA片段的PCR引物PH1182-R。

SEQ ID NO：5；修饰pCold TF的寡核苷酸STPU1。

SEQ ID NO：6；修饰pCold TF的寡核苷酸STPL2。

SEQ ID NO：7；寡核糖核苷酸DGC001。

SEQ ID NO：8；寡核糖核苷酸MRI017。

SEQ ID NO：9；寡核糖核苷酸ABC007。

SEQ ID NO：10；寡核糖核苷酸MRI023。

SEQ ID NO：11；寡核糖核苷酸MRI002。

SEQ ID NO：12；寡核糖核苷酸MRI014。

SEQ ID NO：13；寡核糖核苷酸MRI027。

SEQ ID NO：14；寡核糖核苷酸MRI031。

SEQ ID NO：15；寡核糖核苷酸ABC001。

SEQ ID NO：16；寡核糖核苷酸ABC017。

SEQ ID NO：17；寡核糖核苷酸ABC018。

序列表

<110>TAKARA BIO INC.

<120>新的内切核糖核酸酶

<130>667044

<150>JP 2005-274017

<151>2005-09-21

<160>17

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>138

<212>PRT

<213>堀越氏火球菌(Pyrococcus horikoshii)ATCC 700860

<400>1

Met Pro Lys Gln Gly Glu Ile Trp Thr Ala Pro Phe Pro Tyr Phe

1 5 10 15

Asp Asp Arg Gly Lys Leu Thr Phe Lys Ile Arg Pro Ile Leu Ile

20 25 30

Val Ser Asn Asp Glu Phe Asn Asp Asn Ala Leu Asp Val Ile Ile

35 40 45

Cys Gln Ile Ser Arg Phe Glu Tyr Glu Arg Ile Leu Lys Leu Pro

50 55 60

Ser Lys Met Arg Ser Lys Ile Lys Ile Ile Thr Asn Asn Asp Leu

65 70 75

Asp Pro Asn Thr Ser Gly Lys Leu Arg Asn Ile Ser Ile Ile Lys

80 85 90

Pro Tyr Lys Leu Phe Ser Ile Ser Lys Asp Lys Leu Asn Asn Tyr

95 100 105

Lys Phe Ile Gly Lys Leu Lys Pro Lys Ala Met Ser Glu Ile Ser

110 115 120

Leu Val Leu Lys Glu Val Phe Gln Thr Glu Asn Ile Ser Ser Gln

125 130 135

Asp Thr Pro

<210>2

<211>414

<212>DNA

<213>堀越氏火球菌(Pyrococcus horikoshii)ATCC 700860

<400>2

atgcctaaac aaggtgaaat ctggacagca cccttcccat attttgatga ccgcggaaag 60

ttaacattca aaataagacc aatcctcata gtatccaacg atgaattcaa cgacaacgca 120

ctagatgtta taatctgtca aatctccaga tttgaatatg aaagaatcct aaagctccct 180

tctaaaatgc ggagcaaaat taaaataata acaaacaacg accttgatcc aaacaccagc 240

ggtaaactac gaaatataag tataattaaa ccttacaagc ttttctccat ctcaaaagat 300

aaacttaaca actacaagtt cattggaaaa ttaaagccaa aagctatgag tgaaataagc 360

ctagtcctaa aagaagtatt ccaaacagaa aatatatcct cacaagacac ccct 414

<210>3

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>扩增编码PH1182蛋白质的DNA片段的PCR引物PH1182-F

<400>3

ggggagctaa catatgccta aacaaggtga aatctg 36

<210>4

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>扩增编码PH1182蛋白质的DNA片段的PCR引物PH1182-R

<400>4

ggggctcgag aggggtgtct tgtgaggata 30

<210>5

<211>12

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>修饰pCold TF的寡核苷酸STPU1

<400>5

tcgagtaact aa 12

<210>6

<211>12

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>修饰pCold TF的寡核苷酸STPL2

<400>6

ctagttagtt ac 12

<210>7

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸DGC001.

<400>7

gcagguuggu uuacauuaau u 21

<210>8

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸MRI017.

<400>8

guuuguuaug uuucuuaugg uucuu 25

<210>9

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸ABC007.

<400>9

uaugaauaug aucucaaauu u 21

<210>10

<211>30

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸MRI023.

<400>10

aucuacaggg aucuccuauc uacuaugggg 30

<210>11

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸MRI002.

<400>11

aaagucuaaa cgcuaagcuc uaaaa 25

<210>12

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸MRI014.

<400>12

ggacucgccg gaacucugca cuuga 25

<210>13

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸MRI027.

<400>13

ggggcucgcc uuacaagcga uuggg 25

<210>14

<211>30

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸MRI031.

<400>14

guguguuccu uuauuugugu uacuuugggc 30

<210>15

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸ABC001.

<400>15

gcagaguuca aaagcccuuu u 21

<210>16

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸ABC017.

<400>16

ggagucguag cugcaguauu u 21

<210>17

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸ABC018

<400>17

auacugcagc uacgacuccu u 21

Claims

1.生产单链RNA降解产物的方法，该方法使用具有序列特异性内切核糖核酸酶活性的多肽，其由SEQ ID NO：1的氨基酸序列所示，其中所述方法包括允许所述多肽作用于包含选自5′-UGG-3′、5′-UUG-3′、5′-UGA-3′、5′-AGG-3′和5′-AAG-3′的序列的单链RNA，且所述多肽水解位于该序列中第一个残基3′的磷酸二酯键。

2.用具有序列特异性内切核糖核酸酶活性的多肽选择性降解单链RNA的方法，所述多肽由SEQ ID NO：1的氨基酸序列所示，其中所述RNA分子包含选自5′-UGG-3′、5′-UUG-3′、5′-UGA-3′、5′-AGG-3′和5′-AAG-3′的序列，且所述多肽水解位于该序列中第一个残基3′的磷酸二酯键。

3.通过在蛋白质合成系统中降解mRNA来抑制蛋白质的合成的方法，其中所述mRNA通过根据权利要求2的方法进行降解。