KR20110102516A - Ｒｎａ 인터페라제 및 이의 사용 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 엔도리보뉴클레아제 활성을 나타내고 본원에서 mRNA 인터페라제로 지칭되는 신규한 계열의 효소의 발견에 관한 것이다. 따라서 본 발명자들에 의한 이같은 신규한 발견은 mRNA 인터페라제 핵산 및 아미노산 서열, 및 이의 조성물이 유리하게 사용될 수 있는 새로운 적용을 나타낸다. 본 발명은 또한 mRNA 인터페라제 활성을 조절할 수 있는 화합물/제제를 동정하는 선별 방법 및 이러한 화합물/제제를 사용하는 방법을 포괄한다. 또한, mRNA 인터페라제 핵산 및/또는 아미노산 서열, mRNA 인터페라제 활성 양립성 완충액 및 지침서를 포함하는 키트가 제공된다.

Description

ＲＮＡ 인터페라제 및 이의 사용 방법 {ＲＮＡ interferases and methods of use thereof}
본 발명은 분자 생물학 분야, 특히 신규한 효소 활성의 발견에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 본원에서 mRNA 인터페라제로 지칭하는 신규한 계열의 단백질의 동정에 관한 것이다. 본원에 기술된 계열의 예시적 구성원에는 MazF 및 PemK 및 이의 동족체 및 상동체(ortholog)가 포함된다. 보다 구체적으로, 본 발명은 엔도리보뉴클레아제 또는 mRNA 인터페라제로서 MazF 및 PemK의 생화학적 특징에 관한 것이다. 또한 mRNA 인터페라제에 기인한 활성을 억제하는데 기여하는 관련된 단백질의 분석도 포함한다. 구체적으로, MazE 단백질 기능의 특징 및 MazF 활성에 대한 이의 효과 및 PemI 단백질 기능의 특징 및 PemK 활성에 대한 이의 효과가 본원에 기재된다. MazF 및 PemK와 같은 신규한 mRNA 인터페라제, 및 MazE 및 PemI와 같은 MazF 및 PemK 활성의 조절인자를 사용하기 위한 방법이 제공되며, 이들은 연구 및 치료적 적용에 있어 유용성이 있다.
에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)에서, 프로그램된 세포 사멸은 두개의 유전자, 즉 안정적 독성 단백질(독소)를 암호화하는 유전자와, 단명성(short-lived) 항독소를 암호화하는 또다른 유전자로 이루어진 "중독 모듈(addiction module)"을 통해 매개된다[참조: Engelberg-Kulka and Glaser, Annu Rev Microbiol 53, 43-70(1999)]. 독소 및 항독소는 오페론으로부터 공발현되고 서로 상호작용하여 안정적 복합체를 형성하고 이들의 발현은 독소-항독소 복합체에 의해 또는 항독소 단독에 의해 자가-조절된다. 이들의 공발현이, 스트레스 조건에 의해 억제되는 경우, 예를 들면 항독소가 프로테아제에 의해 분해되면, 독소가 이의 표적 상에 작용할 수 있게 된다. 세균성 프로그램된 세포 사멸에 있어 이같은 유전자 시스템은 다수의 이. 콜라이 염색체외 요소에 있어 소위 격리후 사멸 효과(postsegregational killing effect)로 보고되었다[참조: Tsuchimoto et al.,JBacteriol 170, 1461-6 (1988) ; Roberts andHelinski,JBacteriol 174, 8119-32 (1992)]. 세균이 플라스미드 또는 기타 염색체외 요소를 상실하는 경우, 불안정한 항독소가 이들의 동족성의 안정된 독소보다 더 빨리 파괴되므로, 당해 세포는 선택적으로 사멸한다. 따라서, 당해 세포는 단명 항독소에 열중하게 되는데, 그 이유는 이들의 신규한(de novo) 합성이 세포 생존에 있어 필수적이기 때문이다.
이. 콜라이 염색체상에서 발견된 이같은 공지된 중독 모듈중에서[참조: Gotfredsen and Gerdes, Mol Microbiol 29,1065-76 (1998); Mittenhuber,JMol Microbiol Biotechnol 1, 295-302 (1999)], 이. 콜라이 MazEF 시스템이 최초로 공지된 원핵성 염색체 중독 모듈이다(참조: Aizenman et al., Proc Natl Acad Sci USA 93, 6059-63 (1996)). mazEF 모듈은 rlA 유전자 하류에 위치한 두개의 중첩 유전자인 mazE 및 mazF로 이루어진다. MazF는 안정적 독소인 반면, MazE는 불안정한 항독소로서, ATP-의존성 ClpPA 세린 프로테아제에 의해 생체내에서 쉽게 분해된다 (참조:Aizenman et al., Proc Natl Acad Sci USA 93,6059-63 (1996)). mazEF 발현은 심한 아미노산 고갈하에 RelA에 의해 합성된 구아노신 3',5'-비스피로포스페이트(ppGpp)에 의해 음성적으로 조절된다(참조: Aizenman et al., Proc Natl Acad Sci USA 93,6059-63 (1996)). 더구나, mazEF-매개된 세포 사멸은 리팜피신, 클로람페니콜 및 스펙티노마이신을 포함한 몇몇 항생제에 의해 촉발될 수 있다(참조:Sat et al., J Bacteriol 183,2041-5 (2001)). 이. 콜라이 세포를 사용한 생체내 실험으로부터의 결과는, MazF가 단백질 합성 및 DNA 복제 둘다를 억제함을 시사한다(참조:Pedersen et al., Mol Microbiol 45, 501-10 (2002)). 티민부재 사멸이 최근 mazEF 모듈에 의해 매개되는 것으로 보고되었다(참조:B. Sat, M. Reches, H.Engelberg-Kulka, JBacteriol 185, 1803-7 (2003)).
이. 콜라이에서, 몇몇 염색체외 요소는 중독 모듈을 함유하여 소위 격리후 사멸 효과를 통해 세균의 프로그램된 세포 사멸을 야기하는 것으로 알려져있다. 가장 잘 연구된 염색체외 중독 모듈로는 박테리오파지 P1상의 phd-doc 시스템[참조:Lehnherr et al. (1993) J Mol Biol 233, 414-428; Gazit and Sauer.(1999) J Biol Chem 274,16813-16818 ; Magnuson et al. (1996) J Biol Chem 271,18705-18710; Lehnherr and Yarmolinsky. (1995) Proc Natl Acad Sci USA 92,32743277)], 인자 F상의 ccdA-ccdB 시스템 [참조: Tam and Kline. (1989) J Bacteriol 171,2353-2360 ; Bahassi et al. (1999) J Biol Chem 274, 10936-10944; Afif et al. (2001) Mol Microbiol 41,73-82 ; Dao-Thi et al. (2002) J Biol Chem 277,3733-3742], 플라스미드 R1상의 kis-kid 시스템[참조: Ruiz-Echevarria et al. (1991) Mol Microbiol 5,2685-2693 ; Hargreaves et al. (2002) Structure (Camb) 10,1425-1433 ; Ruiz-Echevarria et al, (1995) J Mol Biol 247,568-577 ; Santos-Sierra et al. (2003) Plasmid 50,120-130], 및 플라스미드 R100상의 peml- pemK 시스템[참조: Tsuchimoto et al. (1992) J Bacteriol 174, 42054211; Tsuchimoto et al. (1988) J Bacteriol 170,1461-1466; Tsuchimoto and Ohtsubo. (1993) Mol Gen Genet 237,81-88; Tsuchimoto and Ohtsubo. (1989) Mol Gen Genet 215,463-468]을 포함한다.
흥미롭게도, 이. 콜라이 염색체는 또한 다수의 중독 모듈 시스템을 함유하는데, 이들은 relBE 시스템 (Gotfredsen and Gerdes. (1998) Mol Microbiol 29,1065-1076 ; Christensen et al. (2001) Proc Natl Acad Sci USA 98,14328-14333; Christensen and Gerdes. (2003) Mol Microbiol 48, 1389-1400; Pedersen et al. (2003) Cell 112, 131-140), mazEF 시스템 (Aizenman et al. (1996) Proc Natl Acad Sci USA 93,6059-6063; Marianovsky et al. (2001) J Biol Chem 276, 5975-5984; Kamada et al. (2003) Mol Cell 11, 875-884; Zhang et al.(2003) J Biol Chem 278, 32300-32306) 및 chpB 시스템 (Santos Sierra et al. (1998) FEMS Microbiol Lett 168, 51-58; Masuda et al. (1993) J Bacteriol 175, 6850-6856; Christensen et al. (2003) J Mol Biol 332, 809-819)이다.
중독 모듈과 관련된 독소의 세포성 효과는 아주 광범위하게 연구되었다. CcdB은 ccdA-ccdB 시스템의 독소로서, DNA 귀라제와 상호작용하여 DNA 복제를 차단하고 (Bahassi et al. (1999) supra ; Kampranis et al. (1999) J Mol Biol 293, 733-744), RelE는 relBE 시스템의 독소로서, 고도의 코돈 특이성으로 리보솜 A 부위내에서 mRNA를 절단하지만 유리 RNA는 분해시키지 못한다(Pedersen et al. (2003) supra). 하지만 최근에 A-부위 mRNA 절단이 RelE 부재하에 일어날 수 있음이 입증되었다(Hayes and Sauer. (2003) Mol Cell 12, 903-911). 따라서 A-부위 mRNA 절단의 정확한 기작은 여전히 공지되어 있지 않다. mazEF 시스템에 의해 암호화되는 독소인 MazF(ChpAK) 및 chpB 시스템에 의해 암호화되는 독소인 ChpBK가 리보솜 의존적 및 코돈 특이적인 방식으로 RelE의 것과 매우 유사한 기작에 의해 해독을 억제한다는 것이 제안되었다(Christensen et al. (2003) supra). 하지만 본 발명자들은, 최근 MazF가 일본쇄 RNA에 대해서만 기능성인 서열-특이적인 엔도리보뉴클레아제로서 리보솜 및 코돈 독립적인 방식으로 ACA 서열에서 mRNAs를 우선적으로 절단하며, 따라서 RelE와 기능상으로 구분됨을 입증하였다(Zhang et al. (2003) Mol Cell 12, 913-923).
pemI-pemK 시스템 및 kis-kid 시스템은 두개의 밀접하게 관련된된 incFII 저 복제수 플라스미드인 플라스미드 R100 (Tsuchimoto et al. (1992) supra ; Tsuchimoto et al. (1988) supra)과 플라스미드 R1 (Ruiz-Echevarria et al.(1991) supra ; Bravo et al. (1987) Mol Getz Genet 210,101-110) 각각의 안정적 유지에 연루된다. 이들 두개의 시스템은 현재 동일한 것으로 공지되어 있다 (Engelberg-Kulka and Glaser. (1999) supra). Kid (PemK)가 DNA 합성의 초기에서 작용하는 ColEl 플라스미드 복제를 억제하지만, 시험관내에서 P4 DNA 복제를 억제하지 않는 것으로 밝혀졌다(Ruiz-Echevarria et al. (1995) supra). 현재까지, Kid (PemK)가 염색체 DNA 복제를 억제한다는 증거는 없다. 독소 Kid (PemK) 및 안티도트 Kis (PemI)는 세균에서만 기능성일 뿐 아니라 다양한 범위의 진핵생물에서도 효율적으로 작용한다. Kid (PemK)는 효모, 제누스 래비스(Xenopus laevis) 및 사람 세포에서 증식을 억제하는 반면, Kis(PemI)는 이러한 억제가 없다(de la Cueva-Mendez et al. (2003) Embo J22, 246-251). Kid(PemK)는 사람 세포에서 아폽토시스를 촉발하는 것이 또한 입증되었다(de la Cueva- Mendez et al. (2003) supra). 이들 결과는 원핵생물과 진핵생물 모두에서 Kid (PemK)에 대한 공동의 표적이 존재함을 시사한다.
본원중 참조문헌의 인용은 이것이 본원 발명에 대한 종래 기술임을 시인하는 것으로 간주될 수는 없다.
본원 발명의 기타 특성 및 이점은 하기 발명의 상세한 설명, 도면 및 특허청구범위로부터 명백해질 것이다.
발명의 개요
제1 양태에 있어, 본 발명은 본원중 "RNA 인터페라제"로 지칭되는, 신규한 계열의 효소의 발견에 관한 것이다. 본원에 기술된 바와 같이, mRNA 인터페라제 계열의 예시적 엔도리보뉴클레아제에는 MazF 및 PemK, 이의 동족체 및 상동체가 포함된다. 본 발명은 따라서, MazF 또는 PemK 폴리펩타이드의 서열 및/또는 이와 구조적으로 상동성인 엔도리보뉴클레아제를 포괄한다.
주목할 점은, 본 발명의 발견 이전, MazF의 세포성 표적(들)은 동정된 바 없었다는 점이다. 더구나, 본 발명은 또한, PemK가 서열 특이적 방식으로 세포성 mRNA를 절단함으로써 단백질 합성을 효율적으로 차단한다는 발견에 관한 것이다. 본 발명자들의 신규한 발견은 따라서, mRNA 인터페라제(즉, MazF 및/또는 PemK) 핵산 및 아미노산 서열 및 이의 조성물이 유리하게 사용될 수 있는 신규한 적용분야에 대한 것이다. 이러한 유용성은, 하기 기재하는 다양한 연구 및 치료학적 적용을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 또한, mRNA 인터페라제(MazF 및/또는 PemK) 핵산 및/또는 아미노산 서열, mRNA 인터페라제 활성 양립성 완충액 및 지침서를 포함하는 키트가 제공된다.
본 발명은 또한,
(a) mRNA 인터페라제 또는 이의 기능성 단편을 암호화하는 핵산 서열을 제공하고;
(b) 단계 (a)의 핵산 서열을 발현시키며;
(c) 단계 (b)의 발현된 핵산 서열을 엔도리보뉴클레아제 기질과 함께 항온처리한 후,
(d) 상기 기질의 절단을 측정함을 포함하며,
이때, 상기 기질의 절단이 엔도리보뉴클레아제 활성을 지시하여 이를 검출하는 수단 또는 당해 mRNA 인터페라제 또는 이의 기능성 단편의 엔도리보뉴클레아제 활성의 포지티브 지시자가 되는, mRNA 인터페라제 또는 이의 기능성 단편의 엔도리보뉴클레아제 활성을 검출하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명에 의해,
(a) mRNA 인터페라제 또는 이의 기능성 단편을 암호화하는 핵산 서열을 제공하고;
(b) 단계 (a)의 핵산 서열을 발현시키며;
(c) 단계 (b)의 발현된 핵산 서열을, 엔도리보뉴클레아제 활성을 촉진시킬 수 있는 조건하에서, 엔도리보뉴클레아제 기질과 함께 항온처리하고;
(d) 상기 mRNA 인터페라제 또는 이의 기능성 단편의 엔도리보뉴클레아제 활성을 잠재적으로 조절할 수 있는 하나 이상의 제제를 부가한 후;
(e) 상기 기질의 절단을 측정함을 포함하며,
이때, 상기 기질의 절단이 엔도리보뉴클레아제 활성을 지시하여 엔도리보뉴클레아제 활성을 검출하기 위한 수단을 제공하거나 당해 mRNA 인터페라제 또는 이의 기능성 단편의 포지티브 지시자가 되며, mRNA 인터페라제 또는 이의 기능성 단편의 엔도리보뉴클레아제 활성을 조절할 수 있는 하나 이상의 제제의 존재하에 절단된 기질의 양의 변화로 상기 mRNA 인터페라제 또는 이의 기능성 단편의 활성을 조절할 수 있는 제제를 동정하는 것인, mRNA 인터페라제 또는 이의 기능성 단편의 엔도리보뉴클레아제 활성을 조절할 수 있는 제제를 동정하기 위한 선별 방법이 제공된다.
본 발명의 방법을 사용하여 동정되고, mRNA 인터페라제 또는 이의 기능성 단편의 엔도리보뉴클레아제 활성을 조절할 수 있는 이같은 제제는 기질 절단의 증가 또는 감소를 일으킬 수 있다. 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 동정되는 제제를 또한 포괄한다.
또다른 양태에 있어서,
(a) mRNA 인터페라제 또는 이의 기능성 단편을 암호화하는 핵산 서열을 제공하고;
(b) 단계 (a)의 핵산 서열을 발현시키며;
(c) 단계 (b)의 발현된 핵산 서열을, 엔도리보뉴클레아제 활성을 촉진시킬 수 있는 조건하에서, 엔도리보뉴클레아제 기질과 함께 항온처리하고;
(d) mRNA 인터페라제 또는 이의 기능성 단편의 엔도리보뉴클레아제 활성을 조절할 수 있는 제제를 부가한 후;
(e) 상기 기질의 절단을 측정함을 포함하며,
이때, 상기 기질의 절단이 엔도리보뉴클레아제 활성을 지시하여 엔도리보뉴클레아제 활성을 검출하기 위한 수단 또는 mRNA 인터페라제 또는 이의 기능성 단편의 포지티브 지시자를 제공하게 되고, 상기 제제의 존재하에 절단된 기질의 양의 변화로 상기 mRNA 인터페라제 또는 이의 기능성 단편의 엔도리보뉴클레아제 활성을 조절하는 수단이 제공되는, mRNA 인터페라제 또는 이의 기능성 단편의 엔도리보뉴클레아제 활성을 조절하기 위한 방법이 제시된다.
mRNA 인터페라제를 암호화하는 예시적 핵산 서열에는 서열번호 1 또는 3, 및 서열번호 2 또는 4를 암호화하는 핵산 서열 및 하기 기술될 이의 동족체 및 상동체를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 예시적인 이의 동족체/상동체는, 서열번호 69 및 74를 각각 포함하는 핵산 및 아미노산 서열을 포함하는 MazF-mtl이다.
또다른 양태에 있어서,
(a) mRNA 인터페라제를 포함하는 아미노산 서열을 제공하고;
(b) 단계 (a)의 아미노산 서열을, 엔도리보뉴클레아제 활성을 촉진시킬 수 있는 조건하에서, 엔도리보뉴클레아제 기질과 함께 항온처리하고;
(c) 상기 기질의 절단을 측정함을 포함하며,
이때, 상기 기질의 절단이 엔도리보뉴클레아제 활성을 지시하여 당해 mRNA 인터페라제 또는 이의 기능성 단편의 엔도리보뉴클레아제 활성을 검출하는 수단을 제공하고 이의 포지티브 지시자가 되는, mRNA 인터페라제 또는 이의 기능성 단편의 엔도리보뉴클레아제 활성을 검출하기 위한 방법이 제공된다.
본 발명은 또한,
(a) mRNA 인터페라제를 포함하는 아미노산 서열을 제공하고;
(b) 단계 (a)의 아미노산 서열을, 엔도리보뉴클레아제 활성을 촉진시킬 수 있는 조건하에서, 엔도리보뉴클레아제 기질과 함께 항온처리하고;
(c) 상기 mRNA 인터페라제 또는 이의 기능성 단편의 엔도리보뉴클레아제 활성을 잠재적으로 조절할 수 있는 하나 이상의 제제를 부가한 후;
(d) 상기 기질의 절단을 측정함을 포함하며,
이때, 상기 기질의 절단이 엔도리보뉴클레아제 활성을 지시하여 상기 mRNA 인터페라제 또는 이의 기능성 단편의 엔도리보뉴클레아제 활성을 검출하는 수단을 제공하게 되고, 상기 하나 이상의 제제의 존재하에 절단된 기질의 양의 변화로 상기 mRNA 인터페라제 또는 이의 기능성 단편의 활성을 조절할 수 있는 제제를 동정하는, mRNA 인터페라제 또는 이의 기능성 단편의 엔도리보뉴클레아제 활성을 조절할 수 있는 제제를 동정하기 위한 선별 방법을 포함한다. 이러한 방법은 시험관내 또는 세포내에서 수행될 수 있다.
mRNA 인터페라제 또는 이의 기능성 단편의 엔도리보뉴클레아제 활성을 조절할 수 있는, 상기 방법을 사용하여 동정되는 제제는 기질 절단을 증가 또는 감소시킬 수 있다. 이러한 조절제는 본원 발명의 범위 내에 있다. 이러한 제제는, 예를 들면 mRNA 인터페라제(독소) 또는 이의 항독소(예: PemI, MazE, 각각, 또는 이의 기능성 및/또는 구조적 동족체 또는 상동체의 항독소) 상에 작용함으로써, 또는 독소-항독소 복합체가 독소 및 항독소 유전자의 발현을 하향조절하는 자가조절 피드백 기작을 변경시킴으로써, mRNA 인터페라제(예: PemK, MazF, 또는 기능성 및/또는 구조적 동족체 또는 상동체)의 엔도리보뉴클레아제 활성을 조절할 수 있는 것으로 이해된다. 독소-항독소 복합체가 독소 및 항독소 유전자의 발현을 하향조절하는 자가조절 피드백 기작을 변경시킬 수 있는 제제는 이들 유전자의 조화된 조절을 변경시킬 수 있다. 이러한 양태의 국면에서, 독소-항독소 복합체 형성을 감소시킬 수 있는 제제는 항독소의 효과를 억제하며, 세포 사멸을 궁극적으로 초래하는 증가된 독소 활성이 야기된다. 또다른 양태에 있어, 항독소 및 독소 유전자의 발현을 차단시킬 수 있는 제제가 구상되는데, 여기서 당해 제제는 독소의 안정적 특성에 기인하여 항독소에 비해 독소 수준의 증가를 초래하게 된다. 이러한 불균형은 또한 세포 독성을 초래한다.
따라서, 이같은 제제는 세균성 감염, 특히 세균의 항생제 내성 균주에 감염된 피험체를 치료하는데 유리하게 사용될 수 있다. 이러한 제제는 본 발명의 영역내에 있으며, 단독으로 또는 배합물로 사용될 수 있다.
또한,
(a) mRNA 인터페라제의 아미노산 서열을 제공하고;
(b) 단계 (a)의 아미노산 서열을, 엔도리보뉴클레아제 활성을 촉진시킬 수 있는 조건하에서, 엔도리보뉴클레아제 기질과 함께 항온처리하고;
(c) 상기 mRNA 인터페라제 또는 이의 기능성 단편의 엔도리보뉴클레아제 활성을 조절할 수 있는 제제를 부가한 후;
(d) 상기 기질의 절단을 측정함을 포함하며,
이때, 상기 기질의 절단이 엔도리보뉴클레아제 활성을 지시하여 당해 mRNA 인터페라제 또는 이의 기능성 단편의 엔도리보뉴클레아제 활성을 검출하는 수단을 제공하게 되고, 상기 제제의 존재하에 절단된 기질의 양의 변화로 상기 mRNA 인터페라제 또는 이의 기능성 단편의 엔도리보뉴클레아제 활성을 조절하는 수단이 제공되는, mRNA 인터페라제 또는 이의 기능성 단편의 엔도리보뉴클레아제 활성을 조절하기 위한 방법이 제공된다. 이러한 방법은 예를 들면 세포-기본 검정(배양물중 또는 비-사람 동물 또는 사람 환자와 같은 피험체 내에서) 또는 시험관내에서 수행될 수 있다.
본 발명에 따라, mRNA 인터페라제를 포함하는 예시적 아미노산 서열에는 서열번호 2 또는 4, 및 하기 기술하게 되는 이의 동족체 및 상동체를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 예시적인 이의 동족체/상동체는, 서열번호 74의 아미노산 서열을 포함하는, MazF-mtl이다.
본 발명은 또한,
(a) mRNA 인터페라제를 암호화하고/하거나 mRNA 인터페라제를 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열 및, 임의로 하나 이상의 조절 서열을 포함하는 발현벡터를 포함하는 세포를 제공하고;
(b) 하나 이상의 세포 기질의 엔도리보뉴클레아제 활성을 촉진시킬 수 있는 조건하에서 단계 (a)의 세포를 항온처리하고;
(c) 하나 이상의 세포성 기질의 절단을 측정함을 포함하며,
이때, 하나 이상의 세포성 기질의 절단이 엔도리보뉴클레아제 활성을 지시하여 세포내에서 mRNA 인터페라제 또는 이의 기능성 단편의 엔도리보뉴클레아제 활성을 검출하는 수단을 제공하는, 세포내에서 mRNA 인터페라제 또는 이의 기능성 단편의 엔도리보뉴클레아제 활성을 검출하기 위한 방법을 포함한다.
하나의 양태에 있어, 본 발명은 또한,
(a) mRNA 인터페라제를 암호화하고/하거나 mRNA 인터페라제를 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열 및, 임의로 하나 이상의 조절 서열을 포함하는 발현벡터를 포함하는 세포를 제공하고;
(b) 하나 이상의 세포 기질의 엔도리보뉴클레아제 활성을 촉진시킬 수 있는 조건하에서 단계 (a)의 세포를 항온처리하고;
(c) mRNA 인터페라제 또는 이의 기능성 단편의 엔도리보뉴클레아제 활성을 조절할 수 있는 제제를 부가하며;
(d) 하나 이상의 세포성 기질의 절단을 측정함을 포함하며,
이때, 하나 이상의 세포성 기질의 절단이 엔도리보뉴클레아제 활성을 지시하여 세포내에서 mRNA 인터페라제 또는 이의 기능성 단편의 엔도리보뉴클레아제 활성을 검출하는 수단을 제공하며, 여기서 당해 제제의 존재하에 하나 이상의 절단된 기질의 양의 변화가 mRNA 인터페라제 또는 이의 기능성 단편의 엔도리보뉴클레아제 활성을 조절하는 수단을 제공하는, 세포내에서 mRNA 인터페라제 또는 이의 기능성 단편의 엔도리보뉴클레아제 활성을 조절하기 위한 방법이 제시된다.
본 발명은 또한,
(a) mRNA 인터페라제를 암호화하고/하거나 mRNA 인터페라제를 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열 및, 임의로 하나 이상의 조절 서열을 포함하는 발현벡터를 포함하는 세포를 제공하고;
(b) 하나 이상의 세포 기질의 엔도리보뉴클레아제 활성을 촉진시킬 수 있는 조건하에서 단계 (a)의 세포를 항온처리하고;
(c) mRNA 인터페라제 또는 이의 기능성 단편의 엔도리보뉴클레아제 활성을 잠재적으로 조절할 수 있는 하나 이상의 제제를 부가하며;
(d) 하나 이상의 세포성 기질의 절단을 측정함을 포함하며,
이때, 하나 이상의 세포성 기질의 절단이 엔도리보뉴클레아제 활성을 지시하여 세포내에서 mRNA 인터페라제 또는 이의 기능성 단편의 엔도리보뉴클레아제 활성을 검출하는 수단을 제공하며, 여기서 당해 제제의 존재하에 하나 이상의 절단된 하나 이상의 기질의 양의 변화가 mRNA 인터페라제 또는 이의 기능성 단편의 활성을 조절하는 제제임을 동정하게 하는, 세포내에서 mRNA 인터페라제 또는 이의 기능성 단편의 엔도리보뉴클레아제 활성을 조절할 수 있는 제제를 동정하기 위한 선별 방법이 제시된다.
본 발명에 따라, mRNA 인터페라제를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터를 포함하는 세포는 서열번호 1 또는 3, 및 본원중 기술된 이의 동족체 및 상동체; 서열번호 2 또는 4를 암호화하는 핵산 서열, 및 본원중 기술된 이의 동족체 및 상동체를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 예시적인 이의 동족체/상동체는, 각각 서열번호 69 및 74를 포함하는 핵산 및 아미노산 서열을 포함하는, MazF-mtl이다.
또한, 하나 이상의 mRNA 인터페라제 또는 이의 기능성 단편, mRNA 인터페라제 암호화 핵산 서열, 및/또는 본원 발명의 방법을 사용하여 동정된 mRNA 인터페라제 조절제 및 약제학적으로 허용되는 완충액을 포함하는 조성물이 제공된다.
하나의 국면에 있어서, 환자에게 치료학적 유효량의 본 발명의 조성물을 투여하여 질환 증상을 경감시킴을 포함하는, 질환을 가진 환자를 치료하는 방법이 제시된다. 당해 조성물은, 환자가 앓는 질환에 따라 당해 질환 증상을 경감시키기 위해 엔도리보뉴클레아제 기질 절단을 증가 또는 감소시킬 수 있는 하나 이상의 제제를 포함한다.
따라서 본 발명은, 질환을 갖는 환자의 치료에 사용하여 당해 질환 증상을 경감시키기 위한 약제의 제조에 있어서의, 치료학적 유효량의 mRNA 인터페라제 또는 이의 기능성 단편, mRNA 인터페라제 암호화 핵산 서열, 또는 mRNA 인터페라제 조절성 제제의 용도를 포함한다. 이러한 약제는 추가로 약제학적으로 허용되는 완충액을 포함할 수 있다.
예를 들면 세균성 감염과 같은 질환이, 엔도리보뉴클레아제 기질 절단을 증가시킬 수 있는 치료학적 유효량의 하나 이상의 분자 또는 제제를 포함하는 본 발명에 따른 조성물을 환자에게 투여하여, 당해 환자의 세균수를 감소시킴으로써 세균성 감염 증상을 경감시켜 치료될 수 있다. 이러한 방법은, 세균성 감염이 하나 이상의 항생제 내성 세균 균주를 포함하는 경우, 특별히 유리하게 사용될 수 있다.
본 발명의 방법은 과증식성 질환의 치료에 유용한데, 엔도리보뉴클레아제 기질 절단을 증가시킬 수 있는 치료학적 유효량의 하나 이상의 분자 또는 제제를 포함하는 본 발명에 따른 조성물을 환자에게 투여하여, 당해 환자의 과증식성 세포의 수를 감소시킴으로써, 과증식성 질환의 증상을 경감시킨다. 본 발명의 조성물 및 방법에 의해 치료가능한, 비조절된 세포 증식에 의해 특징지워지는 과증식성 질환은 상이한 조직의 이형성증 및 화생, 염증상태, 자가면역 질환, 과증식성 피부 질환, 건선, 알레르기/천식, 아테롬성경화증 및 혈관성형술후 재협착증 및 암을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
또한, 환자에게 본 발명의 조성물의 치료학적 유효량을 투여함을 포함하는 질환을 갖는 환자를 치료하는 방법이 제공되는데, 여기서 당해 조성물의 하나 이상의 제제는 엔도리보뉴클레아제 기질 절단의 감소를 일으켜 당해 질환 증상을 경감시킨다.
또한 본 발명에 의해,
(a) mRNA 인터페라제 인지 서열이 다른 트리플렛 코돈으로 치환되도록 돌연변이되고 이같이 돌연변이된 핵산 서열에 의해 암호화되는 폴리펩타이드의 아미노산 서열이 상기 돌연변이에 의해 변화되지 않는, 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열로 세포를 형질감염시키고;
(b) 상기 mRNA 인터페라제 인지 서열을 인식하는 mRNA 인터페라제를 암호화하는 핵산 서열로 상기 세포를 형질감염시키며;
(c) 단계 (a) 및 (b)의 핵산 서열을 당해 세포내에서 발현시켜, 당해 세포 내에서 단계 (a) 및 (b)의 핵산 서열의 발현으로 폴리펩타이드를 생산하는 수단이 제공되는, 세포 내에서 폴리펩타이드를 생산하기 위한 방법이 제공된다.
본 발명에 따라, 폴리펩타이드 또는 mRNA 인터페라제를 암호화하는 핵산 서열은 제1 및 제2 발현 벡터내에 각각 포함될 수 있다. 더구나, 단계 (a) 및 (b)의 형질감염 단계는 별도로 또는 동시에 수행될 수 있다(예, 공형질발현). 본원중 상기 지시된 바와 같이, 핵산 서열내 mRNA 인터페라제 인지 서열의 상이한 트리플렛 서열 또는 코돈으로의 돌연변이는 당해 돌연변이된 핵산 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 변화시키지 않는다. 따라서, 돌연변이는 암호화된 폴리펩타이드의 아미노산 서열 측면에서 침묵성이다. 핵산 서열을 돌연변이시키는 목적은 이로부터 전사되는 RNA 메세지의 미지의 mRNA 인터페라제의 엔도리보뉴클레오타이드 분해 활성에 대한 감수성을 극적으로 감소시키기 위함이다. 단계 (b)의 핵산(예: 예를 들면 PemK 폴리펩타이드 또는 이의 기능성 단편, 또는 MazF 폴리펩타이드 또는 이의 기능성 단편, 또는 MazF 또는 PemK의 동족체 또는 상동체를 암호화하는 핵산 서열)의 발현은 mRNA 인터페라제 인지 서열을 포함하는 핵산 서열에 의해 암호화되는 세포성 폴리펩타이드의 합성을 감소시키거나 억제시킨다. 따라서, 당해 방법은 RNA 전사체가 발현된 mRNA 인터페라제에 의해 인지되는 mRNA 인터페라제 인지 서열을 포함하는 세포성 단백질의 본질적인 부재하에 RNA 전사체가 목적하는 폴리펩타이드를 생산한다. 이로써 본 방법은 세포내에서 '정제된' 폴리펩타이드를 제조하기 위한 방법을 제공한다. 몇몇 적용에 있어, 당해 방법은 단계 (c) 동안 또는 이에 앞서 하나 이상의 방사성 표지된 동위원소를 포함하는 배지내에서 세포를 항온처리함을 추가로 포함한다. 이러한 적용은 핵자기공명(NMR) 기술을 사용한 후속적 분석을 위해 표지된 폴리펩타이드의 제조를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
특정의 양태에 있어서, 세포내에서 폴리펩타이드를 제조하는 방법은 mRNA 인지 서열 아데닌-사이토신-아데닌(ACA), 및 서열번호 2를 포함하는 mRNA 인터페라제 MazF 또는 이의 기능성 단편을 사용한다. 이러한 양태에 있어서, MazF 또는 이의 기능성 단편을 암호화하는 핵산 서열의 발현은 ACA 서열을 포함하는 핵산 서열에 의해 암호화되는 세포성 폴리펩타이드의 합성을 억제하거나 감소시킨다.
또다른 양태에서, 세포내에서 폴리펩타이드를 제조하기 위한 방법은 mRNA 인지 서열 우라실-아데닌-X (UAX)[여기서, X는 사이토신(C), A, 또는 U이다], 및 서열번호 4를 포함하는 mRNA 인터페라제 PemK 또는 이의 기능성 단편을 사용한다. 이러한 양태에서, PemK 또는 이의 기능성 단편을 암호화하는 핵산의 발현은 UAX 서열을 포함하는 핵산 서열에 의해 암호화되는 세포성 폴리펩타이드의 합성을 감소 또는 억제한다.
또다른 양태에 있어서, 세포내에서 폴리펩타이드를 제조하기 위한 방법은 mRNA 인지 서열 우라실-아데닌-C (UAC), 및 서열번호 74를 포함하는 mRNA 인터페라제 MazF-mtl 또는 이의 기능성 단편을 사용한다. 이러한 양태에서, MazF-mtl을 암호화하는 핵산 또는 이의 기능성 단편의 발현은 UAC 서열을 포함하는 핵산 서열에 의해 암호화되는 세포성 폴리펩타이드의 합성을 감소 또는 억제한다.
본 발명의 하나의 양태에 있어,
(a) mRNA 인터페라제 인지 서열이 다른 트리플렛 코돈으로 치환되도록 돌연변이되는 폴리펩타이드로서, 이같이 돌연변이된 핵산 서열에 의해 암호화되는 당해 폴리펩타이드의 아미노산 서열이 상기 돌연변이에 의해 변화되지 않는, 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 제공하고;
(b) 상기 mRNA 인터페라제 인지 서열을 인식하는 mRNA 인터페라제를 암호화하는 핵산 서열을 제공하며;
(c) 단계 (a) 및 (b)의 핵산 서열을 발현시킴을 포함하고,
이때, 단계 (a) 및 (b)의 핵산 서열의 발현으로 당해 폴리펩타이드를 생산하는 수단이 제공되는, 폴리펩타이드를 생산하기 위한 방법이 제공된다. 이러한 방법은 시험관내, 예를 들면 테스트튜브 등에서 수행될 수 있다. 적합한 시험관내 전사/해독 시스템 또는 세포-부재 발현 시스템은 당업계에 공지되어 있으며 하기 기술되어 있다. mRNA 인터페라제 또는 이의 단편은, 발현을 필요로 하는 핵산 서열의 형태보다는 발현된 단백질로서 임의로 제공될 수 있다.
특정의 양태에서, 폴리펩타이드를 생산하는 방법은, mRNA 인지 서열 ACA 및 서열번호 2를 포함하는 mRNA 인터페라제 MazF 또는 이의 기능성 단편을 사용한다.
또다른 양태에서, 폴리펩타이드를 생산하는 방법은, mRNA 인지 서열 UAX[여기서, X는 C, A, 또는 U이다], 및 서열번호 4를 포함하는 mRNA 인터페라제 PemK 또는 이의 기능성 단편을 사용한다.
또다른 양태에 있어서, 폴리펩타이드를 생산하는 방법은, mRNA 인지 서열 UAC, 및 서열번호 74를 포함하는 mRNA 인터페라제 MazF-mtl 또는 이의 기능성 단편을 사용한다.
본 발명은 본 발명의 mRNA 인터페라제를 사용하여 다수의 폴리리보뉴클레오타이드 서열을 제조하는 방법에 관한 것이다. 당해 방법은,
(a) 제1 핵산 서열의 영역이 제2 핵산 서열의 영역과 상보적이고 당해 제1 또는 제2 핵산 서열의 상보성 영역에 mRNA 인터페라제 인지 부위와 상보성인 서열을 포함하지 않으며, 당해 제1 및 제2 핵산 서열 각각이 이의 5' 말단에서 인산화된, 제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열을 제공하고;
(b) 상기 제1 및 제2 핵산 서열의 상보성 영역을 통해 제1 및 제2 핵산 서열을 어닐링하여, 일본쇄 오버행(overhang)들에 의해 플랭킹된 상보성 영역을 포함하는 이본쇄 핵산 서열을 형성시키고, 이때 상기 일본쇄 오버행 각각은 mRNA 인터페라제 인지 부위와 상보성인 하나 이상의 서열을 포함하고 당해 일본쇄 오버행들은 서로에 대해 상보적이며;
(c) 어닐링된 제1 및 제2 핵산 서열을 상보성 일본쇄 오버행들을 통해 연결시켜, 어닐링된 제1 및 제2 핵산 서열의 다수의 탠덤 반복체들을 포함하는 콘카타머(concatamer)를 형성시키고;
(d) T7 프로모터 및 상기 제1 핵산 서열에 상보성인 영역을 포함하는 제1 프라이머 및 상기 제2 핵산 서열에 상보성인 제2 프라이머를 사용하여 상기 콘카타머를 증폭시키고, 이러한 증폭으로 T7 프로모터를 포함하는 다수의 콘카타머가 생산되고;
(e) T7 RNA 폴리머라제를 사용하여 상기 다수의 콘카타머로 부터 RNA 분자(이들 RNA 분자 각각은 mRNA 인터페라제 인지 부위에 의해 플랭킹된 폴리리보뉴클레오타이드 서열의 다수의 탠덤 반복체를 포함한다)를 전사시키고;
(f) 인터페라제 인지 부위에서 RNA를 절단할 수 있는 mRNA 인터페라제로 상기 RNA 분자를 분해시켜, 다수의 폴리리보뉴클레오타이드 서열을 생산함을 포함한다.
다수의 폴리리보뉴클레오타이드 서열을 제조하는 특정의 양태에서, mRNA 인지 서열은 ACA 서열이고 mRNA 인터페라제가 서열번호 2를 포함하는 MazF 또는 이의 기능성 단편이다.
다수의 폴리리보뉴클레오타이드 서열을 제조하는 특정의 양태에서, mRNA 인지 서열은 UAX 서열이고[여기서, X는 C, A, 또는 U이다], mRNA 인터페라제가 서열번호 4를 포함하는 PemK 또는 이의 기능성 단편이다.
다수의 폴리리보뉴클레오타이드 서열을 제조하는 특정의 양태에서, mRNA 인지 서열은 UAC 서열이고, mRNA 인터페라제가 서열번호 74를 포함하는 MazF-mtl 또는 이의 기능성 단편이다.
본 발명은 또한 서열번호 2 또는 서열번호 4의 서열 및/또는 이와 구조적으로 상동성인 서열을 갖고 엔도리보뉴클레아제 활성을 나타낼 수 있는 폴리펩타이드 또는 이의 기능성 단편을 암호화하는 분리된 핵산 서열에 관한 것이다. 하나의 양태에서, 서열번호 2의 서열 및/또는 이의 구조적으로 상동성인 서열을 갖는 폴리펩타이드 또는 이의 기능성 단편은 엔도리보뉴클레아제 활성을 나타낼 수 있는 MazF 상동체이다. 엔도리보뉴클레아제 활성을 나타낼 수 있는 폴리펩타이드는 바실러스 할로두란스(Bacillus halodurans) MazF (NP_244588.1), 스타필로코쿠스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis) MazF (AAG23809.1), 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) MazF (NP_372592.1), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) MazF (1NE8_A), 나이세리아 메닝기티디스(Neisseria meningitides) MazF(NP_266040.1), 모르가넬라 모르가니(Morganella morgani) MazF (AAC82516.1) 및 미코박테리움 튜베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis) MazF(NP_217317. 1)를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
또다른 양태에서, 서열번호 4의 서열 및/또는 이와 구조적으로 상동성인 서열을 갖는 폴리펩타이드 또는 이의 기능성 단편은 엔도리보뉴클레아제 활성을 나타낼 수 있는 PemK 동족체 또는 상동체이다. 엔도리보뉴클레아제 활성을 나타낼 수 있는 폴리펩타이드에는 PemK 단백질 계열의 73개의 공지된 구성원을 포함하나 이에 제한되지 않으며, 여기에는, MazF (ChpAK), ChpBK 및 기타 PemK-유사 단백질을 포함한다. 하기는 웹사이트(http://pfam.wustl.edu/cgi-bin/getdesc?acc=PF02452)에서 발견된 이들 단백질에 대해 지칭된 것들의 목록이다: Q9RX98; Q8F5A3; Q9K6K8; CHPAECOLI; Q7NPF9;Q88TP7; Q7WWW1; Q8YS80; Q8DW95; Q82YR2; Q7X3Y1; Q93S64; Q8PRN1; Q8GFY1; 052205; PEMK_ECOLI Q7N4H2; Q88PS7; Q8XCF2CHPBJ_ECOLI; Q82VU0; Q8UGU5; Q9RWK4; Q9PHH8; Q7TXU4; P71650; Q7U1Y5; P96295; Q9JWF2; Q9JXI1; Q8E882; Q82VB5; Q8KJS3; Q7NMY4; Q9KFF7; P96622; Q81IT4; Q81VF4; Q8ESK5; Q92DC7; Q8Y8LO; Q97LR0; Q8XNN7; Q8R861; Q88Z43; 007123; Q837I9; Q9F7V5; Q8CRQ1; 005341; P95840; Q9FCV0; Q837L1; Q93M89; Q99IU9; Q82UB5; Q93MT8; YJ91_MYCTU; Q97MV8; Q7NHWO; Q7NI95; Q8YML2; Q7NHR3; YE95_MYCTU; Q9PCB9; Q8YZW8; Q7TZ90; P95272; Q8VJR1; Q7UON2; 053450; 006780; 및 Q7U1I8.
본 발명에 의해 서열번호 2 또는 서열번호 4의 서열 및/또는 이와 구조적으로 상동성인 서열을 갖고 엔도리보뉴클레아제 활성을 나타낼 수 있는 폴리펩타이드 또는 이의 기능성 단편을 암호화하는 분리된 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터가 포함된다. 발현 벡터를 포함하는 세포는, 본 발명의 분리된 핵산 서열을 포함하는 유전자이식 동물로서 구체화되는데, 여기서 유전자이식된 동물의 하나 이상의 세포에서 핵산 서열이 발현된다.
본 발명의 또다른 양태에 있어서, 서열번호 2 또는 서열번호 4의 서열 및/또는 이와 구조적으로 상동성인 서열을 갖고 엔도리보뉴클레아제 활성을 나타낼 수 있는 폴리펩타이드 또는 이의 기능성 단편을 포함하는 분리된 아미노산 서열이 제시된다. 또한, 아미노산 서열의 발현이 발현 벡터내의 조절성 서열에 의해 제어되는, 아미노산 서열을 암호화하는 발현 벡터, 이러한 발현 벡터를 포함하는 세포, 및 하나 이상의 세포에서 아미노산 서열이 발현되는, 본 발명의 아미노산 서열을 포함하는 유전자이식 동물이 본원 발명중에 포함된다.
본 발명의 또다른 양태에서, 서열번호 1 또는 서열번호 3을 포함하며, 엔도리보뉴클레아제 활성을 나타낼 수 있는 mRNA 인터페라제 또는 이의 기능성 단편을 암호화하는 분리된 핵산 서열이 제공된다.
또한, 엔도리보뉴클레아제 활성을 나타낼 수 있는 mRNA 인터페라제 또는 이의 기능성 단편을 암호화하는 서열번호 1 또는 서열번호 3의 핵산 서열을 포함하며, 서열번호 1 또는 서열번호 3이 조절서열에 작동가능하게 연결되어 있는 발현 벡터가 기술되어 있다. 또한 이러한 발현 벡터를 포함하는 세포가 본 발명의 범위내에 있다.
또다른 양태에서, 서열번호 1 또는 서열번호 3을 포함하는 핵산 서열을 포함하는 유전자 이식된 동물이 제시되는데, 여기서 핵산 서열은 엔도리보뉴클레아제 활성을 나타낼 수 있는 mRNA 인터페라제 또는 이의 기능성 단편을 암호화하고, 핵산 서열은 유전자 이식된 동물의 하나 이상의 세포에서 발현된다.
또한, 서열번호 2 또는 서열번호 4를 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 분리된 핵산 서열이 제공되는데, 여기서 폴리펩타이드는 엔도리보뉴클레아제 활성을 나타낼 수 있는 mRNA 인터페라제 또는 이의 기능성 단편이다.
또다른 양태에서, 서열번호 2 또는 서열번호 4를 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 분리된 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터가 제공되는데, 여기서 폴리펩타이드는 엔도리보뉴클레아제 활성을 나타낼 수 있는 mRNA 인터페라제 또는 이의 기능성 단편이고, 핵산 서열은 조절서열에 작동가능하게 연결된다. 이러한 발현 벡터를 포함하는 세포가 또한 포함된다.
여전히 또다른 양태에 있어, 서열번호 2 또는 서열번호 4를 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 분리된 핵산 서열을 포함하는 유전자 이식된 동물이 제시되는데, 여기서 폴리펩타이드는 엔도리보뉴클레아제 활성을 나타낼 수 있는 mRNA 인터페라제 또는 이의 기능성 단편이고, 핵산 서열은 유전자 이식된 동물의 하나 이상의 세포에서 발현된다.
본 발명의 하나의 양태에 있어, 서열번호 2 또는 서열번호 4를 포함하는 분리된 아미노산 서열이 제공되는데, 여기서 아미노산 서열은 엔도리보뉴클레아제 활성을 나타낼 수 있는 mRNA 인터페라제 또는 이의 기능성 단편이다.
또다른 양태에서, 서열번호 2 또는 서열번호 4를 포함하는 분리된 아미노산 서열을 암호화하는 발현 벡터가 제공되는데, 여기서 아미노산 서열은 엔도리보뉴클레아제 활성을 나타낼 수 있는 mRNA 인터페라제 또는 이의 기능성 단편이고, 아미노산 서열의 발현은 당해 발현 벡터내의 조절서열에 의해 제어된다. 이러한 발현 벡터를 포함하는 세포가 또한 본원 발명에 포함된다.
또다른 양태에 있어, 서열번호 2 또는 서열번호 4를 포함하는 분리된 폴리펩타이드를 포함하는 유전자 이식된 동물이 제시되는데, 여기서 폴리펩타이드는 엔도리보뉴클레아제 활성을 나타낼 수 있는 mRNA 인터페라제 또는 이의 기능성 단편이고, 폴리펩타이드는 유전자 이식된 동물의 하나 이상의 세포에서 발현된다.
본 발명은 또한 mRNA 인터페라제 또는 이의 기능성 단편을 암호화하는, 서열번호 1 또는 서열번호 3을 포함하는 분리된 핵산 서열; mRNA 인터페라제 또는 이의 기능성 단편인 서열번호 2 또는 서열번호 4를 포함하는 분리된 아미노산 서열; mRNA 인터페라제 활성 양립성 완충액; 및 지침서를 포함하는 키트를 포함한다.
본 발명은 또한 유전자 치료법에 대한 적용에 있어 본 발명의 mRNA 인터페라제의 용도를 포함한다. 피험체(예: 사람 피험체)에서 결함 또는 결손된 분자를 발현하도록 조작된 세포를 또한 본 발명의 mRNA 인터페라제의 혼입을 통해 자가파괴되도록 디자인할 수 있는데, 이의 발현은 유도성 조절 요소(들)에 의해 제어된다. 유전자 치료법 적용분야에 사용하기 위해 세포의 파괴를 위한 유도성 수단의 혼입은 패일-세이프 기작(fail-safe mechanism)을 제공하게 되고, 이로써 상기 세포는, 이들이 피험체에게 이로운 효과를 부여한 후 및/또는 이들이 해로운 효과를 야기하기 전에 제거될 수 있다.
본 발명의 발견 및 이의 사용 방법을 기술하기 전, 본 발명은 기술된 특정의 검정 방법, 또는 시험 화합물 및 실험 조건에 제한되지 않음을 이해해야 하는데, 그 이유는 이러한 방법 및 화합물이 다양할 수 있기 때문이다. 또한 본원중 사용된 용어는 단지 특정의 양태를 기술할 목적으로 사용된 것으로, 이를 제한할 의도가 아님을 이해해야 하는데, 그 이유는 본 발명의 범위가 첨부된 특허청구의 범위에 의해서만 제한될 것이기 때문이다.
따라서, 본원 명세서 및 특허청구범위에 사용된 용어 "MazF" 또는 "PemK"는 일반적인 계열의 엔도리보뉴클레아제, 및 특정 명칭하의 특정 효소를 모두 일컫는 것으로, 이것과 구조적 및 서열 상동성을 갖는 효소를 포함하는 것으로 의도된다. 마찬가지로, 본 발명에 의해 포괄되는 효소의 계열은 본원중에서 "RNA 인터페라제"로서 지칭되는데, 이는 본 발명자들에 의해 본원에서 동정된 신규한 계열의 효소이다. 더욱이, 본 발명은 본 발명에서 이들의 역할과 일치하는 구조적 및 기능적 유사성을 갖는 분자들까지 확대되는 것으로 의도된다.
또한, 본 명세서 및 특허청구범위에 사용된 용어 "MazE" 또는 "PemI"는 일반적인 계열의 MazE (또는 MazF 조절 분자) 또는 PemI (또는 PemK 조절 분자), 및 이러한 명칭을 갖는 특정의 분자를 모두 일컫는 것으로, 서열번호 6 또는 서열번호 8의 구조 및/또는 이와 서열 상동성을 갖는 MazE (또는 MazF 조절 분자) 또는 PemI (또는 PemK 조절 분자)를 포함하는 것으로 의도된다. 사실상, 본 발명은 본 발명에서 이들의 역할과 일치하는 구조적 및 기능적 유사성을 갖는 분자들까지 확대되는 것으로 의도된다.
세균성 세포 사멸 및 성장 억제는 특정의 스트레스 조건에 대해 반응하여 세균 게놈내 내인성 독소 유전자에 의해 촉발된다. MazF는 세포 사멸을 야기하고, 에스케리키아 콜라이에서 "MazEF 중독 모듈"로 불리우는 오페론에 의해 암호화되는 내인성 독소이다. 본원에 기술된 바와 같이, DNA, RNA 및 단백질 합성에 대한 MazF의 효과는 투과 세포에서 검사되었다. 요약하면, MazF 유도한지 10분 후, ATP-의존성 35S-메티오닌 혼입이 완전히 억제된 반면, [α-32P]dTTP 및 [α-32P]UTP 혼입은 그렇지 못했는데, 이는 MazF가 단백질 합성의 특이적 억제제임을 시사한다. 더구나, 정제된 MazF는 원핵 및 진핵 세포-부재 시스템에서 단백질 합성을 억제하였고, 이러한 억제는 MazE의 존재하에 차단되었다. 슈크로즈 밀도-구배 원심분리에 의해 분석하는 경우, MazF 유도는 70S 리보솜 분획의 동시적 증가와 함께 폴리좀의 형성을 차단하는 한편, 50S 및 30S 리보솜 분획은 MazF의 발현에 의해 영향을 받지 않았다.
주목할 만한 것은, 토프린팅 분석에 의해, MazF가 ACA 서열을 인식하는 서열 특이적 엔도리보뉴클레아제이며 리보솜과는 무관하게 기능하는 것으로 나타났다. 더구나, 노던 블롯 분석은 전체 세포성 mRNA 가 MazF 유도시에 분해되었음을 지시하였다. 본 발명자들은 따라서 MazF가 신규한 계열의 엔도리보뉴클레아제의 최초로 규명된 구성원이며, 세포성 mRNA의 기능을 간섭하는 이들의 능력의 측면에서, 본원에서 이들을 "mRNA 인터페라제"로서 지칭하였다. 본원에 나타난 바와 같이, 인터페라제 기능은 특정 서열(ACA)에서 mRNA 전사체를 절단시키는 것이고, 이로써 신속한 세포 성장 정지 및/또는 세포 사멸이 야기된다. 본원에 입증된 바와 같이, mRNA 인터페라제의 역할은 정상적인 세포 생리 및/또는 스트레스의 조건하에 유도되는 스트레스성 세포 생리에 광범위하게 연루되어 있다.
본 발명자들은 또한 "pemI-pemK 중독 모듈"에 의해 암호화된 독소인 정제된 PemK가 이. 콜라이 세포-부재 시스템에서 단백질 합성을 억제하는 한편, PemK에 대한 항독소인 PemI의 부가로 단백질 합성이 복구된다는 것을 발견하였다. 본원에 기재된 추가의 연구로, PemK가 mRNA를 절단하는 서열-특이적 엔도리보뉴클레아제이며 따라서 단백질 합성을 억제하는 것이 드러났다. PemI는 PemK 매개된 엔도리보뉴클레아제 활성을 차단하고 따라서 단백질 합성을 복구한다. PemK는 우선적으로 "UAX(X는 C, A 또는 U)" 인지 부위내 A 잔기의 5' 또는 3' 측면에서 단지 일본쇄 RNA만을 절단하는 것으로 나타났다. 유도시에, PemK는 세포성 mRNA를 절단하여 이. 콜라이에서 단백질 합성을 효율적으로 차단한다. pemK 동족체는 다양한 범위의 세균의 게놈상에서 동정되었고, 본 발명자들은 본원에서 PemK 및 이의 동족체가 서열-특이적 방식으로 세포성 mRNA를 절단함으로써 mRNA 기능을 간섭하는 신규한 엔도리보뉴클레아제 계열을 형성함을 제안하고 있다.
본 발명의 매개변수를 보다 명확히 설명하기 위하여, 하기 정의를 사용한다:
용어 "핵산 서열을 플랭킹하는" 이란 엔도리보뉴클레아제 절단 부위에 대해 5' 및 3'에 있는 연속적 핵산 서열을 언급한다. 본원 및 첨부된 특허청구범위에 사용된 단수형 "a", "an" 및 "the"는 별도로 명확히 규정짓지 않는 한 복수의 대상도 포함하는 것이다. 따라서, 예를 들면 "당해 방법(the method)"으로 지칭하는 경우 하나 이상의 방법, 및/또는 본원중 기술된 유형의 단계들 및/또는 이러한 기술내용을 읽은 후 당업자에게 명백하게 될 것들을 포함한다.
용어 "엔도뉴클레아제"란 내부적으로 DNA를 절단할 수 있는 효소를 언급한다.
용어 "엔도리보뉴클레아제"란 내부적으로 RNA를 절단할 수 있는 효소를 언급한다.
용어 "상보성"이란 실질적으로 정상의 염기쌍 특성을 나타내는 두개의 DNA 쇄를 언급한다. 하지만 상보성 DNA는 하나 이상의 미스매치를 함유할 수도 있다.
용어 "하이브리드화"란 두개의 상보성 DNA쇄 사이에서 발생하는 수소 결합을 언급한다.
본원중 사용된 용어 "핵산" 또는 "핵산 분자"란 일본쇄 또는 이본쇄일 수 있는 임의의 DNA 또는 RNA를 언급하고, 일본쇄인 경우, 이의 상보성 서열의 분자는 선형 또는 환형일 수 있다. 핵산 분자를 논하는데 있어, 특정 핵산 분자의 서열 또는 구조는 본원에서 5'에서 3' 방향으로 서열을 제공하는 통상적인 기준에 따라 기술될 수 있다. 본 발명의 핵산과 관련하여, 용어 "분리된 핵산"이 때때로 사용된다. 이러한 용어는, DNA에 대해 적용되는 경우, 이것이 유래된 유기체의 천연 발생 게놈내의 바로 연속적인 서열들로부터 분리된 DNA 분자를 언급한다. 예를 들면, "분리된 핵산"이란 플라스미드 또는 바이러스 벡터와 같이, 벡터 내로 삽입된 DNA 분자이거나, 원핵 또는 진핵성 세포 또는 숙주 유기체의 게놈 DNA 내로 통합되는 DNA 분자를 포함할 수 있다.
RNA에 적용되는 경우, 용어 "분리된 핵산"은 주로 상기 정의된 분리된 DNA 분자에 의해 암호화되는 RNA 분자를 언급한다. 달리, 당해 용어는 이것이 천연 상태(예: 세포 또는 조직에서)에서 일반적으로 결합되어 있는 다른 핵산들로부터 충분히 분리된 RNA 분자를 언급할 수 있다. 분리된 핵산(DNA 또는 RNA)은 추가로 생물학적 또는 합성 수단에 의해 직접 생산되고 이의 생산중에 존재하는 다른 성분으로부터 분리되는 분자를 나타낼 수도 있다.
핵산의 특정 서열의 "천연 대립유전자 변이체", "돌연변이체" 및 "유도체"는 특정 서열과 밀접하게 관련되지만, 천연적으로 또는 설계에 의해 서열 또는 구조에 있어 변화를 소지할 수 있는 핵산 서열을 언급한다. "밀접하게 관련된"이라 함은, 약 60% 이상, 종종, 85% 이상의 뉴클레오타이드 서열이 특정의 서열번호를 사용하여 언급되는 핵산 서열의 정의된 길이에 걸쳐 매치함을 의미한다. 밀접하게 관련된 핵산 서열들 사이의 뉴클레오타이드 서열의 변화 또는 차이는, 천연에서 특정의 핵산 서열의 정상적인 복제 또는 복사의 과정동안 발생하는 서열에서의 뉴클레오타이드 변화를 나타낼 수 있다. 다른 변화는 핵산의 조절 영역에서 아미노산 코돈 또는 서열을 변화시키는 것과 같이 특정하게 디자인되고 특정 목적을 위해 서열내로 도입될 수 있다. 이러한 특정의 변화는 시험관내에서 다양한 돌연변이유발 기술을 사용하여 제조하거나 변화를 유도하거나 선택하는 특정의 선택 조건하에 놓인 숙주 유기체내에서 생산될 수 있다. 이러한 특이적으로 생성되는 서열 변이체를 원래 서열의 "돌연변이체" 또는 "변이체"로서 지칭할 수 있다.
특정 서열을 지칭하는 경우 용어 "유사성(%)", "동일성(%)" 및 "상동성(%)"은 유니버시티 오브 위스콘신 GCG 소프트웨어 프로그램에 설명된 바와 같이 사용되며, 당업계에 공지되어 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 MazF 폴리펩타이드 또는 단백질의 활성 부위, 단편, 유도체 및 기능성 또는 비-기능성 모사체를 포함한다. MazF 폴리펩타이드의 "활성 부위"란 전장 MazF 폴리펩타이드 보다는 짧지만 측정가능한 생물학적 활성을 보유하는 펩타이드를 의미한다.
mRNA 인터페라제의 "단편" 또는 "부분"은 적어도 약 5 내지 7개 연속 아미노산의, 종종 적어도 약 7 내지 9개 연속 아미노산, 통상적으로 적어도 9 내지 13개 아미노산 및, 가장 바람직하게는, 적어도 약 20 내지 30개 또는 그 이상의 연속 아미노산으로 이루어진 아미노산 잔기의 스트레치를 의미한다. mRNA 인터페라제의 "유도체" 또는 이의 단편은, 예를 들면 단백질을 암호화하는 핵산의 조작에 의해 또는 단백질 자체를 변화시킴에 의해, 단백질의 아미노산 서열을 변화시킴으로써 변형된 폴리펩타이드를 의미한다. 이러한 천연 아미노산 서열의 유도체는 하나 이상의 아미노산의 삽입, 부가, 결실 또는 치환을 포함할 수 있고, 원래의 mRNA 인터페라제의 본질적 활성은 변화되거나 변화될 수 없다.
mRNA 인터페라제의 상이한 "변이체"는 천연에 존재한다. 이들 변이체는 단백질을 암호화하는 유전자의 뉴클레오타이드 서열에서의 차이로 특징지워지는 대립유전자이거나, 상이한 RNA 프로세싱 또는 해독후 변형과 관련될 수 있다. 당업자는 단일 또는 다수의 아미노산 치환, 결실, 부가 또는 치환을 갖는 변이체를 제조할 수 있다. 이들 변이체는 특히: (a) 하나 이상의 아미노산 서열이 보존적 또는 비-보존적 아미노산으로 치환된 변이체, (b) 하나 이상의 아미노산이 mRNA 인터페라제로 부가된 변이체, (c) 하나 이상의 아미노산이 치환기를 포함하는 변이체, 및 (d) mRNA 인터페라제가 또다른 펩타이드 또는 폴리펩타이드, 즉 융합 파트너, 단백질 태그 또는 기타 화학적 잔기와 융합되어, mRNA 인터페라제에 유용한 특성을 부여할 수 있는, 예를 들면 항체에 대한 에피토프, 폴리히스티딘 서열, 바이오틴 잔기 등이 융합된 변이체를 포함할 수 있다. 본 발명의 기타 mRNA 인터페라제는, 보존 또는 비보존된 위치에서, 하나의 종으로부터의 아미노산 잔기를 다른 종의 상응하는 잔기에 의해 치환시킨 변이체를 포함한다. 또다른 양태에서, 비보존된 위치에서의 아미노산 잔기는 보존된 또는 비보존된 잔기로 치환된다. 유전적(억제, 결실, 돌연변이등), 화학적, 및 효소적 기술을 포함한 이들 변이체를 수득하는 기술은 당업자에게 공지되어 있다.
이같은 대립유전자 변이체, 유사체, 단편, 유도체, 돌연변이체 및 변형체, 또다른 핵산 프로세싱 형태 및 또다른 해독후 변형체가 mRNA 인터페라제의 임의의 생물학적 특성을 보유하는 mRNA 인터페라제의 유도체를 초래하는 범위까지, 이들은 본 발명의 영역내에 포함된다.
본원에 사용된 용어 "상동체" 또는 "동족체"는 폴리펩타이드 산물이 MazF 암호화 서열과 60% 초과의 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 암호화되고/되거나 유전자 산물이 MazF와 유사한 3차원 구조 및/또는 이의 생화학적 활성을 갖는 뉴클레아제를 의미한다. 예시적 상동체/동족체는 바실러스 할로두란스(Bacillus halodurans)(진뱅크 승인번호 NP_244588.1), 스타필로코쿠스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis) (진뱅크 승인번호 AAG23809.1), 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)(진뱅크 승인번호 Nu_372592.1), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)(진뱅크 승인번호 1NE8_A), 나이세리아 메닝기티디스(Neisseria meningitides)(진뱅크 승인번호 NP_266040.1), 모르가넬라 모르가니(Morganella morgani)(진뱅크 승인번호 AAC82516.1) 및 마이코박테륨 튜베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)(진뱅크 승인번호 NP217317.1)의 MazF를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 참조 도 22 및 23. 용어 "상동체" 및 "동족체"는 임의의 종의 MazF 핵산 또는 아미노산 서열의 상동체/동족체를 언급하는데 사용될 수 있다. 이러한 종에는 이. 콜라이, 바실러스 할로두란스, 스타필로코쿠스 에피더미디스, 스타필로코쿠스 아우레우스, 바실러스 서브틸리스, 나이세리아 메닝기티디스, 모르가넬라 모르가니, 마이코박테륨 튜베르쿨로시스, 무스 무스쿨루스(Mus musculus) 및 호모 사피엔스(Homo sapiens)를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 방법에서 이같은 상동체/동족체에 의해 암호화되는 뉴클레아제의 용도는 본원에서 고려된다.
본원중 사용된 용어 "상동체" 또는 "동족체"는 또한 폴리펩타이드 산물이 PemK 암호화 서열과 60% 초과의 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 암호화되고/되거나 유전자 산물이 PemK와 유사한 3차원 구조 및/또는 이의 생화학적 활성을 갖는 뉴클레아제를 의미한다. 용어 "상동체" 및 "동족체"는 임의의 종의 PemK 핵산 또는 아미노산 서열의 상동체/동족체를 언급하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 방법에서 PemK의 동족체 또는 상동체에 의해 암호화되는 뉴클레아제의 사용이 본원중 고려된다. 동족체 및 상동체의 예는 MazF(ChpAK), ChpBK 및 기타 PemK-유사 단백질을 포함하는 PemK 단백질 계열의 73개의 공지된 구성원을 비제한적으로 포함한다. 하기는 웹사이트(http://pfam.wustl.edu/cgi-bin/getdesc?acc=PF02452)에서 발견된 이들 단백질에 대해 지칭된 것들의 목록이다: Q9RX98; Q8F5A3; Q9K6K8; CHPAECOLI; Q7NPF9;Q88TP7; Q7WWW1; Q8YS80; Q8DW95; Q82YR2; Q7X3Y1; Q93S64; Q8PRN1; Q8GFY1; 052205; PEMK_ECOLI Q7N4H2; Q88PS7; Q8XCF2CHPBJ_ECOLI; Q82VU0; Q8UGU5; Q9RWK4; Q9PHH8; Q7TXU4; P71650; Q7U1Y5; P96295; Q9JWF2; Q9JXI1; Q8E882; Q82VB5; Q8KJS3; Q7NMY4; Q9KFF7; P96622; Q81IT4; Q81VF4; Q8ESK5; Q92DC7; Q8Y8LO; Q97LR0; Q8XNN7; Q8R861; Q88Z43; 007123; Q837I9; Q9F7V5; Q8CRQ1; 005341; P95840; Q9FCV0; Q837L1; Q93M89; Q99IU9; Q82UB5; Q93MT8; YJ91_MYCTU; Q97MV8; Q7NHWO; Q7NI95; Q8YML2; Q7NHR3; YE95_MYCTU; Q9PCB9; Q8YZW8; Q7TZ90; P95272; Q8VJR1; Q7UON2; 053450; 006780; 및 Q7U1I8. 참고 도 33 및 34.
스위스-단백질 번호 (이후 NCBI 번호가 따름):
Figure pat00001

본원중 사용된 용어 "상동체" 또는 동족체는 또한 폴리펩타이드 산물이 MazE 암호화 서열과 60% 초과의 동일성을 갖는 핵산에 의해 암호화되고/되거나 유전자 산물이 MazE와 유사한 3차원 구조 및/또는 이의 생화학적 활성을 갖는 뉴클레아제의 결합 파트너(항독소 또는 뉴클레아제의 조절제)를 언급한다. 예시적인 상동체/동족체로는 제한없이, MazE, 데이노코쿠스 라디오두란스(Deinococcus radiodurans)(진뱅크 승인번호: NP_294139); MazE, 바실러스 할로두란스(진뱅크 승인번호 NP_244587); PemI, 플라스미드 R100(진뱅크 승인번호 NP_052993); PemI, 플라스미드 R466b(진뱅크 승인번호 AAC82515); ChpS, 에스케리키아 콜라이(진뱅크 승인번호 NP_290856); MazE, 슈도모나스 푸티다 KT2440(진뱅크 승인번호 NP_742931); MazE, 포토박테리움 프로푼덤(AAG 34554)를 포함한다. 참조 도 24 및 25. 용어 "상동체" 및 "동족체"는 임의의 종의 MazE 핵산 또는 아미노산 서열의 상동체/동족체를 언급하는데 사용될 수 있다. 이러한 종에는 이. 콜라이, 데이노코쿠스 라디오두란스, 바실러스 할로두란스, 슈도모나스 푸티다, 포토박테리움 프로푼덤, 스타필로코쿠스 에피더미디스, 스타필로코쿠스 아우레우스, 나이세리아 메닝기티디스, 모르가넬라 모르가니, 마이코박테륨 튜베르쿨로시스, 무스 무스쿨러스 및 호모 사피엔스를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 방법에서 이러한 상동체/동족체에 의해 암호화되는 뉴클레아제 조절 분자(항독소)의 사용이 본원중에서 고려된다.
본원중 사용된 용어 "상동체" 또는 "동족체"는 또한 폴리펩타이드 산물이 PemI 암호화 서열과 60% 초과의 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 암호화되고/되거나 유전자 산물이 PemI와 유사한 3차원 구조 및/또는 이의 생화학적 활성을 갖는 뉴클레아제의 결합 파트너(항독소 또는 뉴클레아제의 조절제)를 언급한다. PemI의 예시적인 상동체/동족체는, MazE(ChpAI), ChpBI 및 기타 MazE 동족체를 포함하여, MazE(항독소) 단백질 계열의 공지된 구성원을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 용어 "상동체" 및 "동족체"는 임의의 종의 PemI 핵산 또는 아미노산 서열의 상동체/동족체를 언급하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 방법에 있어 이러한 동족체에 의해 암호화되는 뉴클레아제 조절 분자의 사용은 본원중에서 고려된다. 본 발명의 방법에서 이러한 동족체/상동체에 의해 암호화되는 뉴클레아제 조절 분자(항독소)의 사용이 본원중에 고려된다.
본원중 사용된 용어 "기능성"이란 언급된 검정 또는 목적을 위해 핵산 또는 아미노산 서열이 기능성임을 시사한다.
본원중 사용된 용어 "기능성 단편"이란 핵산 또는 아미노산 서열이 전장 폴리펩타이드의 서브도메인 또는 부위이고 언급된 검정 또는 목적을 위해 기능성임을 시사한다.
특정의 뉴클레오타이드 또는 아미노산을 언급하는 경우 어구 "...로 본질적으로 이루어진"이란, 주어진 서열번호의 특성을 갖는 서열을 의미한다. 예를 들면, 아미노산 서열을 참고하여 사용되는 경우, 당해 어구는 서열 자체 및 당해 서열의 기본적 및 신규한 특성에 영향을 끼치지 않는 분자성 변형을 포함한다.
"레플리콘"이란 임의의 유전자 요소, 예를 들면, 대개 자기 자신의 조절하에 복제할 수 있는 플라스미드, 코스미드, 배크미드, 파아지 또는 바이러스이다. 레플리콘은 RNA 또는 DNA일 수 있고 일본쇄 또는 이본쇄일 수 있다.
용어 "벡터"는, 또다른 유전자 서열 또는 요소(DNA 또는 RNA)가 이에 결합되어 결합된 서열 또는 요소의 복제를 초래하는, 플라스미드, 코스미드, 배크미드, 파아지 또는 바이러스와 같은 레플리콘이다.
"발현 벡터" 또는 "발현 오페론"은 프로모터, 인핸서, 해독 개시 시그날(예: ATG 또는 AUG 코돈), 폴리아데닐화 시그날, 터미네이터등과 같은 전사 및 해독 조절 서열을 가질 수 있고, 숙주 세포 또는 유기체내에서 폴리펩타이드 암호화 서열의 발현을 용이하게 할 수 있는 핵산 서열 절편을 의미한다.
본원중 사용된 용어 "작동가능하게 연결된"이란 암호화 서열의 발현을 매개할 수 있으며, 암호화 서열의 발현을 일으키기 위해 암호화 서열에 대해 적절한 위치에서 DNA 분자(예: 발현 벡터)내에 위치한 조절 서열을 언급한다. 이와 동일한 정의는 때로는 발현 벡터내 암호화 서열 및 전사 조절 요소(예: 프로모터, 인핸서 및 종결요소)의 배열에 적용된다. 이러한 정의는 또한 때로는 하이브리드 핵산 분자가 생성되는, 제1 및 제2 핵산 분자의 핵산 서열의 배열에도 적용된다.
본원중 사용된 용어 "올리고뉴클레오타이드"는 본 발명의 프라이머 및 프로브를 지칭하는 것으로, 2개 이상, 바람직하게는 3개 이상의 리보- 또는 데옥시리보뉴클레오타이드로 구성되는 핵산 분자로서 정의된다. 올리고뉴클레오타이드의 정확한 크기는 다양한 인자 및 특정의 적용 그리고 올리고뉴클레오타이드의 용도에 의존할 것이다.
본원중 사용된 용어 "프로브"는 올리고뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산(RNA 또는 DNA)을 언급하며, 정제된 제한 효소 분해물로 천연에서 생성되든지 합성적으로 생산되든지, 당해 프로브와 상보적인 서열을 갖는 핵산과 어닐링하거나 특이적으로 하이브리드화할 수 있다. 프로브는 일본쇄이거나 이본쇄일 수 있다. 프로브의 정확한 길이는 온도, 프로브의 공급원 및 사용 방법을 포함한 다양한 인자에 의존할 것이다. 예를 들면, 진단적 적용에 있어, 표적 서열의 복잡성에 따라, 올리고뉴클레오타이드 프로브는 더 적은 뉴클레오타이드도 함유할 수 있지만, 통상 15 내지 25개 또는 그 이상의 뉴클레오타이드를 함유한다. 본원중 프로브는 특정의 표적 핵산 서열의 상이한 쇄들과 "실질적으로" 상보성이도록 선택된다. 이것은 프로브가 실질적으로 상보적이어서, 예정되어 설계된 조건하에 이들의 각각의 표적 쇄와 "특이적으로 하이브리드화"되거나 어닐링될 수 있어야 함을 의미한다. 따라서, 프로브 서열은 표적의 정확한 상보성 서열을 반영할 필요는 없다. 예를 들면, 프로브의 나머지 서열이 표적쇄와 상보적인 상태에서, 비-상보성 뉴클레오타이드 단편이 프로브의 5' 또는 3' 말단에 부착될 수 있다. 다른 방편으로, 프로브 서열이 표적 핵산의 서열과 충분히 상보적이어서 이들간에 특이적으로 어닐링되는 경우, 비-상보성 염기 또는 보다 긴 서열이 프로브내로 산재될 수 있다.
용어 "특이적으로 하이브리드화한다"는 것은 당업계에서 일반적으로 통용되는 예정된 조건하에서 이러한 하이브리드화가 일어나도록, 충분히 상보성인 서열을 갖는 2개의 일본쇄 핵산 분자들 사이에서 결합함을 의미한다(때로는 "실질적으로 상보성인"으로 일컫는다). 특히, 당해 용어는 본 발명의 일본쇄 DNA 또는 RNA 분자내에 함유된 실질적으로 상보성인 서열과 올리고뉴클레오타이드가, 비-상보성 서열의 일본쇄 핵산을 갖는 올리고뉴클레오타이드의 하이브리드화를 실질적으로 배재하면서 하이브리드화함을 의미한다.
본원중 사용된 용어 "프라이머"는, 일본쇄 또는 이본쇄인, RNA 또는 DNA인 올리고뉴클레오타이드로서, 생물학적 시스템에서 유래되거나, 제한효소 분해로 생성되거나, 또는 합성적으로 생산되며, 적절할 환경하에 놓일 경우 주형의존성 핵산 합성의 개시제로서 기능적으로 작용할 수 있다. 적합한 핵산 주형, 핵산의 적합한 뉴클레오사이드 트리포스페이트 전구체, 폴리머라제 효소, 적합한 조인자, 및 적절한 효소 및 pH와 같은 조건하에 함께 제시되는 경우, 프라이머는 폴리머라제 또는 유사한 활성의 작용에 의해 뉴클레오타이드의 부가에 의해 이의 3'말단에서 연장하여 프라이머 연장 생성물을 산출할 수 있다. 프라이머는 특정 조건 및 적용 필요성에 따라 길이에 있어 다양할 수 있다. 예를 들면, 진단 분야에서, 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 길이가 15 내지 25개 또는 그 이상이다. 프라이머는 목적하는 주형에 충분히 상보적이어서 목적하는 연장 생성물의 합성을 개시할 수 있어야 하고, 즉, 폴리머라제 또는 유사한 효소에 의한 합성의 개시에 사용하기 위해 적절한 병렬위치하에 프라이머의 3' 하이드록실 잔기를 제공하기에 충분한 방식으로, 목적하는 주형 쇄와 어닐링될 수 있어야 한다. 프라이머 서열이 목적하는 주형의 정확한 상보체를 나타낼 필요는 없다. 예를 들면, 비-상보성 뉴클레오타이드 서열은 다른 부분은 상보성인 프라이머의 5' 말단에 부착될 수 있다. 다른 방식으로, 비-상보성 염기는 올리고뉴클레오타이드 프라이머 서열내에 산재될 수 있으며, 단 프라이머 서열은 목적하는 주형 쇄의 서열과 충분히 상보적이어서, 연장 생성물의 합성을 위한 주형-프라이머 복합체를 기능적으로 제공하게 된다.
프라이머는 6-카복시플루오레세인(6-FAM)으로 형광표지될 수 있다. 다른 방식으로 프라이머는 4,7,2',7'-테트라클로로-6-카복시플루오레세인(TET)으로 표지될 수 있다. 기타 또다른 DNA 표지화 방법이 당업계에 공지되어 있고, 본 발명의 영역내에서 고려될 수 있다.
용어 "분리된 단백질" 또는 "분리되고 정제된 단백질"이 본원중 때로는 사용된다. 이러한 용어는 주로 본 발명의 분리된 핵산 분자의 발현에 의해 생산되는 단백질을 의미한다. 달리, 이러한 용어는 천연적으로는 이것이 결합되어 있는 다른 단백질로부터 충분히 분리되어 "실질적으로 순수한" 형태로 존재하게 되는 단백질을 의미한다. "분리된"이란 다른 화합물 또는 물질과의 인공적 또는 합성적 혼합물, 또는 예를 들면, 불완전한 정제, 안정화제의 첨가, 또는 예를 들면 면역원성 제제 또는 약제학적으로 허용되는 제제내로의 혼합으로 인해 존재할 수 있는, 기초적인 활성을 방해하지 않는 불순물의 존재를 배제하는 것을 의미하지 않는다.
용어 "실질적으로 순수한"이란 소정의 물질(예: 핵산, 올리고뉴클레오타이드, 단백질, 등)의 50 내지 60중량% 이상을 포함하는 제제를 의미한다. 보다 바람직하게, 제제는 소정의 화합물 75중량% 이상, 가장 바람직하게는 90 내지 95 중량%를 포함한다. 순도는 소정의 화합물에 대해 적절한 방법으로 측정한다(예: 크로마토그래피 방법, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, HPLC 분석, 등). "성숙한 단백질" 또는 "성숙한 폴리펩타이드"란, 폴리펩타이드 전구체로부터의 가단백분해 프로세싱과 같은 폴리펩타이드의 생성중에 정상적으로 발생하는 임의의 프로세싱 사건후 폴리펩타이드 서열을 갖는 폴리펩타이드를 의미한다. 성숙한 단백질의 서열 또는 경계를 디자인하는데 있어서, 성숙한 단백질 서열의 처음 아미노산을 아미노산 잔기 1로서 지정한다.
용어 '태그', '태그 서열' 또는 '단백질 태그'는 뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드 또는 아미노산, 펩타이드, 또는 단백질 또는 기타 화학물질과 같은 화학적 잔기를 의미하며, 이들은 다른 서열에 부가되는 경우, 특히 서열의 검출 또는 분리와 관련된 방법의 측면에서, 당해 서열에 부가적 유용성을 제공하거나 유용한 특성을 부여하게 된다. 따라서, 예를 들면, 단독중합체 핵산 서열 또는 캡쳐 올리고뉴클레오타이드에 상보성인 핵산 서열은 프라이머 또는 프로브 서열에 부가되어 연장 생성물 또는 하이브리드화된 생성물의 후속적 분리를 용이하게 한다. 단백질 태그의 경우, 히스티딘 잔기(예: 4 내지 8개의 연속적인 히스티딘 잔기)를 단백질의 아미노- 또는 카복시-말단에 부가하여 킬레이팅 금속 크로마토그래피에 의해 단백질 분리를 수월하게 한다. 다른 방편으로, 아미노산 서열, 펩타이드, 단백질 또는, 특이적 항체 분자 또는 기타 물질(예: 플래그 에피토프, c-myc 에피토프, 인플루엔자 A 바이러스 헤마글루티닌 단백질의 횡단막 에피토프, 단백질 A, 셀룰로스 결합 도메인, 칼모듈린 결합 단백질, 말토스 결합 단백질, 키틴 결합 도메인, 글루타티온 S-트랜스퍼라제 등)과 반응성인 결합 결정기를 나타내는 융합 파트너를 단백질에 가해 친화성 또는 면역친화성 크로마토그래피와 같은 절차에 의한 단백질 분리를 수월하게 할 수 있다. 화학적 태그 잔기는 바이오틴과 같은 분자를 포함할 수 있는데, 이는 핵산 또는 단백질에 부가되어 아비딘 시약등과의 상호작용에 의한 분리 또는 검출을 용이하게 한다. 다수의 기타 태그 잔기가 당업계의 숙련인에게 공지되어 있으며 이들에 의해 구상될 수 있고, 이같은 정의의 영역내에서 고려된다.
용어 "형질전환", "형질감염", "형질도입"은 핵산을 세포 또는 숙주 유기체내로 도입하는 임의의 방법 또는 수단을 지칭하는 것으로, 동일한 의미를 전달하기 위해 상호교환적으로 사용될 수 있다. 이러한 방법에는 형질감염, 전기천공, 미세주입, PEG-융합 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
도입된 핵산은 수용체 세포 또는 유기체의 핵산내로 통합(공유결합)될 수 있거나 그렇지 않을 수 있다. 세균, 효모, 식물 및 포유동물 세포에서, 예를 들면, 도입된 핵산은 에피좀 요소로서 또는 플라스미드와 같은 독립적 레플리콘으로서 유지될 수 있다. 달리, 도입된 핵산은 수용체 세포 또는 유기체의 핵산으로 통합되어 당해 세포 또는 유기체내에서 안정적으로 유지되고 추가로 수용체 세포 또는 유기체의 자손 세포 또는 유기체로 전달되거나 유전될 수 있다. 다른 적용분야에 있어서, 도입된 핵산은 수용체 세포 또는 숙주 유기체 내에서 단지 일시적으로만 존재할 수 있다.
"클론" 또는 "클로날 세포 집단"은 단일 세포 또는 유사분열에 의한 공통의 조상으로부터 유래된 세포의 집단이다.
"세포주"는 많은 세대 동안 시험관 내에서 안정적으로 성장할 수 있는 원시 세포 또는 세포 집단의 클론이다.
본 발명의 분자 및 화합물을 함유하는 조성물은 예방적 및/또는 치료적 처치를 위해 투여될 수 있다. 하나의 치료적 적용에 있어서, 예를 들면, 조성물은 이미 과증식성 질환(예: 암)을 앓고 있는 환자에게 당해 질환 및 이의 합병증을 치유하거나 적어도 부분적으로 멈추게 하기에 충분한 양으로 투여한다. 이를 달성하기에 적절한 양은 "치료학적 유효량 또는 용량"으로서 정의된다. 이러한 사용에 유효한 양은 질환의 중증도 및 환자의 체중 및 일반적인 상태에 좌우될 것이다.
본원중 사용된 용어 "암"이란 세포의 비조절된 진행성 증식에 의해 초래되는 조직의 이상 성장을 일컫는다. 본 발명의 방법에 따라 치료될 수 있는 암의 예로는, 육종, 모세포종 및 암종, 즉, 섬유육종, 점액육종, 리포육종, 연골육종, 골원성 육종, 척삭종, 혈관육종, 내피육종, 림프관육종, 림프관내피육종, 윤활막종, 중피종, 어윙 종양, 평활근육종, 횡문근육종, 결장암종, 결장직장암, 위암, 췌장암, 유방암, 수막암종증(절제된 유방 또는 폐암과 가장 보편적으로 관련됨), 난소암, 전립선암, 편평세포암종, 기저세포암종, 선암종, 땀샘암종, 피지선암종, 유두암종, 유두모양샘암종, 낭샘암종, 수질암종, 기관지유래암종, 신장세포 암종, 감암종, 간 전이, 담관암종, 융모막암종, 고환종, 배아암종, 갑상선 암종, 즉 역형성 갑상선암, 윌름종양, 자궁경부암, 정소암, 폐암종, 즉 소세포 폐암종 및 비-소세포 폐암종, 방광암종, 상피암종, 교종, 성상세포암종, 속질모세포종, 두개인두종, 뇌실막세포종, 송과체종, 혈액혈과모세포종, 청각신경종, 희소돌기아교세포종, 수막종, 흑색종, 모세포종 및 망막모세포종을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 방법에 따라서 치료될 수 있는 혈액암의 예로는 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 골수성 백혈병(CML), 급성 림프구 백혈병(ALL), 만성 림프구 백혈병(CLL), 다발성 골수종, 비호지킨 림프종(NHL), 호지킨 질환 및 림프종(HD), 전림프구성 백혈병(PLL) 및 골수이형성증후군(MDS)이 포함된다.
"면역반응"은 기능성 면역계를 갖는 숙주에서 단백질 항원과 같은 항원에 의해 유발되는 임의의 반응을 의미한다. 면역반응은 면역글로불린 또는 항체의 생산을 포함을 포함하는 체액성 면역반응 또는 B 및 T 림프구, 수지상 세포, 대식세포, 항원 제시 세포 등을 포함하는 세포성 면역반응 또는 이들 둘다일 수 있다. 면역반응은 또한 사이토킨, 림포카인 등과 같은 다양한 이펙터 분자의 생산 또는 개량을 포함할 수 있다. 면역반응은 시험관내 및 다양한 세포 또는 동물 시스템에서 측정할 수 있다.
"항체" 또는 "항체 분자"는 특정 항원에 결합하는 항체 및 이의 단편을 포함하는 임의의 면역글로불린이다. 당해 용어에는 폴리클로날, 모노클로날, 키메라 및 이특이적 항체가 포함된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 항체 또는 항체 분자는 온전한 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 면역학적 활성 부분, 예를 들어, 당업계에서 Fab, Fab', F(ab')2 및 F(v)로서 공지된 부분들 둘다를 의도한다.
"세포성 기질"이란 용어는 효소 또는 관련 효소의 계열의 효소적 표적인 세포내 분자를 의미한다. mRNA 인터페라제와 관련하여 "세포성 기질"은 내인성 또는 외인성 핵산 서열로부터 발현되는, 세포내 폴리리보뉴클레오타이드를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "엔도리보뉴클레아제 활성을 촉진하는 조건하에"란 어구는 본 발명의 mRNA 인터페라제가 엔도리보뉴클레아제 활성을 나타내는 세포내(세포 배양물 또는 생체내) 또는 시험관내(시험관 또는 기타 유사 용기내)의 임의의 조건을 포함한다. 이러한 조건은 본원에서 제시하는 실시예에서 기술되어 있다. 유사하게, "mRNA 인터페라제 양립성 완충액"은 본 발명의 mRNA 인터페라제가 엔도리보뉴클레아제 활성을 나타내는 완충액이다.
본원에서 사용되는 "mRNA 인터페라제 조절제"란 용어는 mRNA 인터페라제의 엔도리보뉴클레아제 활성을 조절할 수 있는(예를 들어, 증가시키거나 감소시킬 수 있는) 제제를 의미한다. 이러한 제제의 스크리닝/동정 방법은 하기에 제시한다. 예시적 내인성 mRNA 인터페라제 조절제는 MazE(MazF 활성을 억제함) 및 PemI(PemK 활성을 억제함)을 포함한다. 각각 MazF 및 PemK 활성을 억제할 수 있는 MazE 및 PemI의 기능성 단편도 또한 본원에서 기술된다.
달리 정의하지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 분야의 숙련가에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 비록 본원에서 기술하는 바와 유사하거나 등가인 어떠한 방법 및 물질이라도 본 발명의 실시 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 본원에서는 바람직한 방법 및 물질들을 기술한다. 문헌들과 관련하여 방법 및/또는 물질들을 개시하고 기술하기 위해 본원에서 언급되고 참조로 도입되는 모든 문헌들이 인용된다.
I. mRNA 인터페라제-암호화 핵산 분자 및 mRNA 인터페라제의 제조
핵산 분자. 본 발명의 엔도리보뉴클레아제(예: MazF 또는 PemK)를 암호화하는 핵산 분자는 2가지 일반적 방법으로 제조할 수 있다: (1) 적절한 뉴클레오타이드 트리포스페이트로부터의 합성; 또는 (2) 생물학적 공급원으로부터의 분리. 두 방법 모두 당업계에 익히 공지된 프로토콜을 사용한다.
서열번호 1 또는 3의 전체길이 cDNA(도 20a 및 31A)와 같은 뉴클레오타이드 서열 정보의 입수가능성은 올리고뉴클레오타이드 합성에 의한 본 발명의 분리된 핵산 분자를 제조할 수 있도록 한다. 합성 올리고뉴클레오타이드는 어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems) 380A DNA 합성기 또는 유사 장치에서 사용되는 포스포르아미디트 방법으로 제조할 수 있다. 수득된 작제물은 당업계에 공지된 방법, 예를 들어, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 따라서 정제할 수 있다. 본 발명의 DNA 분자와 같은 긴 이본쇄 폴리뉴클레오타이드는 통상의 올리고뉴클레오타이드 합성 방법 고유의 크기 제한으로 인해서 단계별로 합성해야만 한다. 이어서, 이러한 수단으로 작제된 합성 DNA 분자를 적절한 벡터에서 클로닝하여 증폭시킬 수 있다. mRNA 인터페라제를 암호화하는 핵산 서열을 당업계에 공지된 방법을 사용하여 적절한 생물학적 공급원으로부터 분리할 수 있다. 바람직한 양태에서, cDNA 클론은 세균 기원의 cDNA 발현 라이브러리로부터 분리된다. 대안적 양태에서는, cDNA 서열에 의해 제공된 서열 정보를 사용하여, mRNA 인터페라제를 암호화하는 게놈 클론을 분리할 수 있다. 대안으로, mRNA 인터페라제에 대한 상동성을 갖는 cDNA 또는 게놈 클론을 mRNA 인터페라제 유전자내의 예정된 서열에 상응하는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용하여 다른 종로부터 분리할 수 있다.
본 발명에 따라서, 서열번호 1 또는 3의 단백질 암호화 영역과 적절한 수준의 서열 상동성을 갖는 핵산을 적절한 엄격성의 하이브리드화 및 세척 조건을 사용함으로써 동정할 수 있다. 예를 들어, 하이브리드화는 5 X SSC, 5 X 덴하르트 시약, 0.5 내지 1.0% SDS, 100㎍/ml 변성된, 단편화된 연어 정자 DNA, 0.05% 인산나트륨 및 50% 이하의 포름아미드를 포함하는 하이브리드화 용액을 사용하여 수행할 수 있다. 하이브리드화는 일반적으로 37 내지 42℃에서 6시간 이상 수행된다. 하이브리드화 후, 매 30분마다 용액을 교체하면서 필터를 다음과 같이 세척한다: (1) 실온에서 2 X SSC 및 0.5 내지 1% SDS에서 5분; (2) 실온에서 2 X SSC 및 0.1% SDS에서 15분; (3) 37℃에서 1 X SSC 및 1% SDS에서 30분 내지 1시간; (4) 42 내지 65℃에서 1 X SSC 및 1% SDS에서 2시간.
규정된 서열 상동성의 핵산 분자 간의 하이브리드화를 달성하는데 요구되는 엄격성 조건을 계산하기 위한 한가지 일반적 수학식은 다음과 같다[참조: Sambrook et al., 1989]:
Tm= 81.5℃ 16.6Log[Na+]+0.41(% G+C)-0.63(% 포름아미드)-600/이중체내 bp 수
상기한 수학식의 예시로서, [Na+]=[0.368] 및 50% 포름아미드와 42%의 GC 함량 및 200개 염기의 평균 프로브 크기를 사용한 경우, Tm은 57℃이다. DNA 이중체의 Tm은 상동성이 1% 감소할때마다 1 내지 1.5℃씩 감소한다. 따라서, 42℃의 하이브리드화 온도를 사용한 경우 약 75% 초과의 서열 상동성을 갖는 표적이 관찰될 수 있다. 이러한 서열은 본 발명의 핵산 서열과 실질적으로 상동인 것으로 고려될 것이다.
상기에서 알수 있는 바와 같이, 하이브리드화 및 세척의 엄격성은 주로 용액의 염 농도 및 온도에 따라 좌우된다. 일반적으로 두 핵산 분자의 어닐링 속도를 최대화하기 위해, 하이브리드화는 일반적으로 하이브리드의 계산된 Tm 이하인 20 내지 25℃에서 수행한다. 세척 조건은 표적에 대한 프로브의 동일성 정도를 위해 가능한 엄격해야 한다. 일반적으로, 세척 조건은 하이브리드의 Tm 이하인 약 12 내지 20℃가 되도록 선택한다. 본 발명의 핵산과 관련하여, 중간정도의 엄격성 하이브리드화는 42℃에서 6 X SSC, 5 X 덴하르트 용액, 0.5% SDS 및 100㎍/ml 변성된 연어 정자 DNA에서의 하이브리드화 및 55℃에서 15분 동안 2 X SSC 및 0.5% SDS에서의 세척으로서 정의된다. 높은 엄격성 하이브리드화는 42℃에서 6 X SSC, 5 X 덴하르트 용액, 0.5% SDS 및 100㎍/ml 변성된 연어 정자 DNA에서의 하이브리드화 및 65℃에서 15분 동안 2 X SSC 및 0.5% SDS에서의 세척으로서 정의된다. 매우 높은 엄격성 하이브리드화는 42℃에서 6 X SSC, 5 X 덴하르트 용액, 0.5% SDS 및 100㎍/ml 변성된 연어 정자 DNA에서의 하이브리드화 및 65℃에서 15분 동안 0.1 X SSC 및 0.5% SDS에서의 세척으로서 정의된다.
본 발명의 핵산은 임의의 편리한 클로닝 벡터내에서 DNA로서 유지될 수 있다. 바람직한 양태에서, 클론은 적합한 이. 콜라이 숙주에서 증식되는 pBluescript(제조원: Stratagene, La Jolla, Calif.)와 같은 플라스미드 클로닝/발현 벡터내에서 유지된다. mRNA 인터페라제 유전자를 암호화하는 본 발명의 게놈 클론은 람다 파지 FIX II(제조원: Stratagene)에서 유지될 수 있다.
본 발명의 mRNA 인터페라제-암호화 핵산 분자는 cDNA, 게놈 DNA, RNA 및 일본쇄 또는 이본쇄일 수 있는 이들의 단편을 포함한다. 따라서, 본 발명은 서열번호 1 또는 3의 cDNA의 선택된 단편과 같은 본 발명의 핵산 분자의 하나 이상의 서열과 하이브리드화할 수 있는 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드(DNA 또는 RNA의 센스 또는 안티센스 쇄)를 제공한다. 이러한 올리고뉴클레오타이드는 mRNA 인터페라제 유전자를 검출하거나 분리하기 위한 프로브로서 유용하다.
당업자는, 이들 서열의 변이체(예: 대립유전자 변이체)가 세균 집단 및/또는 종에 존재하고 본 발명의 올리고뉴클레오타이드를 고안 및/또는 사용하는 경우에 고려되어야 함을 인지할 것이다. 따라서, 본 발명의 범주내에는 본원에서 기술하는 mRNA 인터페라제 서열, 또는 각각의 유전자 RNA 전사체상의 특정 위치로 표적화되는 올리고뉴클레오타이드와 관련하여 이러한 변이체가 포함된다. 이러한 변이체의 포함과 관련하여, "천연 대립유전자 변이체"란 용어는 본원에서 소정의 DNA 집단에서 발생할 수 있는 다양한 특이적 뉴클레오타이드 서열 및 이의 변이체를 지칭하기 위해 사용된다. 암호화된 단백질내에서 보존적 또는 중성 아미노산 치환을 일으키는 유전적 다형태가 이러한 변체의 예이다. 또한, "실질적으로 상보성인"은 표적 서열과 완벽하게 매치될 수 없지만 미스 매치가 상기한 조건하에 올리고뉴클레오타이드가 이의 표적 서열과 하이브리드화하는 능력에 크게 영향을 미치지 않는 올리고뉴클레오타이드 서열을 의미한다.
따라서, 암호화 서열은 예를 들어, 서열번호 1 또는 3에 제시한 것일 수 있거나, 이들 서열 중 어느 하나의 돌연변이체, 변이체, 유도체 또는 대립유전자일 수 있다. 서열은 제시한 서열의 하나 이상의 뉴클레오타이드의 첨가, 삽입, 결실 및 치환 중 하나 이상인 변화에 의해서 제시한 것과 상이할 수 있다. 뉴클레오타이드 서열의 변화는 유전자 코드로 측정되는 바에 따르면 단백질 수준에서의 아미노산 변화를 야기할 수 있거나, 야기하지 않을 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 핵산은 서열번호 1 또는 3에 제시한 서열과 상이하지만 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 서열을 포함할 수 있다.
반면에, 암호화된 폴리펩타이드는 서열번호 2 또는 4에 제시한 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 서열을 포함할 수 있다(도 20b 및 31b 참조). 서열번호 2 또는 4에 제시한 서열의 아미노산 서열 돌연변이체, 변이체, 유도체 또는 대립유전자인 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산이 본 발명에 의해 추가로 제공된다. 이러한 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 서열번호 1 또는 3에 제시한 암호화 서열과 60% 초과의 동일성, 약 70% 초과의 동일성, 약 80% 초과의 동일성, 약 90% 초과의 동일성 또는 약 95% 초과의 동일성을 나타낼 수 있다.
본 발명은 관심대상의 핵산을 수득하는 방법, 즉 서열번호 1 또는 3에 제시한 서열 또는 이에 상보적인 서열의 일부 또는 모두를 갖는 프로브의 표적 핵산에 대한 하이브리드화를 포함하는 방법을 제공한다. 성공적 하이브리드화는 프로브에 하이브리드화하는 핵산을 분리할 수 있게 하며, 여기에는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 증폭의 하나 이상의 단계가 관여할 수 있다.
이러한 올리고뉴클레오타이드 프로브 또는 프라이머 뿐만 아니라 전체길이 서열(및 돌연변이체, 대립유전자, 변이체 및 유도체)은 mRNA 인터페라제의 대립유전자, 돌연변이체 또는 변이체, 시험할 세포, 조직 또는 유기체로부터 수득된 샘플로부터의 표적 서열과 하이브리드화하는 프로브의 존재에 대해 핵산을 함유하는 시험 샘플을 스크리닝하는데 유용하다. 하이브리드화 조건은 비특이적 결합을 최소화하도록 조절할 수 있다. 바람직하게는, 엄격한 내지 중간정도로 엄격한 하이브리드화 조건이 사용된다. 당업자는 문헌[참조: Sambrook et al (1989) 및 Ausubel et al (1992)]과 같은 교과서를 보조로 하여 이러한 프로브를 용이하게 고안하고, 이를 표지하고, 하이브리드화 반응에 적합한 조건을 계획할 수 있다.
일부 바람직한 양태에서, 서열번호 1 또는 3에 제시한 서열 또는 엔도리보뉴클레아제 활성을 갖는 임의의 대립유전자의 단편인 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드는 길이가 약 10개 뉴클레오타이드 이상, 보다 바람직하게는 15개 뉴클레오타이드 이상, 보다 바람직하게는 약 20개 뉴클레오타이드 이상이다. 이러한 단편 자체는 개별적으로 본 발명의 측면을 대표한다. 단편 및 다른 올리고뉴클레오타이드는 논의되는 바와 같은 프라이머 또는 프로브로서 사용될 수 있지만, mRNA 인터페라제의 동족체 또는 상동체를 암호화하는 서열이 시험 샘플내에 존재하는지를 결정하는 것과 관련된 방법으로 (예를 들어, PCR에 의해) 제조할 수도 있다.
B. 단백질
MazF는 특정 핵산 서열(즉, ACA)에서 높은 특이성으로 RNA를 절단하는 것으로 동정된 최초의 뉴클레아제이다. PemK는 특정 핵산 서열(즉, UAX, 여기서 X는 C, A 또는 U이다)에서 높은 특이성으로 RNA를 절단하는 것으로 동정된 최초의 뉴클레아제이다. 본 발명의 전체 길이 mRNA 인터페라제 단백질(예: MazF 또는 PemK)은 공지된 방법에 따라서 다양한 방식으로 제조될 수 있다. 당해 단백질은 적절한 공급원으로부터 정제될 수 있다. 그러나, 언제라도 소정의 세포 유형중에서 존재할 수 있는 단백질이 양이 적기 때문에 이는 바람직한 방법이 아니다. MazF 및 PemK를 암호화하는 핵산 분자의 입수가능성은 당업계에 공지된 시험관내 발현 방법을 사용하여 이들 단백질 중 어느 것이라도 제조할 수 있도록 한다. 예를 들어, cDNA 또는 유전자를 시험관내 전사를 위해 pSP64 또는 pSP65와 같은 적절한 시험관내 전사 벡터내로 클로닝한 다음, 밀 배아 또는 토끼 망상적혈구와 같은 적합한 세포 부재 해독 시스템에서 세포 부재 해독시킨다. 시험관내 전사 및 해독 시스템은 예를 들어, Promega Biotech(위스콘신주 매디슨 소재) 또는 BRL(메릴랜드주 로크빌 소재)로부터 시판되고 있다.
대안으로, 바람직한 양태에 따라서, 보다 다량의 mRNA 인터페라제를 적합한 원핵세포 또는 진핵세포 시스템에서 발현시켜 제조할 수 있다. 예를 들어, 서열번호 1 또는 3의 cDNA와 같은 DNA 분자의 일부분 또는 모두를 이. 콜라이와 같은 세균 세포에서의 발현용으로 적합화된 플라스미드 벡터에 삽입시킬 수 있다. 이러한 벡터는 숙주 세포에서의 DNA 발현을 허용하도록 위치된, 숙주 세포(예: 이. 콜라이)내 DNA 발현을 위해 필수적인 조절 요소를 포함한다. 발현을 위해 필요한 이러한 조절 요소는 프로모터 서열, 전사 개시 서열 및 임의로 인핸서 서열을 포함한다.
재조합 원핵세포 또는 진핵세포 시스템에서 유전자 발현으로 생산된 mRNA 인터페라제는 당업계에 공지된 방법에 따라서 정제될 수 있다. 바람직한 양태에서, 재조합 단백질을 발현시키고 이어서 주위 배지로부터 용이하게 정제되도록 숙주 세포로부터 분비시키는 시판되는 발현/분비 시스템을 사용할 수 있다. 발현/분비 시스템을 사용하지 않는 경우, 대안적 접근법은 N-말단 또는 C-말단에서 6 내지 8개 히스티딘 잔기로 태그된 재조합 단백질의 분리를 위해 재조합 단백질 또는 니켈 컬럼에 특이적으로 결합하는 항체와의 면역학적 상호작용과 같은 친화성 분리에 의해 재조합 단백질을 정제함을 포함한다. 대안적 태그는 FLAG 에피토프 또는 헤마글루티닌 에피토프를 포함할 수 있다. 이러한 방법들은 당업자에 의해 통상적으로 사용된다.
상기한 방법들로 제조된, 본 발명의 mRNA 인터페라제는 표준 과정에 따라서 분석할 수 있다. 예를 들어, 이러한 단백질을 공지된 방법에 따라서 아미노산 서열 분석에 적용시킬 수 있다.
아미노산 서열 변이체, 대립유전자, 유도체 또는 돌연변이체인 폴리펩타이드가 본 발명에 의해서 또한 제공된다. 변이체, 대립유전자, 유도체 또는 돌연변이체인 폴리펩타이드는 하나 이상의 아미노산의 첨가, 치환, 결실 및 삽입 중 하나 이상에 의해 서열번호 2에 제시한 서열과 상이한 아미노산 서열을 가질 수 있다. 이러한 바람직한 폴리펩타이드는 MazF 작용을 갖는데, 즉 다음 특성 중 하나 이상을 갖는다: RNA내 ACA 서열을 절단하는 능력; 서열번호 2에 제시한 서열에 대한 폴리펩타이드와 반응성인 항체와의 면역학적 교차 반응성; 서열번호 2에 제시한 서열에 대한 폴리펩타이드와 에피토프를 공유하는 능력(예를 들어, 두 폴리펩타이드 간의 면역학적 교차 반응성으로 측정됨).
대안으로, 변이체, 대립유전자, 유도체 또는 돌연변이체인 폴리펩타이드는 하나 이상의 아미노산의 첨가, 치환, 결실 및 삽입 중 하나 이상에 의해 서열번호 4에 제시한 서열과 상이한 아미노산 서열을 가질 수 있다. 이러한 바람직한 폴리펩타이드는 PemK 작용을 갖는데, 즉 다음 특성 중 하나 이상을 갖는다: RNA내 UAX 서열(여기서, X는 C, A 또는 U이다)을 절단하는 능력; 서열번호 4에 제시한 서열에 대한 폴리펩타이드와 반응성인 항체와의 면역학적 교차 반응성; 서열번호 4에 제시한 서열에 대한 폴리펩타이드와 에피토프를 공유하는 능력(예를 들어, 두 폴리펩타이드 간의 면역학적 교차 반응성으로 측정됨).
서열번호 2 또는 4에 제시한 아미노산 서열의 아미노산 서열 변이체, 대립유전자, 유도체 또는 돌연변이체인 폴리펩타이드는 제시한 서열과 약 35% 초과, 약 40% 초과, 약 50% 초과, 약 60% 초과, 약 70% 초과, 약 80% 초과, 약 90% 초과 또는 약 95% 초과의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 특정한 아미노산 서열 변이체는 1개 아미노산, 2, 3, 4, 5 내지 10개, 10 내지 20개, 20 내지 30개, 30 내지 40개, 40 내지 50개, 50 내지 100개, 100 내지 150개 또는 150개 이상의 아미노산의 삽입, 첨가, 치환 또는 결실에 의해 서열번호 2 또는 4에 제시한 서열과 상이할 수 있다. 아미노산 "상동성"의 경우, 이는 (예를 들어, 알고리즘 GAP(제조원: Genetics Computer Group, 위스콘신주 매디슨 소재)을 사용하여 측정한 바와 같은 확립된 아미노산 유사성 원리에 따라서) 동일성 또는 유사성인 것으로 이해될 수 있다. GAP는 매치(match)의 수를 최대화하고 갭(gap)의 수를 최소화하는 2개의 완전한 서열을 정렬하는 Needleman 및 Wunsch 알고리즘을 사용한다. 일반적으로, 갭 생성 페널티=12 및 갭 확장 패널티=4로 하는 데폴트 파라미터가 사용된다. GAP의 사용이 바람직할 수 있지만, 일반적으로 데폴트 파라미터를 사용하는 BLAST[참조: Altschul et al. (1990 J. Mol. Biol. 215:405- 410]; FASTA[참조: Pearson and Lipman (1998) PNAS USA 85:2444-2448] 또는 Smith Waterman 알고리즘[참조: Smith and Waterman (1981) J. Mol. Biol. 147: 195-197]을 포함하는 다른 알고리즘이 사용될 수 있다. 본원에서 "상동성" 또는 "상동"이란 용어의 사용은 비교되는 서열들 간의 어떠한 필요한 진화적 관계를 의미하지 않는다. 상기 용어들은 "상동 재조합"과 유사하게 사용되며, 즉, 상기 용어들은 단지 2개의 뉴클레오타이드 서열이 적절한 조건하에 재조합될 정도로 충분히 유사한 것을 요구된다.
본 발명에 따른 폴리펩타이드는 이의 활성 또는 작용에 영향을 미치거나 조절하는 분자를 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 이러한 분자는 조사 목적상 유용할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 단백질에 면역특이적으로 결합할 수 있는 항체를제공한다. mRNA 인터페라제(예: MazF 또는 PemK)에 대해 지시된 폴리클로날 항체는 표준 방법에 따라 제조될 수 있다. 바람직한 양태에서, mRNA 인터페라제의 다양한 에피토프와 면역특이적으로 반응하는 모노클로날 항체가 제조된다. 모노클로날 항체는 표준 프로토콜 후에 콜러(Kohler) 및 밀스타인(Milstein)의 일반적 방법에 따라서 제조될 수 있다. mRNA 인터페라제와 면역특이적으로 상호작용하는 폴리클로날 및 모노클로날 항체는 이러한 단백질을 동정 및 정제하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 항체는 이들이 면역특이적으로 상호작용하는 단백질의 친화성 분리를 위해 사용될 수 있다. 항체는 또한 단백질과 다른 생물학적 분자의 혼합물을 함유하는 샘플로부터 단백질을 면역침전시키는데도 사용될 수 있다. 항-mRNA 인터페라제 항체의 다른 용도는 하기에 기술한다.
본 발명에 따른 항체는 수많은 방식으로 변형될 수 있다. 실제로, "항체"란 용어는 요구되는 특이성을 갖는 결합 도메인을 갖는 모든 결합 물질을 포함하여 해석되어야 한다. 따라서, 본 발명은 합성 분자 및 그 모양이 항원 또는 에피토프에 결합하도록 하는 항체의 모양을 모사하는 분자를 포함하여 항체 단편, 유도체, 항체의 기능성 등가물 및 동족체를 포함한다.
항원 또는 다른 결합 파트너와 결합할 수 있는 예시적 항체 단편은 VL, VH, C1 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fab 단편; VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; 항체의 단일 암(arm)의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편; 분리된 CDR 영역 및 F(ab')2 단편들, 힌지(hinge) 영역에서 이황화 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편들을 포함하는 이가 단편이다. 일본쇄 Fv 단편이 또한 포함된다.
II. mRNA 인터페라제-암호화 핵산, mRNA 인터페라제 및 이에 대한 항체의 용도
MazF 및 PemK는 예를 들어, 세포, 조직 또는 유기체에서 단백질 합성을 감소시키거나 억제하는데 유리하게 사용될 수 있는 RNA 엔도뉴클레아제이다. 게다가, 본 발명의 mRNA 인터페라제는 피험체내 특정 조직 또는 조직들로 특이적으로 표적화되어 표적화된 조직(들)에서의 단백질 합성을 특이적으로 감소시키거나 억제할 수 있다. 일부 적용의 경우, MazF에 의한 핵산내부분해적 절단을 위해 특정 RNA 전사체를 표적화하는 것이 유리하다. 이러한 서열은 ACA 서열의 상승된 빈도를 포함하고 따라서 MazF 활성에 대한 천연의 바람직한 표적이 된다. 대안으로, RNA 전사체는 절단에 대해 표적화된 전사체(들)에 특이적으로 또는 우선적으로 결합하고/하거나 절단하도록 MazF 폴리펩타이드를 변경시킴으로써 MazF 절단에 대해 표적화될 수 있다. 대안으로, PemK에 의한 핵산내부분해적 절단을 위해 특이적 RNA 전사체를 표적화하는 것이 유리할 수 있다. 이러한 서열은 UAX 서열(여기서, X는 C, A, U이다)의 상승된 빈도를 포함하고 따라서 PemK 활성에 대한 천연의 바람직한 표적이 된다. 대안으로, RNA 전사체는 절단에 대해 표적화된 전사체(들)에 특이적으로 또는 우선적으로 결합하고/하거나 절단하도록 PemK 폴리펩타이드를 변경시킴으로써 MazF 절단에 대해 표적화될 수 있다.
구체적으로는, 본 발명의 mRNA 인터페라제 분자(예: MazF 및 PemK) 및 조성물은 과증식성 질환 환자를 치료하는데 유리하게 사용될 수 있다. 이러한 질환으로는, 제한없이, 상이한 조직의 이형성증 및 화생, 염증 상태, 자가면역 질환, 과증식성 피부 질환, 건선, 알레르기/천식, 아테롬성경화증, 혈관성형술 후 재협착증 및 암이 포함된다. 본 발명의 mRNA 인터페라제 분자(예: MazF 및 PemK) 및 조성물은 또한 세균성 감염 환자를 치료하는데 유리하게 사용될 수 있다.
추가로, 본 발명에 따른 mRNA 인터페라제 핵산, 단백질 및 이에 대한 항체는 RNA 인식 및 절단 반응에 깊이 관여하는 다른 단백질을 동정하기 위한 조사 도구로서 유용할 수 있다.
A. mRNA 인터페라제를 암호화하는 핵산
MazF- 및 PemK-암호화 핵산은 본 발명에 따른 다양한 목적을 위해 사용될 수 있다. MazF- 및 PemK-암호화 DNA, RNA 또는 이의 단편은 MazF-유사 및 PemK-유사 단백질을 암호화하는 유전자의 존재 및/또는 발현을 검출하기 위한 프로브로서 사용될 수 있다. MazF- 및 PemK-암호화 핵산이 이러한 분석법을 위한 프로브로서 사용될 수 있는 방법으로는, 제한없이, (1) 원위치(in situ) 하이브리드화; (2) 서던 하이브리드화; (3) 노던 하이브리드화; 및 (4) PCR와 같은 분류된 증폭 반응이 포함된다.
본 발명의 mRNA 인터페라제-암호화 핵산은 다른 세균, 식물 또는 동물 종으로부터의 관련 유전자를 동정하기 위한 프로브로서 사용될 수도 있다. 당업계에 익히 공지되어 있는 바와 같이, 하이브리드화 엄격성은 핵산 프로브가 다양한 상동성 정도의 상보적 서열과 하이브리드화할 수 있도록 조절될 수 있다. 따라서, MazF- 및 PemK-암호화 핵산은 MazF 및/또는 PemK에 대한 다양한 관련성 정도의 다른 유전자를 동정하고 특성화하는데 유리하게 사용되어, RNA 분해 시스템을 추가로 특성화할 수 있도록 한다. 또한, 당해 핵산은 MazF 및/또는 PemK과 상호작용하는 단백질을 암호하하는 유전자를 (예를 들어, "상호작용 트랩(trap)" 기법에 의해) 동정하는데 사용될 수 있으며, 이는 RNA 절단에 관여하는 성분의 동정을 보다 가속화시킨다.
MazF 또는 PemK를 암호화하는 핵산 분자 또는 이의 단편은 또한 MazF 또는 PemK의 생산을 조절하는데 사용되어, RNA 절단 반응에 참여할 수 있는 단백질의 양을 조절할 수 있다. MazF 또는 PemK 단백질의 생리학적 양의 변경은 RNA 절단에 관여하는 다른 단백질 인자의 활성에 급격하게 영향을 줄 수 있다.
B. mRNA 인터페라제 및 이에 대한 항체.
본 발명의 MazF 또는 PemK 암호화 핵산의 발현을 통해 생산된, 분리된 MazF 또는 PemK 단백질 또는 이들의 단편과 같은 정제된 mRNA 인터페라제는 세균 세포내의 MazF(또는 MazF를 함유하는 복합체) 또는 PemK(또는 PemK를 함유하는 복합체)의 존재 및 축적에 대한 민감성 검출 시약으로서 사용될 수 있는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체를 제조하는데 사용될 수 있다. 재조합 기법은 MazF 또는 PemK 단백질의 일부분 또는 모두를 함유하는 융합 단백질의 발현을 가능하게 한다. 전체길이 단백질 또는 이 단백질의 단편은 단백질의 다양한 에피토프에 특이적인 모노클로날 항체의 정렬을 생성시키는데 유리하게 사용되어 세포내 단백질의 검출에 대한 보다 큰 민감성을 제공할 수 있다.
mRNA 인터페라제(예: MazF 또는 PemK)에 면역학적으로 특이적인 폴리클로날 또는 모노클로날 항체는 단백질을 검출하고 정량하기 위해 고안된 다양한 분석법에서 사용될 수 있다. 이러한 분석법으로는, 제한없이, (1) 유세포측정 분석; (2) 예를 들어, 세균 세포내 mRNA 인터페라제의 면역화학적 국소화; 및 (3) 다양한 세포 유래 추출물의 면역블롯 분석(예: 돗트 블롯, 웨스턴 블롯)이 포함된다. 또한, 상기한 바와 같이, 예를 들어, 항-MazF 및 항-PemK 항체는 MazF 및 이의 상동체 또는 PemK 및 이의 상동체의 정제(예: 친화성 컬럼 정제, 면역침전)를 위해 사용될 수 있다.
MazF 또는 PemK 단백질과 같은 mRNA 인터페라제는 또한 상기 논의한 바와 같은 세포, 조직 또는 유기체에서의 단백질 합성을 감소시키거나 억제하는데 유리하게 사용될 수 있다.
상기 논의로부터, 본 발명의 mRNA 인터페라제-암호화 핵산, mRNA 인터페라제 발현 벡터 및 항-mRNA 인터페라제 항체를 RNA 절단에 관여하는 유전자 및 단백질 상호작용을 평가하고자 하는 목적으로 사용하여 다량의 mRNA 인터페라제 단백질을 제조하고, mRNA 인터페라제 유전자 발현을 검출하며, mRNA 인터페라제 축적을 변경시킬 수 있다.
본 발명자들은, 놀랍게도, 세균으로부터 유래된 안정한 독소 MazF가 엔도리보뉴클레아제라는 것을 발견하였다. 본원에서 기술하는 바와 같이, MazF는 "RNA 인터페라제"라 불리는 신규한 효소 계열의 최초 구성원으로 지정되었다. 또한, MazF가 당해 "RNA 인터페라제"의 신규 계열의 좋은 예가 될 것으로 예상된다. 주목할 점은, 본 발명의 발견 이전에 MazF의 세포성 표적(들)이 동정된 바 없다는 점이다 본원에서 제시하는 바와 같이, MazF는 ACA 부위에서 세포성 mRNA를 절단하는 고도로 서열-특이적인 엔도리보뉴클레아제로서 작용을 한다. 이러한 활성은 세포내 단백질 합성의 부분적 또는 전체적 억제를 일으킬 수 있다. RNA 전사체내 ACA 서열의 예측된 빈도는, 4개의 뉴클레오타드 중 어느 하나가 3개의 뉴클레오타이드 위치 중 각각의 하나에 도입될 수 있다는 동일 확률로 예측되는 표준 계산에 근거하여 1/64이다. 일부 RNA 전사체는 예측되는 빈도에 비교하여 보다 낮은 또는 높은 빈도의 ACA 서열을 포함함이 이해될 것이다. 따라서, MazF 엔도리보뉴클레아제에 의한 절단에 대한 특이적 RNA 전사체 또는 관련 RNA 전사체의 계열의 민감성은 전사체내 ACA 서열 또는 MazF 표적 서열의 빈도에 의존한다. 또한, 당업자라면 RNA 전사체의 서열에 근거하여 MazE 매개된 절단에 대한 전사체의 민감성을 예측할 수 있다.
본 발명자들은 PemK가 "RNA 인터페라제"로서 본원에서 지정된 신규한 효소 계열의 구성원이라는 것을 또한 발견하였다. 본원에서 제시하는 바와 같이, PemK는 UAX 부위(여기서, X는 C, A 또는 U이다)에서 세포성 mRNA를 절단하는 고도로 서열-특이적인 엔도리보뉴클레아제로서 작용을 한다. 이러한 활성은 세포내 단백질 합성의 부분적 또는 전체적 억제를 달성할 수 있다. RNA 전사체내 UAX 부위(여기서, X는 C, A 또는 U이다)의 예측된 빈도는, 4개의 뉴클레오타드 중 어느 하나가 3개의 뉴클레오타이드 위치 중 각각의 하나에 도입될 수 있다는 동일 확률로 예측되는 표준 계산에 근거하여 3/64이다. 일부 RNA 전사체는 예측되는 빈도에 비교하여 보다 낮은 또는 높은 빈도의 UAX 서열을 포함하는 것으로 이해될 것이다. 따라서, PemK 엔도리보뉴클레아제에 의한 절단에 대한 특이적 RNA 전사체 또는 관련 RNA 전사체 계열의 민감성은 전사체내 UAX 서열(여기서, X는 C, A 또는 U이다) 또는 PemK 표적 서열의 빈도에 의존한다. 또한, 당업자라면 RNA 전사체의 서열에 근거하여 PemK 매개된 절단에 대한 전사체의 민감성을 예측할 수 있다.
따라서, 본 발명의 새로운 발견은 mRNA 인터페라제(예: MazF 및 PemK) 핵산 및 아미노산 서열 및 이의 조성물이 유리하게 사용될 수 있는 새로운 적용을 제시한다. 이러한 용도로는 본원에서 기술하는 다양한 조사 및 치료학적 적용이 포함되나 이에 제한되지 않는다. MazF 및 PemK 핵산 및/또는 아미노산, MazF 및/또는 PemK-활성 양립성 완충액 및 지침서를 포함하는 키트가 또한 제공된다.
III. mRNA 인터페라제 억제제-암호화 핵산 분자 및 mRNA 인터페라제 억제제 단백질의 제조
MazE- 및 PemI-암호화 핵산 분자 및 MazE 및 PemI 폴리펩타이드, 및 이들의 기능성 단편은 MazF- 및 PemK-암호화 핵산 서열 및 MazF 및 PemK 폴리펩타이드에 대해 상기 기술한 바와 같이 본질적으로 제조된다. 본 발명에 따라서, MazE 단백질을 암호하고 서열번호 5를 포함하는 핵산 서열이 제공된다(도 21a 참조). 서열번호 6을 포함하는 아미노산 서열 및 이의 기능성 단편이 또한 제공된다(도 21b 참조). 따라서, PemI 단백질을 암호화하고 서열번호 7을 포함하는 핵산 서열이 제공된다(도 32a 참조). 서열번호 8을 포함하는 아미노산 서열 및 이의 기능성 단편이 또한 제공된다(도 32b 참조).
IV. mRNA 인터페라제 억제제-암호화 핵산 및 mRNA 인터페라제 억제제 단백질의 용도
서열번호 5에 의해 암호화되는 MazE 폴리펩타이드, 서열번호 6을 포함하는 MazE 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열 및 이의 기능성 단편, 및 서열번호 6을 포함하는 MazE 폴리펩타이드 및 이의 기능성 단편은 본 발명에 포함된다. 본원에서 기술하는 바와 같이, MazE 폴리펩타이드 및 이의 기능성 단편은 MazF 활성을 조절하는 능력을 나타낸다(실시예 III 및 하기 요약 참조).
간략하게, 본원에서 입증되는 바와 같이, mazEF 프로모터 DNA에 정제된 (His)6MazE의 결합은 MazF에 의해 증진된다. MazE의 N-말단 영역내에 보존된 아미노산에서의 부위-지시된 돌연변이(K7A, R8A, S12A 및 R16A)는 (His)6MazE 및 MazE-MazF(His)6 복합체의 DNA-결합 능력을 붕괴시켰는데, 이는 MazE가 N-말단 도메인을 통해서 mazEF 프로모터 DNA에 결합함을 시사한다. 용액 중에서, MazE-MazF(His)6 복합체내의 MazE 대 MazF(His)6의 비는 약 1: 2이다. MazE 및 MazF(His)6 둘다가 동종이량체로서 존재하기 때문에, MazE-MazF(His)6 복합체(76.9 kDa)는 1개의 MazE 이량체 및 2개의 MazF(His)6 이량체로 이루어진 것으로 예상된다. 또한, 효모 2-하이브리드 시스템을 사용하여 MazE와 MazF 간의 상호작용을 특성화하였다. MazE의 잔기 38번 내지 75번의 영역이 MazF에 결합하기 위해 필요한 것임이 밝혀졌다. 상기 영역에서의 부위-지시된 돌연변이유발로, Leu55 및 Leu58이 MazE-MazF 복합체 형성에서 중요한 역활을 하지만, mazEF 프로모터 DNA로의 MazE 결합에는 역활을 하지 않는다는 것이 밝혀졌다. 본 결과는 MazE가 2개의 도메인인, N-말단 DNA-결합 도메인 및 C-말단 MazF 상호작용 도메인으로 이루어져 있다는 것을 입증한다.
따라서, 한 양태에서, 본 발명의 MazE 폴리펩타이드 및 MazE 기능성 단편은 MazF 활성을 억제한다. 특정한 측면에서, 본 발명의 MazE 폴리펩타이드 또는 MazE 기능성 단편은 MazF 엔도리보뉴클레아제 활성을 억제하거나 엔도리보뉴클레아제 활성의 감소를 일으킨다. 실제로, MazE 및 이의 기능성 단편은 본 발명에 의해 특성화되고 엔도리보뉴클레아제 활성의 감소를 일으킴으로써 엔도리보뉴클레아제 기질 절단의 감소를 일으키는 것으로 본원에서 입증된 최초의 분자이다. 엔도리보뉴클레아제 기질 절단의 감소를 일으킬 수 있는 예시적 MazE 기능성 단편으로는 C-말단 MazF 상호작용 도메인이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 구체적 양태에서, C-말단 MazF 상호작용 도메인은 MazE의 잔기 38번 내지 75번의 영역을 포함한다. 본원에서 기술하는 바와 같이, 상기 영역내에서 동정된 결정적 잔기는 Leu55 및 Leu58이다. 다른 양태에서, C-말단 MazF 상호작용 도메인은 MazE 분자의 Hp-Box 및 여기서 동정되는 결정적 잔기를 포함한다.
본 발명의 특정한 측면에서, MazE의 2개의 C-말단 펩타이드, T54-K77(24개 아미노산 잔기; TLAELVNDITPENLHENIDWGEPK; 서열번호 9)를 갖는 하나의 펩타이드와 N60-K77(18개 a.a. 잔기; NDITPENLHENIDWGEPK; 서열번호 10)를 갖는 다른 펩타이드를 화학적으로 합성할 수 있다. 이들 펩타이드는 MazE-MazF 복합체의 X-선 구조에 근거하여 MazF 이량체와의 안정한 억제성 복합체를 형성하는 것으로 예상된다. 전자의 펩타이드는 헬릭스 2 및 C-말단 산성 테일 둘다를 포함하는 반면, 후자의 펩타이드는 헬릭스 2가 결여되어 있다. 이들 펩타이드는 기질로서 합성 30-염기 RNA(5'-UAAGAAGGAGAUAUACAUAUGAAUCAAAUC-3'; 서열번호 11)를 사용하여 MazF의 mRNA 인터페라제 활성을 억제하는 능력에 대해 검사될 것이다. 이의 억제 활성은 대조군으로서 온전한 MazE와 비교될 것이다.
다른 양태에서, 본 발명의 MazE 폴리펩타이드 및 MazE 기능성 단편은 MazF 활성을 증진시키거나 증가시킨다. 특정한 측면에서, 본 발명의 MazE 폴리펩타이드 또는 MazE 기능성 단편은 MazF 엔도리보뉴클레아제 활성을을 증진시키거나 엔도리보뉴클레아제 활성의 증가를 일으킨다. 실제로, MazE 폴리펩타이드 돌연변이체 및 이의 기능성 단편은 본 발명에 의해서 엔도리보뉴클레아제 활성의 증가를 일으킴으로써 엔도리보뉴클레아제 기질 절단의 증가를 일으킬 수 있는 것으로 특성화된 최초의 분자이다. 엔도리보뉴클레아제 기질 절단의 증가를 일으킬 수 있는 MazE 폴리펩타이드로는, C-말단 MazF 상호작용 도메인, MazE 잔기 38번 내지 75번, Hp-box 또는 Leu55 또는 Leu 58(또는 이의 상동 위치)에 돌연변이를 포함하는 MazE 폴리펩타이드가 포함되나 이에 제한되지 않으며, 여기서 이러한 돌연변이(들)은 MazE가 MazF에 결합하는 능력을 감소시키거나 억제한다. 엔도리보뉴클레아제 기질 절단의 증가를 일으킬 수 있는 예시적 MazE 단편로는 MazE 단편이 MazF에 결합하는 능력을 감소시키거나 억제하는 돌연변이(들)을 포함하는 MazE 단편이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 이러한 돌연변이를 포함하는 MazE 단편으로는, C-말단 MazF 상호작용 도메인 또는 MazE의 잔기 38번 내지 75번의 영역이 포함되나 이에 제한되지 않는다. MazE 단편이 MazF에 결합하는 능력을 감소시키거나 억제하는 것으로 공지된, 잔기내 돌연변이는 Leu55 및 Leu58에서의 돌연변이를 포함한다. 이러한 MazE 돌연변이 폴리펩타이드 및 단편은 본원에서 우세한 음성 활성을 갖는다고 언급될 수 있다. 일반적으로, 우세한 음성 폴리펩타이드는 상응하는 야생형 폴리펩타이드의 활성을 감소시키거나 억제하는 작용을 하는데, 그 이유는 당해 폴리펩타이드가 여전히 기질 및/또는 상호작용 단백질 또는 분자와 결합하고 따라서 이에 대해 경쟁할 수 있지만, 야생형 작용이 적어도 부분적으로 손상되어 있기 때문이다.
서열번호 7에 의해 암호화되는 PemI 폴리펩타이드, 서열번호 8을 포함하는 PemI 폴리펩타이드 및 이의 기능성 단편을 암호화하는 핵산, 및 서열번호 8을 포함하는 PemI 폴리펩타이드 및 이의 기능성 단편도 또한 본 발명에 포함된다. 본원에서 기술하는 바와 같이, PemI 폴리펩타이드 및 이의 기능성 단편은 PemK 활성을 조절하는 활성을 나타낸다. PemI 활성 및 연장으로서 PemK의 활성을 조절할 수 있는 예시적 PemI 기능성 단편으로는 N-말단 DNA 결합 도메인 및 C-말단 PemK 상호작용 도메인이 포함된다(하기 실시예 IV 참조).
따라서, 하나의 양태에서, 본 발명의 PemI 폴리펩타이드 및 PemI 기능성 단편은 PemK 활성을 억제한다. 특정한 측면에서, 본 발명의 PemI 폴리펩타이드 또는 PemI 기능성 단편은 PemK 엔도리보뉴클레아제 활성을 억제하거나 엔도리보뉴클레아제 활성을 감소시킨다. 실제로, PemI 및 이의 기능성 단편은 본 발명에 의해 특성화되고 엔도리보뉴클레아제 활성을 감소시킴으로써 엔도리보뉴클레아제 기질 절단의 감소를 일으킬 수 있는 것으로 입증된 최초의 분자이다.
다른 양태에서, PemI를 억제할 수 있는, PemI 폴리펩타이드 또는 이의 단편의 돌연변이된 형태 또는 유도체가 고려된다. 이러한 PemI 돌연변이체 폴리펩타이드 및 단편은 본원에서 우세한 음성 활성을 갖는다고 언급될 수 있다. 일반적으로, 우세한 음성 폴리펩타이드는 상응하는 야생형 폴리펩타이드의 활성을 감소시키거나 억제하는 작용을 하는데, 그 이유는 당해 폴리펩타이드가 여전히 기질 및/또는 상호작용 단백질 또는 분자와 결합하고 따라서 이에 대해 경쟁할 수 있지만, 야생형 작용이 적어도 부분적으로 손상되어 있기 때문이다. PemI는 정상적으로는 PemK에 결합함으로써 이의 독성 효과를 억제하기 때문에, PemK의 PemI-매개된 억제의 방지는 이러한 음성 조절로부터 PemK를 방출시키는 작용을 한다. 따라서, PemI 활성을 억제함으로써 PemK 활성이 증가된다.
C. MazF 활성을 조절할 수 있는 화합물을 동정하기 위한 일반적 방법
에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 염색체 MazE/MazF 중독 모듈의 구조는 1.7Å에 대해 측정되었다[참조; Kamada et al.,Mol Cell 11, 875-884 (2003)]. 본원에서 기술하는 바와 같이, 중독 모듈은 세균 세포 사멸을 좌우하는, 안정한 독소 및 불안정한 해독제 단백질로 이루어져 있다. MazE(해독제) 및 MazF(독소)는 교호되는 독소 및 해독제 동종이량체로 이루어진 선형 이종육량체(MazF2-MazE2-MazF2)를 형성한다. 카마다(Kamada) 등은 MazE 동종이량체가 플랭킹 MazF 동종이량체와 상호작용하는 2개의 신장된 C 말단이 돌출된 β 배럴(barrel)을 함유하고 있음을 제시한다. 이러한 상호작용은 플라스미드-암호화된 독소 CcdB 및 Kid의 것과 유사하다. MazE/MazF 이종육량체 구조는 해독제-독소 인식 기작이 염색체와 플라스미드에 내재한 중독 모듈 둘다에게 공통적이라는 것을 입증하며 독소 기능, 독소 부재하의 해독제 분해 및 해독제/독소 복합체에 의한 프로모터 DNA 결합에 대한 일반적 분자적 식견을 제공한다.
본원에서 제시한 정보에 근거하여, MazE내 적합한 펩타이드 표적은 하기에 열거한 잔기 및 영역을 포함하나 이에 제한되지 않는다. MazE내 적합한 펩타이드 표적은 DNA-결합을 매개하는 잔기 7번 내지 18번의, MazE내의 고도로 보존된 N-말단 영역인 N-box 및 그 내부의 결정적 잔기들을 포함한다. MazE의 N-box내의 결정적 잔기는 K7A, R8A, S12A 및 R16A를 포함하며, 이들 잔기의 돌연변이는 MazE 및 MazE-MazF 복합체 둘다의 DNA-결합 능력을 붕괴시킨다. 소수성 잔기가 풍부한 잔기 53번 내지 64번의 MazE내 보존된 C-말단 영역인 Hp-Box도 또한 펩타이드-기반 치료제에 적합한 표적이다. Hp-box 영역은 MazE 및 MazF 간의 외견적으로 가장 안정한 경계면내에 포함되어 있다. Hp-box내 소수성 아미노산 잔기(Leu55, Leu58, Val59 및 Ile62)의 측쇄는 MazF 동종이량체내 소수성 잔기 집단과 상호작용한다.
본원에서 제시하는 정보에 근거하여, MazF내의 적합한 펩타이드 표적은 하기에 열거한 잔기 및 영역을 포함하나 이에 제한되지 않는다. MazF내 적합한 펩타이드 표적은 R29S, N40D, T52K, Q77H, R86G,I110N, E24A 및 K79A 잔기 및 이러한 결정적 잔기들을 포함하는 소형 펩타이드(예: 이들 잔기 및 이들의 플랭킹 잔기를 포함하는 5 내지 10개 잔기 펩타이드)를 포함한다.
본 발명의 하나의 양태에서, 2:4 MazE/MazF 복합체의 결정 구조[참조: Kamada et al., supra], 이의 구조 성분 및 MazE와 MazF 간에 동정된 경계면은, 컴퓨터 도킹(docking) 방법을 통해서 표적 부위에 높은 친화성으로 결합하는 광범위한 화합물 라이브러리로부터 후보 화합물을 동정하고자 하는 가상 리간드 스크리닝 과정에서 표적으로서 사용된다.
다른 양태에서, MazE/MazF 복합체의 구조정보[참조: Kamada et al., supra], 이의 성분 및 MazE와 MazF 간에 동정된 경계면은 MazF 및/또는 MazE/MazF 경계면에 결합하는 것으로 예상되는 화합물을 고안하는데 사용되며, 이러한 화합물은 높은 친화성 결합에 대해 시험된다.
구체적 양태에서, RNA에의 MazF의 결합을 조절하는 후보 화합물 및 "고안된 화합물"이 선별된다. 이러한 화합물들은 RNA에의 MazF의 결합을 증진시키거나 억제할 수 있다. 그 다음, 이러한 화합물들은 기질(즉, RNA) 절단의 증가 또는 감소를 일으킬 수 있다. 이어서, 도킹 과정에서의 최고치를 스코어화하는 접근법으로부터 유도되거나 수득된 화합물을 세포 기반 분석법 및 세포 부재 분석법(하기 기술함)에서 시험하여 MazF 활성을 조절하는데 있어 이의 효능을 측정한다.
이어서, 생물학적 분석법에서 효능을 나타내는 어떠한 화합물이라도 결합 부위를 동정하기 위해 MazF와 공-결정화시킬 수 있다. 본 발명의 추가 양태에서, MazF에 결합할 수 있는 후보 화합물을 당업계에 공지된 방법으로 변형시켜 특정 특징을 개선, 예를 들어, 효능 및/또는 특이성 및/또는 가용성을 증가시킨다. 가장 바람직한 특징을 나타내는 선별된 화합물은 선도 화합물로서 지정하고 예를 들어, 과증식성 질환의 동물 모델에서 추가 시험하여 이의 효능을 측정한다.
D. PemK 활성을 조절할 수 있는 화합물을 동정하기 위한 일반적 방법
본원에서 제시한 정보에 근거하여, PemI내 적합한 펩타이드 표적은 하기에 열거한 잔기 및 영역을 포함하나 이에 제한되지 않는다. PemI내 적합한 펩타이드 표적은 폴리펩타이드의 PemI 계열의 구성원 간에 보존된 영역을 포함한다.
본원에서 제시한 정보에 근거하여, PemK내 적합한 펩타이드 표적은 하기에 열거한 잔기 및 영역을 포함하나 이에 제한되지 않는다. β 쇄 S1 및 S2 간에 보존된 루프(S1-S2 루프로 명명됨) 및 그 내부의 잔기가 적합한 펩타이드 표적이다. 보존된 영역 및 그 내부의 아미노산 서열의 아미노산 서열 정렬에 대해서 도 33 및 34를 참조한다.
본 발명의 하나의 양태에서, 2:4 MazE/MazF 복합체의 결정 구조[참조: Kamada et al., supra], 이의 구조 성분 및 MazE와 MazF 간에 동정된 경계면은 PemI/PemK 복합체의 검사에 적용될 수 있다. 따라서, 이러한 추정은 컴퓨터 도킹 방법을 통해서 표적 부위에 높은 친화성으로 결합하는 광범위한 화합물 라이브러리로부터 후보 화합물을 동정하고자 하는 가상 리간드 스크리닝 과정에서 표적을 동정하는데 사용된다.
다른 양태에서, MazE/MazF 복합체의 구조 정보[참조: Kamada et al., supra], 이의 성분 및 MazE와 MazF 간에 동정된 경계면은 PemI/PemK 복합체의 검사에 적용될 수 있다. 따라서, 이러한 추정은 PemK 및/또는 PemI/PemK 경계면에 결합하는 것으로 예측된 화합물을 고안하는데 사용될 수 있으며, 이러한 화합물을 높은 친화성 결합에 대해 시험할 수 있다.
구체적 양태에서, RNA로의 PemK의 결합을 조절하는 후보 화합물 및 "고안된 화합물"이 선별된다. 이러한 화합물들은 RNA에의 PemK 결합을 증진시키거나 억제할 수 있다. 그 다음, 이러한 화합물들은 기질(즉, RNA) 절단의 증가 또는 감소를 일으킬 수 있다. 이어서, 도킹 과정에서의 최고치를 스코어화하는 접근법으로부터 유도되거나 수득된 화합물을 세포 기반 분석법 및 세포 부재 분석법(하기 기술함)에서 시험하여 PemK 활성을 조절하는데 있어 이의 효능을 측정한다.
이어서, 생물학적 분석법에서 효능을 나타내는 어떠한 화합물이라도 결합 부위(들)를 동정하기 위해 PemK와 공-결정화시킬 수 있다. 본 발명의 추가 양태에서, PemK에 결합할 수 있는 후보 화합물을 당업계에 공지된 방법으로 변형시켜 특정 특징을 개선, 예를 들어, 효능 및/또는 특이성 및/또는 가용성을 증가시킨다. 가장 바람직한 특징을 나타내는 선별된 화합물은 선도 화합물로서 지정하고 예를 들어, 과증식성 질환의 동물 모델에서 추가 시험하여 이의 효능을 측정한다.
유연한 도킹 기법을 통한 가상 리간드 스크리닝
통상의 도킹 및 스크리닝 방법론은 특정 단백질 구조를 사용하여 다수의 화합물 라이브러리로부터 가능한 선도 화합물의 작은 세트를 선별할 수 있다. 이러한 방법은 문헌[참조: Abagyan and Totrov (2001) Current Opinion Chemical Biology 5:375-382, 이의 전문은 본원에서 참조로 인용된다]에 기술되어 있다.
고처리량의 유연한 도킹에 기초하는 가상 리간드 스크리닝(VLS)은 특정 단백질 구조에 결합할 수 있는 화합물을 고안하고 동정하는데 유용하다. VLS는 각각 하나씩 합성하여 실험에 의해 시험하지 않고도 다량의 화학 분자를 가상적으로 샘플링하는데 사용될 수 있다. 일반적으로, 당해 방법은 통상의 수단, 예를 들어, X-선 결정학, NMR, 상동성 모델링으로 추론한 선별된 단백질 구조를 사용하는 폴리펩타이드 모델링으로 개시한다. 이어서, 화합물 및/또는 분자 단편의 세트를 기존의 도킹 프로그램, 예를 들어, MCDOCK[참조: Liu et al. (1999) J. Comput. Aided Mol. Des. 13:435-451], SEED[참조: Majeux et al. (1999) Proteins 37:88-105]; DARWIN[참조: Taylor et al. (2000) Proteins 41: 173-191]; MM[참조: David et al. (2001) J. Comput. Aided Mol. Des. 15:157-171] 중 어느 하나를 사용하여 선별된 결합 부위내로 도킹시킨다. 화합물을 추가의 시험관내 및 생체내 시험 및/또는 화학적 변형을 위해서 리간드, 및 생성된 최고의 결합 친화성을 지니는 것으로 예상되는 후보 화합물의 목록으로서 스코어화한다.
VLS의 한 접근법에서, 분자는 화학적 생성 전에 선별된 결합 포켓내로 "조립(build)"된다. 다수의 프로그램은 리간드를 원자 하나씩[예를 들어, GENSTAR(참조; Pearlman et al. L (1993) J. Comput. Chem. 14: 1184), LEGEND(참조: Nishibata et al. (1993) J. Med. Chem. 36: 2921-2928), MCDNLG(참조: Rotstein et al. (1993) J. Comput-Aided Mol. Des. 7: 23-43), CONCEPTS(참조; Gehlhaar et al. (1995) J. Med. Chem 38: 466- 472) 참조] 또는 단편 하나씩[예를 들어, GROUPBUILD(참조: Rotsein et al. (1993) J. Med. Chem.36 :1700-1710), SPROUT(참조: Gillet et al. (1993) J. Comput. Aided Mol. Des. 7:127-153), LUDI(참조: Bohm (1992) J. Comput. Aided Mol. Des. 6: 61-78), BUILDER(참조: Roe (1995) J. Comput. Aided Mol. Des. 9: 269-282) 및 SMOG (DeWitte et al. (1996) J. Am. Chem. Soc. 118: 11733-11744) 참조] 사용하여 "성장"시키도록 고안되어 있다
단백질 구조에 결합할 수 있는 소수의 분자와 다수의 비-결합제를 구별할 수 있도록 하는, 특정한 단백질에 대한 리간드를 스코어화하는 방법은 공지되어 있다[가상 리간드 도킹 및 스크리닝 방법론을 통해 동정된 증가되는 수의 성공적 리간드에 관한 보고서에 대해서는 문헌(Agagyan et al. (2001) supra)을 참조한다]
예를 들어, 문헌[참조: Nishibata et al. (1993) J. Med. Chem 36: 2921-2928]에는 분자, 디하이드로폴레이트 리덕타제의 활성 부위의 3차원 구조에 기초하여 억제성 분자를 생성시키는 구조 구축 프로그램의 능력이 기술되어 있다. 상기 프로그램은, 효소의 공지된 4가지 억제제의 유사한 구조를 갖는 분자를 예측하여 신규한 선도 화합물을 표적 3차원 구조에 대한 지식으로 수득할 수 있음을 강력하게 뒷받침한다. 마찬가지로, 문헌[참조: Gillet et al. (1993) J. Computer Aided Mol. Design 7: 127-153]에는 입체적 제한에 기초한 인공지능 기법을 통한 구조 생성이 기재되어 있다(SPROUT).
본 발명의 스크리닝 방법으로 동정된 제제
본 발명은 mRNA 인터페라제(예: MazF 또는 PemK) 또는 mRNA 인터페라제 억제제(예: MazE 또는 PemI)에 높은 친화성으로 결합하는 제제(예: 후보 화합물 또는 시험 화합물)을 동정하는 방법을 제공한다. 본 발명의 스크리닝 방법으로 동정된 제제는 항-과증식성 질환 및 항-세균 치료제 후보물로서 유용하다.
제제, 즉 후보 화합물 또는 시험 화합물의 예는 핵산(예: DNA 및 RNA), 탄수화물, 지질, 단백질, 펩타이드, 펩타이드모사체(peptidomimetic), 소분자 및 기타 약물이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 제제는 수많은 접근법 중 어느 하나와, 생물학적 라이브러리; 공간적으로 어드레스가능한(addressable) 평행 고체상 또는 용액상 라이브러리; 얽힘풀기(deconvolution)를 요하는 합성 라이브러리 방법; 1개 비이드-1개 화합물" 라이브러리 방법; 및 친화성 크로마토그래피 선별을 사용한 합성 라이브러리를 포함하는 당업계에 공지된 라이브러리 방법을 병용하여 수득할 수 있다. 생물학적 라이브러리 접근법은 펩타이드 라이브러리로 제한되는 반면, 다른 4가지 접근법은 펩타이드, 비-펩타이드 올리고머 또는 화합물의 소분자 라이브리에도 적용할 수 있다[참조: Lam (1997) Anticancer Drug Des. 12: 145; 미국 특허 제5,738,996호; 및 미국 특허 제5,807,683호, 각각은 전문이 본원에서 참조로 인용된다].
분자 라이브러리를 합성하기 위한 방법은 예는 당업계에서 예를 들어, 문헌[참조: DeWitt et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6909; Erb et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 11422; Zuckermann et al. (1994) J. Med. Chem. 37: 2678; Cho et al. (1993) Science 261: 1303; Carrell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2059; Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2061; and Gallop et al. (1994) J. Med. Chem. 37: 1233, 각각은 본원에서 전문이 참조로 인용된다]에서 찾아볼 수 있다.
화합물의 라이브러리는 예를 들어, 용액[참조; Houghten (1992) Bio/Techniques 13:412-421] 또는 비이드[참조: Lam (1991) Nature354 :82- 84], 칩[참조: Fodor (1993) Nature 364: 555-556], 세균[참조: 미국 특허 제5,223,409호], 포자[참조: 특허 제5,571,698호; 제5,403,484호; 및 제5,223,409호], 플라스미드[참조: Cull et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1865-1869] 또는파아지[참조: Scott and Smith (19900 Science 249: 386-390; Devlin (1990) Science 249: 404-406; Cwirla et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6378-6382; and Felici(1991) J. Mol. Biol. 222:301-310, 각각은 본원에서 전문이 참조로 인용된다] 중에 존재할 수 있다.
스크리닝 분석법
상기한 가상 리간드 도킹 및 스크리닝 방법론을 통해서 동정된 소분자는 시험관내 및 생체내 분석법으로 추가 시험된다. 하나의 양태에서, MazF 또는 PemK와 같은 mRNA 인터페라제 또는 MazE 또는 PemI와 같은 mRNA 인터페라제 억제제와 상호작용하는(즉, 결합하는) 제제는 세포 기반 분석법 시스템에서 동정된다. 명료성 및 간결성의 목적상, 이들 분석법의 나머지는 MazF 및 MazF 단편과 관련하여 기술하지만, 이러한 분석법/방법을 다른 mRNA 인터페라제 및 이의 단편들, 예를 들어, MazE 및 MazE 단편, PemK 및 PemK 단편, 및 PemI 및 PemI 단편에도 적용할 수 있음이 이해될 것이다.
본 발명에 따라서, MazF 또는 이의 단편을 발현하는 세포를 후보 화합물 또는 대조군 화합물과 접촉시키고, 당해 후보 화합물이 MazF와 상호작용하는 능력을 측정한다. 경우에 따라서, 이러한 분석법을 사용하여 다수의(예를 들어, 라이브러리) 후보 화합물을 스크리닝할 수 있다. 세포는 예를 들어, 원핵생물 기원(예: 이. 콜라이) 또는 진핵생물 기원(예: 효소 또는 포유동물)일 수 있다. 또한, 세포는 MazF 또는 이의 단편을 내생적으로 발현할 수 있거나, MazF 또는 MazF 단편을 발현하도록 유전자 조작될 수 있다. 특정한 양태에서, MazF 또는 MazF 단편을, 예를 들어, 방사성 표지(예: 32p, 35S 또는 125I) 또는 형광성 표지(예: 플루오레세인, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리트린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프트알데히드 또는 플루오레스카민)으로 표지하여 MazF와 후보 화합물 간의 상호작용을 검출할 수 있다. 후보 화합물이 MazF에 결합하는 능력은 당업자에게 공지된 방법으로 측정할 수 있다. 예를 들어, 후보 화합물과 MazF 간의 상호작용은 유세포측정, 섬광 분석법, 면역침전 또는 웨스턴 블롯 분석으로 측정될 수 있다.
다른 양태에서, MazF 또는 이의 관련 단편과 상호작용하는(즉, 결합하는) 제제는 세포 부재 분석법 시스템에서 동정된다. 상기 양태에 따라서, 천연 또는 재조합 MazF 또는 이의 단편을 후보 화합물 또는 대조군 화합물과 접촉시키고, 후보 화합물이 MazF와 상호작용하는 능력을 측정한다. 경우에 따라, 상기 분석법을 사용하여 다수의(예를 들어, 라이브러리) 후보 화합물을 스크리닝할 수 있다. 하나의 양태에서, MazF 또는 이의 단편은 먼저, 예를 들어, 이를 특이적으로 인식하여 이와 결합하는 고정화된 항체와 접촉시킴으로써 또는 MazF 또는 이의 단편의 정제된 제제를 단백질에 결합하도록 고안된 표면과 접촉시킴으로써 고정화시킨다. MazF 또는 이의 단편은 부분적으로 또는 완전히 정제될 수 있거나(예를 들어, 부분적으로 또는 완전히 다른 폴리펩타이드를 함유하지 않을 수 있거나) 세포 용해물의 일부분일 수 있다. 추가로, MazF 또는 이의 단편은 MazF 또는 이의 생물학적 활성 부분 및 글루타티오닌-S-트랜스퍼라제와 같은 도메인을 포함하는 융합 단백질일 수 있다. 대안으로, MazF 또는 이의 단편을 당업자에게 익히 공지된 기법을 사용하여 바이오티닐화(biotinylation)시킬 수 있다(예: 바이오티닐화 키트, Pierce Chemicals; Rockford, IL). 후보 화합물이 MazF와 상호작용하는 능력은 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 측정할 수 있다.
다른 양태에서, MazF 활성을 조절하는 제제는 동물 모델에서 동정된다. 적합한 동물의 예로는 마우스, 랫트, 토끼, 원숭이, 기니아 피그, 개 및 고양이가 포함되나 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게는, 사용되는 동물은 과증식성 질환의 모델을 대표한다. 상기 양태에 따라서, 시험 화합물 또는 대조군 화합물을 적합하 동물에게 (예를 들어, 경구, 직장, 또는 복막내 또는 정맥내와 같은 비경구로) 투여하고, 활성 수준에 대한 효과를 측정한다.
E. mRNA 인터페라제 또는 mRNA 인터페라제 억제제에 결합할 수 있는 제제의 치료학적 용도
본 발명은 상기한 방법들을 사용하여 동정된 치료학적 화합물의 투여에 의한 과증식성 질환의 치료법을 제공한다. 이러한 화합물들로는 단백질, 펩타이드, 단백질 또는 펩타이드 유도체 또는 유사체, 항체, 핵산 및 소분자가 포함되나 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 피험체에게 본 발명의 방법으로 동정된 화합물의 유효량을 투여함을 포함하는, 과증식성 질환을 앓는 환자의 치료 방법을 제공한다. 바람직한 측면에서, 당해 화합물은 실질적으로 정제된다(예를 들어, 이의 효과를 제한하고 목적하지 않은 부작용을 유발하는 물질을 실질적으로 함유하지 않는다). 피험체는 바람직하게는 소, 돼지, 말, 닭, 고양이, 개 등과 같은 동물을 포함하나 이에 제한되지 않는 동물이며, 바람직하게는 포유동물이고 가장 바람직하게는 사람이다. 구체적 양태에서, 사람이 아닌 포유동물이 피험체이다.
당해 화합물이 핵산을 포함하는 경우에 사용될 수 있는 제형 및 투여 방법은 하기에 기술하며, 추가의 적절한 제형 및 투여 경로도 하기에 기술한다.
각종 전달 시스템은 공지되어 있으며 본 발명의 화합물을 투여하는데 사용될 수 있으며, 예로는 리포좀 중에 캡슐화, 미립자, 미세캡슐, 화합물을 발현할 수 있는 재조합 세포, 수용체 매개된 엔도사이토시스(endocytosis)[참조: Wu and Wu (1987) J. Biol. Chem. 262: 4429-4432] 및 레트로바이러스 또는 다른 바이러스 벡터의 일부분으로서 핵산의 작제가 있다. 도입 방법은 장관 또는 비경구적일 수 있으며, 피내, 근육내, 복막내, 정맥내, 피하, 비내, 경막외 및 경구 경로를 포함할 수 있다. 화합물은 임의의 통상의 경로에 의해, 예를 들어, 주입 또는 거환 주사에 의해, 상피 또는 점막 내층(예: 경구 점막, 장 및 창자 점막 등)을 통한 흡수에 의해 투여될 수 있으며 다른 생물학적 활성제와 함께 투여될 수 있다. 투여는 전신 또는 국소 투여일 수 있다. 또한, 본 발명의 약제학적 조성물을 뇌실내 및 초내(intrathecal) 주사를 포함하는 임의의 적합한 경로에 의해 중추신경계로 도입시키는 것이 바람직할 수 있으며; 뇌실내 주사는 뇌실내 카테터, 예를 들어, Ommaya 저장소와 같은 저장소에 부착된 카테터에 의해 촉진될 수 있다. 예를 들어, 흡입기 또는 분무기 및 에어로졸화제를 이용한 제형화를 사용하여 폐 투여를 사용할 수도 있다.
구체적 양태에서, 본 발명의 약제학적 조성물을 예를 들어, 주사, 카테터 사용 또는 이식물 사용에 의해 예를 들어, 수술 동안의 국소 주입, 국소 적용에 의해 국소 투여하는 것이 바람직할 수 있으며, 이때 상기 이식물은 시알라스틱(sialastic) 막 또는 섬유와 같은 막을 포함하여 다공질, 비-다공질 또는 젤라틴 물질이다. 하나의 양태에서, 투여는 CSF로의 직접 주사에 의해 또는 예를 들어, CNS 조직내 종양 부위에서 이루어질 수 있다.
다른 양태에서, 당해 화합물은 소포, 특히 리포좀[참조: Langer(1990) Science 249: 1527-1533; Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353- 365 (1989); Lopez-Berestein, ibid., pp. 317-327; see generally ibid.] 중에서 전달될 수 있다.
또 다른 양태에서, 당해 화합물은 서방출 시스템 중에서 전달될 수 있다. 하나의 양태에서, 펌프를 사용할 수 있다[참조: Langer, supra; Sefton (1987) CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14: 201; Buchwald et al. (1980) Surgery 88: 507;Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321: 574]. 다른 양태에서, 중합체성 물질을 사용할 수 있다[참조: Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise(eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger and Peppas, J., 1983, Macromol. Sci. Rev. Macromol.Chein. 23: 61; see also Levy et al. (1985) Science 228: 190; During et al. (1989) Ann. Neurol. 25: 351; Howard et al.(1989) J. Neurosurg. 71: 105]. 또 다른 양태에서, 서방출 시스템은 치료제의 근처에, 즉 표적 조직 또는 종양에 위치함으로써 전신 투여량의 분획만을 필요로 할 수 있다[참조: Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984)]. 다른 서방출 시스템은 랑거의 논문[참조: Langer, 1990, Science 249: 1527-1533]에 논의되어 있다.
F. 약제학적 조성물
본 발명은 약제학적 조성물을 또한 제공한다. 이러한 조성물은 치료학적 유효량의 제제 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 특정한 양태에서, "약제학적으로 허용되는"이란 연방정부 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 승인되었거나 미국 약전 또는 동물 및 보다 특히 사람에서의 사용에 대한 다른 일반적으로 인정된 약전에 열거된 것들을 의미한다. "담체"란 용어는 치료제와 함께 투여되는 희석제, 보조제, 부형제 또는 비히클을 의미한다. 이러한 약제학적 담체는 물, 및 땅콩유, 대두유, 광유, 참기름 등과 같은 석유, 동물성, 식물성 또는 합성 기원의 오일을 포함하는 오일과 같은 멸균된 액체, 예를 들어, 물 및 오일일 수 있다. 약제학적 조성물을 정맥내로 투여하는 경우 물이 바람직한 담체이다. 식염수 및 수성 덱스트로즈 및 글리세롤 용액도 특히 주사액용의 액체 담체로서 사용될 수 있다.
적합한 약제학적 부형제로는 전분, 글루코즈, 락토즈, 슈크로즈, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 쵸크, 실리카 겔, 나트륨 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 활석, 염화나트륨, 탈지유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등이 포함된다. 조성물은 경우에 따라 소량의 습윤제 또는 유화제, 또는 pH 완충제를 함유할 수도 있다. 이들 조성물은 액제, 현탁제, 유제, 정제, 환제, 캡슐제, 산제, 서방출 제형 등의 형태를 취할 수 있다. 조성물은 통상의 결합제 및 트리글리세라이드와 같은 담체를 사용하여 좌제로서 제형화될 수 있다. 경구 조성물은 약제 등급의 만니톨, 락토즈, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 사카라이드, 셀룰로즈, 탄산마그네슘 등과 같은 표준 담체를 포함할 수 있다. 적합한 약제학적 담체의 예는 문헌[참조: "Remington's Pharmaceutical Sciences" by E. W. Martin, 이는 전문이 본원에서 참조로 인용된다]에 기술되어 있다. 이러한 조성물은 바람직하게는 정제된 형태의 치료학적 유효량의 화합물과 함께 적당량의 담체를 함유함으로써 피험체에게 적절하게 투여하게 위한 형태를 제공할 것이다. 제형은 투여 방식에 맞게 적합화되어야 한다.
바람직한 양태에서, 조성물은 통상의 과정에 따라서 사람에게 정맥내 투여하기 위해 적합화된 약제학적 조성물로서 제형화된다. 전형적으로, 정맥내 투여용 조성물은 멸균 등장성 수성 완충액 중의 용액이다. 필요에 따라, 조성물은 가용화제 및 주사 부위의 통증을 완화시키는 리도카인과 같은 국소 마취제를 포함할 수도 있다. 일반적으로, 성분들은 별도로 공급되거나, 예를 들어, 활성 성분의 양을 표시한 앰풀 또는 샤세(sachette)와 같은 밀폐 밀봉된 용기 내의 무수 동결건조된 분말 또는 무수 농축물로서 단위 투여 형태중에서 함께 혼합된다. 조성물이 주입에 의해 투여되는 경우, 멸균된 약제학적 등급의 물 또는 식염수를 함유하는 주입 병으로 분배될 수 있다. 조성물이 주사에 의해 투여되는 경우, 주사용 멸균수 또는 식염수의 앰풀을 공급하여 성분들이 투여전에 혼합되도록 할 수 있다.
본 발명의 화합물은 중성 또는 염 형태로서 제형화될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 염으로는 유리 아미노 그룹으로 형성된 염, 예를 들어, 염산, 인산, 아세트산, 옥살산, 타르타르산 등으로부터 유도된 염 및 유리 카복실 그룹으로 형성된 염, 예를 들어, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 수산화제2철, 이소프로필아민, 트리에틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등으로부터 유도된 염이 포함된다.
과증식성 질환(예: 암)의 치료시 유효할 수 있는 본 발명의 화합물의 양은 본원 기술에 기초하여 표준 임상 기법으로 측정할 수 있다. 또한, 임의로 시험관내 분석법을 사용하여 최적의 투여량 범위를 동정하는데 도움을 줄 수 있다. 제형에서 사용되는 정확한 용량은 또한 투여 경로, 질환 또는 질병의 중증도에 따라 좌우될 수 있으며, 주치의 판단 및 각각의 피험체의 상황에 따라서 결정되어야 한다. 그러나, 정맥내 투여에 적합한 투여량 범위는 일반적으로 체중 kg당 활성 화합물 약 20 내지 500㎍이다. 비내 투여에 적합한 투여량은 일반적으로 약 0.01pg/kg 체중 내지 1 mg/kg 체중이다. 좌제는 일반적으로 0.5 내지 10중량% 활성 성분을 포함하고, 경구 제형은 10 내지 95중량% 활성 성분을 함유하는 것이 바람직하다. 유효량은 시험관내 또는 동물 모델 시험 시스템으로부터 유도된 용량 의존 곡선으로부터 추론한다.
핵산
본 발명은 mRNA 인터페라제(예; MazF 또는 PemK)에 결합하여 mRNA 인터페라제의 리보핵산내부분해 활성을 증가시킬 수 있는 제제를 동정하는 방법을 제공한다. 따라서, 본 발명은 mRNA 인터페라제 또는 이의 상동체의 펩타이드 또는 단백질 활성화인자를 암호화하는 핵산 뿐만 아니라 mRNA 인터페라제(예: MazE 또는 PemI) 또는 이의 상동체의 내인성 억제제의 발현을 간섭할 수 있는 안티센스 서열 또는 효소적 RNA의 투여를 포함한다.
하나의 양태에서, mRNA 인터페라제에 경쟁적으로 결합할 수 있는 펩타이드 또는 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 핵산이 투여된다. 본 발명에 따라서, 당업계에서 입수가능한 핵산 서열을 투여하기에 적합한 어떠한 방법이라도 사용될 수 있다.
핵산을 투여하고 발현시키는 방법은 치료요법 분야에 일반적으로 공지되어 있다. 유전자 치료요법 방법의 전반적 검토를 위해서는 문헌[참조: Goldspiel et al. (1993) Clinical Pharmacy 12:488-505 ; Wu and Wu (1991) Biotherapy 3: 87-95; Tolstoshev(1993) Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32: 573-596; Mulligan (1993) Science 260: 926-932; and Morgan and Anderson (1993) Ann. Rev.Biochem. 62: 191-217; May (1993) TIBTECH 11 (5): 155-215]을 참조한다. 본 발명에서 사용될 수 있는 재조합 DNA 기법 분야에 통상적으로 공지된 방법은 문헌[참조: Ausubel et al. (eds.), 1993, Current Protocols in Molecular Biology, Jolm Wiley & Sons, NY; and Kriegler (1990) Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY]에 기재되어 있다.
특정한 측면에서, 당해 화합물은 mRNA 인터페라제에 결합하여 mRNA 인터페라제의 리보핵산내부분해 활성을 증가시킬 수 있는 펩타이드 또는 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는데, 여기서 이러한 핵산은 적합한 숙주에서 펩타이드 또는 단백질을 발현하는 발현 벡터의 일부분이다. 특히, 이러한 핵산은 암호화 영역에 작동적으로 연결된 프로모터를 가지며, 이러한 프로모터는 유도성 또는 구성성(및 임의로 조직 특이적)이다. 다른 특정한 양태에서, 암호화 영역 및 임의의 다른 목적하는 서열이 게놈내 목적하는 부위에서의 상동 재조합을 촉진하는 영역에 의해 플랭킹되어 있는 핵산 분자를 사용하여, 핵산의 염색체내 발현을 제공한다[참조: Koller and Smithies (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 8932-8935; Zijlstra et al. (1989) Nature 342: 435-438].
피험체로의 핵산 전달은 직접적일 수 있는데, 이 경우에 피험체는 핵산 또는 핵산 보유 벡터에 직접 노출되며, 이러한 접근법은 생체내 유전자 요법으로서 공지되어 있다. 대안으로, 피험체로의 핵산 전달은 간접적일 수 있는데, 이 경우에 세포는 먼저 시험관내에서 핵산으로 형질전환된 다음, 피험체에게 이식되며, 이는 "생체외 유전자 요법"으로서 공지되어 있다.
다른 양태에서, 핵산은 생체내에서 직접 투여되고, 여기서 발현되어 암호화된 산물을 생산한다. 이는 당업계에 공지된 수많은 방법 중 하나, 예를 들어, 핵산을 적절한 핵산 발현 벡터의 일부분으로서 작제하여 이를 투여하여 세포내에 존재하도록 함에 의해, 예를 들어, 결함성 또는 약독화된 레트로바이러스 또는 다른 바이러스 벡터를 사용한 감염[참조; 미국 특허 제4,980,286호]에 의해; 나상(naked) DNA의 주사에 의해; 미립자 충격(microparticle bombardment)(예: 유전자 총; Biolistic, Dupont)에 의해; 지질, 세포 표면 수용체 또는 형질감염제로 피복시킴에 의해; 리포좀, 미립자 또는 미세캡슐 중에 캡슐화시킴에 의해; 핵산을, 핵으로 진입하는 것으로 공지된 펩타이드에의 연결물 중에 투여함에 의해; 또는 핵산을 수용체를 특이적으로 발현하는 세포 유형을 표적화하는데 사용할 수 있는, 수용체 매개성 엔도사이토시스에 적용되는 리간드에의 연결물 중에서 투여함에 의해[참조: Wu and Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262: 4429-4432] 달성할 수 있다.
다른 양태에서, 리간드가, 엔도좀을 파괴하여 핵산이 리소좀에 의한 분해를 피할 수 있도록 하는 융합유발성(fusogenic) 바이러스 펩타이드를 포함하는 핵산-리간드 복합체를 형성시킬 수 있다. 또 다른 양태에서, 핵산은 특이적 수용체를 표적화시킴으로써 세포 특이적 흡수 및 발현을 위해 생체내에서 표적화시킬 수 있다[참조: PCT 공보 제WO 92/06180호 dated April 16, 1992 (Wu et al.) ; WO92/22635 dated December 23,1992 (Wilson et al. ) ; W092/20316 dated November 26,1992 (Findeis et al. ) ;W093/14188 dated July 22,1993(Clarke et al. ), WO 93/20221 dated October 14,1993 (Young)). 대안으로, 핵산은 세포내에서 도입되어 상동 재조합에 의해 발현을 위한 숙주 세포 DNA내로 혼입될 수 있다[참조: Koller and Smithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 8932-8935; Zijlstra et al. (1989) Nature 342: 435-438].
추가의 양태에서, 레트로바이러스 벡터가 사용될 수 있다[참조: Miller et al. (1993) Meth. Enzymol. 217: 581-599]. 이들 레트로바이러스 벡터는 바이러스 게놈의 패키징과 숙주 세포 DNA로의 통합에 필요하지 않은 레트로바이러스 서열이 결실되도록 변형되었다. 유전자 요법에서 사용될 mRNA 인터페라제를 암호화하는 핵산은 피험체로의 유전자 전달을 용이하게 하는 벡터로 클로닝된다. 레트로바이러스 벡터에 관한 보다 상세한 사항은 줄기세포를 화학요법에 대해 보다 내성이도록 만들기 위해 mdr1 유전자를 조혈 줄기세포로 전달하기 위한 레트로바이러스 벡터의 용도가 기재되어 있는 문헌[참조: Boesen et al. (1994) Biotherapy 6:291-302]에서 찾아볼 수 있다. 유전자 요법에서의 바이러스 벡터의 용도를 예시하는 다른 참조문헌은 문헌[참조: Clowes et al. (1994) J. Clin. Invest. 93:644-651 ; Kiem et al. (1994) Blood 83: 1467-1473; Salmons and Gunzberg (1993) Human Gene Therapy 4: 129-141; and Grossman and Wilson (1993) Curr. Opin. in Genetics and Devel. 3: 110-114]이다.
아데노바이러스도 유전자 요법에서 효과적으로 사용될 수 있다. 아데노바이러스는 호흡기 상피로 유전자를 전달하는데 있어 특히 흥미로운 비히클이다. 아데노바이러스계 전달 시스템에서의 다른 표적은 간, 중추신경계, 내피 세포 및 근육이다. 아데노바이러스는 비분열성 세포를 감염시킬 수 있다는 이점을 갖고 있다. 문헌[참조: Kozarsky and Wilson (1993) Current Opinion in Genetics and Development 3: 499-503]에는 아데노바이러스계 유전자 요법에 관한 검토가 제시되어 있다. 문헌[참조: Bout et al.(1994) Human Gene Therapy 5:3-10]에는 레수스 원숭이의 호흡기 상피로 유전자를 전달하는 아데노바이러스 벡터의 용도가 입증되어 있다. 유전자 요법에서 아데노바이러스를 사용한 다른 사례는 문헌[참조: Rosenfeld et al. (1991) Science 252: 431-434; Rosenfeld et al. (1992) Cell 68: 143-155; Mastrangeli et al. (1993) J. Clin. Invest. 91: 225-234; PCT 공보 제W094/12649호; and Wang, et al, (1995) Gene Therapy 2:775-783]에서 찾아볼 수 있다. 아데노-관련 바이러스(adeno-associated virus; AAV)도 유전자 요법에서의 용도가 제안된 바 있다[참조: Walsh et al. (1993) Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204: 289-300; 미국 특허 제5,436,146호].
유전자 요법에 대한 다른 적합한 접근법은 유전자를 전기천공, 리포펙션(lipofection), 인산칼슘 매개된 형질감염 또는 바이러스 감염과 같은 방법에 의해 조직 배양물 중의 세포로 전이시킴을 포함한다. 통상적으로, 전달 방법은 선별가능한 마커를 세포로 전이함을 포함한다. 이어서, 세포를 선별하에 위치시켜, 전이된 유전자를 흡수하여 발현하고 있는 세포를 분리시킨다. 이어서, 상기 세포를 피험체에게 전달한다.
이러한 양태에서, 핵산은 수득된 재조합 세포의 생체내 투여 전에 세포로 도입된다. 이러한 도입은 형질감염, 전기천공, 마이크로인젝션, 당해 핵산 서열을 함유하는 바이러스 또는 박테리오파지 벡터로의 감염, 세포 융합, 염색체-매개성 유전자 전이, 마이크로셀(microcell) 매개성 유전자 전이, 세포벽불완전제거균(spheroplast) 융합 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 외래 유전자의 세포로의 도입을 위한 수많은 기법들이 당업계에 공지되어 있고[참조: Loeffler and Behr (1993) Meth. Enzymol. 217: 599-618 ; Cohen et al. (1993) Meth. Enzymol. 217: 618-644; Cline (1985) Pharmac. Ther. 29: 69-92] 본 발명에 따라서 사용될 수 있는데, 단 수용 세포의 필수적 발달 및 생리학적 기능은 파괴되지 않아야 한다. 당해 기법은 핵산이 세포에 의해 발현될 수 있고 바람직하게는 이의 세포 자손에게 유전될 수 있고 발현될 수 있도록 핵산의 세포로의 안정한 전이를 제공해야 한다.
수득된 재조합 세포는 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 피험체로 전달될 수 있다. 바람직한 양태에서, 상피 세포가 예를 들어, 피하로 주사된다. 다른 양태에서, 재조합 피부 세포가 피부 이식편으로서 피험체에 적용될 수 있고; 재조합 혈액 세포(조혈 줄기세포 또는 전구세포)가 바람직하게는 정맥내로 투여된다. 사용이 고려되는 세포의 양은 목적하는 효과, 피험체의 상태 등에 따라 좌우되며 당업자에 의해 결정될 수 있다.
유전자 요법을 목적으로 핵산이 도입되어질 수 있는 세포는 모든 목적하는 입수가능한 세포 유형이 포함하며, 신경세포, 아교세포(예: 희소돌기아교세포 또는 성상세포), 상피 세포, 내피 세포, 각화세포, 섬유모세포, 근육 세포, 간세포; T 림프구, B 림프구, 단핵구, 대식세포, 호중구, 호산구, 거핵세포, 과립구와 같은 혈액 세포; 다양한 줄기세포 또는 전구세포, 특히, 예를 들어, 골수, 제대혈, 말초혈 또는 태아 간으로부터 수득된 조혈 줄기세포 또는 전구세포를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 바람직한 양태에서, 유전자 요법을 위해 사용되는 세포는 치료되는 피험체에 대해 자가 세포이다.
다른 양태에서, 유전자 요법의 목적으로 도입될 핵산은 암호화 영역에 작동적으로 연결된 유도성 프로모터를 포함함으로써, 당해 핵산의 발현이 적절한 전사 유도인자의 농도를 조정함으로써 조절될 수 있다.
mRNA 인터페라제에 결합할 수 있는 펩타이드 또는 단백질 또는 mRNA 인터페라제(예를 들어, MazE 또는 PemI, 또는 이들의 상동체)의 내인성 억제제의 발현을 간섭할 수 있는 제제를 암호화하는 DNA의 직접적 주사도 예를 들어, 미국 특허 제5,589,466호에 기재된 기법에 따라서 수행될 수 있다. 이러한 기법들은 "나상 DNA", 즉 리포좀, 세포 또는 적합한 담체 이외의 기타 물질의 부재하에 분리된 DNA 분자의 주사를 포함한다. 단백질을 암호화하고 적합한 프로모터에 작동적으로 연결된 DNA를 주사함으로써 주사 부위 부근의 세포에서 단백질을 생산한다.
G. 키트
본 발명은 또한 본 발명의 약제학적 조성물의 성분 중 하나 이상으로 충전된하나 이상의 용기를 포함하는 약제학적 팩 또는 키트를 제공한다. 임의로 이러한 용기(들)과 연관되는 것은 약제학적 또는 생물학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관에 의해 정해진 형태의 통지서일 수 있으며, 통지서는 (a) 사람 투여에 대해 제조, 사용 또는 판매 기관에 의한 승인, (b) 사용 지시사항 또는 둘다를 반영한다.
본 발명은 엔도리보뉴클레아제 활성을 나타내고 본원에서 mRNA 인터페라제로 지칭되는 신규한 계열의 효소의 발견에 관한 것이다. 따라서 본 발명자들에 의한 이같은 신규한 발견은 mRNA 인터페라제 핵산 및 아미노산 서열, 및 이의 조성물이 유리하게 사용될 수 있는 새로운 적용을 나타낸다.
도 1a 및 1b는 상이한 고체 매질상에서의 세포 증식 및 RNA 인터페라제의 MazF 계열의 상이한 구성원들의 서열 정렬을 도시한다. 도 1a는 pBAD-MazF, pBAD-MazF R29S 또는 pBAD-MazF R86G 플라스미드로 각각 형질전환된 이. 콜라이 BW25113 (△araBAD) 세포의 성장 특성을 도시한다. 도 1b는 에스케리키아 콜라이의 MazF (진뱅크(GenBank) 승인 번호 NP_289336. 1)를 바실러스 할로두란스(Bacillus halodurans) (진뱅크 승인번호. NP_244588. 1), 스타필로코쿠스 에피더미디스 (진뱅크 승인번호 AAG23809.1), 스타필로코쿠스 아우레우스 (진뱅크 승인번호 NP_372592. 1), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) (진뱅크 승인번호 1NE8_A), 나이세리아 메닝기티디스(Neisseria meningitides) (진뱅크 승인번호 NP_266040. 1), 모르가넬라 모르가니(Morganella morgani) (진뱅크 승인번호 AAC82516.1) 및 마이코박테리움 튜베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis) (진뱅크 승인번호 NP_217317. 1)의 그것과 서열정렬한 결과이다.
도 2a 내지 2e는 톨루엔 처리된 이. 콜라이 세포내에서, 35S-Met 혼입(도 2a); [α-32P] dTTP 혼입(도 2b); [α-32P] UTP 혼입(도 2c)에 대한 MazF의 효과; 및 생체내 이. 콜라이 세포내로 35S-Met 혼입에 대한 MazF 의 효과(도 2d); 및 MazF의 유도후 생체내 단백질 합성의 SDS-PAGE 분석(도 2e)을 도시하는 선형 그래프를 나타낸다.
도 3a 내지 3c는 폴리좀 프로파일에 대한 MazF의 효과를 나타내는, 폴리좀 프로파일의 농도계 분석을 도시하는 라인 트레이스(도 3a)를 나타내며, 원핵성(도 3b) 및 진핵성(도 3c) 세포 부재 단백질 합성에 대한 MazF(His)6 의 효과를 입증하는 단백질 겔을 보여준다.
도 4a 내지 4d는 mRNA 합성에 대한 MazF의 효과를 나타낸다. 도 4a는 MazF의 존재하에 mazG mRNA의 토프린팅(toeprinting)을 도시한다. 도 4b는 페놀 추출후 mazG mRNA의 토프린팅을 도시한다. 도 4c는 MazG mRNA의 MazF 절단에 대한 MazE의 효과를 도시한다. 도 4d는, 아라비노스(지시됨)의 부가후 방사성표지된 ompA 및 lpp ORF DNA로 프로빙한 후 다양한 시점에서 pBAD-MazF를 함유하는 이. 콜라이 BW25113 세포로부터 추출된 총 세포성 mRNA의 노던 블롯 분석을 도시한다.
도 5a 및 5b는 카수가마이신의 부재(도 5a) 및 존재(도 5b)하에 폴리좀 프로파일의 농도계 분석을 도시하는 라인 트레이스이다. 70, 50 및 30S 리보솜 위치가 표시되어 있다.
도 6은 리보솜에 의한 mazG mRNA의 MazF 절단 억제를 도시하는 토프린팅 분석을 나타낸다.
도 7은 MazF 기능에 대한 mazG mRNA의 샤인-달가노 서열의 GGAG에서 UUUG로의 돌연변이 효과를 설명하는 토프린팅 분석을 나타낸다.
도 8은 MazF 기능에 대한 mazG mRNA의 개시 코돈에서의 돌연변이의 효과를 나타내는 토프린팅 분석을 나타낸다.
도 9는 MazF 기능에 대한 UACAU(U1A2C3A4U5) 절단 서열에서의 돌연변이의 효과를 도시한 토프린팅 분석을 나타낸다.
도 10은 16S 및 23S rRNA의 절단에 대한 MazF 및 MazE의 효과를 나타내는 아크릴아미드 겔을 나타낸다.
도 11은 트리신 SDS-PAGE 분리 및 쿠마시 브릴리언트 블루에 의한 염색으로 가시화한 정제된 MazE-MazF (His)6 복합체, MazF, 및 (His)6MazE 단백질의 분석을 나타낸다.
도 12a 및 12b는 (His)6MazE 및 MazF 사이의 화학량론적 복합체 형성을 입증하는 천연 폴리아크릴아미드 겔을 나타낸다.
도 13은 MazF 및 MazE-MazF(His)6 복합체의 측정된 분자량을 도시하는 단백질 분자량 표준 곡선의 직선 그래프를 도시한다.
도 14a, 14b 및 14c는 mazEF 프로모터 DNA에 대한 (His)6MazE 및/또는 MazF의 결합을 도시하는 EMSA 겔을 나타낸다.
도 15는 MazE 동족체의 아미노산 서열을 정렬한 도면이다. 8개의 MazE 계열 단백질의 서열 정렬이 나타나 있다.
도 16a 및 16b는 단백질-DNA 상호작용을 도시하는 EMSA 겔을 나타낸다. 도 16a 및 16b에 나타낸 바와 같이, MazE N-말단 도메인은 각각 MazE-MazF(His)6 복합체 및 (His)6MazE 단백질의 DNA 결합을 매개한다.
도 17은 MazE 및 이의 절두형을 도시하고, MazF 및 MazE 또는 이의 절두체/단편 사이의 상호작용을 지시하는 효모 2-하이브리드 검정의 결과를 나타낸다.
도 18a 및 18b는 단백질 상호작용을 도시하는 천연 폴리아크릴아미드 겔 및 단백질-DNA 상호작용을 도시하는 EMSA 겔을 각각 나타낸다.
도 19는 MazE-MazF 복합체의 X-선 구조를 도시한다.
도 20a 및 20b는 이. 콜라이 MazF의 핵산 및 아미노산 서열을 나타낸다.
도 21a 및 21b는 이. 콜라이 MazE의 핵산 및 아미노산 서열을 나타낸다.
도 22a 내지 22h는 이. 콜라이 MazF 상동체의 핵산 서열을 나타낸다.
도 23a 내지 23h는 이. 콜라이 MazF 상동체의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 24a 내지 24g는 이. 콜라이 MazE 상동체의 핵산 서열을 나타낸다.
도 25a 내지 25g는 이. 콜라이 MazE 상동체의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 26a 내지 26c는 DNA 및 단백질 합성에 대한 PemK 의 효과를 나타낸다. 도 26a 및 26b는 PemK의 (A) DNA 및 (B) 단백질의 생체내 합성에 대한 효과를 나타내는 직선 그래프이다. 도 26c는 PemK 유도후 총 세포성 단백질의 SDS-PAGE 분석을 나타낸다.
도 27a 내지 27c는 SDS-PAGE에 의해 분리된 단백질의 오토다이아그램을 나타낸다. 결과는 세포-부재 단백질 합성에 대한 PemK 및 PemI의 효과를 나타낸다.
도 28a 내지 28e는 PemK 매개된 엔도리보뉴클레아제 활성을 입증하는, 폴리아크릴아미드 겔 (A) 또는 폴리아크릴아미드 겔(B-E)의 오토다이아그램의 사진이다.
도 29a 내지 29b는 일본쇄 RNA에 대한 PemK 매개된 엔도리보뉴클레아제 활성의 특이성을 입증하는, 폴리아크릴아미드 시퀀싱 겔 (A) 및 폴리아크릴아미드 겔(B)의 오토다이아그램의 사진이다.
도 30a 내지 30d는 생체내에서 다양한 mRNA에 대한 PemK 매개된 엔도뉴클레오분해 활성을 도시하는 노던 블롯 분석(A) 또는 폴리아크릴아미드 겔의 오토다이아그램(B-D)을 나타낸다.
도 31a 및 31b는 이. 콜라이 PemK의 핵산 및 아미노산 서열을 도시한다.
도 32a 및 32b는 이. 콜라이 PemI의 핵산 및 아미노산 서열을 도시한다.
도 33은 PemK, ChpBK 및 MazF 폴리펩타이드의 서열 정렬을 도시한다.
도 34는 PemK, ChpBK, MazF, 및 마이코박테리움 셀라툼(Mycobacterium celatum), 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) KT2440 및 쉬겔라 플렉스네리(Shigella flexneri) 2a str. 301로부터의 3개의 PemK-유사 단백질의 서열 정렬을 도시한다.
도 35는 성숙한 사람 에오탁신의 핵산 및 아미노산 서열을 도시한다 (서열번호 67 및 68, 각각).
도 36은 pCold I 벡터의 도식이다.
도 37은 백그라운드 단백질 합성의 부재하에 성숙한 사람 에오탁신의 생산을 나타내는 폴리아크릴아미드 겔의 오토라디오그램을 도시한다.
도 38a 내지 38f는 MazF 독소를 발현하도록 유도되고(D-F) 유도되지 않은 (A-C) 사람 세포의 형태를 도시하는 마이크로그래프이다.
도 39a 내지 39b는 (A) pET28a와 함께 발현된 MazF (E24A) 돌연변이체의 N-말단 연장부의 아미노산 서열 및 (B) 비절단된 MazF 돌연변이체 융합 단백질(레인 1) 및 트롬빈 절단된 MazF 돌연변이체 융합 단백질(레인 2)에 상응하는 밴드를 도시하는 폴리아크릴아미드 겔의 사진이다.
도 40은 MazF-mtl mRNA 인터페라제 활성의 프라이머 연장 분석을 도시한다.
도 41a 내지 b는 (A) 이. 콜라이 MazF 및 엠. 튜베르쿨로시스(M. tuberculosis)에서 이의 동족체 및 (B) 이. 콜라이 MazF 및 비.서브틸리스 (B. subtilis), 비. 안트라시스 (B. anthracis) 및 에스. 아우레우스(S.aureus)에서의 이의 동족체의 서열 정렬을 나타낸다.
도 42는 mazF 개방 판독 프레임(ORF)의 RNA 서열을 도시한다. 모든 ACA서열은 회색으로 표시되고, 암호화되는 MazF 아미노산 서열을 변화시키지 않고 ACA 서열을 치환하는 염기 변화는 RNA 서열의 상단에 도시되어 있다.
도 43a 내지 43e는 엠.튜베르쿨로시스 내의 이. 콜라이 MazF 동족체의 핵산 서열을 도시한다.
도 44a 내지 44e는 엠.튜베르쿨로시스내의 이. 콜라이 MazF 동족체의 아미노산 서열을 도시한다.
도 45a 내지 45d는 마이코박테륨 셀라툼(Mycobacterium celatum), 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) KT2440 및 쉬겔라 플렉스네리(Shigella flexneri) 2a str. 301 및 ChpBK 로부터의 3개의 PemK-유사 단백질의 핵산 서열을 나타낸다.
도 46a 내지 46d는 마이코박테륨 셀라툼(Mycobacterium celatum), 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) KT2440 및 쉬겔라 플렉스네리(Shigella flexneri) 2a str. 301 및 ChpBK 로부터의 3개의 PemK-유사 단백질의 아미노산 서열을 나타낸다.
다음 실시예는 당업자들에게 본 발명의 분석법, 스크리닝 및 치료 방법을 고안하고 사용하는 방법에 관한 완전한 설명 및 기술을 제공하기 위해 제시되며, 이의 발명으로서 간주하는 범주를 제한하기 위함이 아니다. 사용된 수(예를 들어, 양, 온도 등)에 대한 정확성을 보장하기 위해 노력하였지만, 일부 실험 오차 및 편차가 고려되어야 한다. 달리 명시하지 않는 한, 부 및 중량부, 분자량은 평균 분자량이며, 온도는 섭씨 단위이며, 압력은 대기압이거나 거의 대기압이다.
다음 프로토콜은 본 발명의 실시를 용이하게 하기 위해 제공된다.
실시예 I
본원에서 기술하는 바와 같이, 톨루엔 처리에 의해 투과성이 된 이. 콜라이세포를 MazF가 해독을 억제하지만, RNA 합성 또는 DNA 복제는 억제하지 않는다는 것을 입증하기 위해 사용하였다. 또한, MazF는 리보솜과 독립적인 방식으로 ACA 서열에서 특이적으로 A와 C 잔기 사이에서 mRNA를 절단하는 것으로 나타났다. 따라서, 본 발명은 MazF가 특정 부위에서 mRNA를 절단함으로써 mRNA 작용을 억제함을 입증한다. 따라서, 본 발명자들은 MazF가 신규한 엔도리보뉴클레아제임을 발견하고 본원에서 이를 "mRNA 인터페라제"로서 명명하였다.
방법 및 재료
균주 및 플라스미드. 이. 콜라이 BL21(DE3), BW25113[참조: Datsenko and Wanner, Proc Natl Acad Sci USA 97,6640-5 (2000)] 및 MRE600[참조: Swaney et al.,Antimicrob Agents Chemother 42,3251-5 (1998)]를 사용하였다. 플라스미드 pET-21cc-MazEF는 pET-21cc(제조원: Novagen)로부터 작제하여, T7 프로모터의 조절하에 MazE 및 MazF(His)6 둘다를 발현하도록 변형시켰다. 그러나, 샤인-달가노(Shine-Dalgarno; SD) 서열은 mazEF 오페론으로부터 유도하였다. 플라스미드 pET-28a-MazE를 pET-28a(제조원: Novagen)를 사용하여 (His)6MazE를 발현하도록 작제하였다. pBAD-MazF를 pBAD[참조: Guzman et al., J Bacteriol 177, 4121-30 (1995)]를 사용하여 아라비노스(0.2%) 첨가 후에 mazF 발현을 엄중하게 조절하도록 작제하였다.
톨루엔-처리된 세포에서의 단백질, DNA 및 RNA 합성의 분석. pBAD-MazF 플라스미드를 함유하는 이. 콜라이 BW25113의 배양물 50ml을 37℃에서 글리세롤-M9 배지에서 증식시켰다. 배양물의 OD600가 0.6에 도달하면, 아라비노스를 최종 농도가 0.2%가 되도록 첨가하였다. 37℃에서 10분 동안 항온처리한 후, 세포를 1% 톨루엔으로 처리하였다[참조: Halegoua et al., Eur J Biochem 69, 163-7(1976)]. 톨루엔-처리된 세포를 이용하여, 단백질 합성을 이미 기술된 바와 같이 35S-메티오닌으로 수행하였다[참조: Halegoua et al. ,JBacteriol 126, 183-91 (1976)]. 톨우엔-처리된 세포를 실온에서 0.05M 인산칼륨 완충액(pH 7.4)으로 1회 세척한 다음, 동일한 완충액 속에 재현탁시켜, [α-32P]dTTP를 이미 기술된 바와 같이 사용하여 DNA 합성을 검사하였다[참조: Moses and Richardson, Proc Natl Acad Sci USA 67,674-81 (1970)]. RNA 합성을 분석하기 위해, 톨루엔-처리된 세포를 실온에서 0.05M Tris-HCl 완충액(pH 7.5)으로 1회 세척한 다음, 동일한 완충액 속에 재현탁시켜, 이미 기술된 바와 같이 RNA로의 [α-32P]UTP 혼입을 측정하였다[참조: Peterson et al. , J Bacteriol 107, 585-8 (1971)].
생체내 단백질 합성의 분석. pBAD-MazF를 함유하는 이. 콜라이 BW25113 세포를 글리세롤-M9 배지에서 증식시켰다. 배양물의 OD600가 0.6에 도달하면, 배양물을 2개의 동일한 부분으로 나누었다. 한 부분에, 아라비노스를 최종 농도가 0.2%가 되도록 첨가하고, 두번째 부분에 물을 첨가하였다. 도 2d에 명시된 상이한 시간 간격으로 배양물 1ml을 2 μCi 35S-메티오닌을 함유하는 시험관으로 옮기고, 혼합물을 37℃에서 1분 동안 항온처리하였다. 이어서, 반응 혼합물 50㎕을 여과지 디스크(Whatman 3mm, 2.3cm 직경)에 적용하였다. 필터를 이미 기술된 바와 같이 5% TCA 용액으로 처리하고[참조: Hirashima and Inouye, Nature 242,405-7 (1973)], 방사성을 액체 섬광 계수기를 사용하여 정량하였다. 반응 혼합물의 나머지 500㎕를 100% TCA 요액 25㎕ 및 100㎕/ml 비방사성 메티오닌을 함유하는 급냉된 시험관에 주입하였다. 혼합물을 빙욕에서 60분 동안 항온처리하였다. 펠렛을 원심분리후 수집하고, 혼합물을 수욕에서 30분 동안 비등시킴으로써 50㎕ SDS-PAGE 로딩 완충액(loading buffer)에 용해시켰다. 불용성 물질을 제거한 후, 상청액(10㎕)을 SDS-PAGE로 분석하였다.
MazF(His)6 및 (His)6MazE 단백질의 정제. C-말단에서 태그된 MazF(His)6를 pET-21cc-MazEF를 보유한 균주 BL21(DE3)로부터 정제하였다. MazF(His)6와 MazE의 복합체를 먼저 Ni-NTA 수지에서 정제하였다. 6M 구아니딘-HCl 중에서 MazE를 MazF(His)6로부터 해리시킨 후, MazF(His)6을 Ni-NTA 수지에서 재정제하고 단계-단계 투석으로 재폴딩시켰다. N-말단에서 태그된 (His)6MazE를 pET-28a-MazE를 보유하는 균주 BL21(DE3)로부터 정제하였다.
원핵성 및 진핵성 세포 부재 시스템에서의 단백질 합성에 대한 MazF의 효과
원핵성 세포 부재 단백질 합성을 이. 콜라이 T7 S30 추출 시스템(제조원: Promega)으로 수행하였다. 반응 혼합물은 최종 용적 24㎕ 중의 S30 예비혼합물 10㎕, S30 추출물 7.5㎕ 및 아미노산 혼합물 2.5㎕(메티오닌을 제외한 모든 아미노산을 각각 1mM씩 포함), 35S-메티오닌 1㎕ 및 상이한 양의 MazF(His)6 및 (His)6MazE으로 이루어졌다. 반응 혼합물을 37℃에서 10분 동안 항온처리하고, pET-1la-MazG 플라스미드-DNA(0.16㎍/㎕)를 첨가하여 분석을 개시하였다[참조: Zhang and Inouye, J Bacteriol 184, 5323-9 (2002)]. 반응을 37℃에서 1시간 동안 수행하고, 단백질을 아세톤으로 침전시키고 SDS-PAGE로 분석하였다. 진핵성 세포 부재 단백질 합성을 PCR DNA용 토끼 망상적혈구 용해물 시스템 TNTR T7 Quick(제조원; Promega)으로 수행하였다. T7 프로모터의 조절하에 사람 단백질을 암호화하는 DNA 단편을 mRNA 전사를 위한 주형으로서 사용하였다. 반응을 37℃에서 1시간 동안 수행하고, 단백질을 아세톤으로 침전시키고 SDS-PAGE로 분석하였다.
폴리좀 프로파일. 밤새 배양한, pBAD-MazF 플라스미드를 함유한 이. 콜라이 BW25113를 신선한 글리세롤-M9 배지에 50배로 희석시켰다. 37℃에서 5시간 동안 항온처리한 후, 아라비노스를 최종 농도가 0.2%가 되도록 첨가하였다. MazF를 10분 동안 유도하고, 클로람페니콜을 최종 농도가 100㎍/ml가 되도록 첨가하였다. 세포 펠렛을 원심분리하여 수집하고, 10mM MgCl2, 60mM NH4Cl, 1mM DTT 및 1mg/ml 라이소좀을 함유하는 10 mM Tris-HCl(pH 7.8) 1ml에 재현탁시켰다. 액체 질소를 사용하여 2회 동결 및 해동시킨 후, 용해물을 Beckman TLA 100.3 로터에서 20분 동안 24,000rpm으로 원심분리하였다. 상청액(300㎕)를 폴리좀 프로파일화를 위해서 5 내지 40% 슈크로스 구배에 부하하였다. 유사한 실험을 아라비노스를 첨가하지 않고 수행하였다. 리보솜 패턴을 OD280에 의해 검출하였으며, 구배는 좌측(40%)에서 우측(5%)으로 전개시켰다. 카수가마이신을 최종 농도가 명시된 500㎍/ml가 되도록 첨가하였다.
이. 콜라이 70S 리보솜의 제조. 70S 리보솜은 약간 변형을 가하여 이미 기술된 바와 같이 이. 콜라이 MRE 600으로부터 제조하였다[참조: Aoki et al., Antimicrob Agents Chemother 46,1080-5 (2002); Du andBabitzke, J Biol Chem 273,20494-503 (1998); Hesterkamp et al., J Biol Chem 272,21865-71 (1997)]. 세균 세포(2g)를 완충액 A[10mM MgCl2, 60 mM NH4Cl 및 6mM 2-머캅토에탄올을 함유하는 10mM Tris-HCl(pH 7.4)]에 현탁시켰다. 세포를 프렌치 프레스를 사용하여 용해시켰다. RNase-비함유 DNase와 함께 항온처리한 후(0℃에서 30분간), 세포 파편을 Beckman 50Ti 로터에서 4℃에서 30분 동안 30,000rpm으로 2회 원심분리하여 제거하였다. 이어서, 상청액(최상층의 3/4)을 동일한 용적의 완충액 B(0.5M NH4Cl을 함유하는 완충액 A) 중의 1.1M 슈크로스에서 용해시키고, Beckman 50Ti 로터에서 4℃에서 15시간 동안 동안 45,000rpm으로 원심분리하였다. 완충액 A로 세척한 후, 리포솜 펠렛을 완충액 A에 재현탁시키고, 완충액 A에서 생성된 선형 10 내지 30%(wt/vol) 슈크로스 구배에 적용시키고, Beckman SW40Ti 로터에서 4℃에서 15시간 동안 동안 20,000rpm으로 원심분리하였다. 구배를 분획화시키고, 70S 리보솜 분획을 모으고 Beckman 50Ti 로터에서 4℃에서 20시간 동안 동안 45,000rpm으로 펠렛화시켰다. 70S 리보솜 펠렛을 완충액 A에 재현탁시키고 -80℃에서 저장하였다.
프라이머 연장 억제(토프린팅(toeprinting)) 분석법. 토프린팅을 약간 변형시켜 이미 기술된 바와 같이 수행하였다[참조: Moll and Blasi, BiochemBioplzys Res Coffznzun 297,1021-1026 (2002)]. mazG mRNA, 및 mazG mRNA의 염기 65번 내지 85번에 상보적인 32P-말단-표지된 DNA 프라이머를 함유하는 프라이머-주형 어닐링용 혼합물을 65℃에서 5분 동안 항온처리한 다음, 실온으로 천천히 냉각시켰다. 리보솜-결합 혼합물은 최종 용적 20㎕ 중에 10 x 완충액[100mM MgCl2, 600mM NH4Cl 및 10mM DTT을 함유하는 100mM Tris-HCl(pH 7.8)] 2㎕, 상이한 양의 MazF(His)6, 0.375mM dNTP, 0.5μM 70S 리보솜 서브유닛, 2.5μM tRNAfMet 및 어닐링 혼합물 2㎕을 함유하였다. 최종 mRNA 농도는 0.05μM이었다. 상기 리보솜-결합 혼합물을 37℃에서 10분 동안 항온처리한 다음, 역전사효소(2U)를 첨가하였다. cDNA 합성을 37℃에서 15분 동안 수행하였다. 반응을 서열화 로딩 완충액 12㎕를 첨가하여 반응을 종결시켰다. 샘플을 6% 폴리아크릴아미드 서열화 겔에서 전기영동하기 전에 90℃에서 5분 동안 항온처리하였다. mazG mRNA를 시험관내에서 T7 RNA 폴리머라제를 사용하여 T7 프로를 함유하는 173-bp DNA 단편으로부터 합성하였다. DNA 주형으로서 pET-11a-MazG 플라스미드를 사용한 PCR 증폭에 의해 T7 프로모터와 +1 내지 +153의 mazG mRNA로 이루어진 DNA 단편을 수득하였다.
페놀 추출 후 mazG mRNA의 토프린팅. 70S 리보솜 및 tRNAfMet를 누락시켰다는 것을 제외하고는 상기한 바와 동일한 방식으로 실험을 수행였다. 프라이머 연장 전에 반응 혼합물을 페놀-추출하여 단백질을 제거하였다.
돌연변이 플라스미드의 작제. 부위-지시된 돌연변이유발을 DNA 주형으로서 pET-11 a-MazG 플라스미드를 사용하여 수행하였다. DNA 서열 분석으로 돌연변이를 동정하였다.
RNA 분리 및 노던 블롯 분석. pBAD-MazF를 함유하는 이. 콜라이 BW25113를 37℃에서 글리세롤-M9 배지에서 증식시켰다. OD600 값이 0.8에 도달하면, 아라비노스를 최종 농도가 0.2%가 되도록 첨가하였다. 샘플을 도 4d에 명시한 바와 같이 상이한 간격으로 취하였다. 전체 RNA를 고온-페닐 방법을 이미 기술된 바와 같이 사용하여 분리하였다[참조: Sarmientos et al., Cell 32, 1337-46 (1983)]. 노던 블롯 분석을 이미 기술된 바와 같이 수행하였다[참조: Baker and Mackie, Mol Microbiol 47, 75-88 (2003)].
도면에 관한 특수한 방법론적 상세설명
도 1a에 도시한 바와 같이, MazF 발현은 세포에 독성 효과를 미친다. 이. 콜라이 BW25113(AaraBAD) 세포를 각각 pBAD-MazF, pBAD-MazF R29S orpBAD- MazF R86G 플라스미드로 형질전환시켰다. 세포를 아리비노스(0.2%)의 존재 및 부재하에 글리세롤-M9 플레이트에 도말하고, 접종된 플레이트를 37℃에서 24시간 동안 항온처리하였다. 도 1b는 에스케리치 콜라이의 MazF의 서열 정렬(NP_289336.1)을 바실러스 할로두란스(NP_244588.1), 스타필로코쿠스 에피더미디스(AAG23809. 1), 스타필로코쿠스 아우레우스(NP_372592.1), 바실러스 서브틸리스(1NE8_A), 네이세리아 메닝기티데스(NP_266040.1), 모르가넬라 모르가니(AAC82516.1) 및 마이코박테리움 투베로큘로시스(NP_217317.1)의 MazF의 서열 정렬과 함께 도시한 것이다.
도 2a에는 톨루엔 처리된 세포에서의 35S-Met의 혼입에 대한 MazF 발현의 효과를 나타낸다. 구체적으로, pBAD-MazF를 함유하는 이. 콜라이 BW25113 세포를 37℃에서 글리세롤-M9 배지에서 증식시켰다. 배양물의 OD600가 0.6에 도달하면, 아라비노스를 최종 농도가 0.2%가 되도록 첨가하였다. 37℃에서 10분 동안 항온처리한 후, 세포를 톨루엔으로 처리하였다[참조: Halegoua et al., J Bacteriol 126, 183-91(1976)]. 톨루엔-처리된 세포를 사용하여, 단백질 합성을 이미 기술한 바와 같이 35S-메티오닌으로 수행하였다[참조: Halegoua et al., Eur J Biochem 69, 163-7 (1976)]. 도 2b에는 톨루엔-처리된 세포에서의 [α-32P] dTTP 혼입에 대한 MazF의 효과를 나타낸다[참조: Moses and Richardson, Proc Natl Acad Sci USA67, 674-81 (1970)]. 도 2c에는 톨루엔-처리된 세포에서의 MazF on[α-32P] UTP 혼입에 대한 MazF의 효과를 나타낸다[참조: Peterson et al. ,JBacteriol 107, 585-8 (1971)]. 도 2d에는 생체내 35S-Met 혼입에 대한 MazF의 효과를 나타낸다. pBAD-MazF를 함유하는 이. 콜라이 BW25113로의 35S-Met 혼입은 명시한 바와 같은 MazF 유도 후 다양한 시점에서 측정하였다. 도 2e는 MazF의 유도 후 생체내 단백질 합성의 SDS-PAGE 분석을 도시한 것이다. 도 2e에서 사용된 배양물은 도 2d에 도시한 것과 동일하다.
도 3a은 폴리좀 프로파일에 대한 MazF의 효과를 도시한다. 리보솜 패턴을 OD260에 의해 검출하였으며, 구배는 좌측(40%)에서 우측(5%)으로 전개시켰다. 70, 50 및 30S 리보솜의 위치는 명시한다. 도 3b는 이. 콜라이 T7 S30 추출 시스템(제조원: Promega)를 사용한 원핵성 세포 부재 단백질 합성에 대한 MazF(His)6의 효과를 예시한 것이다. 레인 C에는 MazF(His)6을 첨가하지 않고; 레인 1 내지 5에는 각각 77, 154, 231, 308 및 384nM MazF(His)6을 첨가하고; 레인 6 내지 10에는 각각 384nM MazF(His)6을 첨가하였으며, (His)6MazE 대 MazF(His)6의 비는 각각 0.1, 0.2, 0.4, 0.8 및 1.2였다. 도 3c에는 PCR DNA용 토끼 망상적혈구 용해물 시스템 TNTR T7 Quick(제조원: Promega)를 사용한 진핵성 세포 부재 단백질 합성에 대한 MazF(His)6의 효과를 나타낸다. 레인 1은 (His)6MazE 및 MazF(His)6을 첨가하지 않고; 레인 2에는 0. 66JμM MazF(His)6을 첨가하고; 레인 3에는 0.9μM(His)6MazE 및 0.66μM MazF(His)6,를 첨가하였으며, (His)6MazE 대 MazF(His)6의 비는 1.2 : 1이었다.
도 4a는 MazF의 존재하에 mazG mRNA의 토프린팅을 도시한다. mRNA는 시험관내에서 T7 RNA 폴리머라제를 사용하여 T7 프로모터를 함유하는 173-bp DNA 단편으로부터 합성하였다. DNA 단편(T7 프로모터 및 +1 내지 +153의 mazG mRNA)을 pET-11a-MazG 플라스미드 DNA를 사용하여 PCR 증폭에 의해 수득하였다. 레인 1에는 MazF(His)6 및 70S 리보솜을 첨가하지 않고; 레인 2에는 2.6M MazF(His)6을 첨가하고 70S 리보솜을 첨가하지 않고; 레인 3에는 0.5M 70S 리보솜을 첨가하고 MazF(His)6을 첨가하지 않고, 레인 4 내지 8에는 각각 0.5μM 70S 리보솜 및 0.35μM, 0.7μM, 1.4μM, 2.1μM 및 2.6μM MazF(His)6을 첨가하였다. 도 4b에는 페놀 추출 후의 mazG mRNA의 토프린팅을 나타낸다. 실험은, 프라이머 연장 전에 반응 생성물을 페놀 추출하여 단백질을 제거한다는 점을 제외하고는 도 4a의 레인 1 및 2에 기술한 바와 동일하게 수행하였다. 레인 1에는 MazF(His)6을 첨가하지 않고, 레인 2에는 2.6μM MazF(His)6을 첨가하였다. 도 4c는 MazG mRNA의 MazF 절단에 대한 MazE의 효과를 도시한다. 레인 1에는 MazF(His)6 및 (His)6MazE을 첨가하지 않고; 레인 2에는 8.8μM (His)6MazE을 첨가하고; 레인 3에는 2.2μM MazF(His)6를 첨가하고, 레인 4 내지 7에는 2.2μM MazF(His)6을 첨가하였으며, (His)6MazE 대 MazF(His)6의 비는 각각 0.25, 0.4, 0.8 및 1.0이었다. 도 4d는 생체내 세포성 mRNA에 대한 MazF의 효과를 도시한다. 총 세포성 RNA를 아라비노스(지시됨)의 부가 후 다양한 시점에서 pBAD-MazF를 함유하는 이. 콜라이 BW25113 세포로부터 추출하고, 방사성표지된 ompA 및 lpp ORF DNA를 프로브로서 사용하는 노던 블롯 분석에 적용시켰다.
도 5는 폴리좀 프로파일에 대한 카수가마이신의 효과를 입증한다. 실험은 상기한 바와 같이 수행하였다. 리보솜 패턴을 OD260에 의해 검출하고, 구배를 좌측(40%)에서 우측(5%)으로 전개시켰다. 70, 50 및 30S 리보솜의 위치가 지시되어 있다.
도 6은 리보솜에 의한 mazG mRNA의 MazF 절단 억제를 도시한다. 반응은 상기한 바와 같이 수행하였다. 레인 1에는 MazF(His)6 및 70S 리보솜을 첨가하지 않고; 레인 2에는 2.6μM MazF(His)6 을 첨가하고 70S 리보솜은 첨가하지 않고; 레인 3에는 0.5μM 70S 리보솜을 첨가하고 MazF(His)6은 첨가하지 않고; 레인 4에서는, mazG mRNA 및 70S 리보솜을 37℃에서 10분 동안 항온처리하고 이어서 2.2μM MazF(His)6을 프라이머 연장 전에 37℃에서 다시 10분 동안 혼합물에 첨가하였다; 레인 5에서는, 70S 리보솜 및 MazF(His)6을 먼저 혼합하고, 37℃에서 10분 동안 항온한 후에 mazG mRNA를 첨가하고 37℃에서 추가로 10분 동안 항온처리한 다음, 프라이머 연장시켰다; 레인 6에서는, mazG mRNA 및 MazF(His)6을 혼합하고 37℃에서 10분 동안 항온처리한 후에, 70S 리보솜을 혼합물에 첨가하고, 이를 프라이머 연장 전에 37℃에서 10분 동안 항온처리하였다. FL, 전체길이 mazG mRNA; TP(s), 2차 구조로 인해 중지된 부위; TP(F), MazF 절단으로 인한 토프린트 부위; 및 TP(r), mazG mRNA에의 리보솜 결합으로 인한 토프린트 부위.
도 7은 MazF 기능에 대한 mazG mRNA의 샤인-달가노 서열의 GGAG에서 UUUG로의 돌연변이 효과를 나타낸다. 반응은 상기한 바와 같이 수행하였다. 레인 1 내지 4에는 야생형 mazG mRNA를 첨가하고; 레인 5 내지 8에는 샤인-달가노 서열에서의 GGAG에서 UUUG로의 돌연변이를 갖는 돌연변이체 mazG mRNA를 첨가하였다. 레인 1 및 5에는 MazF(His)6 및 70S 리보솜을 첨가하지 않고; 레인 2 및 6에는 2.6μM MazF(His)6을 첨가하지만 70S 리보솜은 첨가하지 않고; 레인 3 및 7에는 0.5μM 70S 리보솜을 첨가하지만, MazF(His)6은 첨가하지 않고, 레인 4 및 8에는 0.5μM 70S 리보솜과 2.2μM MazF(His)6을 첨가하였다. 좌측 방향에서 마커의 표시는 도 6과 동일하다.
도 8은 MazF 기능에 대한 mazG mRNA의 개시 코돈에서의 돌연변이의 효과를 나타낸다. 반응은 상기한 바와 같이 수행하였다. 레인 1내지 4에는 야생형 mazG mRNA를 첨가하고; 레인 5 내지 8에는 개시 코돈이 GUG로 변경된 돌연변이체 mazG mRNA를 첨가하고; 레인 9 내지 12에는 개시 코돈이 AGG로 변경된 돌연변이체 mazG mRNA를 첨가하였다. 레인 1, 5 및 9에는 MazE(His)6 및 70S 리보솜을 첨가하지 않고; 레인 2, 6 및 10에는 2.6μM MazF(His)6을 첨가하지만 70S 리보솜은 첨가하지 않고; 레인 3, 7 및 11에는 0.5μM 70S 리보솜을 첨가하지만 MazF(His)6을 첨가하지 않고; 레인 4, 8 및 12에는 0.5μM 70S 리보솜과 2.2μM MazF(His)6을 첨가하였다. 좌측 방향에서 마커의 표시는 도 6과 동일하다.
도 9는 MazF 기능에 대한 UACAU(U1A2C3A4U5) 절단 서열에서의 돌연변이의 효과를 나타낸다. 반응 혼합물을 상기한 바와 같이 수행하였다. 레인 1 및 2에는 대조군으로서 야생형 mazG mRNA이 존재한다. 모든 돌연변이는 화살표로 표시한다. 레인 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29 및 31에는 MazF(His)6을 첨가하지 않고; 레인 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 및 32에는 2.6μM MazF(His)6을 첨가한다. 좌측 방향에서 마커의 표시는 도 6과 동일하다.
도 10은 16S 및 23S rRNA의 절단에 대한 MazF 및 MazE의 효과를 나타낸다. 반응은 10mM MgCl2, 60mM NH4Cl, 1mM DTT, 0.5㎕ 사람 태반 RNase 억제제(제조원: Roche), 5.6μM MazF(His)6 및/또는 17.6μM(His)6 MazE를 총 용적 10㎕ 중에 함유하는 10mM Tris-HCl(pH 7.8) 중에서 수행하였다. 37℃에서 10분 동안 항온처리한 후, 로딩 완충액 2㎕을 첨가하여 반응을 중지시켰다. 샘플을 3.5% 아크릴아미드 겔에서 분석하였다. 레인 1에는 MazF(His)6을 첨가하지 않고; 레인 2에는 5.2μM MazF(His)6을 첨가하고; 레인 3에는 17.6μM (His)6MazE을 첨가하고; 레인 4에는 5.2μM MazF(His)6 및 17.6μM(His)6 MazE을 첨가하였다. 23S 및 16S rRNA 및 tRNA의 위치는 화살표로 표시한다.
결과
mazF 유전자를 아라비노스 유도성 pBAD 플라스미드로 클로닝하였다[참조: Guzman et al., J Bacteriol 177, 4121-30 (1995)]. pBAD-MazF를 보유한 이. 콜라이 BW25113은 아라비노스(0.2%)의 존재하에 글리세롤-M9 플레이트에서 증식하지 못하였다(도 1a 참조). MazF 동족체 간에 고도로 보존된 잔기인 Arg29 또는 Arg86를 각각 Ser 또는 Gly로 치환시킨 경우(도 1b), 아라비노스 민감성은 제거되었다(도 1a). 당해 결과는 관찰된 세포 증식 억제가 야생형 MazF의 존재 때문이었음을 나타냈다. 액체 배지에서, 세포 생존성은 5분 동안 아라비노스를 첨가한 후에 104 감소하였다.
MazF에 의해 억제된 세포 작용을 동정하기 위해, 톨루엔 처리로 투과성이 된 pBAD-MazF를 보유한 이. 콜라이 BW25113로부터 제조된 세포 부재 시스템을 사용하였다[참조: Halegoua et al., J Bacteriol 126, 183-91 (1976); Halegoua et al., Eur JBiochem 69,163-7 (1976)]. ATP-의존적 35S-메티오닌 혼입은 세포를 톨루엔 처리 전에 아라비노스의 존재하에 10분 동안 예비항온처리시킨 경우 완전히 억제되었다(도 2a). 그러나, [(α-32P]dTTP의 혼입[참조: Moses and Richardson, Proc Natl Acad Sci USA 67, 674-81 (1970)](도 2b) 및 [α-32P]UTP의 혼입[참조: Peterson et al., J Bacteriol 107, 585-8 (1971)](도 2c)은 유사한 조건하에 영향을 받지 않았다. 이러한 결과는 MazF가 단백질 합성을 억제하지만, DNA 복제 또는 RNA 합성은 억제하지 않음을 입증한다. 35S-메티오닌의 생체내 혼입[참조: Hirashima and Inouye, Nature 242, 405-7(1973)]은 톨루엔으로 처리되지 않은 세포를 사용하여 아라비노스를 첨가한 후에 급격하게 억제되었다(도 2d). 아라비노스 첨가 후 상이한 시점에서의 전체 세포성 단백질 합성의 SDS-PAGE 분석(도 2e)는 MazF가 단백질 합성의 전반적 억제제로서, 모든 세포성 단백질에 본질적으로 영향을 미친다는 것을 보여주었다. 흥미롭게도, 보다 큰 단백질의 합성은 보다 소형 단백질의 합성에 비해서 MazF 독성에 보다 민감하였다.
pBAD-MazF 세포를 보유한 이. 콜라이 BW25113 세포의 폴리좀 패턴의 분석을 10분간의 아라비노스 유도 후 슈크로스 밀도 구배에 의해 수행하였다. 도 3a에 도시한 바와 같이, 폴리좀은 상기 세포에서 완전히 소멸되었으며, 동시에 70S 리보솜 분획은 증가되었으며 30S 또는 50S 리보솜 분획에서 유의적 변화는 없었다. 세포를 해독 개시를 억제하는 항생제인 카수가마이신으로 처리한 경우 폴리좀 패턴의 유사한 변화가 관찰되었다(도 5). 이러한 발견은 MazF가 해독 개시를 억제함으로써 또는 RNA를 분해시킴으로써 mRNA로부터 리보솜의 방출을 야기한다는 것을 시사한다.
또한, 후보 단백질 MazG의 합성에 미치는 정제된 MazF(His)6의 효과를 이. 콜라이 세포 부재 RNA/단백질 합성 시스템에서 검사하였다. MazF(His)6을 MazE 및 MazF(His)6 둘다를 공발현하는 세포로부터 정제하였다. 플라스미드 pET-11a-MazG로부터 MazG(30kD)의 합성[참조: Hirashima and Inouye, Nature 242, 405-7(1973)]를 증가되는 농도의 MazF(His)6의 존재 또는 부재하에 37℃에서 이. 콜라이 T7 S30 추출 시스템(제조원: Promega)을 사용하여 1시간 동안 수행하였다(도 3b). MazG 합성은 231nM 이상의 MazF(His)6 농도에서 완전히 차단되었다. 이렇게 관찰된 MazG 합성의 MazF-매개된 억제에 대한 MazE 항독소의 효과를 또한 병행하여 평가하였다. 흥미롭게도, 항독소 (His)6MazE의 공첨가는 용량 의존적 방식으로 MazG 합성을 구제하였다(도 3b). MazF(His)6은 또한 진핵성 세포 부재 단백질 합성을 억제할 수 있었으며(도 3c, 레인 2), 이러한 합성은 또한 (His)6MazE의 공첨가시 회복되었다(레인 3).
MazF가 MazG 합성을 억제하였기 때문에(도 3b), 억제 시점의 분석을 수행하였다. 억제가 해독 개시 단계에 영향을 미쳤는지를 결정하기 위해, 70S 리보솜 및 mazG mRNA를 사용하여 토프린팅(TP) 기법을 사용하였다[참조: Moll and Blasi, Biochem Biophys Res Commun 297,1021-1026 (2002)]. mazG mRNA 단독의 토프린팅으로 mazG mRNA의 5' 말단에서의 2차 구조로 인해서 전체 길이의 밴드(FL) 및 밴드 TP(s)가 산출되었다(도 4a, 레인 1). 70S 리보솜의 존재하에, 개시 코돈의 하류에 있는 토프린팅 밴드[TP(r)]이 검출되었다(레인 3). MazF(His)6를 70S 리보솜과 함께 첨가한 경우, 새로운 밴드 TP(F)가 나타났으며 이는 샤인-달가노(SD) 서열과 개시 코돈 간의 영역에 상응하였다(레인 4 내지 8). MazF(His)6 농도를 증가시키면 TP(r) 밴드 강도가 점진적으로 감소되었으며, 3.75μM MazF(His)6에서 TP(r) 밴드는 거의 완전히 소멸되었다(레인 7).
놀랍게도, TP(F) 밴드는 70S 리보솜의 부재하에서도 검출되었으며(레인 2), 이는 MazF가 70S 리보솜과 무관하게 mRNA에 결합할 수 있었거나 또는 MazF가 A 및 C 잔기 사이를 절단하는 엔도리보뉴클레아제임을 나타낸다(도 4a).
이러한 가능성들을 구별하기 위해서, mazG mRNA를 MazF(His)6와 함께 항온처리하고, 페놀-추출하여 단백질을 제거하고, 도 4b에 도시한 바와 같이 프라이머 연장을 위해 사용하였다. TP(F) 밴드는 페놀 추출 후에도 또한 관찰되었으며(레인 2), 이는 MazF(His)6이 실제로 mazG mRNA을 절단하였음을 나타낸다. mazG mRNA의 절단은 MazE를 공첨가한 경우에 다시 차단되었다(도 4c, 레인 4 내지 7). 단독의 (His)6MazE만으로는 mRNA에 검출가능한 효과를 미치지 않았다는 것이 주지된다(레인 2). 이러한 결과는 MazE의 항독성 효과가 MazF 엔도리보뉴클레아제 활성의 억제로 인한 것이었음을 나타낸다. MazF(His)6 전에 70S 리보솜을 첨가한 결과, MazF(His)6에 의한 mRNA 절단이 억제되었는데, 이는 mazG mRNA내에서 SD 서열 및 ACA 서열이 가까이 위치하기 때문일 것이다(도 6). 대조적으로, Re1E의 독성 작용은 리보솜을 필요로 한다[참조: Pedersen etal., supra, (2003)].
하기 표 I에는 검사된 상이한 mRNA 전사체내의 MazF 절단 서열을 제시한다.
[표 I]
Figure pat00002
(YeeW 제1행: 서열번호 84; YeeW 제2행: 서열번호 90; EzlvZ: 서열번호 91; lacZ: 서열번호 92) MazF 절단의 특이성을 측정하기 위해, mazG-mRNA SD 서열을 GGAG에서 UUUG로 돌연변이시키고, AUG 개시 코돈을 GUG 또는 AGG로 돌연변이시켰다. 이러한 돌연변이들 중 어떠한 것도 MazF(His)6에 의한 mazG mRNA 절단에 영향을 미치지 않았다(도 7 및 8). yeeW, envZ and lacZ 에 대한 mRNA를 기질로서 사용하고, 각각을 SD 서열 및 개시 코돈과 무관한 mRNA 전사체내의 예상되는 ACA 서열에서 절단하였다(표 I). 이들 mRNA에서, ACA 서열은 5' 말단에서 G, A 또는 T에 의해 플랭킹되어 있고 3' 말단에서 C 또는 T에 의해 플랭킹되어 있다. 이러한 발견의 견지에서, 절단 부위에 UACAU 서열을 갖는 mazG mRNA를 돌연변이시켜 5' 및 3' 말단의 U 잔기가 G, A 또는 C로 돌연변이되도록 하였다. 이러한 돌연변이들 중 어떠한 것도 절단에 어떠한 영향도 미치지 않았다(도 9). 그러나, 중심적 ACA 서열을 G CA, C CA, T CA; A G A, A T A, A A A; AC C , AC G 또는 AC T 로 변경한 경우, 절단은 관찰되지 않았으며(도 9), 이는 MazF가 ACA 서열을 인식하는 고도로 서열 특이적인 엔도리보뉴클레아제임을 나타낸다.
요약하면, 상기 결과들은 MazF가 ACA 부위에서 세포성 mRNA를 절단함으로써 세포에서의 전체 단백질 합성을 차단하는 고도로 서열 특이적인 엔도리보뉴클레아제로서 작용한다는 것을 나타낸다(도 2e). 이러한 발견을 추가 시험하기 위해, 노던 블롯 분석을 MazF의 아라비노스 유도 후에 상이한 시간 간격으로 추출된 총 세포성 RNA를 사용하여 수행하였다[참조: Baker and Mackie, Mol Microbiol 47,75-88 (2003); Sarmientos et al.,Cell 32, 1337-46(1983)]. ompA 및 lpp mRNA 둘다 분해되었다(도 4c). 이들 두 mRNA의 반감기에서 관찰된 차이는 mRNA내에 존재하는 ACA 서열의 총 수 및 mRNA 길이와 상관관계가 있었다. 예를 들어, 322 bp lpp mRNA[참조: Nakamura and Inouye, Cell 18,1109-17 (1979)]는 오직 하나의 ACA 서열만을 갖는 반면, 1229bp ompA mRNA[참조: Mowa et al., JMol Biol 143, 317-28 (1980)]는 21개의 ACA 서열을 갖는다. 이러한 상관관계는 보다 긴 mRNA가 MazF에 의해 매개된 분해에 대해 보다 짧은 mRNA에 비해 민감할 수 있음을 시사한다.
흥미롭게도, mazF ORF 내에는 총 9개의 ACA 서열이 있으며, 이중 4개는 ORF의 중심에 밀집되어 있는데, 이는 mazF 발현이 이의 자체 유전자 산물에 의해 음성적으로 자가조절될 수 있음을 시사한다. 또한, MazF(His)6이 16S 및 23S rRNA를 보다 작은 단편으로 분해시킬 수 있었지만, (His)6MazE의 존재하에서는 분해시킬 수 없음이 주지된다(도 10).
결론지으면, MazF는 고유한 3중 서열에서 절단시킴으로써 RNA 기능을 특이적으로 억제하는 신규한 엔도리보뉴클레아제이다. mRNA 기능을 간섭하는 이의 기능 때문에, 이러한 엔도리보뉴클레아제 부류는 본원에서 "mRNA 인터페라제"로 명명된다. 본원에서 제시한 결과로 이해되는 바와 같이, 상이한 서열 특이성을 갖는 추가의 mRNA 인터페라제가 존재할 가능성이 있다.
새로이 발견된 엔도리보뉴클레아제 부류 이외에, mRNA 기능의 간섭을 야기하는 것으로 공지된 몇가지 다른 기작이 있다. 이러한 한가지 기작은 이. 콜라이에서의 특이적 유전자 발현에 대한 RNA 레프레서로서 본래 특성화된 micRNA(mRNA-간섭-상보적 RNA)를 포함한다[참조: Mizuno et al, Proc NatlAcad Sci USA 81, 1966-70 (1984)]. 보다 최근에는, 유사한 RNA 요소가 miRNA[참조: Zeng and Cullen, Rna 9,112-23 (2003] 및 siRNA[참조: Billy et al., Proc Natl Acad Sci USA 98,14428-33 (2001)]로서 진핵생물에서 발견되었다. 본 연구에서 이. 콜라이에서 입증된, mRNA 인터페라제에 의해 mRNA 기능을 파괴시키는 당해 신규 기작이 진핵생물과도 관련될 수 있다는 흥미로운 가능성이 존재한다. 이는 전부는 아니지만 많은 살아있는 유기체의 세포생리학에 대한 수많은 암시를 내포할 수 있다. 게다가, 고도로 서열 특이적인 mRNA 인터페라제를 사람 질환을 치료하기 위한 치료학적 도구 뿐만 아니라 RNA의 구조 연구를 위한 생화학적 도구로서 사용할 수 있다. 주목할만하게도, 2:4 MazE/MazF 복합체의 결정 구조가 최근에 공개되었다[참조: Kamada et al., Mol Cell 11,875-884 (2003)]. 결정 구조로부터 야기된 정보는 MazF가 어떻게 ACA 서열을 특이적으로 인식하여 이를 절단하는지를 결정하는데 도움이 될 수 있다.
실시예 II
주목할 점은, 본 발명의 발견 이전에, MazF의 세포 표적(들)이 동정되지 않았다는 점이다. 본원에서 나타나는 바와 같이, MazF는 세포성 mRNA를 ACA 위치에서 절단하는 고도의 서열-특이적 엔도리보뉴클레아제로 작용한다. 상기 활성은 세포내에서 단백질 합성을 부분적으로 또는 전체적으로 억제시킬 수 있다. RNA 전사체에서 ACA 서열의 예상 빈도는, 세개의 뉴클레오티드 위치 중 하나에 네개의 뉴클레오티드 중 임의의 하나가 각각 혼입될 수 있다는 동일 확률로 예상되는 표준 계산에 근거하여, 1/64분이다. 일부 RNA 전사체는 예상 빈도와 비교하여 ACA 서열에서 낮거나 높은 빈도를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 그리하여, 특이적 RNA 전사체 또는 관련 RNA 전사체 계열의 MazF 엔도리보뉴클레아제에 의한 절단에 대한 민감성은 전사체내의 ACA 서열 또는 MazF 표적 서열의 빈도와 관련된다. 더욱이, 당업자는 RNA 전사체의 서열에 기초하여, 전사체의 MazF 매개된 절단의 민감성을 예상할 수 있다.
실시예 III
상기 기술된 바와 같이, 프로그램된 세포 사멸은 동시 발현되는 안정한 독소 및 불안정한 항독소를 암호화하는 한 쌍의 유전자로 각각 이루어진 "중독 모듈" 시스템을 통해 이. 콜라이내에 매개되는 것으로 제안된다. 이의 발현은 독소/항독소 복합체에 의해 또는 항독소만으로 자가-조절된다. 동시 발현이 억제되는 경우, 항독소는 프로테아제에 의해 신속하게 분해되고, 독소가 그 표적상에 작용하게 한다. 이. 콜라이에서 염색체외 요소는 세균의 프로그램된 세포 사멸에 대한 주요 유전 시스템이다. 가장 많이 연구된 염색체외 중독 모듈은 박테리오파아지 P1상의 pAd-doc(Lehnherr et al. (1993) J Mol Biol 233, 414-428; Lehnherr and Yarmolinsky (1995) Proc Natl Acad Sci USA 92, 3274-3277; Magnuson and Yarmolinsky (1998) J Bacteriol 180, 6342-6351; Gazit and Sauer (1999) J Biol Chem 274, 16813-16818; Gazit and Sauer (1999) J Biol Chem 274, 2652-2657), 인자 F상의 cedA-cedB (Tam and Kline (1989) J Bacteriol 171, 2353-2360; Van Melderen et al. (1994) Mol Microbiol 11,1151-1157; Bahassi et al. (1999)J Biol Chern 274, 10936-10944; Loris et al. (1999) J Mol Biol 285, 1667-1677; Afif et al. (2001) Mol Microbiol 41, 73-82; Dao- Thi et al. (2002)J Biol Chem 277, 3733-3742; Van Melderen (2002) Int J Med Microbiol 291, 537-544), 및 플라스미드 R100상의 peml-pemK (Tsuchimoto et al. (1988) J Bacteriol 170, 1461-1446; Tsuchimoto and Ohtsubo. (1989) Mol Gen genet 215, 463-468; Tsuchimoto et al. (1992) J Bacteriol 174, 4205-4211; Tsuchimoto and Ohtsubo. (1993) Mol Gen genet 237, 81-88)이다. 흥미롭게도, 이. 콜라이 염색체는 또한 몇몇 중독 모듈 시스템, 예를 들어 상기에 기술된 relBE 시스템 및 mazEF 시스템을 함유한다.
두 개의 인접한 유전자인 mazE 및 mazF로 이루어진 mazEF 시스템은 이. 콜라이 염색체상의 relA 유전자로부터 하류에 위치한다. 서열 분석으로 이들은 플라스미드 pR100상의 pemI 및 pemK 유전자에 대해 부분적으로 상동성인 것으로 밝혀졌다 (Masuda et al. (1993) J Bacteriol 175, 6850-6856). 상기 기술된 바와 같이, mazEF 시스템은 중독 모듈의 하기 특성을 나타낸다: MazF는 독성이고 MazE는 항독성이며; MazF는 안정한 반면, MazE는 생체내에서 ATP 의존성 C1pPA 세린 프로테아제에 의해 분해되는 불안정한 단백질이고 (Aizenman et al. (1996) 상기 기술); MazE 및 MazF는 동시 발현되고 서로 상호작용하여 복합체를 형성하며; mazEF의 발현은 MazE 및 MazE-MazF 복합체에 의해 음성적으로 자가-조절된다 (참고: Marianovsky et al.(2001) J Biol Chem 276,5975-5984). 상기 기술된 바와 같이, mazEF-매개된 세포 사멸은 아미노산의 극한 고갈 및 티아민 고갈에 의해 (Sat et al. (2003) 상기 기술), 독성 단백질 Doc에 의해 (Hazan et al. (2001) J Bacteriol 183, 2046-2050), 및 전사 및/또는 해독의 일반적인 억제제, 예를 들어 리팜피신, 코람페니콜 및 스펙티노마이신인 일부 항생제의 의해 (Sat et al. (2001) 상기 기술) 촉발될 수 있다 .
하기 기술되는 바와 같이, MazE, MazF 및 mazEF 프로모터 DNA 사이의 상호작용은 mazEF 프로모터 DNA에 대한 결합 및 MazF와의 상호작용에 관여하는 MazE에서 기능성 도메인을 동정하는 것으로 조사하였다. MazE는 이의 N-말단 영역에서 DNA-결합 도메인을 가지고, MazE에서 잔기 38번 내지 75번의 영역은 Leu55 및 Leu58 잔기가 필수적인 MazF에 대한 결합에 필요하다는 것이 증명되었다.
본원에서 제시되는 데이타도 또한 용액내의 MazE-MazF 복합체가 하나의 MazE 이량체 및 2개의 MazF 이량체를 포함할 수 있음을 암시한다.
방법 및 재료
시약 및 효소 - 뉴클레오티드, 암피실린 및 카나마이신이 Sigma사로부터 제공되었다. 클로닝에 사용된 제한 효소 및 DNA 변형 효소는 New England Biolabs사로부터 제공되었다. Pfu DNA 폴리머라제는 Stratagene사로부터 제공되었다. 방사성 뉴클레오티드는 Amersham Pharmacia Biotech사로부터 제공되었다.
플라스미드의 작제 - mazEF 유전자 (샤인-달가노(Shine-Dalgarno) 서열 영역을 포함)을 주형으로서 이. 콜라이 게놈 DNA를 사용하여 PCR로 증폭시켜, pET11a의 XbaI-NheI 위치로 클로닝하여, 플라스미드 pETla-EF를 제조하였다. mazEF 유전자 (샤인-달가노 서열 영역을 포함)를 PCR로 증폭시켜, pET21cc의 XbaI-XhoI 위치로 클로닝하여, MazF C-말단에서 (His)6 태그를 가진 프레임내 해독물을 제조하였다. 당해 플라스미드를 pET21cc-EF(His)6로 명명하였다. mazE 유전자를 PCR로 증폭시켜 pET28a의 NdeI-Hind III 위치로 클로닝하였다. 상기 플라스미드를 pET28a- (His)6E로 명명하였다. MazE를 트롬빈 절단 부위 앞에 N-말단 (His)6 태그 ((His)6MazE로 명명됨)를 가진 융합체로 발현시켰다. 전체 길이의 mazE 유전자 및 mazE 유전자의 각종 N-말단 및 C-말단 결실 작제물(도 17 참고)을 PCR로 생성시켜 pGAD-Cl 벡터의 EcoRI-PstI 위치로 클로닝하여, Gal4 전사적 활성 도메인을 가진 프레임내 해독 융합체를 제조하였다. 이들 플라스미드를 pGAD-MazE, pGAD-MazE△(1-13), pGAD-MazE△(1-24), pGAD-MazE△(1-37), pGAD-MazE△(1-46), pGAD-MazE△(68-82) 및 pGAD-MazE△(76-82)로 명명하였다.
전체 길이의 mazF 유전자 및 mazF 유전자의 각종 N-말단 및 C-말단 결실 작제물을 PCR로 생성시켜 pGBD-Cl 벡터의 EcoRI-BglII 위치로 클로닝하여, Gal4 DNA 결합 도메인을 가진 프레임내 해독 융합체를 제조하였다. 이들 플라스미드를 pGBD-MazF, pGBD-MazF△(1-14), pGBD-MazF△(1-25), pGBD-MazF△(72-111) 및 pGBD-MazF△(97-111)로 명명하였다.
단백질 정제 - pETlla-EF를 이. 콜라이 BL21(DE3) 균주내로 도입하였다. MazE 및 MazF를 1 mM 이소프로필-β-티오갈락토피라노시드(IPTG)의 존재하에 4시간동안 동시 발현시켰다. 상기 세포를 원심분리로 수거하여 프렌치 프레스(French press)를 사용하여 용해시켰다. 세포 용해물을 30분동안 37℃에서 유지시켜, MazE를 최대로 분해하고, 세포 파편과 용해되지 않은 세포를 10분 동안 8,000xg의 원심분리에 이어 1시간동안의 10,000xg로 초고속 원심분리로 펠렛화시켜 세포막 및 불용성 분획물을 제거하였다. MazF를 황산암모니아 분획화, 세파덱스 G-100 칼럼상의 겔 여과법, DEAE-세파로즈 및 하이드록시아파타이트 칼럼 크로마토그래피에 의해 실질적으로 정제하였다. MazF 단백질을 함유하는 분획물을 풀링(pooled)하여 농축시켰다. MazF를 슈퍼둑스(Superdux) 200 칼럼 (Pharmacia Biotech)을 사용한 겔 여과법에 의해 추가로 정제하였다.
(His)6MazE를 정제하기 위하여, pET28a-(His)6E를 이. 콜라이 BL21(DE3) 균주내로 도입시켜, (His)6MazE를 4시간동안 1mM IPTG를 사용하여 발현시켰다. (His)6MazE 단백질을 Ni-NTA (QIAGEN) 친화성 크로마토그래피에 의해 즉시 정제하였다.
pET21cc-EF(His)6을 또한 이. 콜라이 BL21(DE3) 균주내로 도입시켰다. MazE 및 MazF(His)6을 4시간동안 1 mM IPTG의 존재하에 동시 발현시켰다. MazE- MazF (His)6 복합체를 Ni-NTA (QIAGEN) 친화성 크로마토그래피로 즉시 정제하고, 겔 여과법에 의해 추가로 정제하였다. 정제된 MazE-MazF(His)6 복합체로부터 MazF(His)6을 정제하기 위해, 정제된 MazE-MazF(His)6 복합체중의 MazE를 6M 구아니딘-HCl중의 MazF(His)6로부터 분리시켰다. MazF(His)6을 Ni-NTA 수지 (QIAGEN)로 재포집시켜 단계적 투석법에 의해 재폴딩시켰다. 재폴딩 수율은 약 80%이다. MazF(His)6의 생화확적 활성을 단백질 합성 억제를 위해 이. 콜라이 T7 S30 추출 시스템 (Promega)으로 측정하였다.
전기영동 이동도 시프트 검정법 (Electrophoretic mobility shift assays; EMSA)- 두개의 일본쇄 올리고뉴클레오티드 5'- GCTCGTATCTACAATGTAGATTGATATATACTGTATCTACATATGATAGC-3' (서열번호 12) 및 3'-CGAGCATAGATGTTACATCTAACTATATATGACATAGATGTATACTATCG-5' (서열번호 13)를 합성하여 어닐링시켜 mazEF 프로모터 서열을 함유하는 50-bp 이본쇄 DNA를 생성하였다. 50-bp DNA 단편을 [γ-32P] ATP를 사용하여 T4 폴리뉴클레오티드 키나제에 의해 말단-표지화시키고 EMSA에 의해 단백질-DNA 결합을 검출하는데 사용하였다. 결합 반응물 (20㎕)을 30분동안 4℃에서 결합 완충액 [50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 5 mM MgCl2, 1 mM 디티오테리톨 및 5% 글리세롤]중의 정제된 단백질, 2㎕ 100㎍/ml 폴리(dI-dC) 및 2㎕ 표지된 DNA 단편과 함께 수행하였다. 전기영동을 6% 천연 폴리아크릴아미드 겔중의 100 V에서 TAE 완충액에서 수행하였다. 전기영동 후, 상기 겔을 건조시키고 나서, X-선 필름에 노출시켰다.
천연 PAGE - 상이한 양의 (His)6MazE 및 MazF를 30분동안 4℃에서 결합 완충액 [50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 5 mM MgCl2, 1 mM 디티오테리톨 및 5% 글리세롤]중에 혼합한 후, 2 x 로딩 용액 [40 mM Tris-HCl (pH7.5), 80 mM β-머캅토에탄올, 0.08% 브로모페놀 블루 및 8% 글리세롤]을 상기 혼합물에 첨가하고 천연 겔상에 로딩하였다. 스태킹 겔(stacking gel) 조성물은 62.5 mM Tris-HCl중의 5% 아크릴아미드-비스 (29: 1) (pH 7.5)이고, 분리 겔 조성물은 187.5 mM Tris-HCl중의 10% 아크릴아미드-비스 (29: 1) (pH8.9)이었다. 전개 완충액(전개 완충액)는 82. 6 mM Tris-HCl (pH 9.4) 및 33 mM 글리신을 함유하였다. 전기영동을 4℃에서 정전압(150 V)으로 수행하였다. 단백질 밴드를 쿠마지 브릴리언트 블루에 의해 가시화하였다.
트리신 SDS-PAGE에 의한 저분자량 단백질의 분리 - 트리신 SDS-PAGE를 상기 기술된 방법(Schagger and von Jagow, G.(1987) Anal Biochem 166, 368-379)에 따라 다음과 같이 일부 변형하여 수행하였다: 스태킹 겔: 0.75 M Tris-HCl중의 5% 아크릴아미드-비스 (48: 1.5) (pH 8.45) 및 0.075 % SDS; 스페이서 겔: 1.0 M Tris-HCl중의 10% 아크릴아미드-비스 (48: 1.5) (pH 8.45) 및 0.1% SDS; 분리용 겔: 1.0 M Tris-HCl중의 16.5% 아크릴아미드-비스 (48: 1.5) (pH 8.45) 및 0.1 % SDS. 양극 전개 완충액은 0.2 M Tris-HCl (pH 8.9)이고, 음극 전개 완충액은 0.1 M Tris 염기, 0.1 M 트리신 및 0.1% SDS이었다. 실온에서 정전류 (20mAmp)로 겔을 전개시킨 후, 단백질 밴드를 쿠마지 브릴리언트 블루로 가시화시켰다.
효모 2-하이브리드 시스템에서 MazE-MazF 상호작용의 검정법 - 효모 2-하이브리드 리포터 균주 PJ69-4A [MATa trpl-901 leu2-3, 112 ura3-52 his3-200 gal4gal80LYS2::GALl-HIS3GAL2-ADE2met::GAL7-lacZ] 및 벡터 pGAD-Cl 및 pGBD-Cl을 2-하이브리드 검정법에 사용하였다 (James et al. (1996) Genetics 144, 1425-1436). MazE에서 MazF-결합 영역을 배치시키기 위해, 일련의 mazE 유전자의 N- 및 C-말단 결실물을 pGAD-Cl내에 작제하여, pGBD-MazF 플라스미드를 사용하여 PJ69-4A 세포내로 동시에 형질전환시켰다. (도 17 참고) MazF 단백질에서 MazE-결합 영역을 배치시키기 위해, 일련의 mazF 유전자의 N- 및 C-말단 결실물을 pGBD-C1내에 작제하여, pGAD-MazE 플라스미드를 사용하여 PJ69-4A 세포내로 공동형질전환시켰다. 상기 상호작용의 검정은 Trp, Leu, His 및 아데닌 (Ade)이 결핍된 전체 드롭아웃 (SD) 최소 배지(Clontech)상에 공동형질전환체의 성장을 모니터함으로써 수행하였다. 상기 배지를 1mM 3-아미노-l,2,4-트리아졸 (3-AT)로 보충하고 5일동안 30℃에서 항온처리하였다.
도면에 관한 구체적인 방법론적 상세설명
도 11에서, 레인들을 다음과 같이 로딩하였다: 레인 1, 단백질 분자량 마커; 레인 2, MazE-MazF(His)6 복합체; 레인 3, MazF; 및 레인 4, (His)6MazE.
도 12a 및 12b에서, (His)6MazE 및 MazF를 지시된 몰 비로 혼합하였다. 상기 혼합물을 30분동안 4℃에서 항온처리하고, 천연 PAGE를 수행하였다. 복합체의 밴드에 상응하는 겔을 절단하여 30분동안 실온에서 환원 완충액 [20mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM NaCl 및 50mM -ME]중에 항온처리하여 2차원 전기영동을 위해 15% SDS-PAGE를 수행하였다. 복합체에서 (His)6MazE 및 MazF를 하단 패널의 겔에서 나타나도록 분리하였다. 각 레인에서 단백질 상대량을 대조군으로 (His)6MazE 및 MazF을 사용하여 농도계측기로 측정하였다. 도 12a에서, 상이한 양의 (His)6MazE를 20-㎕의 2 μM MazF 용액에 첨가하였다. 1 내지 5 레인에서, (His)6MazE : MazF 비는 각각 1:1, 2:1, 4:1, 6:1 및 8:1이다. 도 12b에서, 상이한 양의 MazF를 20-㎕의 2 μM (His)6MazE 용액에 첨가하였다. 레인 1 내지 5에서, (His)6MazE : MazF 비는 각각 1:1, 1:2, 1:4, 1:6 및 1:8이다. 도 12a 및 12b의 상단 패널에서 천연 PAGE의 결과를 나타낸다. (His)6MazE-MazF 복합체의 위치는 화살표 a로 제시된다. 도 12a 및 12b의 하단 패널에서 2차원 전기영동에 대한 SDS-PAGE의 결과를 나타낸다. 정제된 (His)6MazE (40 pmol) 및 MazF (40 pmol)을 대조군으로서 제1 및 제2 레인에 적용하였다.
도 13에서, MazF 및 MazE-MazF(His)6 복합체의 분자 질량을 슈퍼덱스 200 칼럼을 사용한 겔 여과법에 의해 측정하였다. 단백질 분자량 표준 곡선은 티로글로불린 (669 kDa), 아포페리딘 (443kDa), β-아밀라제 (200 kDa), BSA (66 kDa), 난알부민 (45 kDa) 및 탄산 탈수효소(29kDa)를 포함한다. 표준 곡선상의 세로 화살표는 MazF 및 MazE-MazF(His)6 복합체의 위치를 제시한다.
도 14a, 14b 및 14c에서, mazEF 프로모터 영역을 함유하는 50-bp [32P]-표지된 DNA 단편을 (His)6MazE의 농도를 증가시키거나 (도 14a), MazF의 농도를 증가시거나 (도 14b), 1:2의 (His)6MazE/MazF 일정한 비율로 (His)6MazE 및 MazF 모두의 농도를 증가시키면서 (도 14c) 항온처리하였다.
도 15에서, ClustalW 프로그램을 정렬 분석에 사용하였다. 8개의 상이한 단백질중 동일한 잔기를 검정 박스로 나타낸다. 유사한 잔기는 회색 박스로 제시한다. 간격(gap) (대시로 제시)을 도입하여 정렬을 최적화시킨다. 서열은 다음과 같다: 데이노코쿠그 라디오두란스(Deinococcus radiodurans)에서 MazE (진뱅크 승인번호 NP_294139); 바실러스 할로두란스(Bacillus halodurans) MazE (진뱅크 승인번호 NP_244587); 플라스미드 R100 상의 PemI (진뱅크 승인번호 Nu_052993); 플라스미드 R466b상의 PemI (진뱅크 승인번호 AAC82515); 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)에서 MazE (진뱅크 승인번호 NP_289337); 에스케리키아 콜라이 ChpB (진뱅크 승인번호 Nu_290856); 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)에서 MazE KT2440 (진뱅크 승인번호 NP_742931); 포토박테리움 프로푼덤(Photobacterium profundum)에서 MazE (진뱅크 승인번호 AAG34554). 상기 숫자는 아미노산 잔기 위치에 상응한다.
도 16a 및 16b에서, 단백질의 DNA 결합을 mazEF 프로모터 영역을 함유하는 50-bp[32P]-표지된 DNA 단편을 사용하여 EMSA에 의해 측정하였다. 도 16a에서, DNA 단편을 30분동안 4℃에서 20-㎕ 혼합물중에 제시된 바와 같은 1 uM의 각각의 복합체와 함께 항온처리하였다. 레인 1, 단백질 불포함 대조군; 레인 2, MazE-MazF(His)6복합체; 레인 3, MazE(K7A)-MazF(His)6복합체; 레인 4, MazE(R8A)-MazF(His)6복합체; 레인 5, MazE(S12A)-MazF(His)6복합체; 레인 6, MazE(R16A)-MazF(His)6복합체; 레인 7, MazE(I43N)-MazF(His)6복합체; 및 레인 8, MazE(E57Q)-MazF(His)6복합체. 도 16b에서, DNA 단편을 30분동안 4℃에서 20-㎕ 혼합물중에 제시된 바와 같은 4 uM의 (His)6MazE 또는 (His)6MazE 돌연변이체와 함께 항온처리하였다. 레인 1, 단백질 불포함 대조군; 레인 2, 야생형 (His)6MazE 단백질; 레인 3, (His)6MazE (K7A) 돌연변이체; 레인 4, (His)6MazE (R8A) 돌연변이체; 레인 5,(His)6MazE (S 12A) 돌연변이체; 및 레인 6, (His)6MazE (R16A) 돌연변이체.
도 17에서, 전체 길이의 mazE 유전자 및 절두된 mazE 유전자를 pGAD-Cl내에 작제하였다. 숫자는 MazE에서 아미노산 위치를 지칭한다. 상기 플라스미드를 pGBD-MazF를 사용하여 효모 PJ69-4A 세포내로 공동 형질전환시켰다. 단백질-단백질 상호작용을 Trp, Leu, His 및 Ade 부재하에 1 mM 3-AT를 함유하는 SD 배지 (Clontech) 플레이트상에서 시험하였다. +는 5일내에 형성된 가시화된 콜로니를 나타내고; -는 5일내에 형성된 비가시화된 콜로니를 나타낸다.
도 18a에서, MazF 및 (His)6MazE 또는 (His)6MazE 돌연변이체 사이의 상호작용을 천연 PAGE에 의해 측정하였다. 레인 1, 야생형 (His)6MazE; 레인 2, MazF; 레인 3, 야생형 (His)6MazE 및 MazF; 레인 4, (His)6MazE L55A/L58A 돌연변이체 및 MazF; 레인 5, (His)6MazE R48A 돌연변이체 및 MazF; 레인 6, (His)6MazE E57Q 돌연변이체 및 MazF; 및 레인 7, (His)6MazE F53A 돌연변이체 및 MazF.
도 18b에서, MazF 및 (His)6MazE 또는 (His)6MazEL55A/L58A 돌연변이체 사이의 상호작용을 mazEF 프로모터 영역을 함유하는 50-bp[32P]-표지된 DNA 단편을 사용하여 EMSA에 의해 측정하였다. 레인 1, 단백질 불포함 대조군; 레인 2, 4 μM 야생형(His)6MazE; 레인 3, 4μM(His)6MazE L55A/L58A 돌연변이체; 레인 4, 2μM 야생형(His)6MazE 및 4 μM MazF; 및 레인 5, 2μM (His)6MazE L55A/L58A 돌연변이체 및 4 μM MazF.
MazE-MazF 복합체의 X-선 구조를 도시하는 도 19에서, MazE 기능(들)에 필수적인 보존된 아미노산 잔기를 나타낸다. 단지 일부의 MazF2-MazE2-MazF2 복합체가 제시되는데, 이는 하나의 MazE 분자 (푸른색)가 MazF 단일이량체의 2개의 MazF 분자(자주색 및 빨간색)와 상호작용한다. MazE 분자에서, N-box 및 Hp-box는 녹색 및 노란색으로 각각 나타낸다. N-box에서 Lys7, Arg8, Serl2 및 Argl6의 위치 및 Hp-box에서 Leu55 및 Leu58의 위치를 나타낸다. 본원에서 나타내는 바와 같이, 이들 치환 돌연변이로 MazE 기능(들) 상실이 유발되었다.
결과
MazE 및 MazF는 1:2 비율로 복합체를 형성할 수 있다 - 정제된 MazE-MazF(His)6, MazF 및 (His)6MazE의 트리신 SDS-PAGE 패턴을 각각 도 11, 레인 2, 3 및 4에 나타낸다. (His)6MazE 및 MazF의 크기는 각각 이론적 분자량 11.4 kDa 및 12.0 kDa에 일치한다 (도 11, 레인 3 및 4). MazE-MazF(His)6 복합체를 9.3 kDa MazE 및 13.2 kDa MazF(His)6으로 분리하고, MazE에 대한 MazF(His)6의 비는 농도계측기를 사용하여 측정한 결과 약 2가 되었다.
(His)6MazE 및 MazF를 함께 혼합하여 당해 혼합물을 천연 PAGE를 수행한 경우, 새로운 밴드가 겔의 최상부 근처의 위치에 나타났다 (도 12에서 위치 a). 새로운 밴드에 상응하는 겔을 잘라내어 30분동안 실온에서 환원 완충액 [20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM NaCI 및 50 mM β-ME]중에 항온처리한 후, 당해 겔을 SDS-PAGE 겔 최상부에 위치하여 2차원 전기영동을 수행하여 단백질 성분을 분석하였다. 겔을 쿠마지 브릴리언트 블루로 염색한 후, (His)6MazE 및 MazF에 상응하는 2개의 밴드를 관찰하는데, (His)6MazE는 SDS-PAGE상에서 MazF 보다 느리게 이동하였다. 상기 결과는 새로운 밴드가 (His)6MazE 및 MazF를 포함하는 복합체라는 것을 증명하였다. 천연 PAGE로부터 겔을 환원 완충핵으로 처리하지 않고 잘라내는 경우, 3개의 단백질 밴드,(His)6MazE, MazF 및 MazF 이량체가 SDS-PAGE 수행 후 관찰되었다 (데이타 제시안됨). 3개의 밴드가 천연 PAGE상의 정제된 MazF에 대해 발현하는데, 정제된 MazF 단백질을 HPLC로 검정하는 경우 단지 1개의 피크만이 관찰되었다 (데이타 제시안됨).
부가 실험을 수행하여 복합체에서 MazF에 대한 (His)6MazE의 비가 안정한지의 여부를 측정하였다. 도 12a에서 나타나는 바와 같이, 상이한 양의(His)6MazE를 일정한 농도의 MazF (2μM)를 함유하는 동일한 용액에 첨가하여, (His)6MazE : MazF 비가 1:1에서 2:1, 4:1, 6:1, 8:1로 다양한 일련의 용액을 생성하였다. 도 12b에서 나타낸 바와 같이, 상이한 양의 MazF도 또한 일정한 농도의 (His)6MazE (2μM)를 함유하는 동일한 용액에 첨가하여 (His)6MazE : MazF 비가 1:1, 1:2, 1:4, 1:6 및 1:8인 일련의 용액을 생성하였다. 상기 혼합물을 30분동안 4℃에서 항온처리하여 천연 PAGE에 의해 분석하였다. 새로운 밴드에 상응하는 겔 (위치 a에서)을 잘라내어 30분동안 실온에서 환원 완충액중에 항온처리하여 15% SDS-PAGE를 수행하였다. 2차원 겔을 쿠마지 브릴리언트 블루로 염색하여 단백질 밴드를 검출하였다. 각각의 레인에서 단백질 상대량을 대조군으로 정제된 (His)6MazE 및 MazF를 사용하여 농도계측기로 측정하였다. 복합체에서 (His)6MazE에 대한 MazF 비는 (His)6MazE 또는 MazF를 과량으로 혼합물에 첨가한 경우 거의 1.8로 일정하게 유지되었다. 상기 언급한 바와 같이, MazE-MazF(His)6 복합체를 트리신 SDS-PAGE에 의해 MazE 및 MazF(His)6으로 분리하고, MazE에 대한 MazF(His)6의 비가 약 2였다 (도 11, 레인 2). 정제된 MazE-MazF(His)6 복합체 및 MazF의 분자 질량을 슈퍼둑스TM 200 칼럼 (Pharmacia Biotech)을 사용하여 겔 여과법에 의해 측정하여 76.9 kDa 및 27.1 kDa (도 13)이었다. MazF(His)6을 MazE-MazF(His)6 복합체로부터 정제하였다. MazF(His)6은 이. 콜라이 세포-부재 시스템 (이. 콜라이 T7 S30 추출 시스템, Promega)에서 단백질 합성을 억제할 수 있고, 상기 단백질 합성을 (His)6MazE의 동시 첨가로 구제하였다 (데이타 제시안됨). MazF(His)6의 분자 질량은 광 산란법에 의해 28.3 kDa으로 측정되었고, 이는 MazF(His)6 이 이량체로 존재함을 암시하였다. MazE의 구조는 이량체로 증명되었다 (Lah et al. (2003) J Biol Chem 278, 14101-14111). 그러므로, MazE-MazF(His)6 복합체 (76.9 kDa)는 1개의 MazE 이량체 (MazE 분자량이 9.3 kDa이므로 약 18.6 kDa로 예상됨) 및 2개의 MazF(His)6 이량체(56.6 kDa)로 이루어질 수 있다.
MazF는 mazEF 프로모터에 대한 MazE 결합을 향상시킨다 - 50-bp mazEF 프로모터 단편을 본원에서 기술한 바와 같이 제조하고 [γ-32p] ATP를 사용하여 T4 폴리뉴클레오티드 키나제로 말단-표지하였다. 전기영동 이동 시프트 검정법 (EMSA)을 사용하여, (His)6MazE, MazF 및 MazE- MazF(His)6 복합체를 mazEF 프로모터 DNA 단편에 대한 결합능을 각각 시험하였다. (His)6MazE는 2μM 이상의 농도에서 mazEF 프로모터 단편을 시프팅시킬 수 있다 (도 14a, 레인 7). 0.4 내지 1.0μM (His)6MazE에서, DNA 단편의 시그날이 개시되어 상향으로 흐려지더라도, 독립된 이동-시프팅된 밴드가 관찰되지 않았고 (도 14a, 레인 3-6), 이는 일부 불안정한 (His)6MazE-DNA 복합체가 상기 농도에서 형성되었음을 제시하였다. 2 내지 20μM (His)6MazE에서, 구별되는 이동-시프팅된 복합체가 관찰되는데, 이는 (His)6MazE의 고농도일수록 더욱 천천히 이동되어 (도 14a, 레인 7-12), DNA 단편에 결합되는 (His)6MazE 분자 수는 고농도의 MazE에서 증가함을 암시하였다. 50-bp mazEF 프로모터 단편에서 (His)6MazE 결합 위치가 하나 이상 존재함이 가능하다.
대조적으로, MazF 단백질은 20μM의 농도에서도 50-bp mazEF 프로모터 DNA에 결합할 수 없었다 (도 14b). (His)6MazE 및 MazF 단백 질 모두의 증가량을 1:2의 (His)6MazE/MazF 일정비로 첨가하였다. 단독의 (His)6MazE와 비교하여, MazF는 mazEF 프로모터에 대한 (His)6MazE 결합을 현저하게 향상시킨다. 이러한 조건하에, 50-bp mazEF 프로모터 단편을 0.2μM 정도로 낮은 (His)6MazE 농도에서 시프팅시키고 (도 14c), 슈퍼시프팅은 (His)6MazE-MazF 복합체의 고농도에서 관찰되는데, 이는(His)6MazE-MazF 복합체의 농도가 높을수록 이것이 DNA 단편에 더욱 많이 결합함을 나타내고, mazEF 프로모터에서 (His)6MazE-MazF 복합체에 대한 다중 결합 위치가 존재함을 증명하였다.
MazE 동족체에서 보존된 아미노산 서열 - MazE 동족체를 BLAST 검색으로 동정하고, 이의 아미노산 서열 정렬을 도 15에 나타낸다. 일반적으로 MazE는 세균에서 고도로 보존되어 있지 않지만, MazE 동족체에 보존된 영역이 존재한다. 우선, MazE의 N-말단 영역이 MazE의 다른 영역에 비해 더욱 보존되어 있다. MazE는 pI가 4.7인 산성 단백질이나, N-말단 영역에 약간의 보존된 염기성 잔기(K7, R8 및 R16)가 존재하여, 이를 N-box라 명명한다 (도 15). MazE는 mazEF 프로모터 DNA에 결합할 수 있기 때문에, N-box가 DNA 결합에 역할이 있을 수 있다. 다음으로, Hp-box (도 15)로 명명된 보존된 C-말단 영역이 있는데, 이는 몇몇 보존된 소수성 잔기를 함유한다.
MazE의 N-box는 MazE 및 MazE-MazF 복합체 모두의 DNA-결합에 관여한다. 각종 부위-지시된 돌연변이를 pET21cc-EF(His)6 플라스미드에서 mazE 유전자내에 작제하여, N-box의 보존된 아미노산 잔기를 Ala로 전환시켰다. MazE 돌연변이체 단백질과 MazF(His)6로 형성된 복합체를 정제하였다. 이러한 복합체를 각각 EMSA로 mazEF 프로모터에 대한 결합능을 시험하였다. 도 16a에서 나타난 바와 같이, MazE 돌연변이체로 형성된 N-box(K7A, R8A, S12A 또는 R16A) 및 MazF(His)6에 돌연변이를 지닌 복합체는 mazEF 프로모터 DNA에 결합할 수 없었다 (도 16a, 레인 3,4, 5 및 6). 그러나, N-box 외부의 보존된 아미노산의 치환 돌연변이, 예를 들어 MazE I43N 및 E57Q는 돌연변이된 단백질을 포함한 복합체의 DNA 결합에 영향을 미치지 않았다 (도 16a, 레인 7 및 8, 각각). 또한 부가적인 치환 돌연변이를 pET28a-(His)6MazE 플라스미드에서 mazE 유전자내에 작제하였다. N-box내 치환 돌연변이(K7A, R8A, S12A 및 R16A)를 가진 모든 (His)6MazE 돌연변이체는 이들의 DNA-결합능을 상실(도 16b, 레인 3, 4, 5 및 6, 각각)한 반면, 야생형(His)6MazE는 mazEF 프로모터에 대한 결합능을 보유하였다 (도 16b, 레인 2). 대조적으로, N-box 외부의 치환 돌연변이 (R48A, F53A, L55A/L58A 및 E57Q)를 가진 (His)6MazE 돌연변이체는 mazEF 프로모터 DNA에 결합할 수 있었다 (데이타 제시안됨). 이러한 결과는 MazE-MazF 복합체의 DNA 결합능이 복합체내에 MazE 단백질에 기인하고, N-box가 MazE의 DNA 결합에 역활이 있음을 제시한다.
MazE 및 MazF 사이의 상호작용 - 효모 2-하이브리드 검정을 수행하여 MazE 및 MazF 사이의 상호작용을 조사하였다. MazE 영역이 MazF와의 상호작용에 필수적임을 증명하기 위하여, 전체 길이의 mazE 유전자 및 mazE 유전자의 각종 N-말단 및 C-말단 결실 작제물을 PCR로 작제하고(도 17 참조) pGAD-Cl 벡터의 EcoRI-PstI 위치로 클로닝시켜 Gal4 전사적 활성 도메인을 지닌 프레임내 해독 융합물을 제조한 후, 이러한 플라스미드 각각을 pGBD-MazF 플라스미드를 사용하여 PJ69-4A 효모 세포내로 공동 형질전환시켰다. pGAD-MazE, pGAD-MazE△(1-13), pGAD-MazE△(1-24), pGAD-MazE△(1-37) 또는 pGAD-MazE△(76-82)를 pGBD-MazF와 함께 보유하는 당해 공동형질전환체는 Trp, Leu, His 및 Ade이 결핍된 합성 배지 (SD 배지, Clontech)에서 성장할 수 있는 반면, GAD-MazE△(1-46) 또는 pGAD-MazE△(68-82)를 pGBD-MazF와 함께 보유하는 공동형질전환체 성장할 수 없었다. 이러한 데이터로 전체 길이의 MazE, MazE△(1-13), MazE△(1-24), MazE△(1-37) 및 MazE△(76-82)가 MazF와 상호작용할 수 있는 반면, 추가의 N-말단 결실 돌연변이체 MazE△(1-46) 및 추가의 C-말단 결실 돌연변이체 MazE△(68-82)는 할 수 없음을 증명하였다. 이러한 결과로 MazE의 잔기 38 내지 75의 영역이 MazF와의 상호작용에 관여함을 나타낸다.
MazF의 N- 및 C-말단으로부터 일련의 절두된 돌연변이를 pGBD-Cl내에 작제하여 pGAD-MazE를 사용하여 PJ69-4A 세포내로 공동 형질전환시켰다. 상기 공동형질전환된 효모 세포 모두는 Trp, Leu, His 및 Ade이 결핍된 완전 합성 배지상에서 성장할 수 없고, 이는 이러한 MazF 돌연변이체 모두가 MazE와 상호작용할 수 없음을 나타내었다. 그러므로 MazF의 N- 및 C-말단 영역 모두는 MazE와의 상호작용에 관계가 있거나, 생성된 결실 돌연변이는 MazE와 상호작용에 유리한 MazF의 파괴된 구조적 입체형태를 생성시켰다.
부위-지시된 돌연변이를 또한 플라스미드 pET28a-(His)6E상에 제조하여 (His)6MazE R48A, F53A, L55A/L58A 및 E57Q 돌연변이체를 작제하였다. (His)6MazE 돌연변이체 및 MazF를 가지는 복합체 형성을 천연 PAGE로 조사하였다. 도 18a에 나타낸 바와 같이, (His)6MazE 돌연변이체 R48A, F53A 및 E57Q는 MazF를 지닌 복합체를 형성할 수 있는 반면 (도 18a, 레인 5, 6 및 7, 각각), (His)6MazE L55A/L58A 돌연변이체는 형성할 수 없었다 (도 18a, 레인 4). EMSA를 사용하여 야생형 (His)6MazE 및 (His)6MazE L55A/L58A 돌연변이체 모두가 mazEF 프로모터 DNA에 결합할 수 있음을 증명하였다 (도 18b, 레인 2 및 3, 각각). MazF가 첨가되는 경우, 야생형(His)6MazE는 MazF와 상호작용하여 복합체를 형성하여서, 야생형(His)6MazE 단독(도 18b, 레인 2)과 비교하여 겔의 최상부 근처에 슈퍼시프팅 밴드(도 18b, 레인 4)를 유발할 수 있었다. 그러나, (His)6MazE L55A/L58A에 MazF를 첨가하면 DNA 단편의 슈퍼시프팅된 종의 외관이 나타나지 않아서, (His)6MazE L55A/L58A 돌연변이체가 MazF와 상호작용하여 복합체를 형성할 수 없음을 확인하였다.
논의
이. 콜라이에서 mazEF 중독 시스템은 각각 불안정한 항독소 MazE 및 안정한 독소 MazF를 암호화하는 2개의 유전자, MazE 및 MazF로 이루어진다. MazF의 독성 효과는 ppGpp로 활성화되고, 시그날은 아미노산 고갈에 반응하여 RelA 단백질에 의해(Aizenman et al. (1996) 상기 참고), 특정 항생제에 의해 (Sat et al. (2001) 상기 참고), 및 독성 단백질 Doc에 의해 (Hazan et al. (2001) 상기 참고) 생산된다. 이러한 환경하에, 불안정한 MazE의 분해로 세포상에 독성 효과를 발휘할 수 있는 유리된 안정한 MazF가 발현한다. 그러므로, MazE 세포 농도의 조절은 세포 사멸에 주요한 결정인자이다. 요약하면, MazF와 복합체를 형성함으로, MazE는 이의 독성 효과를 억제한다. 더욱이, MazE는 또한 mazEF 프로모터에 결합함으로써 mazEF 발현의 자가 조절에 관계한다 (Marianogfvsky et al. (2001) 상기 참고). 본원에서 나타낸 바와 같이, MazE는 2개 이상의 기능성 도메인: DNA- 결합 도메인 및 MazF-결합 도메인을 포함한다.
융합 단백질 (His)6MazE는 MazF와 상호작용을 할 수 있고 mazEF 프로모터에 결합할 수 있다. MazF와 같이, MazF(His)6은 이량체를 형성하고 시험관내 단백질 합성을 억제하며, 이러한 단백질 합성의 억제는 (His)6MazE의 공동-첨가로 구제할 수 있다 (데이타 제시안됨). 따라서, His-태그된 융합 단백질은 시험관내 야생형 MazE 및 MazF의 활성과 비교하여 유사한 기능 활성을 나타내는 것으로 보인다. 고도로 정제된 (His)6MazE 및 MazF를 사용하여, (His)6MazE는 자체로 mazEF 프로모터에 결합할 수 있고, MazF의 첨가로 이와의 상호작용이 향상됨을 증명하였다. 확실히, MazF는 mazEF 프로모터 DNA에 대한 (His)6MazE-결합을 열배 이상 향상시켰다. (His)6MazE 또는 (His)6MazE-MazF 복합체의 더 높은 농도에서, mazEF 프로모터 DNA를 포함하는 슈퍼시프팅된 복합체를 전기영동 이동 시프트 검정법에서 관찰하여, (His)6MazE 및 (His)6MazE-MazF 복합체 모두가 mazEF 프로모터 DNA상의 결합 위치를 하나 이상 가짐을 나타내었다. 주목할만하게도, 선행 연구에서 mazEF 프로모터 영역에서 3개의 MazE-결합 위치가 존재할 수 있음 암시하였다(Lah et al. (2003) J Biol Chem 278,14101- 14111). 흥미롭게 EMSA로 관찰된 밴드가 단계적으로 시프팅되지 않았음을 주목해야 한다.
N-box의 보존된 MazE에서 부위-지시된 돌연변이(K7A, R8A, S12A 및 R16A)로 (His)6MazE 및 MazE-MazF(His)6 복합체 모두의 DNA-결합능이 파괴되는데(도 16), 이는 MazE가 MazE-MazF(His)6 복합체의 DNA-결합능에 대해 역할을 가지고, MazE에서 고도로 보존된 N-말단 영역이 DNA-결합 도메인임을 암시하였다.
효모 2-하이브리드 검정을 수행하여, MazE- MazF 상호작용에 책임이 있는 영역(들)을 동정하였다. MazE의 카복시 말단 잔기 38 내지 75의 영역이 MazF에 대한 결합에 요구됨을 발견하였다. 주목할 점은, 소수성 잔기가 풍부한 Hp-box로 명명된 MazE에서의 보존된 C-말단 영역이 존재한다는 점이다. MazE Hp-box에서의 Leu55 및 Leu58의 보존된 아미노산의 돌연변이 (L55A/L58A)로 (His)6MazE 및 MazF 사이의 상호작용을 파과하였다. 효모 2-하이브리드 실험은 또한 MazF의 N- 또는 C-말단으로부터의 결실이 MazE 및 MazF 사이의 상호작용을 파괴하기 때문에, MazF 단백질의 전체 구조가 이의 MazE와의 상호작용에 요구될 수 있음을 나타내었다.
MazE-MazF(His)6 복합체의 분자 질량은 겔 여과법에 의해 76.9 kDa으로 측정되었다. 정제된 MazE-MazF (His)6 복합체를 트리신 SDS-PAGE로 수행하는 경우, MazF(His)6에 대한 MazE의 비가 약 1:2임이 밝혀졌다 (도 11, 레인 2). 과량의 (His)6MazE 또는 MazF의 존재에서도, (His)6MazE-MazF 복합체에서 MazF에 대한 (His)6MazE의 비는 1:1.8 근처에서 일정하게 유지하였다 (도 12). MazE (Lah et al. (2003) 상기 참고) 및 MazF(His)6 모두가 이량체로 존재하기 때문에, MazE-MazF(His)6 복합체 (76.9 kDa)는 1개의 MazE 이량체 ( MazE의 분자량이 9.3 kDa이므로 약 18.6 kDa으로 예측됨) 및 2개의 MazF(His)6 이량체 (MazF(His)6 이량체의 분자 질량이 28.3kDa이므로 약 56.6 kDa으로 예측됨)로 이루어질 수 있다.
상기 기술된 바와 같이, MazE-MazF 복합체의 결정 구조를 문헌(Kamada et al ((2003) 상기 참고)에 의해 측정하였다. MazE-MazF 복합체의 결정 구조는 몇몇 측면으로 1)MazE 및 MazF는 교호되는 MazF 및 MazE 동종이량체(MazF2-MazE2-MazF2)로 구성된 2:4 이종육량체를 형성한다는 발견을 포함하여, 본원에서 설명된 결과를 확증하였다. (His)6MazE-MazF 복합체에서 (His)6MazE 및 MazF의 비는 단백질이 과량으로 첨가되는 것과 관계없이 발견되기 때문에, MazE 및 MazF 사이의 2:4 화학양론적 복합체의 형성은 매우 안정한 것으로 나타남을 주목하는 것이 중요하다 (도 12). 2) MazE의 C-말단 영역은 MazE-MazF 복합체의 구조에서 MazF 동종이량체와 상호작용한다. 당해 연구에서 동정된 Hp-box 영역은 MazE 및 MazF 사이에 표면적으로 가장 안정한 계면과 관련이 있다 (도 19). 3) MazE 및 다른 중독 모듈 해독제와의 유사성 및 MazE 및 MazF의 정전기적 표면상의 염기성 영역의 분포에 기초하여, 문헌(Kamada et al((2003) 상기 참고)은 MazE에서 Lys7 및 Arg8이 MazE-MazF 복합체에서 일차 DNA 고정화 위치로 작용함을 제안하였다. 본원에서 증명한 바와 같이, (His)6MazE 및 MazE-MazF(His)6 복합체의 DNA-결합능은 Lys7 및 Arg8에서의 부위-지시된 돌연변이뿐만 아니라 N-box에서 다른 보존된 아미노산 잔기에서의 돌연변이 (Serl2 및 Argl6)에 의해서도 파괴되었다 (도 19). MazE가 이량체로 존재하기 때문에, MazE 이량체에서 2개의 N-box가 함께 DNA-결합에 관련될 수 있음이 가능하다.
실시예 IV
본원에서 나타낸 바와 같이, 정제된 PemK, "pemI-pemK 중독 모듈"에 의해 암호화된 독소는, 이. 콜라이 세포-부재 시스템에서 단백질 합성을 억제하는 반면, PemK에 대한 항독소인 PemI의 첨가는 단백질 합성을 복원시킨다. 추가 연구로 PemK이 mRNA를 절단하여 단백질 합성을 억제하는 서열-특이적 엔도리보뉴클레아제인 반면, PemI는 PemK의 엔도리보뉴클레아제 활성을 차단시킴이 밝혀졌다. 본원에서 기재된 바와 같이, PemK는 X가 C, A 또는 U인 "UAX" 서열에서 A 뉴클레오티드의 5' 또는 3' 위치에서 일본쇄 RNA를 우선적으로 절단한다. 유도시, PemK는 이. 콜라이에서 단백질 합성을 효과적으로 차단하도록 세포성 mRNA를 절단한다. 따라서, 본 출원에서 PemK가 특정한 위치에서 mRNA를 절단함으로써 그 기능을 간섭함을 증명한다. 그리하여, 본 발명자들은 PemK가 신규한 엔도리보뉴클레아제임을 발견하고 본원에서 "mRNA 인터페라제"로 명시하였다. pemK 동족체는 광범위한 세균의 게놈상에서 동정되었다. PemK 및 이의 동족체는 서열-특이적 방식으로 세포성 mDNA를 절단함으로써 mRNA 기능을 간섭하는 신규한 엔도리보뉴클레아제 군을 형성함이 제안된다. 또한 도 33 및 34 참고.
방법 및 재료
균주 및 플라스미드: 이. 콜라이 BL21(DE3) 및 BW25113 세포를 본원에서 기재된 바와 같이 사용하였다. pemIK 유전자를 주형으로서 플라스미드 R100을 사용하여 PCR로 증폭시키고, pET21cc(Novagen)의 NdeI-XhoI 위치로 클로닝하여, PemK C-말단에서 (His)6 태그를 가진 프레임내 해독물로 제조하였다. 당해 플라스미드를 pET21cc-IK(His)6으로 명명하였다. pemI 유전자를 pET28a (Novagen)의 NdeI-BamHI 위치내로 클로닝하여, 플라스미드 pET28a-(His)6I를 제조하였다. PemI를 트롬빈 절단 부위 앞에 N-말단 His6 태그를 가진 융합체로 발현시켜 (His)6PemI로 명명하였다. pemK 유전자를 pBAD내로 클로닝시켜(Guzman et al. (1995) J Bateriol 177, 4121-4130), 플라스미드 pBAD-K를 제조하였다. 이. 콜라이 mazG 유전자를 pET11a(New England Biolabs)의 NdeI-BamHI 부위내로 클로닝시켜, 플라스미드 pET11a-mazG를 제조하였다. mazG 유전자를 pINIII 벡터내로 클로닝시켜(NAkano et al. (1987) J Virol 61, 302-307), 플라스미드 pIN-MazG를 제조하였다. 이. 콜라이 era 유전자를 pET28a의 ScaI-XhoI 부위내로 클로닝시켜, 플라스미드 pET28a-Era를 제조하였다. era 유전자를 또한 pINIII 벡터내로 클로닝시켜 플라스미드 pIN-Era를 제조하였다.
단백질 정제: (His)6PemI의 정제를 위해, pET28a-(His)6I를 이. 콜라이 BL21(DE3) 균주내로 도입하고, (His)6PemI 발현을 4시간동안 1 mM IPTG를 사용하여 유도하였다. (His)6PemI 단백질을 Ni-NTA(QIAGEN)을 사용하여 정제하였다. pET21cc-IK(His)6을 또한 이. 콜라이 BL21(DE3) 균주내로 도입하였다. PemI 및 PemK(His)6의 공동발현을 4시간동안 1 mM IPTG의 존재하에 유도하였다. PemI-PemK(His)6 복합체를 Ni-NTA(QIAGEN)을 사용하여 정제하였다. PemK(His)6을 정제된 PemI-PemK(His)6 복합체로부터 정제하기 위해, PemI-PemK(His)6 복합체를 5 M 구아니딘-HCl중에 분리시켜 PemK(His)6로부터 PemI을 방출시켰다. PemK(His)6을 Ni-NTA(QIAGEN)상에 재포집시킨 후, 용출하여 단계적 투석법에 의해 재폴딩시켰다.
생체내 단백질 및 DNA 합성의 검정 : pBAD-K를 함유하는 이. 콜라이 BW25113 세포를 0.5% 글리세롤 (글루코스 부재) 및 메티오닌 부재의 아미노산 혼합물 (각각 1 mM)을 가진 변형된 M9 배지에서 성장시켰다. 배양물의 OD600가 0.6에 이르는 경우, 아라비노스를 0.2%의 최종 농도가 되도록 첨가하여 PemK 발현을 유도하였다. 세포 배양물 (1 ml)을 지시된 시점에 취하여 5μCi[35S]-메티오닌(단백질 합성 분석용) 또는 2μCi 메틸-H-티미딘 (DNA 합성 분석용)과 혼합하였다. 37℃에서 1분간의 혼입 후, DNA 복제 및 단백질 합성의 속도를 이전에 기술된 바와 같이 측정하였다 (Pedersen et al. (2002) Mol Microbiol 45, 501510). 총 세포성 단백질 합성의 SDS-PAGE 분석용 샘플을 제조하기 위해, [35S]-메티오닌 혼입 반응 혼합물 (500㎕)을 제시된 시점에서 제거하고 25 ㎕의 100% TCA 용액 및 100㎍/ml 비-방사성 메티오닌을 함유하는 냉각된 시험관에 첨가하였다. 세포 펠렛을 원심분리로 수거하고 SDS-PAGE 이후 방사선자동사진법을 수행하였다.
프라이머 연장 분석 : T7 프로모터 및 mazG 유전자를 함유하는 DNA 단편을 주형으로서 pETlla-MazG와 함께 T7 프라이머 (5'-AGATCTCGATCCCGCA AATTAAT-3') (서열번호 14) 및 프라이머 G6 (5'-TTAGAGATCAATTTCCTGCCGTTTTAC-3') (서열번호 15)을 사용하여 PCR 증폭에 의해 수득하였다. T7 프로모터 및 era 유전자를 포함하는 또다른 DNA 단편을 주형으로서 pET28a-Era를 사용하고 상기와 동일한 T7 프라이머 및 프라이머 E5(5'-TTAAAGATCGTCAACGTAACCG-3') (서열번호 16)를 사용하여 PCR 증폭에 의해 수득하였다. mazG mRNA 및 era mRNA를 T7 대규모 전사 키트 (Promega)를 사용하여, 이들 2개의 DNA 단편으로부터 각각 제조하였다. RNA 기질을 15분동안 37℃에서 PemK(His)6으로 부분적으로 분해하였다. 분해 반응 혼합물 (20㎕)은 4㎍ RNA 기질, 0.2㎍ PemK(His)6, 1㎕ RNase 억제제, 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM NaCl 및 1 mM DTT를 함유하였다. 부분 분해 생성물을 RNA이지(RNAeasy) 칼럼 (QIGENE)을 사용하여 정제하여 PemK(His)6 단백질을 제거하였다. 프라이머 Gl(5'-TGCTCTTTATCCCACGGGCAGC-3') (서열번호 17), G2(5'-GCCCAGTTCACCGCGAAGATCGTC-3') (서열번호 18), G3(5'-GGTTTTGATTTGCTCCCAACGGGCAAG-3') (서열번호 19), G4(5'-CATTTCCT CCTCCAGTTTAGCCTGGTC-3') (서열번호 20), 및 G5(5'- TTGCCAGACTTCTTCCATTGTTTCG : 21)를 mazG RNA의 프라이머 연장 분석용으로 사용하였다; 프라이머 E1(5'- GATCCCCACAATGCGGTGACGAGT-3') (서열번호 22), E2(5'- CACGTTGTCCACTTTGTTCACC : 서열번호 23), E3(5'- CAGTTCAGCGCCGAGGAAACGCAT-3') (서열번호 24), 및 E4(5'-GCGTTCGTCGTCGGCCCAACCGGA-3') (서열번호 25)를 era RNA의 프라이머 연장 분석용으로 사용하였다. 상기 프라이머를 T4 폴리뉴클레오티드 키나제를 사용하여 [γ-32P] ATP로 5'-표지화하였다. 프라이머 연장 반응을 1시간동안 42℃에서 수행하였다. 대조군 실험을 PemK(His)6을 분해 반응 혼합물에 첨가하지 않는 것을 제외하고 상기와 동일한 조건을 사용하여 수행하였다. 프라이머 연장 생성물을 6% 서열화 겔상에서 분석하였는데, 이는 상기 겔상에서 동일한 프라이머로 제조된 DNA 서열화 사다리(DNA sequencing ladder)와 함께 전개하였다.
PemK에 의한 합성된 RNA의 절단: 30-염기 RNA 5'-UAAGAAGGAGAUA UACAUAUGAAUCAAAUC-3' (서열번호 11), 안티센스 RNA 5'- GAUUUGAUUCAUAUGUAUAU CUCCUUCUUA-3' (서열번호 26), 및 상보성 DNA 5'-GATTTGATTCATATGTATATC TCCTTCTTA-3' (서열번호 27)를 통상적으로 합성하였다. 30-염기 RNA를 T4 폴리뉴클레오티드 키나제를 사용하여 [γ-32P] ATP로 5'-말단 표지화시키고 PemK(His)6에 대한 기질로서 사용하였다. 당해 30-염기 RNA의 절단 생성물을 RNA 사다리와 함께 20% 서열화 겔 (7M 요소 함유)에 적용하고, 이를 이전에 기술된 바와 같이 5'-말단 표지된 30-염기 RNA의 부분 알칼리 가수분해로 제조하였다 (Smith 및 Roth. (1992) J Biol Chem 267, 15071-15079). PemK-매개된 RNA 절단물상의 RNA-RNA 이중체 및 RNA-DNA 이중체 형성의 효과를 이에 기술된 바와 같이 측정하였다 (Zhang et al. (2003) 상기 참고).
생체내 mRNA상의 PemK 효과의 노던 블롯 및 프라이머 연장 분석 : pIN-MazG 플라스미드 및 pIN-Era 플라스미드를 pBAD-K를 포함하는 이. 콜라이 BW25113 세포 내로 형질전환시켜, 각각 BW25113/pBAD-K/pIN-MazG 및 BW25113/pBAD-K/pIN-Era 균주를 제조하였다. 상기 세포를 37℃에서 암피실린 (50㎍/ml) 및 클로람페니콜 (20㎍/ml)을 함유하는 LB 배지중에 성장시켰다. OD600 값이 0.4에 이른 경우, IPTG를 최종 농도가 1 mM이 되도록 첨가하여 mazG 또는 era mRNA의 합성을 유도하였다. 다시 30분동안 37 ℃에서 항온처리 후, 아라비노스를 최종 농도가 0.2%가 되도록 첨가하여 PemK의 발현을 유도하였다. 당해 샘플을 PemK의 유도 후 상이한 시간 간격에 제거하였다. 총 세포성 RNA를 핫-페놀(hot-phenol)법을 사용하여 이전에 기술된 바와 같이 분리하였다 (Sarmientos et al. (1983) Cell 32, 1337-1346). mazG 또는 era 유전자의 전체 길이의 ORF를 함유하는 DNA 단편을 사용하여 방사성 표지된 프로브 각각을 제조하고, 이를 노던 블롯 분석에 사용하였다. 프라이머 연장 분석을 프라이머 G2 (mazG mRNA에 대한) 또는 E1 (era mRNA에 대한)을 사용하여 수행하였다. lpp mRNA를 검출하기 위해, 총 세포성 RNA를 아라비노스 첨가 후 각종 시점에서 이. 콜라이BW25113/pBAD-K로부터 추출하고 방사선 표지된 Ipp ORF DNA 단편을 프로브로서 사용하여 노던 블롯 분석을 수행하였다. Ipp mRNA의 프라이머 연장 분석을 프라이머 lpp-C (5'-AGAATGTGCGCC ATTTTTCACT-3') (서열번호28)를 사용하여 수행하였다.
도면에 관한 구체적인 방법론적 상세설명
도 26. 생체내 DNA 및 단백질 합성에 대한 PemK의 효과. (A) DNA 합성에 대한 PemK의 효과. pBAD-K를 함유하는 이. 콜라이 BW25113 세포를 37 ℃에서 탄소원으로서 글리세롤을 갖는 M9 배지중에 성장시켰다. 배양물의 OD600가 0.6에 도달한 경우, 아라비노스를 최종 농도가 0.2%가 되도록 첨가하여 PemK 발현을 유도하였다. DNA 복제 비율을 재료 및 방법에서 기술한 바와 같이 PemK의 유도 후 각종 시점에서 메틸-H-티미딘 혼입을 검출함으로써 측정하였다. (B) 단백질 합성에 대한 PemK의 효과. 단백질 합성율을 재료 및 방법에서 기술한 바와 같이 PemK의 유도 후 각종 시점에서 [S35]-메티오닌을 검출함으로써 측정하였다. (C) PemK 유도 후 총 세포성 단백질 합성의 SDS-PAGE 분석. 세포 배양물(1ml)을 제시한 바와 같이 PemK 유도 후 시점에서 취하여 5μCi [35S]-메티오닌과 함께 혼합하였다. 37℃에서 1분의 혼입 후, [35S]-메티오닌 혼입 반응 혼합물 (500㎕)을 25㎕의 100% TCA 용액 및 100 ㎍/ml 비-방사성 메티오닌을 함유하는 냉각된 시험관중에 넣었다. 세포 펠렛을 원심분리에 의해 수거하고 SDS-PAGE 이후 방사선자동사진법을 수행하였다. 화살표로 제시된 밴드가 PemK이다.
도 27. 세포-부재 단백질 합성에 대한 PemK 및 PemI의 효과. (A) PemK에 의한 세포 부재 단백질 합성. 단백질 합성을 37℃에서 1시간 동안 이. 콜라이 T7 S30 추출 시스템 (Promega)중에 수행하였다. pET11a-MazG로부터 MazG를 발현시키고, (His)6Era를 플라스미드 pET28a-Era로부터 발현시켰다. 레인 1, PemK의 첨가 없는 대조군; 레인 2 내지 5, 0.125, 0.25, 0.5, 및 1㎍ PemK(His)6을 각각 첨가하였다. (B) PemI에 의한 세포-부재 시스템에서 PemK-매개된 단백질 합성의 억제 해제. 레인 1, PemK(His)6의 첨가 없는 대조군; 레인 2, 1㎍ PemK(His)6의 첨가 대조군; 레인 3 내지 5, 0.5, 1, 2㎍ (His)6PemI을 각각 1㎍ PemK(His)6과 함께 첨가하였다. (C) 단백질 합성에 대한 PemK를 가진 세포-부재 시스템의 예비 항온처리 효과. 당해 세포-부재 시스템을 37 ℃에서 15분동안 PemK(His)6의 존재 또는 비존재하에 예비 항온처리한 후 pET28a-Era 플라스미드를 첨가하였다. 단백질 합성을 37 ℃에서 또다른 1시간 항온처리동안 계속하였다. 반응 생성물을 SDS-PAGE에 이어서 방사선자동사진법에 의해 분석하였다. 레인 1, PemK(His)6 부재하에 예비 항온처리된 대조군; 레인 2, 1㎍ PemK(His)6에 이어서 pET28a-Era 플라스미드와 함께 예비항온처리됨; 레인 3, 1㎍ PemK(His)6과의 예비항온처리 후 pET28a-Era 플라스미드 및 1㎍ (His)6PemI이 함께 첨가됨; 레인 4, 1 ㎍ PemK(His)6 및 1 ㎍ (His)6PemI와 함께 예비 항온처리된 후 pET28a-Era 플라스미드의 첨가.
도 28. PemK의 엔도리보뉴클레아제 활성. (A) PemK에 의한 mazG mRNA의 절단 및 PemK-매개된 RNA 절단물에 대한 PemI의 억제 효과. 레인 1, 대조군, mazG mRNA 단독; 레인 2, 0.2 ㎍ PemK(His)6과 함께 항온처리된 mazG mRNA (1.5㎍); 레인 3 내지 6, 각각 0.05, 0.1, 0.2 및 0.4 ㎍ (His)6PemI과 0.2 ㎍ PemK(His)6이 함께 항온처리된 mazG mRNA (1.5 ㎍); 레인 7, 0.4 ㎍(His)6PemI과 함께 항온처리된 mazG mRNA (1.5 ㎍). 반응을 37 ℃에서 15분동안 수행하고, 반응 생성물을 TAE 완충액을 사용하여 3.5% 천연 PAGE에 의해 분석하였다. (B), (C), (D) 및 (E), mazG mRNA 및 era mRNA에서 PemK 절단 부위의 프라이머 연장 분석. 프라이머 연장 실험을 재료 및 방법에서 기술한 바와 같이 수행하였다. 각각의 프라이머 연장 생성물을 동일한 프라이머로 제조된 DNA 서열화 사다리와 함께 전개시켜 6% 서열화 겔상에서 분석하였다. PemK(His)6 절단 부위 주변의 DNA 서열 사다리에 상보적인 RNA 서열을 오른쪽 부분에 나타내고, 절단 부위를 화살표로 나타낸다. 프라이머 Gl (B) 및 G2 (C)로 검출된 mazG mRNA에서 PemK(His)6 절단 부위를 당해 도에 나타내고, PemK(His)6 절단 부위를 프라이머 E1 (D) 및 E4 (E)로 검출된 era mRNA에 나타낸다.
도 29. RNA/RNA 형성에 의한 PemK 엔도리보뉴클레아제 활성의 억제. 30개 염기 RNA를 mazG mRNA (표 II, 2번째 열)에서 PemK(His)6 절단 부위 주변에 동일한 서열을 사용하여 합성하였다. (A) 30-염기 RNA상의 PemK 절단 부위. 30-염기 RNA를 T4 폴리뉴클레오티드 키나제를 사용하여 [γ-32P]-ATP로 5'-말단 표지시킨 후, 37 ℃에서 15분동안 PemK(His)6와 함께 항온처리하였다. 절단 생성물을 20% 서열화 겔상에서 분석하였다. 레인 1, 5'-말단[32P]-표지된 11-염기 RNA 크기 마커; 레인 2, 이전에 기술된 바와 같이 (Smith 및 Roth. (1992)J Biol Chem 267,15071-15079) 부분 알칼리 가수분해에 의해 5'-말단[32P]-표지된 30-염기 RNA로부터 제조된 RNA 사다리; 레인 3, PemK(His)6에 의한 5'-말단[32P]-표지된 30-염기 RNA; 및 레인 4, PemK(His)6으로 처리된 5'-말단[32P]-표지된 30-염기 RNA의 절단 생성물. 레인 1 및 4에서 각각의 밴드의 크기는 총 뉴클레오타이드 수로 나타낸다. (B) PemK의 엔도리보뉴클레아제 활성에 대한 RNA-RNA 이중체 형성의 효과. 레인 1, [32P]-표지된 30-염기 RNA 단독(1 pmol); 레인 2, [32P]-표지된 30-염기 RNA (1 pmol)를 0.2㎍ PemK(His)6과 함께 37 ℃에서 15분동안 항온처리하였다; 레인 3 내지 7, [32P] -표지된 30-염기 RNA (1 pmol)를 제시한 바와 같이 상이한 비율로 30-염기 안티센스 RNA와 어닐링시킨 후, 0.2 ㎍ PemK(His)6과 함께 37 ℃에서 15분동안 항온처리하였다. 반응 생성물을 15% PAGE에 이어서 방사선자동사진법에 의해 분석하였다.
도 30. 생체내 각종 mRNAs상의 PemK 효과의 노던 블롯 및 프라이머 연장. (A) 생체내에서 mazG, era 및 lpp mRNA상의 PemK 효과의 노던 블롯 분석. mazG mRNA 및 era mRNA를 1 mM IPTG의 존재하에 30분동안 pIN-MazG 및 pIN-Era로부터 각각 생성한 후 아라비노스 (최종 농도가 0.2%에 이름)를 첨가하여 PemK 발현을 유도하였다. lpp mRNA를 이. 콜라이 염색체로부터 전사하였다. 총 세포성 RNA를 PemK 유도 후 제시된 바와 같이 각종 시점에서 추출하고 노던 블롯 분석용으로 사용하였다. 대조군 실험을 PemK 유도 없이 동일한 조건하에 수행하였다. (B), (C) 및 (D) 생체내 mazG, era 및 Ipp mRNA에서 PemK 절단 부위의 프라이머 연장 분석. 총 세포성 RNA를 제시한 바와 같이 각각의 시점에서 추출하여 프라이머 연장 실험용으로 사용하였다. 프라이머 연장 생성물을 동일한 프라이머로 제조된 DNA 서열화 사다리와 함께 전개한 6% 서열화 겔상에서 분석하였다. PemK 절단 부위 주변 DNA 서열 사다리에 상보적인 RNA 서열을 오른쪽 부분에 나타내고, 절단 부위를 화살표로 제시하였다. 프라이머 G2 (B)로 검출된 mazG mRNA, 프라이머 El (C)로 검출된 era mRNA, 및 프라이머 lpp-C (D)로 검출된 lpp mRNA에서 생체내 PemK 절단 부위를 나타낸다.
결과
생체내에서 DNA 및 단백질 합성에 대한 PemK 효과: pemK 유전자를 pBAD 벡터 (Guzman et al. (1995) J Bacteriol 177, 4121-4130)내로 클로닝하여 플라스미드 pBAD-K를 제조하고, 이를 사용하여 이. 콜라이 BW25113를 형질전환시켰다. BW25113/pBAD-K에서 PemK 발현을 아라비노스를 최종 농도가 0.2%에 이르게 첨가함으로써 유도하였다. PemK 유도 후, DNA 복제 및 단백질 합성의 속도는 도 26a 및 B에서 각각 제시되는 바와 같이 각종 시점에서 측정되었다. DNA 복제 및 단백질 합성 모두가 PemK의 유도로 영향을 받지만, DNA 복제는 단백질 합성보다 현저히 낮은 정도로 억제되었다. 단백질 합성을 PemK 유도 후 10분에 약 50%로 신속히 감소시키는 반면, DNA 복제의 유사한 억제에 대해 약 100분이 걸렸다. 도 26c에서 나타난 바와 같이, PemK 유도 후 상이한 시점에서 총 세포성 단백질 합성의 SDS-PAGE 분석은 PemK가 세포성 단백질 합성의 일반적 억제제임을 제시한다. PemK 유도 후, 밴드의 강도(화살표로 표시된)는 0 내지 30분에 증가한 후 감소하였다. 분자 질량 및 유도의 반응속도론에 기초하여, 이러한 밴드는 유도된 PemK 단백질을 의미한다.
PemK는 세포-부재 시스템에서 단백질 합성을 억제한다 : PemK(His)6 (C-말단 태그됨)를 방법 및 재료에서 기술한 바와 같이 PemI 및 PemK(His)6을 모두 동시 발현하는 이. 콜라이 균주 BL21(DE3)/pET21cc-IK(His)6으로부터 정제하였다. (His)6PemI(N-말단 태그됨)를 이. 콜라이 균주 BL21(DE3)/pET28a-(His)6I로부터 정제하였다. PemK(His)6 및 (His)6PemI를 PemK 및 PemI로 지칭하고, 각각 시험관내 실험에 사용하였다. PemK가 단백질 합성을 억제하는지의 여부를 측정하기 위하여, 이. 콜라이 세포-부재 RNA/단백질 합성 시스템에서 MazG 및 (His)6Era의 합성상 정제된 Pemk의 효과를 조사하였다. 플라스미드 pETlla-MazG로부터의 MazG 합성 및 플라스미드 pET28a-Era로부터의 (His)6Era 합성을 37 ℃에서 1시간동안 PemK의 부재하에(도 27a, 레인 1) 또는 증가량의 PemK의 존재하에 (도 27a, 레인 2 내지 5) 이. 콜라이 T7 S30 추출 시스템 (Promega)을 사용하여 수행하였다. MazG 및 (His)6Era 합성 모두는 용량 의존성 방식으로 PemK에 의해 차단하였다 (도 27a). 이러한 결과로 PemK가 단백질 합성을 억제하고, 생체내에서 관찰되는 PemK-매개된 억제와 일치함 (도 26b 및 26c)을 증명한다. 따라서 생체내에서 관찰된 DNA 복제의 지연된 PemK-매개된 억제가 세포성 단백질 합성 억제의 제2 효과에 기인하는 것으로 추측된다. 흥미롭게도, 항독소 PemI의 첨가로 단백질 합성의 PemK-매개된 억제가 차단되고 PemI-용량 의존성 방식으로 MazG 및 (His)6Era 합성이 복원되었다(도 27b). PemK와 함께 15분동안 37 ℃에서 이. 콜라이 세포-부재 시스템의 예비-항온처리가, 15분의 예비-항온처리 후 PemI를 플라스미드 DNA와 함께 첨가하는 경우, (His)6Era 합성상 현저한 역효과를 갖지 않았음을 주목해야 한다 (도 27c에서 레인 1 및 3 비교). 그러나, PemI의 부재시, 어떤 단백질도 생성되지 않았다 (도 27c, 레인 2). 특히, (His)6Era 합성은, PemI를 PemK와 함께 15분의 예비-항온처리 후 첨가하는지(도 27c, 레인 3) 또는 15분의 예비-항온처리동안 PemK와 함께 첨가하는지(도 27c, 레인 4)의 여부에 관계없이 복원되었다. 이러한 결과로 PemK의 주요 표적은 mRNA이고, tRNA, 리보솜 및 세포-부재 시스템에서 단백질 합성에 요구되는 기타 다른 인자가 아님을 암시한다.
PemK의 엔도리보뉴클레아제 활성: T7 프로모터 및 mazG 유전자를 포함하는 DNA 단편을 방법 및 재료에서 기술한 바와 같이 주형으로서 플라스미드 pETlla-MazG를 사용하여 PCR 증폭으로 수득하였다. 유사하게 T7 프로모터 및 era 유전자를 함유하는 또다른 DNA 단편을 주형으로서 플라스미드 pET28a-Era를 사용하여 수득하였다. 이어서 mazG mRNA 및 era mRNA를 T7 대규모 전사 키트 (Promega)를 사용하여 이들 2개 DNA 단편 각각으로부터 제조하였다. mazG mRNA는 37 ℃에서 15분동안 PemK와 함께 항온처리 후 더 작은 단편으로 분해되는 반면 (도 28a, 레인 2), PemI의 첨가로 용량-의존성 방식으로 mazG mRNA의 절단이 억제되었다(도 28a, 레인 3 내지 6). PemI 단독으로 mazG mRNA상에 효과가 없었다 (도 28a, 레인 7). 유사한 결과를 기질로서 era mRNA를 사용하여 수득하였다. 이러한 결과로 PemK는 mRNA를 절단하여 단백질 합성을 억제하는 엔도리보뉴클레아제이고, PemI는 PemK의 엔도리보뉴클레아제 활성을 차단하는 항독소로서 작용함을 증명한다.
PemK에 의해 절단된 mazG mRNA의 분해 생성물이 3.5% 폴리아크릴아미드 겔상에서 명확한 밴드(도 28a)를 형성한다는 발견으로 PemK가 특정 위치에서 RNA를 절단함을 나타낸다. mazG mRNA를 PemK로 부분적으로 절단한 후, 재료 및 방법에서 기술한 바와 같이 5개의 상이한 올리고데옥시리보뉴클레오티드 프라이머, G1 내지 G5를 사용하여 프라이머 연장에 적용하였다. mazG mRNA를 따라 다수의 특정한 절단 부위를 PemK 처리를 제외하고 비슷하게 처리한 대조군과 비교하여 6% 서열 겔상에서 검출하였다. PemK에 의해 부분적으로 분해된 era mRNA를 또한 재료 및 방법에서 기술한 바와 같이 4개의 상이한 프라이머, E1 내지 E4를 사용하여 프라이머 연장에 적용하여, era mRNA를 따른 PemK 절단 부위를 검출하였다. PemK 절단 부위 주변의 정확한 서열을 결정하기 위하여, 각각 프라이머 연장 생성물을 동일한 프라이머로 제조한 DNA 서열화 사다리를 사용하여 6% 서열화 겔상에서 분석하였다 (도 28b 내지 e).
표 II는 PemK 절단 부위 주변의 mRNA 서열을 나타낸다. mRNA는 mazG mRNA (pETlla-MazG로부터)에서 PemK 절단 부위 주변(화살표로 지시됨)을 서열화한다.
era mRNA (pET28a-Era로부터) 및 lpp mRNA (이. 콜라이 염색체성 DNA로부터, 도 30d 참고)를 나타낸다. 보존된 UA 디뉴클레오티드를 굵은 글씨로 나타낸다. 숫자는 개시코돈 AUG에서 A 잔기를 +1로 취하면서 mRNA에서 뉴클레오티드의 위치를 나타낸다.
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표 II는 프라이머 연장 실험에 의해 측정한 바와 같이, mazG mRNA, era mRNA 및 lpp mRNA에서 주요 절단 부위 주변의 서열을 나타낸다 (lpp mRNA에 대한 도 30d 참고). 이러한 발견으로 UA 디뉴클레오티드가 1개의 절단 부위가 아닌 모두에 공통적인 것이고, 주요 절단은, UGC 서열에서 U 및G 잔기 사이를 절단한 하나의 예외 (표 II, 7번째 열)를 제외하고, UAX(X는 C, A 또는 U임) 서열에서 A 잔기의 5' 또는 3' 측면에서 발생함이 밝혀진다. UAC 서열은 결정된 18개 중 11개 절단 부위를 나타낸다.
30-염기 RNA 기질을 UAC 서열을 포함하는 mazG mRNA에서 1개의 PemK 절단 부위 주변 서열에 기초하여 분해하였다 (표 II, 2번째 열). RNA를 T4 폴리뉴클레오티드 키나제를 사용하여 [γ-32P]ATP를 가진 5' 말단에서 표지하였다. 전체 길이의 mazG mRNA를 사용한 프라이머 연장 실험에서, UAC 서열을 A 잔기의 5' 측면에서만 절단하였다 (도 28b). 그러나, 30-염기 RNA를 UAC 서열 (도 29a)에서 A 잔기의 5' 측면 또는 3' 측면에서 균등하게 (30개 염기 RNA에서 뉴클레오티드 15개) 절단하였다 (도 29a). 15% 천연 PAGE겔상에서, 30-염기 RNA로부터의 절단 생성물을 단일 밴드로서 이동하였다 (도 29b, 레인 2). 안티센스 RNA를 PemK의 첨가 전에 상이한 비율로 30-염기 RNA 기질과 어닐링하는 경우, 용량-의존성 방식으로 RNA 절단을 차단하였다 (도 29b, 레인 3 내지 7). 유사한 결과를 30-염기 RNA 기질이 이의 상보적 DNA와 이중체를 형성하는 경우 수득하였다. 이러한 결과는 30-염기 RNA 기질에서 PemK 절단 부위를 RNA-RNA 및 RNA-DNA 이중체에서 보호함을 제시한다. 그러므로, PemK는 일본쇄 RNA에 대한 서열-특이적 엔도리보뉴클레아제인 것으로 결론내려질 수 있다.
PemK 유도시 생체내 mRNA 절단: 생체내 mRNA상의 PemK의 효과를 조사하기 위하여, 노던 블롯 및 프라이머 연장 분석을 방법 및 재료에서 기술된 바와 같이 PemK 유도 후 상이한 시점에서 추출된 총 세포성 RNA를 사용하여 수행하였다. 16S 및 23S rRNA는 생체내에서 PemK에 대하여 안정하여, PemK 유도 후 60분동안 총 세포성 RNA 샘플의 1% 아가로스 겔상에 가시화로 밝혀진 바와 같이 밴드의 강도에서 어떠한 현저화 변화도 관찰되지 않았다. 이는 생체내에서 16S 및 23S rRNA 모두가 PemK 절단으로부터 잘 보호됨을 나타낸다. 도 30a는 각종 시점에서 mazG, era 및 lpp mRNA의 노던 블롯 분석이 PemK의 유도의 존재 또는 부재를 지적함을 나타낸다. mazG mRNA 및 era mRNA를 아라비노스 첨가(최종 농도 0.2%) 전 30분동안 1 mM IPTG의 존재하에 pIN-MazG 및 pIN-Era로부터 각각 생성하여 PemK 발현을 유도하였다. lpp mRNA는 이. 콜라이 염색체로부터 전사하였다. 이러한 mRNA의 3개 모두를 PemK 발현 유도 10분 후 분해하는 반면, PemK의 유도 부재시 60분의 항온처리동안 변화가 관찰되지 않았다 (도 30a). mazG 및 lpp mRNA를 비교시, era mRNA는 더 작은 명확한 밴드로 대부분 전환하는데, 이는 PemK의 유도 60분동안 비교적 안정하였다. 이 안정한 mRNA 절단 생성물의 성질은 알려지지 않았다.
프라이머 연장 실험을 또한 수행하여 생체내 mRNA에서 PemK 절단 부위를 결정하였다. 각각 mRNA에서 1개의 절단 부위는 mazG, era 및 Ipp에 대해 각각 도 30b, c 및 d에 나타난다. 모든 경우에서, 밴드는 PemK 유도 후 10분 후 출현하고(도 30b, c 및 d에서 레인 2), 밴드의 강도는 PemK 유도 60분동안 추가로 증가하였다 (레인 2 내지 6). 중요하게, 상기 밴드는 0분에 거의 검출되지 않으며 (레인 1), 이는 명확하게 관찰된 절단물이 PemK의 유도에 기인하였음을 증명하였다. mazG 및 Ipp mRNA를 UAC 서열에서 A 및 C 잔기 사이에서 절단되는 반면, era mRNA는 U 및 A 잔기 사이에서 절단되었다. mazG mRNA를 생체내 및 시험관내에서 동일한 위치에서 절단하였다 (도 28c 및 도 30b 비교). era mRNA의 생체내 절단은 또한 동일한 프라이머의 사용으로 시험관내에서 검출되는 바와 같이 동일한 위치에서 발생하였다 (도 28d 및 도 30c 비교). mazG 및 era mRNA에서 절단된 UAC 서열은 MazG에서 Tyr41 및 Era에서 Tyr7를 암호화하는 ORF의 판독 프레임내에 있는 반면, lpp mRNA에서 절단된 UAC 서열은 2개의 인접한 코돈인, Ala73에 대한 GCU 및 Thr74에 대한 ACU 사이에 존재한다. 생체내 PemK에 의한 mRNA 절단은 매우 특이적이어서 다른 절단 이벤트가 전혀 검출되지 않아 도 30b, c 및 d에서 보이는 바와 같다. 그러므로, 리보솜상에서 A 위치에서 코돈-특이적 mRNA 절단을 자극하는 RelE와 달리 (Pedersen et al. (2003) Cell 112, 131-140; Hayes and Sauer. (2003) Mol Cell 12, 903-911), PemK는 리보솜 및 코돈-판독과 무관한 방식으로 mRNA를 절단함으로써 단백질 합성을 억제할 수 있는 서열-특이적 엔도리보뉴클레아제이다.
결론
본 발명은 부분적으로 PemK, peml-pemK 중독 모듈에 의해 암호화되는 독소가 서열-특이적 엔도리보뉴클레아제라는 신규한 발견에 관한 것이다. 시험관내 및 생체내 연구 모두에서 특이적 위치에서 mRNA를 절단함으로써 PemK가 단백질 합성을 억제함을 증명한다. 정제된 PemK는 이. 콜라이 세포-부재 시스템에서 단백질 합성을 억제하는 반면, PemI의 첨가로 PemK의 억제 효과를 차단시키고 단백질 합성을 복원시킬 수 있다. 더욱이, 본원에서 mRNA를 PemK로 분해하고, PemK 매개된 mRNA 절단을 PemI로 억제함을 증명한다. 그러므로, PemI는 PemK와 복합체를 형성함으로써 PemK의 엔도리보뉴클레아제 활성을 억제하는 항독소로 작용한다. 엔도리보뉴클레아제 활성과 관련하여, PemI-PemK 복합체는 불활성이다.
PemK는 본원에서 일본쇄 RNA에 대해 매우 특이적이어서, PemK 매개된 RNA 절단은, RNA 기질이 이의 안티센스 RNA 또는 상보적인 DNA와 어닐링하여 RNA-RNA 또는 RNA-DNA 이중체를 형성하는 경우 차단된다. 본 결과로 또한 PemK는 UAX (X는 C, A 또는 U임) 서열에서 A 잔기의 5' 또는 3' 측면에서 우선적으로 절단함을 증명한다. 본원에서 제시되는 당해 결과로 또한 PemK에 의한 RNA 절단은 리보솜과 무관하고, 이는 RelE, relBE 중독 모듈에 의해 암호화되는 독소와 명백히 상이함을 밝히고 있다. RelE은 유리 RNA를 절단할 수 없으나 매우 코돈-특이적으로 리보솜 A 위치에서 mRNA 절단을 자극한다 (Christensen and Gerdes. (2003) Mol Microbiol 48, 1389-1400; Pedersen et al. (2003) Cell 112, 131-140; Hayes and Sauer. (2003) Mol Cell 12, 903-911).
pemI-pemk 시스템과 동일한 중독 모듈인 kis-kid 시스템에 대한 이전 연구에서, Kid (PemK)는 개시 단계에서 시험관내 ColEl 복제를 억제하나, P4 DNA 복제에 현저한 효과를 나타내지 않음을 보고하고 있다. DnaB는 Kid(PemK)의 억제 작용에 대한 표적으로 보고되고 있다 (Ruiz-Echevarria et al. (1995)JMoI Biol 247,568-577). 그러나, Kid (PemK) 및 DnaB 사이의 상호작용을 뒷받침하는 데이타가 존재하지 않는다. ColEl 복제가 RNA II에 의해 개시되고 RNA I에 의해 억제되는 반면 (Cesareni et al. (1991) Trends genet 7, 230-235; Davison. (1984) Gene 28, 1-15), P4 DNA 복제는 주로 α단백질에 의해 조절됨(Briani et al. (2001) 플라스미드 45,1-17)을 주목하는 것은 흥미롭다. RNA I 및 RNA II의 대사작용에 관여하는 RNase는 ColEl 플라스미드 복제의 조절에서 중요한 역할을 하는 것으로 예측된다 (Jung and Lee. (1995) Mol Biol Rep 22,195-200). RNA II는 몇몇 UAC 서열을 함유하는데, 이중 2개는 제1 및 제2 스템-루프 구조의 루프 영역에 존재한다 (Tomizawa and Itoh. (1982) Cell 31, 575-583; Tomizawa. (1984) Cell 38, 861-870). 그러므로, Kid(PemK)에 의한 ColEl DNA 복제의 억제는 이의 엔도리보뉴클레아제 활성에 의해 RNA II의 분해에 기인할 것이다. 더욱이, Kid(PemK), 세균에서 독소는 각종 진핵 세포의 성장을 억제한다는 사실 (de la Cueva-Mendez et al. (2003) Embo J 22, 246-251)은 DnaB와의 상호작용 대신에 세포성 mRNA에 대한 이의 엔도리보뉴클레아제 활성에 의한 것임이 즉시 설명될 수 있다.
PemK 동족체는 광범위한 세균에서 동정되어 있다. MazF (ChpAK) 및 ChpBK는 이. 콜라이에서 2개의 PemK-유사 단백질이다 (Santos Sierra et al. (1998) FEMS Microbiol Lett 168,51-58; Masuda et al. (1993)J Bacteriol 175,6850-6856; Christensen et al. (2003) J Mol Biol 332, 809-819). MazF (ChpAK), mazEF 중독 모듈에 의해 암호화되는 독소는 PemK와 25% 상동성이고; ChpBK, chpB 중독 모듈에 의해 암호화되는 독소는 PemK와 41% 상동성이다. 특히, MazF (ChpAK) 및 ChpBK는 RelE와 유사한 방식으로 mRNA를 절단함으로써 해독을 억제하는 것으로 공지되어 있다 (Christensen et al. (2003) 상기 참고). 그러나, 최근에 본 발명자들은 MazF가 리보솜과 무관하게 작용하는 엔도리보뉴클레아제이고 특이적 서열에서 일본쇄 mRNA를 절단함으로써 단백질 합성을 억제함을 증명하였다 (Zhang et al. (2003) Mol Cell 12,913-923). MazF는 우선적으로 ACA 서열에서 A 및 C 잔기 사이에서 mRNA를 절단한다 (Zhang et al. (2003) 상기 참고).
Kid (PemK) 단백질의 결정 구조는 동종이량체로 결정되었다(Hargreaves et al. (2002) Structure (Camb) 10, 1425-1433; Hargreaves et al. (2002) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 58, 355-358). MazF의 구조가 결정되지 않았음에도, 문헌(Kamada et al (2003))에서는 2개의 MazF 동종이량체 및 1개의 MazE 동종이량체에 의해 형성된 MazE-MazF 복합체의 결정 구조 (MazF2-MazE2-MazF2)를 보고하고 있다. 흥미롭게도, Kid (PemK) 동종이량체의 구조와 MazE-MazF 복합체에서 MazF 동종이량체의 구조가 유사하다. 그러나, MazE-결합된 MazF 동종이량체내 β쇄 S1 및 S2 사이의 보존된 루프 (S1-S2 루프로 지칭됨)를 용매로 투입하면 대부분 무질서하게 하는 반면, 2개의 상응하는 루프는 Kid (PemK) 동종이량체에서 "폐쇄형" 입체형태이다 (Kamada et al. (2003)Mol Cell 11, 875-884). Kid (PemK) 동종이량체의 구조에서 S1-S2 루프는 염기성 표면 및 보존된 소수성 포켓를 포함하는 공동-유사 구조를 형성한다. 보존된 소수성 포켓은 MazE-MazF 복합체 형성에서 MazE를 인식하는 필수 역할을 한다 (Kamada et al. (2003) 상기 참고). 본 발명자들은 상당히 음으로 하전된 MazE의 C-말단 연장이 MazF 동종이량체에서 S1-S2 루프 사이에 결합하는 일본쇄 RNA를 모방할 수 있음을 제안하였다 (Zhang et al. (2003) 상기 참고). PemI은 PemK의 엔도리보뉴클레아제 활성을 차단하는 것과 매우 유사한 방식으로 PemK에 결합하는 것으로 계획된다.
PemK 및 MazF 둘다는 일본쇄 RNA에 대한 서열-특이적 엔도리보뉴클레아제로 본 발명자들에 의해 특징지워졌으나, 이들의 생리 기능은 RNase E, A 및 T1과 같은 다른 공지된 엔도리보뉴클레아제와 구별되는 것으로 보인다. PemK 및 MazF는 세포성 mRNA의 기능을 간섭함으로써 일반적 단백질 합성 억제제로서 작용한다. 작은 RNA, 예를 들어 micRNA (mRNA-간섭하는-상보적 RNA) (Mizuno et al. (1984) Proc Natl Acad Sci USA 81,1966-1970), miRNA (Ambros. (2001) Cell 107,823-826) 및 siRNA (Billy et al. (2001) Proc Natl Acad Sci USA 98,14428-14433)는 특이적 표적 RNA의 기능을 간섭한다는 것이 익히 공지되어 있다. 리보자임은 또한 표적 RNA에 특이적으로 작용하여 그 기능을 간섭한다 (Puerta-Fernandez et al. (2003) FEMS Microbiol Rev 27,75-97). 본 발명자들은 PemK 및 PemK 동족체 (iMazF 포함)가 특이적 서열에서 mRNA를 절단시키는 신규한 mRNA-간섭하는 메카니즘을 가진 신규한 엔도리보뉴클레아제 군을 형성함을 제안한다. 이와 같이, 본 발명자들은 본원에서 이를 "mRNA 인터페라제"라 명명하였다. 이전에 보고된 바와 같이, Kid(PemK)는 사람 암 세포에서 아폽토시스를 촉발하는 반면, Kis(PemI)는 Kid(PemK)의 독성 효과를 억제한다 (de la Cueva-Mendez etal.(2003) 상기 참고). 그러므로,이러한 신규한 조절가능한 mRNA-간섭하는 시스템이 사람 질환의 치료학적 개입(예. 유전자 치료법)에 유용할 수 있다.
실시예 V
본원에서 나타낸 바와 같이, PemK는 X가 C, A 또는 U인 UAX 서열에서 세포성 mRNA를 절단하는 고도의 서열-특이적 엔도리보뉴클레아제로 작용한다. 이러한 활성은 세포에서 단백질 합성을 부분적으로 또는 전체적으로 억제시킬 수 있다. RNA 전사체에서 UAX 서열(여기서 X는 C, A, U임)의 예측되는 빈도는, 4개의 뉴클레오티드 중 임의의 1개가 제1의 2개 뉴클레오티드 위치 중 각각 하나로 혼입되고 3개의 제시된 뉴클레오티드 중 임의의 하나가 제3 뉴클레오티드 위치로 혼입된다는 동일 확률로 예측되는 표준 계산에 기초하여, 64분의 3이다. 일부 RNA 전사체의 빈도는 예측된 빈도와 비교하여 UAX 서열 빈도가 더 낮거나 높을 수 있음을 이해하여야 한다. 그리하여, 특이적 RNA 전사체 또는 관련된 RNA 전사체 군의 PemK 엔도리보뉴클레아제에 의한 절단에 대한 민감성이 전사체에서 UAX 서열 또는 PemK 표적 서열의 빈도에 의존한다. 더욱이, 당업자는 RNA 전사체의 서열에 기초하여, PemK 매개된 절단에 대한 전사체의 민감성을 예측할 수 있다.
실시예 VI
일반적으로, RNA 인터페라제 및 본 발명의 특이적 RNA 인터페라제는 또한 백그라운드(비-특이적) 단백질 생성물이 극적으로 감소되거나 제거되어 "단일-단백질" 합성 시스템을 생성하는 생체내 및 시험관내 단백질 생성 시스템의 성분으로서 유리하게 사용될 수 있다. "단일 단백질" 합성 시스템을 사용하여 발현되는 단백질은 본질적으로 오염 단백질이 존재하지 않으므로, "순수한" 단백질 제제에 유리하거나 필수적인 적용에 유용하다. 이러한 적용은 막 단백질과 관련된 단백질을 포함하여, 비제한적으로 정제 없이 단백질의 핵 자기 공명(nuclear magnetic resonance ; NMR) 분석 및 단백질의 다른 구조 결정법을 포함한다. 막 단백질의 구조적 분석에 관련하여, 본 발명의 방법을 사용하여 생성된 막 단백질 제제는 고체 상태 NMR과 관련된 프로토콜에 매우 적합한다. 바람직한 측면에서, 본 발명의 방법을 사용하여 세포 내용물에서 방사성 동위원소를 사용하여 특이적 막 단백질을 배타적으로 표지하는 것이 바람직할 수 있다. 표지된 막 단백질은 이어서 내인성 세포 기관을 통하여 표지로 인하여 즉시 검출되는 적합한 세포막으로 혼입된다.
생체내 또는 시험관내 적용에서 단일-단백질 합성 시스템을 작제하기 위하여, 내인성 mRNA를 절단하여 이러한 mRNA로부터 단백질 합성을 차단하는 mRNA 인터페라제 (예, PemK 및/또는 MazF)를 사용하여 당해 시스템을 예비 처리한다. 생체내에서 이러한 예비처리를 위하여, mRNA 인터페라제에 대한 조절가능한 유전자를 세포 또는 조직내로 도입하여 이의 발현을 유도한다. 외인성 유전자를 세포 및/또는 조직으로 도입하고 발현시키는 방법은 본원에서 기술되어 있고 당업계에 공지되어 있다. 시험관내에서 mRNA 인터페라제를 예비 처리하기 위하여, 정제된 mRNA 인터페라제를 시험관내 해독 시스템으로 첨가한다. 각종 시험관내 해독 시스템은 당업계에 공지되어 있고, 비제한적으로 토끼 망상적혈구, 맥아 및 이. 콜라이로부터 유래한 추출물로 이루어진다. 생체내 또는 시험관내 시스템에서 "단일 단백질"의 생산을 위해, 목적하는 단백질을 암호화하는 유전적 작제물을 조작하여 mRNA 인터페라제-표적 서열 모두가 제거된 것으로부터 mRNA를 전사한다. 이러한 공정으로 "단일 단백질" 발현 시스템에 첨가된 mRNA 인터페라제의 엔도뉴클레아제 활성에 민감하지 않은 mRNA를 생성한다. 당해 발명의 상기 조작된 mRNA 전사체는 본원에서 "인터페라제 내성 mRNA"로 지칭될 수 있다. 인터페라제 내성 mRNA는, 예를 들면, 조작된 작제물로부터 발현을 유도함으로써 발현한다. 인터페라제 내성 mRNA는, 본질적으로 mRNA 인터페라제의 활성에 민감한 임의의 다른 단백질의 해독 부재하에 단백질로 해독되어서, 따라서 본질상 단일 단백질 샘플을 생성한다. 이러한 접근법으로 원핵 또는 진핵 시스템에 적용할 수 있다.
mRNA 인터페라제를 사용한 처리는 또한 인터페라제 내성 mRNA의 발현/유도 또는 첨가와 동시에 할 수 있음을 이해하여야 한다. 이러한 접근법은 단일 단백질 합성에 관계하는 본 발명의 시험관내 또는 생체내 (세포-기반) 시스템과 함께 사용할 수 있다.
세포-기반 발현 시스템: MazF가 서열 특이적(ACA) 엔도리보뉴클레아제라는 점에서, 일본쇄 RNA(Zhang et al. 2003, 상기 참고)에서만 기능적인 , 세포-기반 "단일-단백질" 합성하는 시스템을 개발하여 상기 적용에서 MazF의 유용성을 예시하였다.
그리하여, 단일 단백질 합성하는 시스템을 개발하여 세균성 세포에서 성숙한 사람 에오탁신을 합성하였다. 상기 목적을 이루기위하여, 야생형 에오탁신 아미노산 서열을 암화화하는 신규한 핵산 서열을 합성하였다. 이러한 신규 핵산 서열로부터 전사된 RNA 분자는 ACA 서열이 결여되어 있다. 도 35; 서열번호 30-31 참고 (각각 성숙한 사람 에오탁신의 핵산 및 아미노산 서열). 성숙한 사람 에오탁신을 암호화하는 상기 신규 핵산 서열을 냉각-쇼크 벡터 (pCOLDI)내로 클로닝하고, 이는 저온에서 항온처리로 IPTG의 존재하에 유도하는 경우 단백질을 발현하였다. 도 36 참고. 이러한 발현 시스템에서 비-특이적 단백질 발현의 낮은 백그라운드가 중요한 장점이다.
목적하는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 다양한 접근법을 사용하여 생성할 수 있음을 이해하여야 한다. 이러한 접근법은 다음을 포함한다: 핵산 서열에서 ACA 서열이 결여된 목적하는 폴리펩티드를 암호화할 수 있는 합성 핵산 서열의 고안 및 생성; 및 교반하는 트리플렛 서열에 대하여 목적하는 폴리펩티드를 암호화하고 이로부터 암호화되는 아미노산 서열을 변형시키는 것과 관련하여 상기 돌연변이가 사일런트하게 각각의 ACA 서열을 돌연변이시킬 수 있는 핵산 서열의 분리.
방법 및 재료
pCold I 벡터를 사용하는 냉각 쇼크 유도 :
pCold I 벡터에 lac 오퍼레이터가 포함되기 때문에, 1 mM IPTG를 첨가하여 이러한 조절 요소로 조절되는 유전자 발현을 유도한다. 일부 단백질에 대하여, 세포가 중간-대수기(OD600=0.4-0.7)에 도달한 후 15℃에서의 유도가 단백질의 폴딩을 향상시키는데 바람직하다. 최적의 단백질 수율에 가장 적합한 조건을 결정하기 위하여, 샘플을 유도한 후 상이한 시간 간격에서 제거하여 SDS-PAGE 분석으로 평가한다. 일반적으로, 세포를 발현이 유도되는 동안 LB 배지중에 유지시키지만, 방사성 동위원소를 사용하여 단백질 표지, 예를 들면, 15N 또는 13C 표지화하기 위한 바람직한 경우, M9 또는 MJ9 배지를 사용한다.
SD 위치로부터 pCold I 벡터의 다중 클로닝 위치의 뉴클레오티드 서열은 하기에 나타난다. 발현된 단백질은 N-말단에서 15-잔기 제거가능한 서열을 포함하고, 해독 향상화 시스-요소인 하류 박스 (downstream box; DB), His6 태그 및 인자 Xa 위치 다음으로 다중 클로닝 위치로 이루어진다.
GAGG SD
TAATACACC SD 서열 하류 (서열번호 29)
ATGAATCACAAAGTG DB (서열번호 30)
CATCATCATCATCATCAT His6 (서열번호 31)
ATCGAAGGTAGG 인자 Xa 위치 (서열번호 32)
CATATGGAGCTCGGTACCCTCGAG GGATCC
NdeI SacI KpnI XhoI BamHI
GAATTCAAGCTTGTCGACCTGCAGTCTAGA 다중 클로닝 위치 (서열번호 33)
EcoRIHindIIISalI PstI XbaI
pCold (SP) 에오탁신 (또한 본원에서 pSPS에오탁신으로 지칭됨)을 작제하기 위하여, 이탤릭체의 굵은 글씨로 제시된 2개의 ACA 서열을 ATA로 변화시켜 MazF 인터페라제에 대한 인지 위치를 제거한다.
본 발명의 방법을 사용하여 임의의 발현 벡터 또는 발현 벡터 시스템 (예, pET 벡터)을 사용할 수 있는 것을 인정해야 한다. pCold I 벡터를 예시 벡터로 제시하고 상기 실시예는 본 발명의 범위를 제한하지는 않는다.
도면에 관한 구체적인 방법론적 상세설명
도 37. pACYCmazF를 포함하는 이. 콜라이 BL21(DE3) 또는 pACYCmazF 및 pCold (SP) 에오탁신을 포함하는 BL21(DE3)를 적합한 항생제를 함유하는 M9-글루코스 배지중에 성장시켰다. 배양물의 OD600가 0.5에 이른 경우, 당해 배양물을 15분동안 15℃로 시프팅시키고, 1 mM IPTG를 배양물에 첨가하였다. 제시된 시간 간격에서, 1 ml의 배양물을 제거하고 10μCi 35S-메티오닌을 함유하는 시험관에 첨가하였다. 15분동안 항온처리 후 (펄스), 0.2 ml의 50 mg/ml 메티오닌을 첨가하고 5분동안 항온처리하였다 (체이스). 표지된 세포를 M9-글루코스 배지를 사용하여 세척하고 100㎕의 SDS-PAGE 로딩 완충액중에 현탁하였다. 각각의 10㎕ 샘플을 SDS-PAGE에 이어서 방사선자동사진법으로 분석하였다.
결과
성숙한 사람 에오탁신을 암호화하는 신규한 핵산 서열을 포함하는 pCOLDI를 주형으로서 사용하였다. 도 36 참조. 수득한 플라스미드를 pCold(SP)에오탁신으로 명명하였다. T7 프로모터의 조절하에 mazF 유전자를 포함하는 플라스미드 pACYCmazF를 사용하여 MazF의 발현을 유도하였다. pACYCmazF 단독으로 또는 pACYCmazF 및 pCold(SP)에오탁신을 포함하는 이. 콜라이 BL21(DE3) 세포를 적합한 항생제를 함유하는 M9-글루코스 배지중에 성장시켰다. 배양물의 OD600가 0.5에 이른 경우, 당해 배양물을 15℃에서 15분동안 시프팅시키고, 1 mM IPTG를 배양물에 첨가하였다. 제시된 시간 간격에서, 1 ml의 배양물을 제거하고 10μCi 35S-메티오닌을 함유하는 시험관에 첨가하였다. 15분동안 항온처리 후 (펄스), 0.2 ml의 50 mg/ml 메티오닌을 첨가하고 배양물을 5분동안 항온처리하였다 (체이스). 표지된 세포를 M9-글루코스 배지를 사용하여 세척하고 100㎕의 SDS-PAGE 로딩 완충액중에 현탁하였다. 각각의 10㎕ 샘플을 SDS-PAGE에 이어서 방사선자동사진법으로 분석하였다. mazF 유전자의 발현은 이전에 기술된 바와 같이 (Zhang et al. 2003, 상기 참고) BL21(DE3) 세포에서 단백질 합성을 억제하였다. 그러나, ACA 서열을 포함하지 않는 mRNA로 암호화된 성숙한 사람 에오탁신의 합성은 mazF 발현으로 억제되지 않았다. 도 37 참조. 상기 결과로 다량의 단일 단백질을 본 발명의 단일-단백질 생성 방법을 사용하여 수득할 수 있음을 증명하고 있다.
주의하여, pCold (SP) 에오탁신을 단독으로 포함하는 이. 콜라이 BL21(DE3) 세포를 적절한 항생제를 함유하는 M9-글루코스 배지에서 성장시키는 유사한 실험을 또한 수행하였다. 이러한 실험으로 상기 시스템에서 MazF 발현 효과가 밝혀진다. pCold (SP) 에오탁신을 보유하는 세포를 MazF 유도 부재시 냉각-쇼크시키는 경우, 다수의 백그라운드 이. 콜라이 단백질을 또한 사람 에오탁신과 함께 생성하였다. 본원에서 상기 기재된 바와 같이, MazF를 에오탁신과 함께 유도한 경우, 세포성 단백질 백그라운드가 현저하게 감소한다. MazF 유도 3시간 후, 백그라운드 단백질 합성이 거의 완전히 제거되어, 단일 단백질, 즉 사람 에오탁신을 단독으로 계속 생산할 수 있는 세포를 제조한다.
에오탁신의 생산이 72시간 이상 지속되고 에오탁신 생산비가 첫 36시간동안 변하지 않는데, 이는 세포의 단백질-합성능이 거의 3일동안 MazF 발현에 의해 영향받지 않는 것을 제시한다. 이는 리보솜, tRNA, 단백질 합성에 요구되는 다른 세포성 성분 모두가 MazF 유도에 의해 영향받지 않음을 증명한다. 이들 결과는 또한 아미노산 생합성 뿐만 아니라 에너지 대사 및 뉴클레오타이드 생합성이 MazF 발현에 의해 크게 영향받지 않음을 시사한다.
또한 MazF 발현이 유도된 세포 배양물의 72시간 항온처리 동안, OD600 (0.5)가 증가하지 않았는데, 이는 MazF 유도 후 세포 성장이 거의 억제된 반면, 당해 세포는 완전한 단백질 합성능을 유지함을 나타내는 것으로 주목할 만한 것이다. 그러나, MazF 유도 부재시, OD600가 15℃에서 72-시간 항온처리동안 백그라운드 세포성 단백질의 생산으로 입증되는 바와 같이 0.5에서 1.2로 상승한다.
상기 발현 시스템에서 에오탁신 생산 수준을 결정하기 위하여, 동일한 양의 배양물을 분리하고 SDS-PAGE에 의해 분석한다. 냉각 쇼크 후 36시간에, 명확히 검출가능한 염색된 에오탁신 밴드가 중요하고 약 5%의 총 세포성 단백질을 차지한다. 이러한 결과는 상기 기술한 바와 같이 M9 최소 배지를 사용하여 수득하였다. M9 배지의 사용은 13C-글루코스 및 15N-NH4C1을 갖는 동위원소-풍부한 단백질에 중요하다. 그러나, 다량으로 비표지된 단백질을 생산하는 것이 바람직한 경우, L-브로쓰 (LB) 배지와 같은 풍부한 배지를 대안적으로 사용할 수 있다. 실제로, 본 발명자들은 에오탁신 생산이 LB 배지중에 항온처리된 배양물중 20%의 총 세포성 단백질 또는 40mg/l의 배양물(25리터 배양물로부터 1g)만큼 높을 수 있음을 발견하였다. M9 또는 LB 배지중에 항온처리된 세포에서 생산된 에오탁신은 완전 가용성이고 함유물 형태가 생성되지 않는 점을 주목하는 것이 중요하다.
본원에서 상기 제시된 바와 같이, 세포 질량은 항온처리 기간동안 증가하지 않는데, 세포 성장이 냉각-쇼크 항온처리 동안 완전히 억제되기 때문이다. 그러므로, 세포 기관이 본원의 단일 단백질 생산 (SPP) 시스템에서 냉각 쇼크시에 pCold 벡터에서 클로닝된 유전자의 생산으로 배타적으로 사용된다. 그러므로, MazF 유도시, 세포 배양물을 세포가 성장하는 조건하에 생존력 유지에 일치하지 않는 정도로 농축할 수 있다. 실제로, 본 발명자들은 지수적으로 성장하는 배양물을 클로닝된 유전자 생성물의 수율에 영향을 주지 않으면서 4배 이상(0.7 내지 2.8의 OD600)으로 농축시킬 수 있음을 측정하였다. 이는 세포가 성장하는 보통 배양물에 대해 25%의 배지만을 사용할 수 있음을 의미한다. 즉, lg의 사람 에오탁신을 잠재적으로 6.5ℓ의 LB 배지만을 사용하여 생산할 수 있다. 이는 본 발명의 SPP 시스템의 특히 관련 이익으로 이러한 특징으로 NMR 구조 연구용 동위원소-풍부한 단백질 또는 다량의 단백질을 발현하는 것과 관련된 비용을 극적으로 감소시키기 때문이다.
세포-부재 발현 시스템 : 토끼 망상적혈구, 맥아 및 이. 콜라이로부터의 추출물은 매우 빈번하게 사용되는 세포-부재 해독 시스템을 포함한다. 상기 모두를 외인성 RNA의 해독에 필요한 거대분자성 성분 (70S 또는 80S 리보솜, tRNAs, 아미노아실-tRNA 신테타제, 개시, 연장 및 종결 인자 등)을 포함하는 조악한 추출물로서 제조한다. 각각의 추출물을 아미노산, 에너지원 (ATP, GTP), 에너지 생성 시스템 (진핵성 시스템을 위한크레아틴 포스페이트 및 크레아틴 포스포키나제, 및 이. 콜라이 용해물을 위한 포스포에놀 피루베이트 및 피루베이트 키나제), 및 기타 보조인자 (Mg2 +, K+, 등)로 일반적으로 보충하여 유효한 해독을 보증한다.
사용된 유전자 재료 (예, RNA 또는 DNA)는 시험관내 단백질 합성의 2개의 접근법이 유용한지를 결정한다. 표준 해독 시스템, 예를 들어 망상적혈구 용해물을 주형으로서 RNA를 사용하는 반면, "커플링된" 및 "연결된" 시스템을 RNA로 전사하고, 이어서 해독되는 DNA 주형으로 이용한다.
토끼 망상적혈구 용해물 : 토끼 망상적혈구 용해물은 외인성 RNA (천연 또는 조작됨)의 해독에 사용되는 유효한 시험관내 진핵성 단백질 합성 시스템이다. 망상적혈구는 매우 분화된 무핵 세포로 이의 생체내 기능은 주로 헤모글로빈 합성에 관계되고, 당해 헤모글로빈은 망상적혈구에 의해 합성된 90% 이상 단백질을 포함한다. 이들 미성숙 적혈구는 충분한 글로빈 mRNA 및 세포성 해독 시스템의 성분을 포함하여, 다량의 글로빈 단백질을 생산하는데 필수적인 기관 모두를 보유한다 (본원의 상기 기술 및 당업계 공지된 바와 같이). 내인성 글로빈 mRNA를 Ca2 +-의존성 구균 뉴클레아제와 함께 항온처리에 의해 제거할 수 있는데, 이는 후에 EGTA에 의해 Ca2 +의 킬레이션으로 불활성화시킨다. 상기 뉴클레아제-처리된 용해물은 낮은 백그라운드 및 낮은 농도에서도 외인성 RNA의 유효한 이용을 나타낸다. 외인성 단백질을 완전한 망상적혈구 세포에서 관찰되는 것과 유사한 속도로 합성한다. 미처리되거나 처리된 망상적혈구 용해물을 캡핑되거나 캡핑되지 않은 RNA (진핵성 또는 세균성)으로부터 더 큰 단백질의 합성에 사용할 수 있다.
밀배아 추출 : 밀배아 추출물은 내인성 낮은 수준의 mRNA에 의하여 최소의 백그라운드 혼입된다는 점에서, 토끼 망상적혈구 추출물에 대한 편리한 대안물이다. 밀배아 추출물은 세균, 효모, 고등식물 및 포유류 유래된 상이한 각종 유기체로부터의 외인성 RNA를 효과적으로 해독한다. 토끼 망상적혈구 용해물을 억제하고 산화된 티올 또는 이본쇄 RNA의 작은 단편을 함유하는 RNA를 해독하기 위한 바람직한 시스템이다.
캡핑되거나 캡핑되지 않은 RNA 주형 : 망상적혈구 용해물 및 밀배아 추출 모두는 시험관내 전사된 RNA 또는 세포 또는 조직으로부터 분리된 RNA를 해독하기 위한 효과적인 시스템이다. 5'캡 구조의 존재는 시험관내 합성된 RNA를 사용하는 경우 해독 활성을 향상시킬 수 있다. 맥아 추출에 의한 해독은 망상적혈구 용해물 추출물에 의한 해독에 비교하여 일반적으로 더욱 캡에 의존적이다. 바람직한지를 결정하기 위하여, RNA를 이. 콜라이 세포-부재 시스템에서 DNA 주형으로부터 직접 발현하는 원핵성 벡터내로 암호화 서열을 서브클로닝함으로써 캡핑할 수 있다.
표준 해독 반응물에서, 정제된 RNA를 해독을 위한 주형으로서 사용한다. 한편, "연결된" 및 "커플링된" 시스템을 주형으로서 DNA를 사용한다. RNA를 DNA로부터 전사하고 이어서 어떤 정제도 하지 않고 해독한다. 상기 시스템에는 전형적으로 원핵성 파아지 폴리머라제 프로모터 (T7, T3, 또는 SP6)를 사용하여 주형 DNA가 요구된다. RNA 폴리머라제 (예, 원핵성 파아지의 폴리머라제)는 DNA를 RNA로 전사하고, 진핵성 또는 원핵성 추출물로 RNA에서 단백질로 해독된다. 전사:해독 반응을 위한 DNA 주형을 플라스미드로 클로닝하거나 PCR로 생성할 수 있다. "연결된" 시스템은 2단계 반응으로, 박테리오파지 폴리머라제를 사용한 전사 및 토끼 망상적혈구 또는 맥아 용해물중의 연속된 해독을 수반한다. 전사 및 해독 반응을 개별적으로 또는 커플링시켜 수행할 수 있다.
이. 콜라이 추출물 : 전사 및 해독이 순차적으로 발생하는 진핵성 시스템과 달리, 이. 콜라이 세포내에서는 전사 및 해독이 동시에 발생한다. 그러므로, 시험관내 이. 콜라이 해독 시스템은 1단계 반응을 수반한다. 전사하는 동안, RNA의 5' 말단에 리보솜 결합이 유효하고, 3' 말단이 여전히 전사되는 동안에 해독이 진행된다. RNA에 대한 리보솜의 초기 결합은 전사체 안정성을 유지시키며 유효한 해독을 촉진시킨다. 따라서, 세균성 해독 시스템은 원핵성 또는 진핵성 유전자 생성물의 신속한 발현에 익히 적합하다. 바람직한 양태에서, 샤인-달가노 리보솜 결합 위치는 고수율의 단백질 및 최적의 개시 정확성을 촉진하기 위하여 사용되는 DNA 주형의 개시인자 코돈 상류에 포함된다. 진핵성 RNA의 캡핑은 이. 콜라이 해독 시스템에서 요구되지 않는다.
이. 콜라이 추출물에서는 또한 교차-반응성 또는 진핵성 용해물내에 내인성 단백질과 연관된 다른 문제점을 감소시키거나 제거하는 점에서 부가적인 혜택이다. 더욱이, 이. 콜라이 S30 추출 시스템으로 천연 이. 콜라이 프로모터 서열 (예, lac 또는 tac)을 포함하는 DNA 벡터로부터 발현 가능하다. 이. 콜라이 세포-부재 시스템은 내인성 mRNA로 풍부한 조악한 추출물로 이루어진다. 전사/해독에 사용하기 위한 추출물을 제조하기 위하여, 항온처리하여 내인성 mRNA를 해독시키고, 당해 mRNA는 이어서 분해된다. 이렇게 제조된 용해물중에 수득한 낮은 수준의 내인성 mRNA로 외인성 합성 생산물을 동정할 수 있다.
진핵성 해독 시그날 : 원핵성 및 진핵성 mRNA 전사체 사이에 일부 현저한 차이점이 존재하여 이를 고려하여야 한다. 진핵성 mRNA는 통상적으로 2개의 전사후 변형으로 특징지워진다: 5'-7 메틸-GTP 캡 및 3'폴리 (A) 테일. 이러한 2개의 변형으로 조기 분해를 예방하여 mRNA의 안정성에 기여한다. 5'캡 구조는 또한 진핵성 리보솜에 대한 결합을 촉진시키고 및 적당한 AUG 개시인자 코돈 인식을 보증함으로써 mRNA의 행독을 향상시킨다. 컨센서스(consensus) 서열, 또는 "코작(Kozak)"서열은 일반적으로 진핵성 mRNA에서 가장 강력한 리보솜 결합 시그날로 인식된다. 유효한 해독 개시를 위하여, 중요 요소는 Kozak 서열에서 +1 위치의 G 잔기 및 -3 위치의 A 잔기이다. 코작 컨센서스 서열이 결핍된 mRNA는, 안정한 2차 구조가 결핍된 적당히 긴 5'-비해독 영역 (UTR)을 포함하는 경우, 진핵성 세포-부재 시스템에서 유효하게 해독될 수 있다.
원핵성 해독 시그날 : 리보솜은 세균에서 샤인-달가노 (SD) 서열로 지칭되는 퓨린-풍부 영역에 의해 AUG 개시 위치로 인도된다. 이러한 서열은 30S 리보솜 서브유닛에서 16S rRNA의 3' 말단에 상보적이다. 개시 AUG 코돈의 상류에 위치한 SD 영역은 당업계에 공지된 컨센서스 서열을 포함한다. 특이적 mRNA는 2 내지 9 이상의 범위에서 16S rRNA의 항-샤인-달가노 서열에 상보적인 다수의 뉴클레오티드로 상당히 다양해진다. AUG 개시인자와 관련하여 리보솜 결합 위치 (RBS)의 위치는 해독의 효율성에 있어서 중요하다 (통상적으로 개시 위치의 A에 대한 -6 내지 -10).
실시예 VII
본 발명은 또한 다량의 작은 일본쇄 RNA를 생산하는 방법을 포괄하는데, 당해 방법은 간단한 생화학적 공정을 수반한다. 이 방법의 개발로, 예를 들면 고가의 화학 합성 공정을 요구하지 않으면서, 다량의 siRNA 또는 miRNA의 생산을 가능하게 한다.
요약하면, 복수의 짧은 동일한 서열을 포함하고 RNA내에 나란히 반복되는 RNA를 T7 RNA 폴리머라제를 사용하여 합성한다. RNA에서 나란히-반복되는 서열을 본 발명의 mRNA 인터페라제, 예를 들어 MazF (ACA 서열에서 특이적으로 절단됨) 또는 PemK (예를 들면, UAC 서열에서 특이적으로 절단됨)로 특이적으로 절단될 수 있는 트리플렛 서열에 의해 분리한다. 따라서, 혼입된 위치를 인식하는 mRNA 인터페라제를 사용하여 인터페라제 인식 서열 (즉, 특이적 트리플렛 서열)로 분리되는 나란히-반복되는 서열을 포함하는 RNA를 후속적으로 처리하여 동일한 작은 RNA를 산출할 것이다.
실험적 접근법
21량체의 생산, CAGGAGAUACCUCAAUGAUCA (서열번호 34)
단계 1: 다음 2개의 21량체 DNA 단편의 합성 (5'-말단이 인산화됨)
Figure pat00004
단계 2: 다량체 수득을 위한 연결
단계 3: 다음 2개 프라이머를 사용한 PCR
Figure pat00005
단계 4: (단계 3)으로부터의 DNA 단편을 사용하는 T7 RNA 폴리머라제로 RNA 생산
단계 5: 반응 (단계 4)로부터의 RNA 생성물의 MazF 처리 및 21량체 생산물의 정제.
일부 적용에서, His-태그된 T7 RNA 폴리머라제 및/또는 MazF를 사용하는 것이 니켈 칼럼을 사용하여 반응 혼합물로부터 제거하는 데 유리할 것이다.
숙련자는 목적하는 RNA 서열의 핵산 서열에서 ACA 트리플렛의 존재로 RNA를 분해하기 위하여 인터페라제로서 MazF의 사용을 배제한다는 점을 높이 평가할 것이다. 이러한 환경하에, 예를 들면, UAC (U 또는 A) 트리플렛 서열에 특이적인 PemK를 MazF 대신 사용할 수 있다. 요약하면, 당해 RNA 서열의 분석으로 공지된 RNA 인터페라제에 대한 인식 위치가 존재하는지의 여부를 결정해야 하는 것이다. 이러한 분석은 RNA 인터페라제(들)이 특정 RNA에 관계된 적용에 유용함을 평가하는데 유용하다.
그러므로, 본 발명은 직접적인 생화학적 수단을 사용하여 다량의 고품질의 작은 RNA (예, siRNA 또는 miRNA)를 생산하는 방법을 기술한다. 이와 같이, 당해 방법은 비용 효율적으로 고가의 기질 및 작은 RNA의 화학적 합성에 관계된 기술적으로 도전적인 프로토콜을 제공한다.
실시예 VIII
mRNA 인터페라제에 의한 세포 사멸의 유도 : 유도된 MazF 및 PemK는 서열-특이적 방식으로 세포성 mRNA를 절단하고 및 단백질 합성을 효과적으로 억제하여, 세포 성장 억제 및 세포 사멸을 유도한다. PemK(Kid) 발현이 효모, 제노푸스 래비스(Xenopus laevis) 및 사람 세포에서 세포 증식을 억제한다는 것이 증명되었다. 이러한 세포에서 PemI(Kis)의 동시-발현은 세포 증식을 복원시켜서, PemK의 억제 효과 (de la Cueva-Mendez et al., 2003, 상기 참고)로부터 세포를 방출시킨다. 본원에서 하기 기재된 바와 같이, 사람 세포상에서 MazF 유도의 효과를 조사한다. T-Rex 시스템(Invitrogen)을 본 실시예에서 MazF의 유도를 조절하는 데 사용하더라도, 숙련가는 임의의 유도성 발현 시스템을 본 발명의 내용중에 사용할 것이라는 점을 높이 높이 평가할 것이다. 유도성 시스템은 비제한적으로 유도되는 세포 유형, 목적하는 발현 수준 및 유도 동역학을 포함하는 몇몇 실험적 고려사항에 기초하여 선택된다.
플라스미드 및 세포주: 이. 콜라이 mazF 유전자를 pcDNA4/TO 벡터 (Invitrogen)내로 테트라사이클린 오퍼레이터 Tet02의 조절하에 클로닝하여, 플라스미드 pcDNA4/TO- MazF를 제조한다. pcDNA4/TO-MazF 플라스미드로 T-Rex-293 세포 (Invitrogen)를 형질전환시켜, T-Rex 293/MazF 세포주를 제조하고, 당해 세포에서 MazF의 발현을 테트라사이클린의 첨가로 유도한다. 이. 콜라이 mazE 유전자를 pcDNA3 벡터내로 클로닝하여, 플라스미드 pcDNA3-MazE를 제조한다. pcDNA3-MazE로 T-Rex 293/MazF 세포를 형질전환시켜, T-Rex 293/MazF/MazE 세포주를 제조한다.
사람 세포상에 MazF의 독성 효과 : MazF 발현을 테트라사이클린의 존재하에 T-Rex 293/MazF 세포에서 유도한다. 각종 시점에서, 세포 집단에서 사멸한 세포를 트립판 블루(Trypan Blue) 용액 (0.4%) (Sigma)으로 구성된 세포 생존력 염료를 사용하여 염색함으로써 계수한다. 대조군 실험을, 테트라사이클린의 부재를 제외하고 동일한 조건하에 유사하게 수행한다. 도 38에서 나타낸 바와 같이, MazF를 발현하도록 유도된 T-Rex 293/MazF 세포의 세포 형태는 대조군 (비유도된) 세포의 형태와 비교하여 제1일의 MazF 유도로 극적으로 변형된다. 특히, 약 50%의 MazF를 발현하도록 유도된 상기 세포는 제5일에 사멸하고, 80%의 세포는 제7일에 사멸한다 (도 38). 이러한 결과로 MazF는 사람 세포에 독성임을 증명한다.
본 발명은 발현이 유도성 조절 요소(들)에 반응하거나 이에 의해 조절되는 임의의 적합한 mRNA 인터페라제의 용도를 포괄한다. 적합한 mRNA 인터페라제에는 세포 내용물중 발현시 독성 효과를 매개할 수 있는 것을 포함한다. 특정 양태에서, mRNA 인터페라제가 발현되는 세포는 포유류 세포이다. 본 발명의 예시적인 mRNA 인터페라제에는 이. 콜라이 MazF의 동족체 및 상동체가 포함된다.
그리하여, 본 발명은 또한 유전자 치료법에 관계된 적용에서 본 발명의 mRNA 인터페라제의 용도를 포괄한다. 개체 (예, 사람 개체)에서 불완전하거나 결핍된 분자를 발현하도록 조작된 세포를 또한 본 발명의 mRNA 인터페라제의 혼입을 통해 유도성 조절 요소(들)로 조절되는 당해 분자의 발현을 자체 파괴되도록 고안할 수 있다. 유전자 치료 적용에 사용되는 세포의 파괴를 위하여 유도성 수단의 혼입은 안전장치 메카니즘(fail-safe mechanism)을 제공하여, 상기 세포가 개체에 유익한 효과를 부여한 후 및/또는 해로운 효과를 유발할 수 있기 전에 이를 제거할 수 있다.
실시예 IX
MazF 돌연변이체의 생성 : 위치 24에 글루탐산(Glu)이 알라닌 (Ala)으로 치환된 MazF 돌연변이체 (E24A)를 생성하였다. 돌연변이 결과로, 합성 기질로 측정되는 mRNA 인터페라제 활성이 약 10배 감소한다. MazF 활성에서 상기 감소는 다양한 이유에서 중요하다. 첫째, 돌연변이 결과로서, MazF (E24A) 돌연변이체가 발현되는 숙주 세포에 대한 독성이 현저하게 감소한다. 감소된 독성으로 세포에서 MazF 돌연변이체의 생산 수준이 증가하게 된다. 예를 들면, pET 28a 시스템을 사용하는 경우, MazF가 합리적으로 높게 생산되었다 (정제 후 약 15mg/l). 이러한 고수준의 발현은 NMR 구조 결정을 위해 15N 및 13C-이중 표지될 수 있는 합당한 양의 MazF를 수득하는 데 중요하다. 둘째, 돌연변이체 MazF의 낮은 mRNA 인터페라제 활성은 기질 RNA를 15N, 13C-표지된 MazF 샘플에 첨가하여 평가할 수 있는, MazF 이량체상에 RNA 상호작용 위치를 결정하는 데 중요하다. 셋째, 돌연변이체 MazF는 mRNA 인터페라제 활성을 보유하기 때문에, 돌연변이체 MazF의 구조는 야생형 MazF 이량체의 3차원 구조에 유사할 것이고, RNA와 복합체를 형성하는 당해 구조로 MazF mRNA 인터페라제 기능에 대한 분자적 메카니즘을 통찰하는 것이 예상된다 .
돌연변이체 MazF의 발현을 pET 28a를 사용하여 수행하여서 당해 생산물은 N-말단 20개 잔기 연장을 함유하고 (도 39a), 이는 His-태그 및 트롬빈 절단 부위를 함유한다. N-말단 연장은 도 39b에서 나타낸 바와 같이 융합 단백질로부터 절단될 수 있다. 도 39a에 화살표는 트롬빈 절단 부위를 나타낸다. 전체 길이의 MazF (E24A) 융합 단백질을 절단하기 위하여, 0.04 유닛의 트롬빈을 10㎍ Ni-NTA 정제된 (His)6MazF(E24A)에 첨가하고 4℃에서 8시간동안 항온처리한다. 절단된 N-말단 단편을 Ni-NTA 칼럼을 사용하여 제거한다. 도 39에는 절단된 MazF 융합 단백질의 성공적인 절단 및 분리 (레인 1, 정제된(His)6MazF(E24A); 레인 2, 트롬빈 절단 후 (His)6MazF(E24A))를 나타낸다. N-말단 연장의 제거 전후에 이종핵간 단일 양자 결합력 (Heteronuclear single quantum coherence; HSQC) 스펙트럼으로 단백질이 실온에서 일주일에 걸쳐 안정함을 밝히고 있다.
부가적으로, Arg 29가 Ala으로 치환된 MazF 돌연변이체가 생성되었다. 이러한 (R29A) 돌연변이체는 야생형 MazF에 비해 독성이 약해서, 과발현될 수 있음이 밝혀졌다. 정제된 15N-표지된 MazF(R29A)를, 예를 들면, 10mg/L 수준으로 생산하였다. 이러한 돌연변이체는 또한 탁월한 HSQC 스펙트럼을 생산하였다.
실시예 X
병원성 세균으로부터의 MazF 동족체의 동정 및 특성화
마이코박테리움 튜베르쿨로시스(엠. 튜베르쿨로시스)로부터의 MazF 동족체의 동정 및 특성화 : 튜베르쿨로시스(TB)는 매년 이백만명의 죽음을 유발하는 만성적인 전염성 질환이다. 이는 가장 오래된 사람 질환의 하나로 엠. 튜베르쿨로시스에 의해 유발한다. 본 발명자들은 엠. 튜베르쿨로시스 염색체상의 유전자(γv2801c)를 동정하였는데, 이는 이. 콜라이 MazF에 매우 상동성인 단백질을 암호화한다. 구체적으로, 본 발명자들은 γv2801c 유전자를 클로닝하고 이. 콜라이 MazF에 40% 상동성을 가지는 118개 아미노산 잔기의 단백질을 암호화하는 유전자를 결정하였다. 참고 도 41a. 이러한 엠. 튜베르쿨로시스 MazF 유전자 (본원에서 MazF-mt1로 명명됨)를 pBAD내로 클로닝하고; 아라비노스 유도에 반응하는 pBAD 벡터로부터 MazF-mt1의 발현물은 이. 콜라이에서 독성이다. 주의하여, 세포 콜로니-형성 단위 (CFU)를 aMazF-mt1 유도 60분 후 약 104배로 감소시킨다. MazF-mt1을 또한 pET28a내로 클로닝하여 (His)6-태그된 MazF-mt1을 성공적으로 발현시켜 Ni-NTA 칼럼상에서 정제한다.
도 40에서 나타난 바와 같이, MazF-mt1은 UAC 서열에서 RNA 절단에 대한 특이성, PemK의 절단에 대한 유사한 특이성을 나타낸다. MazF-mt1은, 그러므로, 단백질의 mRNA 인터페라제 군의 진정한 구성원이다. 요약하면, era mRNA를 T7 RNA 폴리머라제로 합성하고 절단 반응을 본원에서 상기 기재된 바와 같이 수행하였다. 프라이머 연장 및 DNA 사다리를 동일한 프라이머를 사용하여 수득한다. MazF-mt1 절단 부위를 화살표로 지시한다.
MazF-mt1 유전자에 추가로, 본 발명자들은 또한 엠. 튜베르쿨로시스 염색체로 암호화되는 4개의 부가적인 MazF 동족체를 동정하였고, 이의 게놈 명칭이 Rv0456A, Rvl991C, Rv0659C 및 Rv1942C이다. 참고 도 41b. MazF를 가진 이러한 유전자의 서열 정렬로 나타나는 바와 같이, 이러한 서열의 각각은 이. 콜라이 MazF에 상동성을 가지므로, 엠. 튜베르쿨로시스 MazF 동족체로서 동정되었다. Rvl991c, Rv0456a, Rv0659c 및 Rv1942c 단백질에 의해 암호화되는 MazF 동족체는 각각 MazF-mt2, -mt3, -mt4 및 -mt5로 명명된다. MazF-mt1, -mt2, -mt3, -mt4 및 -mt5의 핵산 및 아미노산 서열은 도 43a-e 및 44a-e에 나타난다.
MazF-mt2, 3, 4 및 5를 암호화하는 유전자를 pBAD 벡터내로 클로닝하여 이. 콜라이 세포 성장에서의 효과로 MazF-mt1에 대해 본원에서 상기 기재된 바와 같이 아라비노스의 존재하에 이의 발현 유도를 조사할 것이다. 생체내 mRNA 절단에 이어서 엠. 튜베르쿨로시스 MazF 동족체의 유도를 노던 블롯 및 프라이머 연장 분석을 사용하여 본원에서 상기 기재한 바와 같이 평가할 것이다. 시험관내 및 생체내 단백질 합성을 또한 엠. 튜베르쿨로시스 MazF 동족체의 존재하에 조사할 것이다.
5개의 엠. 튜베르쿨로시스 MazF 유전자 각각을 또한 미코박테리아 발현 벡터 pMIP12 (Picardeau et al. (2003) FEMS Microbiol Lett229,277-281)내로 클로닝하여 미코박테륨 스메그마티스(Mycobacterium smegmatis; 비병원성 모델, 미코박테륨 속의 빠른 성장 종)에서 발현가능하여 상이한 성장 조건하에 상기 박테리움에서 이의 독성을 시험할 것이다. MazF-7에 대한 유전자를 엠. 튜베르쿨로시스에서 조절하는 방법을 명료하게 하는 것이 특히 흥미롭다. 튜베르쿨로시스의 병인은 폐 육아종의 형성에 좌우되는데, 또한 이는 비-성장 상태에서 유기체의 영속성의 위치이고 산소 및 영양분 제한으로 발생한다. 잠복기에서 세균의 생리를 이해하는 것은 파괴적인 질환의 진단 및 치료를 개선하는데 중요하다. 엠. 튜베르쿨로시스 유전자의 DNA 마이크로어레이 분석을 상이한 성장 조건하에 수행하여 MazF-mt 유전자를 이러한 조건에 반응하여 조절하는 방법을 결정할 것이다.
세균성 독소-항독소 쌍의 과잉은 이들이 세포 생리에 중요한 역할을 함을 암시한다. 다양한 성장 조건을 탐구하여 이러한 분자를 암호화하는 유전자의 발현을 유도하는 시험관내 조건을 조사하였다. 다수의 연구에서 ppGppp 및 엄격한 반응에 의존함을 암시한다. 예를 들면, 가장 선행된 관찰 중 하나는 돌연변이체 mazEF 무효의 이. 콜라이는 ppGppp 수준이 인위적으로 증가한 후 사멸하지 않는 것이었다 (Aizenman et al. , 1996, 상기 참고). ppGpp 신테타제를 암호화하는 엠. 튜베르쿨로시스 relA 유전자를 클로닝하고 특징화하여 시험관내 장기 생존에 역할을 함을 나타내었다 (Primm et al., 2000, J Bacteriol 182, 4889-4898). 이러한 작업으로 하기 열거된 조건 모두에서 ppGpp(p) 수준이 증가함을 나타내었다. 다양한 성장 조건에 대한 MazF 동족체의 전사 반응을 조사하는 이러한 발견을 확장하기 위하여, RNA를 하기 열거된 조건하에 생성된 병원성 엠. 튜베르쿨로시스 (균주 H37Rv)로부터 제조하고, 정량적 폴리머라제 연쇄 반응 (Q-PCR)을 사용하여 MazF 동족체의 전사 반응을 평가할 것이다.
성장 조건
정지기 : H37Rv 세포를 통상의 미코박테리아 배지 (0.2 % 덱스트로즈, 0.2% 글리세롤, 0.5% BSA 분획물 V 및 0.1 % 트윈80으로 보충된 미들러브룩 7H9)중에 성장시킨다. 특정한 OD600에 도달한 후 (엠. 튜베르쿨로시스가 약 24시간의 배증기를 가짐), 정지기에서 3일 후, 전체 RNA를 세포로부터 제조한다. 이러한 실험의 대조군은 성장의 중간-대수기의 세포로부터의 RNA이다.
아지드 : 중간-대수기 성장의 H37Rv 세포를 2개의 배양물로 분리한다; 이중 하나를 2시간동안 5 mM 나트륨 아지드로 처리한다.
탄소 고갈 : 중간-대수기에 대해 초기의 H37 Rv 세포를 세척하여 24시간동안 탄소원 부재하에 7H9 배지에 재현탁한다.
아미노산 다운시프트 : H37Rv를 중간-대수기로 7H9 배지에서 성장시키고, 20개 아미노산으로 보충한다. 당해 배양물을 과량의 아미노산-비함유 배지로 세척하고, 2개의 배양물과 신선한 배지, 즉 하나는 아미노산 함유 및 다른 하나는 아미노산 비함유 배지로 24시간동안 분리한다.
아미노산 고갈 : 세린 하이드록시메이트로 처리한 경우 이. 콜라이 세포를 아미노산 L-세린에 대한 고갈로 하여, mazEF 유전자좌의 발현을 유도하는 것을 나타내었다 (Christensen et al., 2003, 상기 참고). 엠. 튜베르쿨로시스는세린 하이드록시메이트로 처리한 경우 상기 종이 아미노산 유사체의 독성 효과에 민감하지 않을 수 있음을 암시하면서 (Primm et al. , 2000, 상기 참고), 상기 아미노산 ppGpp(p)의 증가를 나타내지 않았다. 독성 효과로 특징지워지는 아미노산 유사체를 MazF-동족체를 유도하는 능력에 대해 시험할 것이다.
항생제 처리 : 엠. 튜베르쿨로시스에서 단백질 합성 (스트렙토마이신) 및 RNA 전사 (리팜핀)에 영향을 주는 공지된 항생제를 H37Rv에서 MazF 동족체를 유도하는 능력에 대해 시험한다.
엠. 튜베르쿨로시스는 아마 영양분 또는 산소에 대한 통로없이 육아종성 병반내에 가둬진, 전세계 인구의 약 삼분의 일에서 잠복기 상태이다 (Flynn and Chan, 2001, Annu Rev Immunol 19, 93-129). 숙주의 면역 시스템이 어떻게든 손상된 경우 (예, HIV 상태, 불량한 영양 등) 질환이 재활성화된다. 심상치않게, 세계의 HIV-지배된 영역중 증가하는 수의 잠복 상태는 또한 다중-약물 내성이어서 치료가 어렵거나 불가능하다. 그러므로, 세균 성장 직접 조절의 이러한 내인성 메카니즘을 이용하기 위한 메카니즘을 이해하면, 이러한 파괴적인 질환의 신규 치료법을 개발하는데 도움이 된다. 그리하여, 잠복기 및 활성/재활성화 상태에서 내인성 MazF-mt 유전자의 역할의 결정으로 대안적 치료제의 고안 및/동정에 유용할 것이다.
본 발명자들은 또한 BLAST 검색을 이용하여 MazF 동족체가 많은 원핵성 유기체내, 예를 들어 에스. 아우레스(S. aureus) 및 비. 안트라시스(B. anthracis)와 같은 다른 병원체에 존재함을 밝혔다. 참고 도 41. 구체적으로, 본 발명자들은 에스. 아우레스에서 MazF 동족체 (MazF-sal)로서 MV1993을 동정하였다. 참고 도 41b. 에스. 아우레스는 병원에서 병원유래의 감염을 유발하는 가장 흔한 그람-파지티브 병원체인 그람-파지티브 세균이다. 이. 콜라이 MazF 및 MazF-sal은 25% 동일성 및 44% 유사성을 나타낸다.
부가하여, MazF 동족체를 또한 비. 안트라시스 및 비. 서브틸리스(B. subtilis)에서 동정하였다. 참고 도 41b. 이. 콜라이 MazF 및 비. 서브틸리스 에서 이의 동족체(MazF-bsl)가 32% 동일성 및 48% 유사성을 나타내다 . 이. 콜라이 MazF 및 비. 안트라시스에서 이의 동족체 (MazF-bal)가 32% 동일성 및 48% 유사성을 나타낸다. 비. 안트라시스 및 비. 서브틸리스 모두는 그람-파지티브 세균이다. MazF-bsl 및 MazF-bal 사이에 단지 7개의 아미노산 치환이 존재한다. 아미노산 서열 및 위치에서의 차이는 도 41b에 나타나고, MazF-bsl 유전자 제1 위치에 존재하는 잔기에 대한 단일 약자, 다음으로 숫자 위치, 이어서 MazF-bal에 존재하는 잔기에 대한 단일 약자 (A42V, R66K, D97E, E98V,D101I, K102R andA112G)로 지시되는 바와 같이 부연된다. 에스. 아우레스, 비. 서브틸리스, 비. 안트라시스에서 MazF (Pem-유사) 동족체 및 이. 콜라이 ChpBK의 핵산 및 아미노산 서열이 도 45a-d 및 46a-d에 제시된다.
실시예 XI
이. 콜라이에서 SPP 시스템의 최적화
본 발명의 이. 콜라이 SPP 시스템을 다른 실험 파라미터, 각종 성장 조건중에 변화시키면서 상이한 단백질의 발현에 대해 최적화할 수 있다. 숙련가는 이와 관련하여 성취되어야 하는 목적이 다음에 관련됨을 높이 평가할 것이다: (a) MazF 유도 후 세포의 단백질 합성 능력의 장기간 유지; (b) 백그라운드 세포성 단백질 합성의 감소 또는 제거; 및 (c) 목적하는 단백질의 증가된 발현 수준. 또한 본 발명의 SPP 시스템이 MazF와 달리 mRNA 인터페라제의 발현을 포함됨이 높이 평가될 것이다. 생성물의 발현 및/또는 안정성을 보조할 수 있는 인자의 공동 발현으로 또한 선택된 폴리펩티드의 향상되거나 최적의 발현 수준을 성취하기 위한 SPP 시스템이 고려될 수 있다.
본 발명자들은 MazF 유도 후 다수의 배양 조건을 변화시켜서 목적 단백질의 생산을 최적화하였다. 이러한 실험은 사람 에오탁신 유전자의 발현을 최적화하도록 고안되었으나, 원리는 다른 단백질 발현에 균등하게 적용된다. 우선, 에오탁신 유전자를 이. 콜라이에 선호되는 코돈을 사용하여 합성하나, 유전자에서 모든 ACA 서열을 제거하였다. 당해 합성 유전자를 pColdI 벡터내로 클로닝하여 유도가 후 에오탁신 발현을 냉각 쇼크 또는 15℃로의 온도 다운시프트에 의해 가능하게 하였다. 이러한 에오탁신 시스템을 사용하여, 조건을 다양하게 하여 하기 기술되는 바와 같이 MazF 유도 후 에오탁신의 합성을 연장하였다.
본 발명자들은 37℃에서 MazF 유도 후 15℃에서 에오탁신 유도가 현저하게 에오탁신 생산에 영향을 주는 것을 결정하였다. 구체적으로, 15℃에서 MazF 유도를 37℃에서 MazF 유도와 비교하여 높은 온도에서의 MazF 유도가 실질적으로 일반적 세포성 단백질 합성에 기인한 백그라운드를 감소시킴을 밝혀냈다. 이러한 발견으로 세포성 단백질의 발현에 상응하는 검출가능한 단백질 밴드의 부재로 증명하였다. 그러나, 이러한 실험적 조건하에, 에오탁신 합성도 또한 현저히 감소한다. 더 높은 온도에서, MazF는, 예를 들면, 더 높은 온도에서 MazF의 리보뉴클레아제 활성에 대한 리보솜/tRNA의 증가하는 감수성; 및/또는 단백질 합성, 뉴클레오드 및 아미노산 생합성, 및 에너지 생산에 요구되는 다른 세포성 성분의 감소된 안정성에 기인하여 세포에 손상을 유발할 수 있다. 이러한 인자가 MazF 유도 후 세포에 생산되기 때문에, 이의 손실 또는 감소로 에오탁신 생산 능력에 감소가 유발할 수 있다.
단백질 발현을 최적화하기 위하여, 다수의 실험적 파라미터가 하기 기재된 바와 같이 변형될 수 있다. 다음의 조건이 MazF 및 에오탁신에 관계되어 기술되나, mRNA 인터페라제 및 목적하는 폴리펩티드의 다른 배합에 적용할 수 있음을 이해하여야 한다. pACYCmazF 및 pCold(SP)에오탁신을 모두 보유하는 이. 콜라이 BL21(DE3)를 M9 최소 배지 (각각 15-ml 배양물)중에 37℃에서 중간-대수기(OD600= 0.5 내지 0.8)로 배양한다. 이어서, MazF 유도를 5개의 상이한 온도에서 수행한다; 37, 30, 25, 20 및 15℃. 이러한 상이한 온도에서의 예비 항온처리 10분 후, 1 mM IPTG를 5, 10 및 15분동안 MazF를 유도하도록 첨가한다. 이 후 배양물을 에오탁신 유도를 위해 15℃에서 유지한다. 세포를 냉각 쇼크 후 0, 0.5, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 36, 48, 72 및 96시간에서 15분동안 35S-메티오닌으로 표지한다. 총 세포성 단백질의 SDS-PAGE 분석으로 백그라운드 세포성 단백질 합성, 에오탁신 생산 속도, 및 에오탁신 생산 기간에 관하여 SPP 시스템에 대한 바람직한 조건을 밝히고 있다. 다른 폴리펩티드에 대한 상기 결정 및 유사한 평가에 대하여, 각 시점에서 생산된 실제량의 에오탁신 또는 다른 폴리펩티드를 쿠마지 블루 염색으로 평가한다. 세포내 프로테아제, 예를 들어 Lon 및 CIpP의 활성은 또한 단백질 축적 및 안정성에 기여할 수 있다. 예를 들면, clpP 및 lon에서의 돌연변이 (단일 또는 이중 돌연변이)는 현저하게 이. 콜라이 균주에서 세포성 단백질의 분해를 감소시킴을 나타내고 있다 (Kandror et al. , 1994, Proc Natl Acad Sci U S A 94,4978-4981). 이러한 발견을 염두에 두면서, SPP 시스템을 상기 돌연변이(lon, clpP 및 lon-clpP)를 BL21(DE3) 세포내로 PI 형질도입에 의해 형질도입시켜서 이러한 돌연변이를 보유하는 균주를 작제하여 향상시킬 수 있다. 그리하여, 하나 이상의 상기 프로테아제 유전자가 결실된 BL21(DE3) 세포에서 폴리펩티드의 조사로 SPP 시스템에서 에오탁신 유도 3 내지 4일 후 향상된 단백질 수율을 밝힐 수 있다. 이와 관련하여, 이. 콜라이 SPP 시스템의 특정 조건이 확립되어 세포성 단백질 합성의 최하 백그라운드를 가진 에오탁신의 최고 생산을 성취할 수 있다. 더욱이, 본원에서 상기 기재된 바와 같이, 이러한 실험적 접근법은 상이한 mRNA 인터페라제 및 폴리펩티드를 사용하는 다른 SPP 시스템에 균등하게 적용된다.
백그라운드 세포성 단백질 합성 수준을 감소시키기 위한 또다른 전략은 MazF의 생산을 증가시키는 것이다. 이로써 mazf 유전자에 ACA 서열을 감소시키고, MazF 전사체의 분해를 유발하여 성취될 수 있다. 놀랍게도, 111-잔기 단백질을 암호화하는 mazF ORF에 총 9개의 ACA 서열이 존재한다. ACA 서열의 상기 빈도는 무작위적 가능성에 기초한 예측 빈도에 비하여 비정상적으로 높다. 이러한 ACA 서열은 MazF 자가조절에서 역할을 할 수 있어서, MazF는 이러한 ACA 위치에서 당해 mRNA를 절단하고, 이에 의해 MazF 단백질 생산의 현저한 감소가 초래된다. 상기 내용을 고려하여, mzf ORF에서 일부 또는 모든 ACA 서열의 제거를 계획한다. 참고 도 42. 주의하여, 여기서 제안된 염기 변화로 MazF의 아미노산 서열을 변형하지 않는다. 우선, MazF의 N-말단 반에서 PCR-기반 접근법을 사용하여 첫 6개 잔기를 변형하고, 수득한 유전자를 mazFa로 명명한다. 독립적으로, C-말단 반에서 3개의 ACA 서열을 Leu99를 암호화하는 코돈을 UUA에서 이. 콜라이에서 류신에 대한 더욱 바람직한 코돈인 CUG로 변화시키면서 변형시킨다. 수득한 유전자를 mazFb로 명명한다. mazEa 및 mazFb 돌연변이 모두의 조합으로 모든 ACA 서열이 제거된 mazFa,b를 제조한다.
야생형 mazF, mazFa(-6ACA), mazFb (-3ACA) 및 mazFab (-9ACA)를 사용하여, MazF로부터 ACA 제거 효과를 SPP 시스템에서 결정할 수 있다. 실험적으로, pACYC mazF에서 야생형 mazf 유전자를 mazFa, mazFb 또는 mazFab로 치환한다. 이러한 4개의 플라스미드를 사용하여, mazF로부터 ACA 서열의 제거가 백그라운드 단백질 합성을 효과적으로 감소시키는 방법을 조사할 수 있다.
SPP 시스템을 사용한 단백질을 높은 수율을 성취하기 위하여, M9 배지 대신에 LB와 같은 풍부한 배지를 사용하는 것이 바람직할 것이다. 그러므로, 실험적 파라미터를 다양하게 하여 LB 배지에서의 성장 조건을 최적화시킨다. 각종 성장 조건을 본원에서 상기 기재된 바와 같이 LB 배지에서 배양하기 위해 최적화할 수 있다. 이러한 조건은, 비제한적으로 MazF 유도를 위한 최적 온도, MazF 유도를 위한 최적 기간, 에오탁신 생산을 위한 위한 최적 온도 및 에오탁신 생산을 극대화하기 위한 최적의 항온처리 시간을 포함한다. 이러한 실험이 모델 시스템으로서 에오탁신 생산에 관계된 것으로 기술되나, 상이한 단백질의 최고 수율을 위한 최적 조건을 변형시킬 수 있다. 그러므로, 각각의 표적 단백질에 대하여, 작은 실험적 변화 요구로 최적의 발현 수준을 성취할 수 있다. 당업자에 공지된 다른 성장 배지도 또한 SPP 시스템과 함께 사용될 수 있고, M9 및 LB 배지에 대한 발현은 본원에서 상기 기재된 바와 같이 최적화될 수 있다.
본원에서 상기 기재된 바와 같이, 본 발명자들은 UAC/A/U 서열에서 mRNA를 절단하는, 플라스미드 R100로부터 PemK으로 명칭되는 또다른 mRNA 인터페라제를 동정하였다. 참고 실시예 IV. 이. 콜라이로부터 ChpBK, 엠. 튜베르쿨로시스로부터 5개의 상이한 mRNA 인터페라제 및 바실러스 안트라시스로부터 1개를 포함하는, 다수의 다른 mRNA 인터페라제를 또한 동정하였다. 상기 열거된 모든 mRNA 인터페라제는 SPP 시스템을 유리하게 향상시키는데 사용할 수 있는 잠재적 후보물질이다. 이들의 A-절단 특이성의 특성화에 대해, SPP 시스템에서 이들의 효과를 결정하고 MazF의 것과 비교할 것이다. 이러한 mRNA 인터페라제는 상이한 RNA 절단 특이성을 가지는 것으로 예상되기 때문에, 백그라운드 세포성 단백질 합성을 감소시키는 것이 더욱 효과적이고 MazF에 비하여 세포 손상을 더 유발시킬 것이다. 이러한 mRNA 인터페라제는 이. 콜라이에서 SPP 시스템의 개발뿐 아니라 효모를 포함하는 다른 유기체의 SPP 시스템의 개발에서도 유용한 도구이다.
본원에 기재된 이. 콜라이 SPP 시스템은 pColdI 벡터를 사용하고, 이는 저온에서 단백질 생산을 유도한다. 저온에서의 단백질 생산은 많은 단백질에 유리한데, 단백질이 저온에서 더욱 유효하게 흔히 폴딩되고 안정하기 때문이다. 그러나, 분자성 샤프론의 공동-발현은 추가로 SPP 시스템에서 적절하게 폴딩된 단백질의 수율을 향상시킬 수 있다. 이를 위하여, 촉발 인자로서 공지된 냉각-쇼크 분자성 샤프론에 대한 유전자(Kandror and Goldberg, 1997, 상기 참고)를 본 발명의 SPP 시스템에 사용하기 위해 클로닝하였다. 촉발 인자가 저온에서 단백질 폴딩을 보조한다고 여겨지기 때문에, 목적하는 단백질 발현상 촉발 인자의 공동-발현 효과는 SPP 시스템에서 유리하게 사용될 것이다. 촉발 인자에 대한 유전자뿐 아니라 GroEL 및 GroES (열 쇼크 분자성 샤프론)을 pColdI 벡터내로 클로닝하여 단백질 수율 및 발현된 단백질의 가용성에 대한 효과를 조사할 수 있다.
본 발명의 바람직한 특정 양태가 기술되어 있고 상기에서 구체적으로 예시되어도, 상기 양태로 본 발명이 제한되는 것으로 의도하지 않는다. 다음 청구항에 제시된 바와 같이, 본 발명의 범위 및 의도를 벗어나지 않으면서 각종 변형이 제공될 수 있다.
<110> UNIVERSITY OF MEDICINE AND DENTISTRY OF NEW JERSEY <120> RNA Interferases and Methods of Use Thereof <130> 601-1-131PCT <150> US 60/478,515 <151> 2003-06-13 <150> US 60/543,693 <151> 2004-02-11 <160> 92 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 336 <212> DNA <213> E. coli <400> 1 atggtaagcc gatacgtacc cgatatgggc gatctgattt gggttgattt tgacccgaca 60 aaaggtagcg agcaagctgg acatcgtcca gctgttgtcc tgagtccttt catgtacaac 120 aacaaaacag gtatgtgtct gtgtgttcct tgtacaacgc aatcaaaagg atatccgttc 180 gaagttgttt tatccggtca ggaacgtgat ggcgtagcgt tagctgatca ggtaaaaagt 240 atcgcctggc gggcaagagg agcaacgaag aaaggaacag ttgccccaga ggaattacaa 300 ctcattaaag ccaaaattaa cgtactgatt gggtag 336 <210> 2 <211> 111 <212> PRT <213> E. coli <400> 2 Met Val Ser Arg Tyr Val Pro Asp Met Gly Asp Leu Ile Trp Val Asp 1 5 10 15 Phe Asp Pro Thr Lys Gly Ser Glu Gln Ala Gly His Arg Pro Ala Val 20 25 30 Val Leu Ser Pro Phe Met Tyr Asn Asn Lys Thr Gly Met Cys Leu Cys 35 40 45 Val Pro Cys Thr Thr Gln Ser Lys Gly Tyr Pro Phe Glu Val 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Asp Gly Val 50 55 60 Gly Ile Arg Thr Thr Gly Val Val Arg Cys Asp Gln Pro Arg Thr Ile 65 70 75 80 Asp Met Lys Ala Arg Gly Gly Lys Arg Leu Glu Arg Val Pro Glu Thr 85 90 95 Ile Met Asn Glu Val Leu Gly Arg Leu Ser Thr Ile Leu Thr 100 105 110 <210> 5 <211> 249 <212> DNA <213> E. coli <400> 5 atgatccaca gtagcgtaaa gcgttgggga aattcaccgg cggtgcggat cccggctacg 60 ttaatgcagg cgctcaatct gaatattgat gatgaagtga agattgacct ggtggatggc 120 aaattaatta ttgagccagt gcgtaaagag cccgtattta cgcttgctga actggtcaac 180 gacatcacgc cggaaaacct ccacgagaat atcgactggg gagagccgaa agataaggaa 240 gtctggtaa 249 <210> 6 <211> 82 <212> PRT <213> E. coli <400> 6 Met Ile His Ser Ser Val Lys Arg Trp Gly Asn Ser Pro Ala Val Arg 1 5 10 15 Ile Pro Ala Thr Leu Met Gln Ala Leu Asn Leu Asn Ile Asp Asp Glu 20 25 30 Val Lys Ile Asp Leu Val Asp Gly Lys Leu Ile Ile Glu Pro Val Arg 35 40 45 Lys Glu Pro Val Phe Thr Leu Ala Glu Leu Val Asn Asp Ile Thr Pro 50 55 60 Glu Asn Leu His Glu Asn Ile Asp Trp Gly Glu Pro Lys Asp Lys Glu 65 70 75 80 Val Trp <210> 7 <211> 258 <212> DNA <213> E. coli <400> 7 atgcatacca cccgactgaa gagggttggc ggctcagtta tgctgaccgt cccaccggca 60 ctgctgaatg cgctgtctct gggcacagat aatgaagttg gcatggtcat tgataatggc 120 cggctgattg ttgagccgta cagacgcccg caatattcac tggctgagct actggcacag 180 tgtgatccga atgctgaaat atcagctgaa gaacgagaat ggctggatgc accggcgact 240 ggtcaggagg aaatctga 258 <210> 8 <211> 85 <212> PRT <213> E. coli <400> 8 Met His Thr Thr Arg Leu Lys Arg Val Gly Gly Ser Val Met Leu Thr 1 5 10 15 Val Pro Pro Ala Leu Leu Asn Ala Leu Ser Leu Gly Thr Asp Asn Glu 20 25 30 Val Gly Met Val Ile Asp Asn Gly Arg Leu Ile Val Glu Pro Tyr Arg 35 40 45 Arg Pro Gln Tyr Ser Leu Ala Glu Leu Leu Ala Gln Cys Asp Pro Asn 50 55 60 Ala Glu Ile Ser Ala Glu Glu Arg Glu Trp Leu Asp Ala Pro Ala Thr 65 70 75 80 Gly Gln Glu Glu Ile 85 <210> 9 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T54 to K77 fragment of E. coli MazE <400> 9 Thr Leu Ala Glu Leu Val Asn Asp Ile Thr Pro Glu Asn Leu His Glu 1 5 10 15 Asn Ile Asp Trp Gly Glu Pro Lys 20 <210> 10 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N60 to K77 fragment of E. coli MazE <400> 10 Asn Asp Ile Thr Pro Glu Asn Leu His Glu Asn Ile Asp Trp Gly Glu 1 5 10 15 Pro Lys <210> 11 <211> 30 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic RNA substrate <400> 11 uaagaaggag auauacauau gaaucaaauc 30 <210> 12 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> single stranded oligonucleotide <400> 12 gctcgtatct acaatgtaga ttgatatata ctgtatctac atatgatagc 50 <210> 13 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> single stranded oligonucleotide <400> 13 cgagcataga tgttacatct aactatatat gacatagatg tatactatcg 50 <210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 14 agatctcgat cccgcaaatt aat 23 <210> 15 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA primer <400> 15 ttagagatca atttcctgcc gttttac 27 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA primer <400> 16 ttaaagatcg tcaacgtaac cg 22 <210> 17 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA primer <400> 17 tgctctttat cccacgggca gc 22 <210> 18 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA primer <400> 18 gcccagttca ccgcgaagat cgtc 24 <210> 19 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA primer <400> 19 ggttttgatt tgctcccaac gggcaag 27 <210> 20 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA primer <400> 20 catttcctcc tccagtttag cctggtc 27 <210> 21 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA primer <400> 21 ttgccagact tcttccattg tttcgag 27 <210> 22 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA primer <400> 22 gatccccaca atgcggtgac gagt 24 <210> 23 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA primer <400> 23 cacgttgtcc actttgttca ccgc 24 <210> 24 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA primer <400> 24 cagttcagcg ccgaggaaac gcat 24 <210> 25 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA primer <400> 25 gcgttcgtcg tcggcccaac cgga 24 <210> 26 <211> 30 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense RNA <400> 26 gauuugauuc auauguauau cuccuucuua 30 <210> 27 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> complementary DNA <400> 27 gatttgattc atatgtatat ctccttctta 30 <210> 28 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA primer <400> 28 agaatgtgcg ccatttttca ct 22 <210> 29 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA fragment <400> 29 taatacacc 9 <210> 30 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 30 atgaatcaca aagtg 15 <210> 31 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA fragment <400> 31 catcatcatc atcatcat 18 <210> 32 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA fragment <400> 32 atcgaaggta gg 12 <210> 33 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> multiple cloning site <400> 33 catatggagc tcggtaccct cgagggatcc gaattcaagc ttgtcgacct gcagtctaga 60 <210> 34 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA primer <400> 34 caggagauac cucaaugauc a 21 <210> 35 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA primer <400> 35 ctcaatgatc acaggagata c 21 <210> 36 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA primer <400> 36 tcctctatgg agttactagt g 21 <210> 37 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA primer <400> 37 gggacaggag atacct 16 <210> 38 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA primer <400> 38 tgtcctctat ggagttacta gtg 23 <210> 39 <211> 330 <212> DNA <213> Bacillus halodurans <400> 39 atgccagtac cggatagagg gaatcttgtt tatgtagact ttaacccaca atcgggtcat 60 gaccaagccg ggacacgacc ggctattgtt ttgtccccta aattatttaa taaaaacaca 120 ggttttgcgg tggtttgtcc aattaccaga caacaaaaag gttatccttt tgaaatagaa 180 ataccaccgg ggttacctat tgaaggggtt attcttactg accaagtaaa aagtctggat 240 tggagagcaa gaaactttca cattaaagga caagcaccag aggaaactgt tactgattgt 300 ttacaactta ttcatacatt tttatcttaa 330 <210> 40 <211> 363 <212> DNA <213> Staphylococcus epidermidis <400> 40 atgattagaa gaggagatgt ttatttagcg gatttatcac cagttcaagg gtctgaacaa 60 gggggagtaa gacctgtagt tatcattcaa aatgatactg gtaataaata tagtccaact 120 gtaattgtag ctgcgattac tgatgggatt aataaagcga aaataccaac ccacgtagaa 180 attgaaaaga aaaagtataa attagacaaa gattcagtta ttcttcttga acaaattaga 240 acactagata aaaagcgttt aaaagaaaaa ttaacatttt tatcagagag taaaatgata 300 gaggttgata atgccttaga tattagtttg ggattaaata actttgatca tcataaatct 360 taa 363 <210> 41 <211> 411 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 41 atgattagac gaggagatgt ttatttagca gatttatcac cagtacaggg atctgaacaa 60 gggggagtca gacctgtagt cataattcaa aatgatactg gtaataaata tagtcctaca 120 gttattgttg cggcaataac tggtaggatt aataaagcga aaataccgac acatgtagag 180 attgaaaaga aaaagtataa gttggataaa gactcagtta tattattaga acaaattcgt 240 acacttgata aaaaacgatt gaaagaaaaa ctgacgtact tatccgatga taaaatgaaa 300 gaagtagata atgcactaat gattagttta gggctgaatg cagtagctca accagaaaaa 360 ttaggcgtct attatatgta tttttcagag ataaataaaa tattgatata a 411 <210> 42 <211> 351 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <400> 42 ttgattgtga aacgcggcga tgtttatttt gctgatttat ctcctgttgt tggctcagag 60 caaggcgggg tgcgcccggt tttagtgatc caaaatgaca tcggaaatcg cttcagccca 120 actgctattg ttgcagccat aacagcacaa atacagaaag cgaaattacc aacccacgtc 180 gaaatcgatg caaaacgcta cggttttgaa agagattccg ttattttgct ggagcaaatt 240 cggacgattg acaagcaaag gttaacggat aagattactc atctggatga tgaaatgatg 300 gataaggttg atgaagcctt acaaatcagt ttggcactca ttgattttta g 351 <210> 43 <211> 324 <212> DNA <213> Neisseria meningitides <400> 43 atggatatgg tagtacgcgg cggaatctat ctggtctcct tagacccgac cgtaggaagc 60 gaaatcaaaa agacacgtcc ttgtgtcgta gtctctcctc ctgaaataca caactatctc 120 aagactgtgc tgatcgttcc catgacgagc ggaagccgtc ctgccccgtt ccgcgtcaat 180 gtccgctttc aggataaaga cggtttgctt ttgcccgaac agattagggc tgtggataaa 240 gccggattgg tcaaacatct tggcaattta gacaacagta cggctgaaaa actgtttgca 300 gtattgcagg agatgtttgc ctga 324 <210> 44 <211> 366 <212> DNA <213> Morganella morgani <400> 44 atgcgccggc ggctggtcag gaggaaatct gacatggaaa gaggggaaat ctggcttgtc 60 tcgcttgacc ctaccgcagg tcatgagcag cagggaacgc ggccggtact gattgtcacg 120 ccggctgctt ttaaccgcgt gacccgcctg cctgttgttg tgcccgtgac cagcggaggt 180 aattttgccc gcacagcagg ctttgctgtg tcgcttgacg gcgccggcat acgtaccacc 240 ggcgttgtgc gttgcgatca accccggacg atcgatatga aagcccgcgg cggcaaacga 300 ctcgaacggg tgccagagac tatcatggac gacgttcttg gccgtctggc caccatcctg 360 acctga 366 <210> 45 <211> 321 <212> DNA <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 45 gtggtgattc ggggagcggt ctacagggtc gacttcggcg atgcgaagcg aggccacgag 60 caacgcgggc ggcgctacgc cgtggtcatc agccccggct cgatgccgtg gagtgtagta 120 accgtggtgc cgacgtcgac aagcgcccaa cctgcggttt tccgaccaga gctggaagtc 180 atgggaacaa agacacggtt cctggtggat cagatccgga cgatcggcat cgtctatgtg 240 cacggcgatc cggtcgacta tctggaccgt gaccaaatgg ccaaggtgga acacgccgtg 300 gcacgatacc ttggtctgtg a 321 <210> 46 <211> 109 <212> PRT <213> Bacillus halodurans <400> 46 Met Pro Val Pro Asp Arg Gly Asn Leu Val Tyr Val Asp Phe Asn Pro 1 5 10 15 Gln Ser Gly His Asp Gln Ala Gly Thr Arg Pro Ala Ile Val Leu Ser 20 25 30 Pro Lys Leu Phe Asn Lys Asn Thr Gly Phe Ala Val Val Cys Pro Ile 35 40 45 Thr Arg Gln Gln Lys Gly Tyr Pro Phe Glu Ile Glu Ile Pro Pro Gly 50 55 60 Leu Pro Ile Glu Gly Val Ile Leu Thr Asp Gln Val Lys Ser Leu Asp 65 70 75 80 Trp Arg Ala Arg Asn Phe His Ile Lys Gly Gln Ala Pro Glu Glu Thr 85 90 95 Val Thr Asp Cys Leu Gln Leu Ile His Thr Phe Leu Ser 100 105 <210> 47 <211> 120 <212> PRT <213> Staphylococcus epidermidis <400> 47 Met Ile Arg Arg Gly Asp Val Tyr Leu Ala Asp Leu Ser Pro Val Gln 1 5 10 15 Gly Ser Glu Gln Gly Gly Val Arg Pro Val Val Ile Ile Gln Asn Asp 20 25 30 Thr Gly Asn Lys Tyr Ser Pro Thr Val Ile Val Ala Ala Ile Thr Asp 35 40 45 Gly Ile Asn Lys Ala Lys Ile Pro Thr His Val Glu Ile Glu Lys Lys 50 55 60 Lys Tyr Lys Leu Asp Lys Asp Ser Val Ile Leu Leu Glu Gln Ile Arg 65 70 75 80 Thr Leu Asp Lys Lys Arg Leu Lys Glu Lys Leu Thr Phe Leu Ser Glu 85 90 95 Ser Lys Met Ile Glu Val Asp Asn Ala Leu Asp Ile Ser Leu Gly Leu 100 105 110 Asn Asn Phe Asp His His Lys Ser 115 120 <210> 48 <211> 136 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 48 Met Ile Arg Arg Gly Asp Val Tyr Leu Ala Asp Leu Ser Pro Val Gln 1 5 10 15 Gly Ser Glu Gln Gly Gly Val Arg Pro Val Val Ile Ile Gln Asn Asp 20 25 30 Thr Gly Asn Lys Tyr Ser Pro Thr Val Ile Val Ala Ala Ile Thr Gly 35 40 45 Arg Ile Asn Lys Ala Lys Ile Pro Thr His Val Glu Ile Glu Lys Lys 50 55 60 Lys Tyr Lys Leu Asp Lys Asp Ser Val Ile Leu Leu Glu Gln Ile Arg 65 70 75 80 Thr Leu Asp Lys Lys Arg Leu Lys Glu Lys Leu Thr Tyr Leu Ser Asp 85 90 95 Asp Lys Met Lys Glu Val Asp Asn Ala Leu Met Ile Ser Leu Gly Leu 100 105 110 Asn Ala Val Ala Gln Pro Glu Lys Leu Gly Val Tyr Tyr Met Tyr Phe 115 120 125 Ser Glu Ile Asn Lys Ile Leu Ile 130 135 <210> 49 <211> 116 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 49 Met Ile Val Lys Arg Gly Asp Val Tyr Phe Ala Asp Leu Ser Pro Val 1 5 10 15 Val Gly Ser Glu Gln Gly Gly Val Arg Pro Val Leu Val Ile 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Ser Ala Thr Thr Thr Gly Leu Gln Val Asp Cys Lys Ala Gln Ala 65 70 75 80 Glu Gln Ile Arg Ser Ile Ala Thr Glu Arg Leu Leu Arg Pro Ile Gly 85 90 95 Arg Val Ser Ala Ala Glu Leu Ala Gln Leu Asp Glu Ala Leu Lys Leu 100 105 110 His Leu Asp Leu Trp Ser 115 <210> 53 <211> 243 <212> DNA <213> Deinococcus radiodurans <400> 53 atgacgagtc aaattcagaa atggggcaac agcctcgcgc tccgcattcc caaagctctg 60 gcgcagcagg tgggactgac gcagagttca gaagtggagc tgcttcttca ggacggtcag 120 attgtcatcc ggccagttcc tgctcggcag tacgatctcg ccgcgctgct ggccgaaatg 180 acacctgaaa atctgcatgg ggaaacagac tggggcgcac tggaaggacg cgaggaatgg 240 taa 243 <210> 54 <211> 246 <212> DNA <213> Bacillus halodurans <400> 54 gtgacactca tgactactat acaaaagtgg ggaaatagtt tagctgttcg tattccgaac 60 cattatgcta aacatattaa cgttacgcaa ggatctgaaa ttgaactaag cttagggagt 120 gatcaaacga ttattttaaa gcctaaaaaa agaaagccaa cattagagga attagtggca 180 aaaatcactc ctgaaaacag acataacgaa attgatttcg ggagaacagg aaaggaattg 240 ttgtaa 246 <210> 55 <211> 258 <212> DNA <213> E. coli Plasmid R100 <400> 55 atgcatacca cccgactgaa gagggttggc ggctcagtta tgctgaccgt cccaccggca 60 ctgctgaatg cgctgtctct gggcacagat aatgaagttg gcatggtcat tgataatggc 120 cggctgattg ttgagccgta cagacgcccg caatattcac tggctgagct actggcacag 180 tgtgatccga atgctgaaat atcagctgaa gaacgagaat ggctggatgc accggcgact 240 ggtcaggagg aaatctga 258 <210> 56 <211> 294 <212> DNA <213> E. coli Plasmid R466b <400> 56 atgttatatt taaatataac ttttatggag ggaaaaatgc ataccactcg actgaagaag 60 gttggcggct cagtcatgct gaccgtccca ccggcactgc tgaatgcgct gtcgctgggt 120 acagataatg aagttggcat ggtcattgat aatggccggc tgattgtgga gccgcacaga 180 cgcccgcagt attcactggc tgagctgttg gcacagtgcg atccgaacgc tgaaatctcg 240 gcagaagaac gtgaatggct ggatgcgccg gcggctggtc aggaggaaat ctga 294 <210> 57 <211> 258 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 57 gtgcagatgc gtattaccat aaaaagatgg gggaacagtg caggtatggt cattcccaat 60 atcgtaatga aagaacttaa cttacagccg gggcagagcg tggaagtgca ggtgagcaac 120 aaccaactga ttctgacacc catctccagg cgctactcgc ttgatgaact gctggcacag 180 tgtgacatga acgccgcgga acttagcgag caggatgtct ggggtaaatc cacccctgcg 240 ggtgacgaaa tatggtaa 258 <210> 58 <211> 255 <212> DNA <213> Pseudomonas putida <400> 58 atgcagatca agattcaaca gtggggcaac agcgccgcga tccgcttgcc cgccgcagta 60 ctcaagcaga tgcgcctcgg tgtcggctcc accctgagcc ttgacacaac gggtgagacg 120 atggtgctca aacccgtcag gtcgaaaccc aagtacaccc ttgaggaact gatggcccag 180 tgtgacctga gtgcaccgga gccagaggac atggccgact ggaatgccat gcgcccagtg 240 gggcgtgaag tgtga 255 <210> 59 <211> 260 <212> DNA <213> Photobacterium profundum <400> 59 gtgcaatgag aactcagata agaaagatcg gtaactcact tggttcaatt attcctgcca 60 cttttattcg tcagcttgaa ctggcagagg gcgcagaaat tgatgttaaa acggttgatg 120 gaaaaattgt gattgagcca attagaaaaa tgaaaaaacg tttcccattc agtgagcgtg 180 aattactaag tggattggat gcacacactg ctcatgctga cgaactggtt gtaatttcta 240 cccaggagct aggcgaataa 260 <210> 60 <211> 80 <212> PRT <213> Deinococcus radiodurans <400> 60 Met Thr Ser Gln Ile Gln Lys Trp Gly Asn Ser Leu Ala Leu Arg Ile 1 5 10 15 Pro Lys Ala Leu Ala Gln Gln Val Gly Leu Thr Gln Ser Ser Glu Val 20 25 30 Glu Leu Leu Leu Gln Asp Gly Gln Ile Val Ile Arg Pro Val Pro Ala 35 40 45 Arg Gln Tyr Asp Leu Ala Ala Leu Leu Ala Glu Met Thr Pro Glu Asn 50 55 60 Leu His Gly Glu Thr Asp Trp Gly Ala Leu Glu Gly Arg Glu Glu Trp 65 70 75 80 <210> 61 <211> 81 <212> PRT <213> Bacillus halodurans <400> 61 Met Thr Leu Met Thr Thr Ile Gln Lys Trp Gly Asn Ser Leu Ala Val 1 5 10 15 Arg Ile Pro Asn His Tyr Ala Lys His Ile Asn Val Thr Gln Gly Ser 20 25 30 Glu Ile Glu Leu Ser Leu Gly Ser Asp Gln Thr Ile Ile Leu Lys Pro 35 40 45 Lys Lys Arg Lys Pro Thr Leu Glu Glu Leu Val Ala Lys Ile Thr Pro 50 55 60 Glu Asn Arg His Asn Glu Ile Asp Phe Gly Arg Thr Gly Lys Glu Leu 65 70 75 80 Leu <210> 62 <211> 85 <212> PRT <213> E. coli PemI plasmid R100 <400> 62 Met His Thr Thr Arg Leu Lys Arg Val Gly Gly Ser Val Met Leu Thr 1 5 10 15 Val Pro Pro Ala Leu Leu Asn Ala Leu Ser Leu Gly Thr Asp Asn Glu 20 25 30 Val Gly Met Val Ile Asp Asn Gly Arg Leu Ile Val Glu Pro Tyr Arg 35 40 45 Arg Pro Gln Tyr Ser Leu Ala Glu Leu Leu Ala Gln Cys Asp Pro Asn 50 55 60 Ala Glu Ile Ser Ala Glu Glu Arg Glu Trp Leu Asp Ala Pro Ala Thr 65 70 75 80 Gly Gln Glu Glu Ile 85 <210> 63 <211> 97 <212> PRT <213> E. coli PemI plasmid R466b <400> 63 Met Leu Tyr Leu Asn Ile Thr Phe Met Glu Gly Lys Met His Thr Thr 1 5 10 15 Arg Leu Lys Lys Val Gly Gly Ser Val Met Leu Thr Val Pro Pro Ala 20 25 30 Leu Leu Asn Ala Leu Ser Leu Gly Thr Asp Asn Glu Val Gly Met Val 35 40 45 Ile Asp Asn Gly Arg Leu Ile Val Glu Pro His Arg Arg Pro Gln Tyr 50 55 60 Ser Leu Ala Glu Leu Leu Ala Gln Cys Asp Pro Asn Ala Glu Ile Ser 65 70 75 80 Ala Glu Glu Arg Glu Trp Leu Asp Ala Pro Ala Ala Gly Gln Glu Glu 85 90 95 Ile <210> 64 <211> 85 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 64 Met Gln Met Arg Ile Thr Ile Lys Arg Trp Gly Asn Ser Ala Gly Met 1 5 10 15 Val Ile Pro Asn Ile Val Met Lys Glu Leu Asn Leu Gln Pro Gly Gln 20 25 30 Ser Val Glu Ala Gln Val Ser Asn Asn Gln Leu Ile Leu Thr Pro Ile 35 40 45 Ser Arg Arg Tyr Ser Leu Asp Glu Leu Leu Ala Gln Cys Asp Met Asn 50 55 60 Ala Ala Glu Leu Ser Glu Gln Asp Val Trp Gly Lys Ser Thr Pro Ala 65 70 75 80 Gly Asp Glu Ile Trp 85 <210> 65 <211> 84 <212> PRT <213> Pseudomonas putida <400> 65 Met Gln Ile Lys Ile Gln Gln Trp Gly Asn Ser Ala Ala Ile Arg Leu 1 5 10 15 Pro Ala Ala Val Leu Lys Gln Met Arg Leu Gly Val Gly Ser Thr Leu 20 25 30 Ser Leu Asp Thr Thr Gly Glu Thr Met Val Leu Lys Pro Val Arg Ser 35 40 45 Lys Pro Lys Tyr Thr Leu Glu Glu Leu Met Ala Gln Cys Asp Leu Ser 50 55 60 Ala Pro Glu Pro Glu Asp Met Ala Asp Trp Asn Ala Met Arg Pro Val 65 70 75 80 Gly Arg Glu Val <210> 66 <211> 85 <212> PRT <213> Photobacterium profundum <400> 66 Ala Met Arg Thr Gln Ile Arg Lys Ile Gly Asn Ser Leu Gly Ser Ile 1 5 10 15 Ile Pro Ala Thr Phe Ile Arg Gln Leu Glu Leu Ala Glu Gly Ala Glu 20 25 30 Ile Asp Val Lys Thr Val Asp Gly Lys Ile Val Ile Glu Pro Ile Arg 35 40 45 Lys Met Lys Lys Arg Phe Pro Phe Ser Glu Arg Glu Leu Leu Ser Gly 50 55 60 Leu Asp Ala His Thr Ala His Ala Asp Glu Leu Val Val Ile Ser Thr 65 70 75 80 Gln Glu Leu Gly Glu 85 <210> 67 <211> 228 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 67 atgggtccag catctgttcc gactacctgt tgctttaacc tggcgaaccg caaaattccg 60 ctgcagcgcc tggaaagcta tcgccgtatt acctctggca aatgcccgca gaaagcggtg 120 atctttaaaa ccaaactggc gaaagatatt tgcgcggatc cgaaaaaaaa atgggtgcag 180 gattctatga aatatctgga tcagaaatct ccgaccccga aaccgtaa 228 <210> 68 <211> 73 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 68 Gly Pro Ala Ser Pro Thr Thr Cys Cys Phe Asn Leu Ala Asn Arg Lys 1 5 10 15 Ile Pro Leu Gln Arg Leu Glu Ser Tyr Arg Arg Ile Thr Ser Gly Lys 20 25 30 Cys Pro Gln Lys Ala Val Ile Phe Lys Thr Lys Leu Ala Lys Asp Ile 35 40 45 Cys Ala Asp Pro Lys Lys Lys Trp Val Gln Asp Ser Met Lys Tyr Leu 50 55 60 Asp Gln Lys Ser Pro Thr Pro Lys Pro 65 70 <210> 69 <211> 357 <212> DNA <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 69 gtgatgcgcc gcggtgagat ttggcaggtc gatctcgacc ccgctcgagg tagcgaagcg 60 aacaaccagc gccccgccgt cgtcgtcagc aacgaccggg ccaacgcgac cgccacgcgt 120 cttgggcgcg gcgtcatcac cgtcgtgccg gtgacgagca acatcgccaa ggtctatccg 180 tttcaggtgt tgttgtcggc caccactact ggtctccagg tcgactgcaa ggcgcaggcc 240 gagcaaatca gatcgattgc taccgagcgg ttgctccggc caatcggccg agtttcagcc 300 gccgaacttg cccagctcga tgaggctttg aaactgcatc tcgacttatg gtcgtag 357 <210> 70 <211> 282 <212> DNA <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 70 atgctgcgcg gtgagatctg gcaggtcgac ctggatccgg cccgcggcag cgcggcaaat 60 atgcggcggc cagcggtaat tgtcagcaac gacagggcca acgctgccgc gatacgtctc 120 gaccgaggcg tggtgccggt tgtcccggtt accagcaaca ccgaaaaggt ccccattcca 180 ggtgttgttg ccggcagcga gcggtggcct ggccgtcgat tcgaaggcgc aggcccagca 240 ggttggatcc gtcgctgcgc aacgtctccc ctgccgagct ga 282 <210> 71 <211> 345 <212> DNA <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 71 gtggtgatta gtcgtgccga gatctactgg gctgacctcg ggccgccatc aggcagtcag 60 ccggcgaagc gccgcccggt gctcgtaatc cagtcagatc cgtacaacgc aagtcgcctt 120 gccactgtga tcgcagcggt gatcacgtcc aatacggcgc tggcggcaat gcccggcaac 180 gtgttcttgc ccgcgaccac aacgcgactg ccacgtgact cggtcgtcaa cgtcacggcg 240 attgtcacgc tcaacaagac tgacctcacc gaccgagttg gggaggtgcc agcgagcttg 300 atgcacgagg ttgaccgagg acttcgtcgc gtactggacc tttga 345 <210> 72 <211> 309 <212> DNA <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 72 atgcggcgcg gtgaattgtg gtttgccgcc acacctggtg gtgacagacc agtacttgtc 60 cttaccagag atccggtggc agaccgcatc ggcgcggtcg ttgtggtggc cctaacccgc 120 acccgccgag gcctggtgtc ggaattggag ctcacggccg tcgaaaaccg tgttccgagc 180 gactgcgtcg tcaacttcga caacattcat acgttgccac gcaccgcatt ccgacgccgc 240 atcacccggc tgtccccggc ccgcctgcac gaagcctgtc aaacactccg ggcgagcacg 300 gggtgttga 309 <210> 73 <211> 330 <212> DNA <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 73 gtgaccgcac ttccggcgcg cggagaggtg tggtggtgtg agatggctga gatcggtcgg 60 cgaccagtcg tcgtgctgtc gcgcgatgcc gcgatccctc ggctgcgacg cgcacttgtc 120 gcgccctgca ccacgaccat ccgagggcta gccagtgagg ttgttcttga acccggttcc 180 gacccgatcc cgcgccgttc cgcggtgaat ttggactcag tcgaaagtgt ctcggtcgcg 240 gtattggtga atcggcttgg ccgcctcgcc gacatccgga tgcgcgccat ctgcacggcc 300 ctcgaggtcg ccgtcgattg ctctcgatga 330 <210> 74 <211> 118 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 74 Met Met Arg Arg Gly Glu Ile Trp Gln Val Asp Leu Asp Pro Ala Arg 1 5 10 15 Gly Ser Glu Ala Asn Asn Gln Arg Pro Ala Val Val Val Ser Asn Asp 20 25 30 Arg Ala Asn Ala Thr Ala Thr Arg Leu Gly Arg Gly Val Ile Thr Val 35 40 45 Val Pro Val Thr Ser Asn Ile Ala Lys Val Tyr Pro Phe Gln Val Leu 50 55 60 Leu Ser Ala Thr Thr Thr Gly Leu Gln Val Asp Cys Lys Ala Gln Ala 65 70 75 80 Glu Gln Ile Arg Ser Ile Ala Thr Glu Arg Leu Leu Arg Pro Ile Gly 85 90 95 Arg Val Ser Ala Ala Glu Leu Ala Gln Leu Asp Glu Ala Leu Lys Leu 100 105 110 His Leu Asp Leu Trp Ser 115 <210> 75 <211> 93 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 75 Met Leu Arg Gly Glu Ile Trp Gln Val Asp Leu Asp Pro Ala Arg Gly 1 5 10 15 Ser Ala Ala Asn Met Arg Arg Pro Ala Val Ile Val Ser Asn Asp Arg 20 25 30 Ala Asn Ala Ala Ala Ile Arg Leu Asp Arg Gly Val Val Pro Val Val 35 40 45 Pro Val Thr Ser Asn Thr Glu Lys Val Pro Ile Pro Gly Val Val Ala 50 55 60 Gly Ser Glu Arg Trp Pro Gly Arg Arg Phe Glu Gly Ala Gly Pro Ala 65 70 75 80 Gly Trp Ile Arg Arg Cys Ala Thr Ser Pro Leu Pro Ser 85 90 <210> 76 <211> 114 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 76 Met Val Ile Ser Arg Ala Glu Ile Tyr Trp Ala Asp Leu Gly Pro Pro 1 5 10 15 Ser Gly Ser Gln Pro Ala Lys Arg Arg Pro Val Leu Val Ile Gln Ser 20 25 30 Asp Pro Tyr Asn Ala Ser Arg Leu Ala Thr Val Ile Ala Ala Val Ile 35 40 45 Thr Ser Asn Thr Ala Leu Ala Ala Met Pro Gly Asn Val Phe Leu Pro 50 55 60 Ala Thr Thr Thr Arg Leu Pro Arg Asp Ser Val Val Asn Val Thr Ala 65 70 75 80 Ile Val Thr Leu Asn Lys Thr Asp Leu Thr Asp Arg Val Gly Glu Val 85 90 95 Pro Ala Ser Leu Met His Glu Val Asp Arg Gly Leu Arg Arg Val Leu 100 105 110 Asp Leu <210> 77 <211> 102 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 77 Met Arg Arg Gly Glu Leu Trp Phe Ala Ala Thr Pro Gly Gly Asp Arg 1 5 10 15 Pro Val Leu Val Leu Thr Arg Asp Pro Val Ala Asp Arg Ile Gly Ala 20 25 30 Val Val Val Val Ala Leu Thr Arg Thr Arg Arg Gly Leu Val Ser Glu 35 40 45 Leu Glu Leu Thr Ala Val Glu Asn Arg Val Pro Ser Asp Cys Val Val 50 55 60 Asn Phe Asp Asn Ile His Thr Leu Pro Arg Thr Ala Phe Arg Arg Arg 65 70 75 80 Ile Thr Arg Leu Ser Pro Ala Arg Leu His Glu Ala Cys Gln Thr Leu 85 90 95 Arg Ala Ser Thr Gly Cys 100 <210> 78 <211> 109 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 78 Met Thr Ala Leu Pro Ala Arg Gly Glu Val Trp Trp Cys Glu Met Ala 1 5 10 15 Glu Ile Gly Arg Arg Pro Val Val Val Leu Ser Arg Asp Ala Ala Ile 20 25 30 Pro Arg Leu Arg Arg Ala Leu Val Ala Pro Cys Thr Thr Thr Ile Arg 35 40 45 Gly Leu Ala Ser Glu Val Val Leu Glu Pro Gly Ser Asp Pro Ile Pro 50 55 60 Arg Arg Ser Ala Val Asn Leu Asp Ser Val Glu Ser Val Ser Val Ala 65 70 75 80 Val Leu Val Asn Arg Leu Gly Arg Leu Ala Asp Ile Arg Met Arg Ala 85 90 95 Ile Cys Thr Ala Leu Glu Val Ala Val Asp Cys Ser Arg 100 105 <210> 79 <211> 351 <212> DNA <213> Bacillus anthracis <400> 79 ttgattgtaa aacgcggcga cgtgtatttt gcagaccttt ccccagttgt tggttctgag 60 caaggaggtg ttcgtccggt tcttgtcatt caaaatgaca tcggaaatcg ttttagtcca 120 acggtgattg tagcggctat tactgcacag attcaaaaag cgaaattacc cactcatgtg 180 gaaattgatg cgaaaaagta cggttttgag agagattctg ttattttact tgagcagatt 240 cgaacaatcg ataagcagcg cttaacggac aaaatcactc acttagatga agtgatgatg 300 attcgtgtag atgaagcgct acaaattagt ttaggactaa tagattttta a 351 <210> 80 <211> 116 <212> PRT <213> Bacillus anthracis <400> 80 Met Ile Val Lys Arg Gly Asp Val Tyr Phe Ala Asp Leu Ser Pro Val 1 5 10 15 Val Gly Ser Glu Gln Gly Gly Val Arg Pro Val Leu Val Ile Gln Asn 20 25 30 Asp Ile Gly Asn Arg Phe Ser Pro Thr Val Ile Val Ala Ala Ile Thr 35 40 45 Ala Gln Ile Gln Lys Ala Lys Leu Pro Thr His Val Glu Ile Asp Ala 50 55 60 Lys Lys Tyr Gly Phe Glu Arg Asp Ser Val Ile Leu Leu Glu Gln Ile 65 70 75 80 Arg Thr Ile Asp Lys Gln Arg Leu Thr Asp Lys Ile Thr His Leu Asp 85 90 95 Glu Val Met Met Ile Arg Val Asp Glu Ala Leu Gln Ile Ser Leu Gly 100 105 110 Leu Ile Asp Phe 115 <210> 81 <211> 348 <212> DNA <213> Pseudomonas putida <400> 81 gtgaaacggt tgaaattcgc caggggtgat attgttcgcg tcaacctgga cccaacagtc 60 gggcgggaac agcagggctc cggccgacct gcactggtac ttactccggc tgcgttcaat 120 gcttcaggcc tggctgtaat catcccgatc actcaaggtg gggatttcgc gaggcatgcg 180 ggtttcgctg tcacgctcag cggtgcgggc acgcagactc agggggtgat gctttgcaac 240 caggtgcgca cagtcgacct tgaagcacga tttgccaagc gcatagagtc ggtgcctgaa 300 gctgtcatcc tggatgcact ggcgcgtgtg caaaccctat tcgattaa 348 <210> 82 <211> 345 <212> DNA <213> Mycobacterium celatum <400> 82 tgaattgctc tgacggaacg cggcgacatc tacatcgttt cgcttgaccc gacgtcggga 60 catgagcaga gcggcacgcg cccagtattg gtcgtgtccc cgggcgcgtt taatcgcctg 120 acgaaaacac cggtcgtgct acctataaca cgcggcggga actttgcccg aacggcaggg 180 ttcgctgtct cgctgaccga tgcgggtact cgcaccgccg gcgtaatacg ctgcgatcag 240 cctcgctcga ttgatatccg cgcccgtaaa ggccgcaagg ttgaacgtgt gccgtctggg 300 gttcttgacg aagcgttggc caagctcgcc acgatcttga cttga 345 <210> 83 <211> 366 <212> DNA <213> Shigella flexneri 2a str. 301 <400> 83 atggtaaagg cacggacgcc acatcgtggt gagatctggt attttaaccc tgatccggtt 60 gccgggcatg aacttcaggg gccacattat tgcattgtgg taacggacaa aaaactcaac 120 aatgttttaa aagttgctat gtgctgcccg atttcaacag gggcaaatgc agcacgttcc 180 acaggggtga cggtgaacgt cctcccccgt gatacgcaaa ccggtaacct gcatggcgtt 240 gtactttgtc accagctaaa agccgtcgat cttattgccc gtggcgctaa atttcatacc 300 gttgccgatg aaaaattgat tagtgaagtt atcagtaaac tggtgaattt aatcgaccca 360 caataa 366 <210> 84 <211> 351 <212> DNA <213> E. coli <400> 84 atggtaaaga aaagtgaatt tgaacgggga gacattgtgc tggttggctt tgatccagca 60 agcggccatg aacagcaagg tgctggtcga cctgcgcttg tgctctccgt tcaagccttt 120 aatcaactgg gaatgacgct ggtggccccc attacgcagg gcggaaattt tgcccgttat 180 gccggattta gcgttccttt acattgcgaa gaaggcgatg tgcacggcgt ggtgctggtg 240 aatcaggtgc ggatgatgga tctacacgcc cggctggcaa agcgtattgg tctggctgcg 300 gatgaggtgg tggaagaggc gttattacgc ttgcaggcgg tggtggaata a 351 <210> 85 <211> 115 <212> PRT <213> Pseudomonas putida <400> 85 Met Lys Arg Leu Lys Phe Ala Arg Gly Asp Ile Val Arg Val Asn Leu 1 5 10 15 Asp Pro Thr Val Gly Arg Glu Gln Gln Gly Ser Gly Arg Pro Ala Leu 20 25 30 Val Leu Thr Pro Ala Ala Phe Asn Ala Ser Gly Leu Ala Val Ile Ile 35 40 45 Pro Ile Thr Gln Gly Gly Asp Phe Ala Arg His Ala Gly Phe Ala Val 50 55 60 Thr Leu Ser Gly Ala Gly Thr Gln Thr Gln Gly Val Met Leu Cys Asn 65 70 75 80 Gln Val Arg Thr Val Asp Leu Glu Ala Arg Phe Ala Lys Arg Ile Glu 85 90 95 Ser Val Pro Glu Ala Val Ile Leu Asp Ala Leu Ala Arg Val Gln Thr 100 105 110 Leu Phe Asp 115 <210> 86 <211> 111 <212> PRT <213> Mycobacterium celatum <400> 86 Met Thr Glu Arg Gly Asp Ile Tyr Ile Val Ser Leu Asp Pro Thr Ser 1 5 10 15 Gly His Glu Gln Ser Gly Thr Arg Pro Val Leu Val Val Ser Pro Gly 20 25 30 Ala Phe Asn Arg Leu Thr Lys Thr Pro Val Val Leu Pro Ile Thr Arg 35 40 45 Gly Gly Asn Phe Ala Arg Thr Ala Gly Phe Ala Val Ser Leu Thr Asp 50 55 60 Ala Gly Thr Arg Thr Ala Gly Val Ile Arg Cys Asp Gln Pro Arg Ser 65 70 75 80 Ile Asp Ile Arg Ala Arg Lys Gly Arg Lys Val Glu Arg Val Pro Ser 85 90 95 Gly Val Leu Asp Glu Ala Leu Ala Lys Leu Ala Thr Ile Leu Thr 100 105 110 <210> 87 <211> 121 <212> PRT <213> Shigella flexneri 2a str. 301 <400> 87 Met Val Lys Ala Arg Thr Pro His Arg Gly Glu Ile Trp Tyr Phe Asn 1 5 10 15 Pro Asp Pro Val Ala Gly His Glu Leu Gln Gly Pro His Tyr Cys Ile 20 25 30 Val Val Thr Asp Lys Lys Leu Asn Asn Val Leu Lys Val Ala Met Cys 35 40 45 Cys Pro Ile Ser Thr Gly Ala Asn Ala Ala Arg Ser Thr Gly Val Thr 50 55 60 Val Asn Val Leu Pro Arg Asp Thr Gln Thr Gly Asn Leu His Gly Val 65 70 75 80 Val Leu Cys His Gln Leu Lys Ala Val Asp Leu Ile Ala Arg Gly Ala 85 90 95 Lys Phe His Thr Val Ala Asp Glu Lys Leu Ile Ser Glu Val Ile Ser 100 105 110 Lys Leu Val Asn Leu Ile Asp Pro Gln 115 120 <210> 88 <211> 116 <212> PRT <213> E. coli <400> 88 Met Val Lys Lys Ser Glu Phe Glu Arg Gly Asp Ile Val Leu Val Gly 1 5 10 15 Phe Asp Pro Ala Ser Gly His Glu Gln Gln Gly Ala Gly Arg Pro Ala 20 25 30 Leu Val Leu Ser Val Gln Ala Phe Asn Gln Leu Gly Met Thr Leu Val 35 40 45 Ala Pro Ile Thr Gln Gly Gly Asn Phe Ala Arg Tyr Ala Gly Phe Ser 50 55 60 Val Pro Leu His Cys Glu Glu Gly Asp Val His Gly Val Val Leu Val 65 70 75 80 Asn Gln Val Arg Met Met Asp Leu His Ala Arg Leu Ala Lys Arg Ile 85 90 95 Gly Leu Ala Ala Asp Glu Val Val Glu Glu Ala Leu Leu Arg Leu Gln 100 105 110 Ala Val Val Glu 115 <210> 89 <211> 17 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA transcript <400> 89 aatgatgaca ctggaag 17 <210> 90 <211> 17 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA transcript <400> 90 gtcgttgaca ttgatgg 17 <210> 91 <211> 17 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA transcript <400> 91 atctcgaaca cgcagcc 17 <210> 92 <211> 17 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA transcript <400> 92 tcgttttaca cccttga 17

Claims (11)

  1. (a) mRNA 인터페라제 인지 서열이 다른(alternate) 트리플렛 코돈으로 치환되도록 돌연변이시키고 이같이 돌연변이된 핵산 서열에 의해 암호화되는 폴리펩타이드의 아미노산 서열이 상기 돌연변이에 의해 변화되지 않는, 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산으로 세포를 형질감염시키고;
    (b) 상기 mRNA 인터페라제 인지 서열을 인식하는 mRNA 인터페라제를 암호화하는 핵산으로 상기 세포를 형질감염시키며;
    (c) 단계 (a) 및 (b)의 핵산을 당해 세포내에서 발현시킴을 포함하며, 이같은 발현으로 당해 세포내에 폴리펩타이드를 생산하는 수단이 제공되는 것인,
    세포 내에서 폴리펩타이드를 생산하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, mRNA 인지 서열이 아데닌-사이토신-아데닌(ACA) 서열이고 mRNA 인터페라제가 서열번호 2를 포함하는 MazF 또는 이의 기능성 단편인 방법.
  3. 제1항에 있어서, mRNA 인지 서열이 우라실-아데닌-X (UAX) 서열이고[여기서, X는 사이토신(C), A, 또는 U이다], mRNA 인터페라제가 서열번호 4를 포함하는 PemK 또는 이의 기능성 단편인 방법.
  4. 제2항에 있어서, 단계 (b)의 핵산의 발현으로 ACA 서열을 포함하는 핵산에 의해 암호화되는 세포성 폴리펩타이드의 합성이 감소되거나 억제되는 방법.
  5. 제3항에 있어서, 단계 (b)의 핵산의 발현으로 UAX 서열을 포함하는 핵산에 의해 암호화되는 세포성 폴리펩타이드의 합성이 감소되거나 억제되는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 단계 (a) 및 단계 (b)가 동시에 수행되는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 단계 (c) 동안 또는 이에 앞서, 하나 이상의 방사성 표지된 동위원소를 포함하는 배지에서 세포를 항온처리함을 추가로 포함하는 방법.
  8. (a) mRNA 인터페라제 인지 서열이 다른(alternate) 트리플렛 코돈으로 치환되도록 돌연변이시키고 이같이 돌연변이된 핵산 서열에 의해 암호화되는 당해 폴리펩타이드의 아미노산 서열이 상기 돌연변이에 의해 변화되지 않는, 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 제공하고;
    (b) 상기 mRNA 인터페라제 인지 서열을 인식하는 mRNA 인터페라제를 암호화하는 핵산 서열을 제공하며;
    (c) 단계 (a) 및 (b)의 핵산을 발현시킴을 포함하고;
    이때, 단계 (a) 및 (b)의 핵산의 발현으로 폴리펩타이드를 생산하는 수단이 제공되는 것인, 폴리펩타이드를 생산하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, mRNA 인지 서열이 ACA 서열이고 mRNA 인터페라제가 서열번호 2를 포함하는 MazF 또는 이의 기능성 단편이거나; mRNA 인지 서열이 UAX 서열이고[여기서, X는 C, A, 또는 U이다], mRNA 인터페라제가 서열번호 4를 포함하는 PemK 또는 이의 기능성 단편인 방법.
  10. (a) 제1 핵산의 영역이 제2 핵산의 영역과 상보적이고 당해 제1 또는 제2 핵산 서열의 상보성 영역에 mRNA 인터페라제 인지 부위와 상보성인 서열을 포함하지 않으며, 당해 제1 및 제2 핵산 각각이 이의 5' 말단에서 인산화된, 제1 핵산 및 제2 핵산을 제공하고;
    (b) 상기 제1 및 제2 핵산의 상보성 영역을 통해 제1 및 제2 핵산이 어닐링되어, 일본쇄 오버행(overhang)들에 의해 플랭킹된 상보성 영역을 포함하는 이본쇄 핵산을 형성시키고, 이때 상기 일본쇄 오버행 각각은 mRNA 인터페라제 인지 부위와 상보성인 하나 이상의 서열을 포함하고 당해 일본쇄 오버행들은 서로에 대해 상보적이며;
    (c) 어닐링된 제1 및 제2 핵산을 상보성 일본쇄 오버행들을 통해 연결시켜, 어닐링된 제1 및 제2 핵산의 다수의 탠덤 반복체들을 포함하는 콘카타머(concatamer)를 형성시키고;
    (d) T7 프로모터 및 상기 제1 핵산에 상보성인 영역을 포함하는 제1 프라이머 및 상기 제2 핵산에 상보성인 제2 프라이머를 사용하여 상기 콘카타머를 증폭시키고, 이러한 증폭으로 T7 프로모터를 포함하는 다수의 콘카타머를 생산시키고;
    (e) T7 RNA 폴리머라제를 사용하여 상기 다수의 콘카타머로부터 RNA 분자(이들 RNA 분자 각각은 mRNA 인터페라제 인지 부위에 의해 플랭킹된 폴리리보뉴클레오타이드 서열의 다수의 탠덤 반복체를 포함한다)를 전사시키고;
    (f) 인터페라제 인지 부위에서 RNA를 절단할 수 있는 mRNA 인터페라제로 상기 RNA 분자를 분해시켜, 이러한 분해로 다수의 폴리리보뉴클레오타이드 서열을 생산함을 포함하는,
    다수의 폴리리보뉴클레오타이드 서열을 생산하기 위한 방법.
  11. 제10항에 있어서, mRNA 인지 서열이 ACA 서열이고 mRNA 인터페라제가 서열번호 2를 포함하는 MazF 또는 이의 기능성 단편이거나; mRNA 인지 서열이 UAX 서열이고[여기서, X는 C, A, 또는 U이다], mRNA 인터페라제가 서열번호 4를 포함하는 PemK 또는 이의 기능성 단편인 방법.
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