KR102575754B1

KR102575754B1 - 이중가닥 dna에 핵산 서열 비특이적으로 결합하는 단백질, 또는 그를 포함하는 융합단백질을 포함하는 바이오센서

Info

Publication number: KR102575754B1
Application number: KR1020200133037A
Authority: KR
Inventors: 강주영
Original assignee: (주)에스비바이오사이언스
Priority date: 2020-10-14
Filing date: 2020-10-14
Publication date: 2023-09-07
Also published as: WO2022080901A1; KR20220049422A

Abstract

이중가닥 DNA에 핵산 서열 비특이적으로 결합하는 단백질, 또는 그를 포함하는 융합단백질을 포함하는 바이오센서 및 이를 이용하여 이중가닥 DNA를 검출하는 방법을 제공한다.

Description

이중가닥 DNA에 핵산 서열 비특이적으로 결합하는 단백질, 또는 그를 포함하는 융합단백질을 포함하는 바이오센서 {Biosensor comprising a protein that binds to double-stranded DNA non-specifically with a nucleic acid sequence, or fusion protein comprising the same}

이중가닥 DNA에 핵산 서열 비특이적으로 결합하는 단백질, 또는 그를 포함하는 융합단백질을 포함하는 바이오센서 및 이를 이용하여 이중가닥 DNA를 검출하는 방법에 관한 것이다.

측방유동분석(Lateral Flow Assay, LFA)은 특별한 장비가 없이도 간단한 방법으로 액체 샘플에서 타겟을 검출할 수 있는 종이 기반의 바이오센서이다. 기존의 측방유동분석은 주로 금나노입자(Gold Nano Particle, AuNP)에 항체를 접합하여 타겟을 검출하는 방식을 사용하였다. AuNP에 항체를 접합하여 LFA에 응용하는 방법은 타겟 검출에 대한 민감도를 높이고, 결과를 눈으로 관찰할 수 있는 장점이 있다. 하지만 이 방법은 검출하고자 하는 타겟에 따라서 새로 항체를 찾아야 하고, 찾은 항체를 AuNP에 접합하여야 한다. 따라서, 타겟에 특이적으로 반응하는 항체를 찾는 데 많은 비용과 시간이 소모된다. 또한, AuNP에 항체를 접합하는 과정에서 항체의 효율이 떨어지며, AuNP의 생산단가가 비싸다는 문제가 있다.

따라서, 보다 간단하고 신속하게 타겟을 검출할 수 있는 LFA-기반 바이오센서의 개발이 여전히 필요하다.

일 양상은 이중가닥 DNA(dna)에 핵산 서열 비특이적으로 결합하는 단백질 또는 이의 단편, 및 비드에 결합하는 단백질, 또는 이의 단편을 포함하는 융합단백질을 제공한다.

다른 양상은 일 양상에 따른 상기 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

다른 양상은 일 양상에 따른 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

다른 양상은 일 양상에 따른 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.

다른 양상은 일 양상에 따른 숙주세포를 배양하는 단계를 포함하는, 상기 융합단백질의 제조방법을 제공한다.

다른 양상은 일 양상에 따른 이중가닥 DNA(dna)에 핵산 서열 비특이적으로 결합하는 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 이중가닥 DNA 검출용 조성물을 제공한다.

다른 양상은 일 양상에 따른 이중가닥 DNA(dna)에 핵산 서열 비특이적으로 결합하는 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 이중가닥 DNA 검출용 키트를 제공한다.

다른 양상은 이중가닥 DNA를 검출하기 위한 바이오센서를 제공한다.

다른 양상은 일 양상에 따른 상기 바이오센서를 이용하여 이중가닥 DNA를 검출하는 방법을 제공한다.

일 양상은 이중가닥 DNA(dna)에 핵산 서열 비특이적으로 결합하는 단백질 또는 이의 단편, 및 비드에 결합하는 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 융합단백질을 제공한다.

본 명세서에서, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 "서열 동일성 (sequence identity)"은 특정 비교 영역에서 양 서열을 최대한 일치되도록 얼라인시킨 후 서열간의 아미노산 잔기 또는 염기의 동일한 정도를 의미한다. 서열 동일성은 특정 비교 영역에서 2개의 서열을 최적으로 얼라인하여 비교함으로써 측정되는 값으로서, 비교 영역 내에서 서열의 일부는 대조 서열 (reference sequence)과 비교하여 부가, 삭제되어 있을 수 있다. 서열 동일성 백분율은 예를 들면, 비교 영역 전체에서 두 개의 최적으로 정렬된 서열을 비교하는 단계, 두 서열 모두에서 동일한 아미노산 또는 핵산이 나타나는 위치의 갯수를 결정하여 일치된 (matched) 위치의 갯수를 수득하는 단계, 상기 일치된 위치의 갯수를 비교 범위 내의 위치의 총 갯수 (즉, 범위 크기)로 나누는 단계, 및 상기 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 수득하는 단계에 의해 계산될 수 있다. 상기 서열 동일성의 퍼센트는 공지의 서열 비교 프로그램을 사용하여 결정될 수 있으며, 일례로 BLASTN(NCBI), CLC Main Workbench (CLC bio), MegAlignTM(DNASTAR Inc) 등을 들 수 있다.

여러 종의 동일하거나 유사한 기능이나 활성을 가지는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 확인하는데 있어 여러 수준의 서열 동일성을 사용할 수 있다. 예를 들어, 50%이상, 55%이상, 60%이상, 65%이상, 70%이상, 75%이상, 80%이상, 85%이상, 90%이상, 95%이상, 96%이상, 97%이상, 98%이상, 99%이상 또는 100% 등을 포함하는 서열 동일성이다.

용어 “핵산 서열 비특이적으로 결합”이란 DNA, RNA와 같은 염기 서열을 갖는 물질에의 결합이 그 물질의 염기 서열에 관계없이 이루어지는 것을 의미한다.

따라서, “이중가닥 DNA에 핵산 서열 비특이적으로 결합”이란 이중가닥 DNA의 서열에 관계없이 그 이중가닥 DNA에 결합하는 것을 의미한다.

상기 이중가닥 DNA에 핵산 서열 비특이적으로 결합하는 단백질은 단일가닥 DNA (single-stranded DNA, ssDNA)에의 결합능보다 이중가닥 DNA (double-stranded DNA, dsDNA)에의 결합능이 큰 단백질일 수 있다.

상기 이중가닥 DNA에 핵산 서열 비특이적으로 결합하는 단백질은 등전점이 9.0 이하, 0.1 내지 9.0, 0.1 내지 8.0, 0.1 내지 7.0, 1.0 내지 9.0, 1.0 내지 8.0, 1.0 내지 7.0, 2.0 내지 9.0, 2.0 내지 8.0, 2.0 내지 7.0, 3.0 내지 9.0, 3.0 내지 8.0, 3.0 내지 7.0, 4.0 내지 9.0, 4.0 내지 8.0, 4.0 내지 7.0, 4.0 내지 6.0, 4.0 내지 5.0, 4.5 내지 5.5, 5.0 내지 9.0, 5.0 내지 8.0, 5.0 내지 7.0, 또는 5.0 내지 6.0인 것일 수 있다. 일 구체예에서, 항독소 MazE 단백질의 단편의 모노머는 등전점이 4.0 내지 5.0일 수 있고, 예를 들어 4.83일 수 있다. 다른 구체예에서, 항독소 MazE 단백질의 단편의 다이머는 등전점이 5.0 내지 6.0일 수 있고, 예를 들어 5.31일 수 있다.

상기 이중가닥 DNA에 핵산 서열 비특이적으로 결합하는 단백질은 헬릭스-턴-헬릭스(helix-turn-helix) 도메인, 징크 핑커 도메인, 루신 지퍼(leucine zipper) 도메인, 윙 헬릭스(winged helix) 도메인, 윙 헬릭스-턴-헬릭스(winged helix-turn-helix) 도메인, 헬릭스-루프-헬릭스(helix-loop-helix) 도메인, HMG-박스 도메인, Wor3 도메인, OB-fold 도메인, B3 도메인, TALE(TAL effecter) 도메인, 또는 이들의 2 이상의 조합을 포함하는 것일 수 있다.

상기 이중가닥 DNA에 핵산 서열 비특이적으로 결합하는 단백질은 항독소 MazE 단백질, FOXO(forkhead box 단백질, 예: FOXO1, FOXO2, FOXO3, FOXO4), p53, EcoRV, FoK1, Cro(Control of repressor's operator protein), 또는 이들 중 어느 하나의 단편 또는 그 단편의 다이머일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 비드는 마이크로비드 또는 나노비드일 수 있다. 상기 마이크로비드의 크기는 1 μm 내지 1000 μm, 1 μm 내지 500 μm, 1 μm 내지 100 μm, 10 μm 내지 1000 μm, 10 μm 내지 500 μm, 또는 10 μm 내지 100 μm일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 나노비드의 크기는 1 nm 내지 1000 nm, 1 nm 내지 500 nm, 1 nm 내지 100 nm, 10 nm 내지 1000 nm, 10 nm 내지 500 nm, 10 nm 내지 100 nm, 100 nm 내지 1000 nm, 또는 100 nm 내지 500 nm일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 일 구체예에서, 상기 비드는 나노입자일 수 있다.

상기 비드는 유리, 니켈, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리(4-메틸부텐), 폴리스티렌, 폴리아크릴레이트, 폴리에틸렌 테레프탈레이트, 레이온, 나일론, 폴리(비닐 부티레이트), 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PCDF), 실리콘, 폴리포름알데히드, 셀룰로스, 셀룰로스 아세테이트, 니트로셀룰로스, 젤라틴, 세파로스 마크로비드, 세파덱스 비드, 덱스트란 마이크로캐리어, 아가로스, 알기네이트, 카라기난, 키틴, 셀룰로스, 덱스트란, 전분, 폴리카프로락톤(PCL), 폴리아크릴아미드, 폴리아크롤레인, 폴리디메틸실록산, 폴리비닐 알콜, 폴리메틸아크릴레이트, 퍼플루오로카본, 실리카, 규조토, 알루미나, 금, 산화철, 그래핀, 산화그래핀, 및 금속 산화물 중 어느 하나의 비드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 상기 비드는 자성 비드 또는 금 비드일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 비드는 자성 나노입자 또는 금 나노입자일 수 있다.

상기 비드에 결합하는 단백질은 MagR(magnetoreceptor) 단백질, 헴단백질(Heme protein)(예: 헤모글로빈, 사이토크롬 등), 철-황 단백질, 트랜스페린(Transferrin), 락토페린(Lactoferrin), 및 페리틴(Ferritin)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

일 구체예에서, 상기 융합단백질은 MagR(magnetoreceptor) 단백질, 또는 이의 단편 및 항독소 MazE 단백질, 또는 이의 단편을 포함하는 MagR-MazE 융합단백질일 수 있다.

용어 “MagR(magnetoreceptor) 단백질”은 “자기수용체 단백질”, “자성수용체(magnetic receptor) 단백질”, “자성 단백질(magnetic protein)”, “ISCA1(Iron-sulfur cluster assembly 1) 단백질” 등으로도 알려져 있다. 상기 MagR 단백질은 자성 물질에 결합할 수 있다. 상기 MagR 단백질의 유래는 초파리, 나방, 조류 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 상기 MagR 단백질은 초파리속(Drosophila sp.); 아그로티스속(Agrotis sp.); 비둘기(Columba livia) 등의 조류로부터 유래된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. MagR 단백질의 예시적인 서열은 NCBI Accession No. P0DN75.1, NWQ81101.1, XP_027490836.1, XP_005154986.1 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, MagR 단백질은 NCBI Accession No. P0DN75.1의 16 내지 132번째 아미노산 서열과 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단백질일 수 있다.

용어 “항독소(antitoxin) MazE 단백질”은 타입 II 독소-항독소 시스템의 항독소 성분이다. 상기 항독소 MazE 단백질은 이중가닥 DNA에 결합할 수 있다. 상기 항독소 MazE 단백질은 박테리아 유래 단백질일 수 있고, 예를 들어 대장균(Escherichia coli) 유래 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 항독소 MazE 단백질의 예시적인 서열은 NCBI Accession no. WP_000581937 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 항독소 MazE 단백질은 NCBI Accession no. WP_000581937의 2 내지 50번째 아미노산 서열과 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단백질일 수 있다.

용어 “융합단백질(fusion protein)”은 서로 다른 2개 이상의 단백질 또는 동종의 단백질이 결합된 형태로 만들어진 새로운 단백질이다. 2개 이상의 이종 단백질이 일부와 일부, 일부와 전체, 또는 전체와 전체가 결합한다. “MagR-MazE 융합단백질”은 MagR 단백질과 항독소 MazE 단백질이 일부와 일부, 일부와 전체, 또는 전체와 전체가 결합하여 형성된 단백질을 의미한다. 일 구체예에서, MagR-MazE 융합단백질은 MagR 단백질의 단편 및 항독소 MazE 단백질의 단편을 포함하는 단백질을 의미한다.

용어 “단편(fragment)”은 전체가 아닌 절단된 일부를 의미한다. 단백질의 단편은 단백질의 절단된 일부 서열을 의미할 수 있다. “MagR 단백질의 단편”은 MagR 단백질의 자기수용체 기능을 갖는 단편을 의미할 수 있다. “항독소 MazE 단백질의 단편”은 항독소 MazE 단백질의 이중가닥 DNA와 결합하는 능력을 갖는 단편을 의미할 수 있다.

상기 MagR 단백질의 단편은 서열번호 1의 16 내지 132번째 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 MagR 단백질의 단편은 서열번호 1의 16 내지 132번째 아미노산 서열과 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.

상기 항독소 MazE 단백질의 단편은 서열번호 2의 26 내지 74번째 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 항독소 MazE 단백질의 단편은 서열번호 2의 26 내지 74번째 아미노산 서열과 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.

상기 MagR-MazE 융합단백질은 항독소 MazE 단백질의 단편을 2개 이상, 2개 내지 10개, 2개 내지 9개, 2개 내지 8개, 2개 내지 7개, 2개 내지 6개, 2개 내지 5개, 2개 내지 4개, 2개 내지 3개, 또는 2개 포함할 수 있다. 상기 MagR-MazE 융합단백질에 포함되는 각각의 항독소 MazE 단백질의 단편은 동일한 서열을 갖는 것이거나 상이한 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 MagR-MazE 융합단백질에 포함되는 각각의 항독소 MazE 단백질의 단편은 동일한 서열을 갖는 것일 수 있다. 일 구체예에 있어서, 상기 융합단백질이 MazE 단백질의 단편(모노머)을 2개 이상 포함할 경우, 상기 각각의 모노머는 링커에 의해 연결될 수 있다. 상기 링커로는 예를 들어, 가요성 링커가 적용될 수 있다. 또한, 상기 링커는 단백질 가수 분해효소 (Protease resistance)에 대한 저항성을 갖는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 링커는, 1 내지 400개, 1 내지 200개, 또는 2 내지 200개의 임의의 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드일 수 있다. 상기 펩티드 링커는 Gly, Asn 및 Ser 잔기를 포함할 수 있으며, Thr 및 Ala과 같은 중성 아미노산들도 포함될 수 있다. 펩티드 링커에 적합한 아미노산 서열은 당업계에 공지되어 있다. 또한 기능적 일부분 사이의 적절한 분리를 달성하기 위하여 또는 필수적인 내부-일부분(inter-moiety)의 상호작용을 유지하기 위한　링커의 최적화를 고려하여 카피 수 “n”을 조절할 수 있다. 해당 기술분야에서 다른 가요성　링커들이 알려져 있는데, 예를 들어 수용성을 향상시키기 위하여 극성 아미노산 잔기를 추가하는 것뿐만 아니라 유연성을 유지하기 위하여 T 및 A와 같은 아미노산 잔기를 추가한 G 및 S　링커가 있을 수 있다. 따라서 일 구체예에 있어서, 상기　링커는 G, S, 및/또는 T 잔기를 포함하는 유연성　링커일 수 있다. 상기　링커는 (G_pS_s)_n 및 (S_pG_s)_n으로부터 선택되는 일반식을 가질 수 있고, 이 경우, 독립적으로, p는 1 내지 10의 정수이고, s = 0 내지 10의 0 또는 정수이고, p + s는 20 이하의 정수이고, 및 n은 1 내지 20의 정수이다. 더욱 구체적으로 링커의 예는 (GGGGS)_n, (SGGGG)_n, (SRSSG)_n, (SGSSC)_n, (GKSSGSGSESKS)_n, (RPPPPC)_n, (SSPPPPC)_n,　 (GSTSGSGKSSEGKG)_n, (GSTSGSGKSSEGSGSTKG)_n,　(GSTSGSGKPGSGEGSTKG)_n, 또는 (EGKSSGSGSESKEF)_n이고, 상기 n은 1 내지 20, 또는 1 내지 10의 정수이다.

일 구체예에서, 상기 융합단백질은 MagR(magnetoreceptor) 단백질, 또는 이의 단편 및 항독소 MazE 단백질, 또는 이의 단편의 다이머를 포함하는 MagR-MazE 융합단백질일 수 있다. 상기 항독소 MazE 단백질의 단편의 다이머는 항독소 MazE 단백질의 단편의 모노머 2개가 결합하여 형성된 것이다. 상기 항독소 MazE 단백질의 단편의 모노머는 서열번호 2의 26 내지 74번째 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 항독소 MazE 단백질의 단편의 모노머는 링커에 의해 연결된 것일 수 있다.

상기 MagR-MazE 융합단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 MagR-MazE 융합단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 MagR-MazE 융합단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열로 구성되는 것일 수 있다.

본 명세서에서, 단백질은 그 기능적 동등물을 포함한다. 상기 기능적 동등물에는 단백질의 일부 또는 전부가 치환되거나, 일부가 결실 또는 부가된 아미노산 서열 변형체가 상기 단백질의 기능을 유지하는 것 모두를 포함한다. 아미노산의 치환은 보존적 치환을 의미할 수 있다. 천연에 존재하는 아미노산의 보존적 치환의 예는 다음과 같다: 지방족 아미노산(Gly, Ala, Pro), 소수성 아미노산(Ile, Leu, Val), 방향족 아미노산(Phe, Tyr, Trp), 산성 아미노산(Asp, Glu), 염기성 아미노산(His, Lys, Arg, Gln, Asn) 및 황함유 아미노산(Cys, Met). 아미노산의 결실은 상기 단백질의 활성에 직접 관여하지 않는 부분에 위치한다.

상기 MagR-MazE 융합단백질은 비드에 특이적으로 결합하는 영역 및 이중가닥 DNA (dsDNA)에 핵산 서열 비특이적으로 결합하는 영역을 포함하는 것일 수 있다. 예를 들어, MagR-MazE 융합단백질에서 MagR 단백질의 단편 서열이 포함된 영역은 비드에 결합할 수 있고, MazE 단백질의 단편 서열이 포함된 영역은 dsDNA에 핵산 서열 비특이적으로 결합할 수 있다.

상기 폴리뉴클레오티드는 변형될 수 있다. 상기 변형은 뉴클레오티드의 추가, 결실, 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다.

상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열로 구성되는 것일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열로 구성되는 것일 수 있다.

용어 "벡터(vector)"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단을 의미한다. 예를 들어, 플라스미드 벡터, 코즈미드(cosmid) 벡터, 박테리오파지(bacteriophage) 벡터, 아데노바이러스(adenovirus) 벡터, 레트로바이러스(retrovirus) 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터를 포함한다. 상기 재조합 벡터로 사용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예를 들어, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈, pUC19 및 p426GPD 등), 파아지(예를 들어, λλλλΔ및 M13 등) 또는 바이러스(예를 들어, CMV, SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드(plasmid)" 및 "벡터(vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다.

상기 재조합 벡터에서 서열번호 3의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 용어 “작동적으로 연결”된 것이란 목적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터의 서열과 상기 폴리뉴클레오티드 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다.

상기 재조합 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 상기 발현용 벡터는 당업계에서 식물, 동물 또는 미생물에서 외래의 단백질을 발현하는데 사용되는 통상의 것을 사용할 수 있다. 상기 재조합 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다.

상기 재조합 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 사용되는 벡터가 발현 벡터이고 원핵 세포를 숙주로 하는 경우, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예를 들어, pLλ프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 진핵 세포를 숙주로 하는 경우, 벡터에 포함되는 진핵 세포에서 작동하는 복제원점은 f1 복제원점, SV40 복제원점, pMB1 복제원점, 아데노 복제원점, AAV 복제원점, CMV 복제원점 및 BBV 복제원점 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터(예를 들어, 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 일반적으로 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 가진다.

재조합 벡터로 형질전환될 수 있는 숙주세포로는 통상 DNA의 도입 효율과 도입된 DNA의 발현 효율이 높은 숙주가 사용된다. 예를 들어 대장균, 슈도모나스, 바실러스, 스트렙토마이세스, 진균, 효모와 같은 주지의 진핵 및 원핵 숙주들, 스포도프테라 프루기페르다(SF 9)와 같은 곤충 세포, CHO, COS 1, COS 7, BSC 1, BSC40, BMT 10 등의 동물 세포 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

폴리뉴클레오티드 또는 이를 포함하는 재조합 벡터의 숙주세포 내로의 삽입은, 당업계에 널리 알려진 방법을 사용할 수 있다. 상기 운반 방법은 예를 들어, 숙주세포가 원핵 세포인 경우, 칼슘 클로라이드(CaCl2) 방법 또는 전기천공법 등을 사용할 수 있고, 숙주세포가 진핵 세포인 경우, 미세 주입법, 칼슘 포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법 및 유전자 밤바드먼트 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 배양하는 단계에서 배지와 배양조건은 숙주세포에 따라 통상적으로 이용되는 것을 적절하게 선택하여 이용할 수 있으며, 융합단백질의 대량 생산에 적합하도록 온도, 배양시간 등의 배양 조건을 조절할 수 있다. 배양 단계를 거쳐 발현된 융합단백질은 세포의 여액(lysate)으로부터 분리할 수 있다. 과잉발현이 끝난 형질전환체를 원심분리하여 세포 펠렛(cell pellet)을 수득하고, 파열된 세포벽 또는 세포막이 포함된 배지 성분들을 제거함으로써 세포 여액(cell lysate)을 포함하는 용리액을 얻을 수 있다. 여기에서, 세포 펠렛은 당업계에 잘 알려진 방법, 예컨대 알칼리, 계면활성제 (CHAPS 및 SDS 등), 유기 용매 및 효소 (라이소자임 등)의 사용, 초음파처리(sonication) 및 고압분쇄기(French Press)의 사용, 주기적인 고온, 압력, 냉동 및 해동 사이클의 적용 등에 의하여 파쇄 (lysis)할 수 있다.

또한, 상기 융합단백질은 정제과정을 거쳐 순수하게 분리될 수 있다.

다른 양상은 상기 이중가닥 DNA(dna)에 핵산 서열 비특이적으로 결합하는 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 이중가닥 DNA 검출용 조성물을 제공한다.

용어 “이중가닥 DNA 검출”이란 이중가닥 DNA의 존재 여부를 확인하는 것을 의미한다. 상기 이중가닥 DNA 검출은 이중가닥 DNA를 특이적으로 검출하는 것을 의미할 수 있다. “이중가닥 DNA를 특이적으로 검출”하는 것은 단일가닥 DNA 등과 같은 이중가닥 DNA가 아닌 물질은 검출하지 않고 이중가닥 DNA만을 검출하는 것을 의미할 수 있다. 상기 이중가닥 DNA 검출은 이중가닥 DNA를 핵산 서열 비특이적으로 검출하는 것을 의미할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 이중가닥 DNA 검출은 PCR 산물의 존재 여부를 검출하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

일 구체예에서, 상기 조성물은 상기 이중가닥 DNA (dsDNA)에 핵산 서열 비특이적으로 결합하는 단백질 또는 이의 단편; 및 상기 단백질 또는 이의 단편과 연결된 비드 또는 항체를 포함하는 컨쥬게이트를 포함하는 것일 수 있다.

상기 이중가닥 DNA에 핵산 서열 비특이적으로 결합하는 단백질 또는 이의 단편은 전술한 바와 같다.

일 구체예에서, 상기 이중가닥 DNA에 핵산 서열 비특이적으로 결합하는 단백질 또는 이의 단편은 MazE 단백질 또는 이의 단편의 다이머일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 비드는 전술한 바와 같다. 일 구체예에서, 상기 비드는 자성 나노입자 또는 금 나노입자인 것일 수 있다.

상기 이중가닥 DNA (dsDNA)에 핵산 서열 비특이적으로 결합하는 단백질 또는 이의 단편은 비드와 결합할 수 있는 단백질 또는 이의 단편을 통해 상기 비드와 연결된 것일 수 있다. 상기 비드와 결합할 수 있는 단백질 또는 이의 단편은 비드에 결합하는 단백질 또는 이의 단편일 수 있다. 상기 비드에 결합하는 단백질 또는 이의 단편은 전술한 바와 같다.

일 구체예에서, 상기 비드와 결합할 수 있는 단백질은 MagR일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 항체는 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 결합 특이성을 보유한다면 항체의 단편도 포함하는 의미이다. 상기 항체는 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 조성물은 MagR-MazE 융합단백질; 및 상기 융합단백질과 연결된 비드를 포함하는 컨쥬게이트를 포함하는 것일 수 있다. 상기 비드는 자성 나노입자일 수 있다. 상기 컨쥬게이트는 MagR-MazE 융합단백질-자성 나노입자 컨쥬게이트일 수 있다. 상기 컨쥬게이트는 MagR-MazE 융합단백질 및 자성 나노입자를 접촉시키는 단계에 의하여 제조될 수 있다. MagR-MazE 융합단백질의 MagR 단백질 단편 서열을 포함하는 영역과 자성 나노입자의 결합이 안정적이기 때문에, 타겟 질환이 바뀔 때마다 새로운 항체를 금 나노입자에 접합하여야 해서 효율이 떨어지던 기존 방법의 단점을 보완할 수 있다.

상기 MagR-MazE 융합단백질-자성 나노입자 컨쥬게이트에서, MagR-MazE 융합단백질의 MazE 단백질 아미노산 서열을 포함하는 영역이 dsDNA에 결합하는 능력을 가지므로, 이에 의해 dsDNA를 검출할 수 있다.

다른 양상은 일 양상에 따른 상기 이중가닥 DNA 검출용 조성물을 포함하는 이중가닥 DNA 검출용 키트를 제공한다.

상기 조성물 또는 키트에는 당업계에서 일반적으로 사용되는 도구, 시약 등을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 도구 또는 시약으로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 키트에서, 상기 컨쥬게이트는 고체 지지체 상에 고정된 상태로 이용될 수 있다. 다양한 물질이 고체 지지체로 사용될 수 있으며, 셀룰로오스, 니트로셀룰로오스, 폴리비닐클로라이드, 실리카겔, 폴리스티렌, 나일론, 활성화된 비드 등을 예로 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

다른 양상은 이중가닥 DNA에 핵산 서열 비특이적으로 결합하는 단백질 또는 이의 단편을 포함하며, 이중가닥 DNA를 검출하기 위한 바이오센서를 제공한다.

일 구체예에서, 상기 바이오센서는 이중가닥 DNA에 핵산 서열 비특이적으로 결합하는 단백질 또는 이의 단편; 및 상기 단백질 또는 이의 단편과 연결된 비드 또는 항체를 포함하는 컨쥬게이트를 포함하는 것일 수 있다.

상기 바이오센서는 지지체를 더 포함할 수 있다. 상기 지지체는 고체 지지체일 수 있다.

상기 컨쥬게이트는 지지체 상에 고정된 것일 수 있다. 상기 컨쥬게이트는 공유 결합 또는 비-공유 결합을 통해 지지체 상에 고정되는 것일 수 있다. 상기 비-공유 결합은 스트렙타비딘과 바이오틴의 결합 및 티올과 금의 결합으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 구성원을 포함할 수 있다.

상기 바이오센서는 이중가닥 DNA에 핵산 서열 비특이적으로 결합하는 단백질 또는 이의 단편을 사용하여 이중가닥 DNA를 검출하는 것을 구현할 수 있는 것이라면 그 종류를 제한하지 않는다.

일 구체예에서, 상기 바이오센서는 전기화학적 센서일 수 있다.

상기 바이오센서는 상기 이중가닥 DNA에 핵산 서열 비특이적으로 결합하는 단백질 또는 이의 단편과 결합하는 이중가닥 DNA의 농도에 따른 전기화학적 신호로부터 이중가닥 DNA의 농도를 검출하는 것일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 바이오센서는 스트립 형태의 측방유동분석(Lateral flow assay, LFA)-기반 바이오센서일 수 있다.

상기 LFA-기반 바이오센서는 일단으로부터 타단 방향으로 순차적으로 배치된, (a) 샘플 패드, (b) 컨쥬게이트 패드, (c) 멤브레인, 및 (d) 흡수 패드를 포함한다.

상기 “샘플 패드”는 분석을 행할 샘플을 수용하여 확산 흐름이 가능한 패드를 의미하며, 분석을 행할 샘플을 수용하여 함유하기에 충분한 다공성을 갖는 물질로 구성된다. 이러한 다공성 물질로는 섬유성 종이, 셀룰로오스 물질로 된 미세 기공 멤브레인, 셀룰로오스, 셀룰로오스 아세테이트와 같은 셀룰로오스 유도체, 니트로셀룰로오스, 유리섬유, 천연발생의 면(cotton), 나일론과 같은 직물 또는 다공성 겔 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 “컨쥬게이트 패드”는 샘플 패드로부터 확산되어 이동되는 샘플을 수용한다. 상기 컨쥬게이트 패드에는 이중가닥 DNA (dsDNA)에 핵산 서열 비특이적으로 결합하는 단백질 또는 이의 단편; 및 상기 단백질 또는 이의 단편과 연결된 비드를 포함하는 컨쥬게이트가 포함될 수 있다. 상기 컨쥬게이트 패드에는 상기 MagR-MazE 융합단백질; 및 상기 융합단백질과 연결된 비드를 포함하는 컨쥬게이트가 포함될 수 있다. 상기 비드는 자성 나노입자일 수 있다. 상기 컨쥬게이트는 MagR-MazE 융합단백질-자성 나노입자 컨쥬게이트일 수 있다. 상기 컨쥬게이트 패드는 샘플 패드와 마찬가지로 확산 흐름이 가능한 물질로 구성된다. 금나노입자 대신 자성 나노입자를 사용할 경우, 비용이 저렴할 수 있다.

상기 “멤브레인”은 샘플 물질이 통과할 수 있는 것이라면 어떠한 물질로도 제조될 수 있다. 예를 들어, 천연, 합성, 또는 합성에 의해 변형된 천연 발생 물질, 예를 들어 폴리사카라이드(예: 셀룰로오스 물질, 종이, 셀룰로오스 아세테이트 및 니트로셀룰로오스와 같은 셀룰로오스 유도체); 폴리에테르 술폰; 폴리에틸렌; 나일론; 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF); 폴리에스테르; 폴리프로필렌; 실리카; 비닐 클로라이드, 비닐클로라이드-프로필렌 공중합체 및 비닐 클로라이드-비닐 아세테이트 공중합체와 같은 중합체와 함께 다공성 중합체 매트릭스에 균일하게 분산된 무기 물질, 예를 들어 불활성화된 알루미나, 규조토, MgSO₄, 또는 다른 무기 미분 물질; 자연 발생(예: 면) 및 합성(예: 나일론 또는 레이온) 천; 다공성 겔, 예를 들어 실리카겔, 아가로스, 덱스트란 및 젤라틴; 중합체 필름, 예를 들어 폴리아크릴아미드 등의 물질로부터 형성될 수 있다. 일 구체예에서, 상기 멤브레인은 중합체 물질, 예를 들어 니트로셀룰로오스, 폴리에테르술폰, 폴리에틸렌, 나일론, 폴리비닐리덴 플루오라이드, 폴리에스테르 또는 폴리프로필렌을 포함한다.

상기 “흡수 패드”는 상기 멤브레인의 말단에 또는 그 가까이에 인접해서 위치할 수 있다. 흡수 패드는 일반적으로 전체 멤브레인을 통해 이동하는 유체 샘플을 받아들인다. 흡수 패드는 멤브레인을 통한 모세관 작용 및 유체의 확산 유동을 촉진하는 데 도움을 줄 수 있다.

상기 LFA-기반 바이오센서는 상기한 샘플 패드, 컨쥬게이트 패드, 멤브레인 및 흡수 패드가 동일한 지지체 상에 순차적으로 배치된 것이다.

상기 지지체는 상기한 샘플 패드, 컨쥬게이트 패드, 멤브레인 및 흡수 패드를 지지 및 운반할 수 있다면 어떠한 물질로도 형성될 수 있다. 일 구체예에서, 상기 지지체는 상기 멤브레인을 통해 확산하는 샘플의 유체가 지지체를 통해 누출되지 않도록 액체 불투과성이다. 예컨대, 유리; 중합체물질, 예를 들어 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리부타디엔, 폴리비닐클로라이드, 폴리아미드, 폴리카르보네이트, 에폭시드, 메타크릴레이트, 폴리멜라민 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

상기 멤브레인 상에는 상기 컨쥬게이트 패드로부터 상기 흡수 패드 방향으로 테스트 영역 및 컨트롤 영역이 순차적으로 형성되어 있다.

상기 테스트 영역에는 상기 컨쥬게이트의 이중가닥 DNA에 핵산 서열 비특이적으로 결합하는 단백질 또는 이의 단편과 결합되는 표적 물질과 특이적으로 결합하는 제1 바인더, 예를 들면, 아비딘, 스트렙타비딘, 뉴트라비딘이 고정되어 있을 수 있다.

상기 컨트롤 영역에는 상기 표적 물질에는 특이적으로 결합하지 않으나 상기 이중가닥 DNA에 핵산 서열 비특이적으로 결합하는 단백질 또는 이의 단편과는 결합하는 제2 바인더, 예를 들면, 이중 가닥 DNA가 스트렙타비딘을 통해 고정되어 있을 수 있다.

상기 표적 물질은 dsDNA일 수 있다. 상기 dsDNA는 중합효소연쇄반응(PCR)에 의해 증폭된 산물일 수 있다. 상기 표적 물질은 상기 테스트 영역의 제1 바인더와 결합할 수 있도록 표지된 것일 수 있다.

본 명세서에서 용어 “표지된” 또는 "라벨"은 예로써, 방사성 표지된 아미노산의 함입에 의한, 또는 표시된　아비딘　(가령, 광학적 또는 비색 방법에 의해 검출될 수 있는 형광 마커 또는 효소적 활성을 내포하는　스트렙타비딘)에 의해 검출될 수 있는　비오틴　모이어티의 폴리펩티드에 부착에 의한 검출가능한 마커의 부착을 지칭한다. 폴리펩티드와 당단백질을 표지하는 다양한 방법은 당분야에 공지되어 있고 이용될 수 있다. 폴리펩티드에 대한 라벨의 실례에는 하기가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다: 방사성동위원소 또는 방사성핵종 (가령,　³H,　¹⁴C,　¹⁵N,　³⁵S,　⁹⁰Y,　⁹⁹Tc,　¹¹¹In,　¹²⁵I,　¹³¹I), 형광 라벨 (가령, FITC, 로다민, 란타니드 포스포르), 효소적 라벨 (가령, 양고추냉이 과산화효소, β-갈락토시다아제, 루시페라아제, 알칼리성 포스파타아제), 화학발광제 또는 비오틴을 포함할 수 있다.

다른 양상은 일 양상에 따른 바이오센서를 이용하여 이중가닥 DNA를 검출하는 방법을 제공한다.

상기 방법은, 액상의 샘플을 일 양상에 따른 바이오센서에 로딩시키는 단계; 및 상기 바이오센서에서 생성되는 신호를 측정하여 샘플 내의 이중가닥 DNA를 검출하는 단계를 포함할 수 있다.

일 구체예에서, 상기 바이오센서는 전기화학적 센서일 수 있다. 이 경우, 상기 방법은 액상의 샘플을 상기 전기화학적 센서에 로딩시키는 단계; 및 상기 전기화학적 센서에서 생성되는 전기화학적 신호를 측정하여 샘플 내의 이중가닥 DNA를 검출하는 단계를 포함할 수 있다.

다른 구체예에서, 상기 바이오센서는 측방유동분석-기반 바이오센서일 수 있다. 이 경우, 상기 방법은 액상의 샘플을 상기 측방유동분석-기반 바이오센서의 샘플 패드에 로딩시키는 단계; 및 상기 테스트 영역 및 컨트롤 영역에서 생성되는 신호를 측정하여 샘플 내의 이중가닥 DNA를 검출하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 샘플은 개체로부터 분리된 검체에 대해 중합효소연쇄반응 (PCR)을 수행하여 얻은 PCR 산물인 것일 수 있다. 상기 중합효소연쇄반응은 검출하고자 하는 핵산 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머를 사용하여 수행되는 것일 수 있다. 따라서, 확인하고자 하는 감염병 혹은 질환의 유전 정보만 있으면 상기 바이오센서에 의한 검출에 사용할 수 있다.

상기 개체로부터 분리된 검체는 혈액, 타액, 뇌척수액, 땀, 소변, 젖, 복수, 점액, 비강유체(nasal fluid), 객혈, 관절혈액, 복강액, 질액, 월경분비물, 양수, 정액 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 방법에 의해, 이중가닥 DNA를 정성적으로, 정량적으로, 또는 정성적 및 정량적으로 검출할 수 있다.

일 양상에 따른 이중가닥 DNA에 핵산 서열 비특이적으로 결합하는 단백질, 또는 그를 포함하는 융합단백질을 사용함으로써, 이중가닥 DNA를 검출할 수 있다. 따라서, 상기 단백질을 이중가닥 DNA를 검출하기 위한 바이오센서 등으로 응용할 수 있다.

도 1은 MagR-MazE 융합단백질을 이용한 측방유동분석-기반 바이오센서의 검출 원리를 나타낸 것이다.
도 2는 His-tag 컬럼 또는 자성 나노입자를 이용한 MagR-MazE 융합단백질의 정제도를 분석한 결과이다. His-Tag의 경우, FT: 통과액(flow through); W1: 50 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl, 및 60 mM 이미다졸 20 ml; W2: 50 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl, 및 60 mM 이미다졸 20 ml; E: 50 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl, 및 300 mM 이미다졸 15 ml. 자성 나노입자(Mag nanoparticle)의 경우, FT: 통과액(flow through); W1: 200 nm 자성 나노입자와 MagR-MazE 융합단백질을 상온에서 섞은 뒤 10분 인큐베이션 후 자석으로 자성 나노입자를 가라앉힌 후의 상층액; W2: 200 nm 자성 나노입자와 MagR-MazE 융합단백질을 상온에서 섞은 뒤 10분 인큐베이션 후 자석으로 자성 나노입자를 가라앉힌 후의 상층액; E: 200 nm 자성 나노입자.
도 3은 전기영동 또는 LFA-기반 바이오센서를 사용한 대장균 감염 여부 확인 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 전기영동 또는 LFA-기반 바이오센서를 사용한 항생제 내성 유전자 검출 결과를 나타낸 것이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: MagR-MazE 융합단백질의 제조

자성 나노입자 (Magnetic nanoparticle, MNP)에 특이적으로 결합하는 MagR 단백질의 단편 및 dsDNA (double stranded DNA)에 특이적으로 결합하는 항독소 MazE 단백질의 단편을 포함하는 MagR-MazE 융합단백질을 제조하였다.

구체적으로, MagR-MazE 융합단백질은 다음과 같이 제조하였다. i) 집비둘기(Coluba livia)의 MagR(잔기 16-132)과 ii) 대장균(Escherichia coli) MazE(잔기 2-49)의 두 반복을 GGGGSGGGGSG 아미노산 링커로 연결한 것을 융합하여 MagR-MazE 융합 구축물을 제조하였다. 사용된 MagR의 아미노산 서열은 서열번호 1로 표시하였고, 뉴클레오티드 서열은 서열번호 5로 표시하였다. 사용된 MazE의 아미노산 서열은 서열번호 2로 표시하였고, 뉴클레오티드 서열은 서열번호 6으로 표시하였다. 사용된 MagR-MazE 융합 구축물의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 4로 표시하였다. 상기 MagR-MazE 융합 구축물을 pET His6 LIC 클로닝 벡터(2Bc-T)에 클로닝하였다.

융합단백질의 과발현을 위해, 상기 벡터를 BL21 (DE3) 세포로 형질전환 하였다. 세포를 37℃에서 0.5-0.6의 OD600으로 성장시킨 다음, IPTG를 최종 농도 0.5 mM이 되도록 첨가 하였다. 세포를 18℃에서 밤새(18시간) 배양 하였다. His-태그된 MagR-MazE 융합단백질을 Ni-NTA 컬럼(GE Healthcare, Chicago, IL, U.S.A.)을 사용하여 정제하고 완충액(50 mM NaH₂PO₄,300 mM NaCl, 300 mM 이미다졸)으로 용리하였다. clMagR-MazE 융합단백질의 추가 정제를 위해 PBS로 사전 평형화된 Superdex 200-pg FPLC 컬럼(GE Healthcare, Chicago, IL, U.S.A.)에 단백질을 로딩하였다.

제조된 MagR-MazE 융합단백질의 아미노산 서열은 서열번호 3에 나타낸 바와 같다.

실시예 2: MagR-MazE 융합단백질을 이용한 측방유동분석-기반 바이오센서의 제조

실시예 1에서 제조한 MagR-MazE 융합단백질을 이용하여 LFA-기반 바이오센서를 제작하였다.

먼저 MagR-MazE 융합단백질(2 mg/ml) 200 μl과 자성 나노입자(MNP, 25 mg/ml, 직경 200 nm, fluidMAG-DX dextran) 100 μl를 혼합하고 5분 동안 배양하여 MagR-MazE 융합단백질과 MNP를 컨쥬게이션 하였다. 컨쥬게이션된 혼합물을 200 μL의 PBST로 3회 세척하였다. 마지막으로, 컨쥬게이션된 혼합물을 1%(v/v) Triton x-10 및 2%(v/v) Tween-20을 포함하는 PBS로 1/2로 희석하였다.

상기 MagR-MazE 융합단백질을 이용하여 샘플 패드, 컨쥬게이트 패드, 멤브레인(FF80HP Membranes | Cytiva, formerly GE Healthcare Life Sciences), 및 흡수 패드를 포함하는 측방유동분석-기반 바이오센서를 제작하였다.

도 1은 MagR-MazE 융합단백질을 이용한 측방유동분석-기반 바이오센서의 검출 원리를 나타낸 것이다.

실시예 3: MagR-MazE 융합단백질의 자성 나노입자에 대한 결합능 확인

MagR-MazE 융합단백질의 자성 나노입자(MNP)에 대한 결합능을 확인하기 위하여, 단백질을 정제할 때 일반적으로 사용하는 His-tag 컬럼 또는 자성 나노입자를 사용하여 MagR-MazE 융합단백질의 정제도를 비교하였다.

구체적으로, MagR-MazE 융합단백질과 MNP의 접합을 위해, 세포 용해(cell lysis)된 200 μL의 MagR-MazE 단백질 혼합물과 100 μL의 MNP(25 mg/mL, 직경 200nm)를 혼합하고 최소 5분 동안 배양하였다. 접합된 혼합물을 200 μL의 PBST로 3 회 세척 하였다. 최종 결과물 20 ul에 대해 SDS-PAGE를 통해 정제도를 분석하였다.

도 2는 His-tag 컬럼 또는 자성 나노입자를 이용한 MagR-MazE 융합단백질의 정제도를 분석한 결과이다.

도 2에 나타낸 바와 같이, E (Elution)의 결과를 보면 자성 나노입자를 사용하여도 단백질이 높은 순도로 정제된다는 것을 확인하였다. 따라서, MagR-MazE 융합단백질의 자성 나노입자에 대한 결합능이 우수함을 알 수 있었다.

실시예 4: LFA-기반 바이오센서를 이용한 대장균의 검출

실시예 2에서 제작한 LFA-기반 바이오센서를 이용하여 대장균을 검출하였다.

구체적으로, PBS에 대장균을 희석한 샘플에서 DNA를 분리하고, 하기 표 1에 기재된 대장균 특이적 프라이머 세트(서열번호 7 및 8, 또는 서열번호 7 및 9)를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR 산물을 실시예 2의 LFA-기반 바이오센서의 샘플 패드에 로딩하였다.

프라이머 명칭	프라이머 방향	서열(5'→3')	서열번호
16s rRNA primer (410F)	정방향	AAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTAC	7
16s rRNA primer (907R)	역방향	CCGTCAATTCCTTTAAGTTT	8
16s rRNA primer (907R)	역방향	CCGTCAATTCCTTTGAGTTT	9

도 3은 전기영동 또는 LFA-기반 바이오센서를 사용한 대장균 감염 여부 확인 결과를 나타낸 것이다.

도 3에 나타낸 바와 같이, PCR 산물을 전기영동으로 확인한 결과와 LFA-기반 바이오센서를 통해 확인한 결과가 동일하다는 것을 알 수 있었다. 따라서, 전기영동 없이도 MagR-MazE 융합단백질을 이용한 LFA-기반 바이오센서를 통해 표적 물질을 간단히 검출할 수 있음을 확인하였다.

실시예 5: LFA-기반 바이오센서를 이용한 항생제 내성 유전자의 검출

실시예 2에서 제작한 LFA-기반 바이오센서를 이용하여 항생제 내성 유전자를 검출하였다.

구체적으로, 암피실린(ampicillin, AMP) 내성 유전자를 포함하는 플라스미드를 갖는 대장균을 PBS에 희석한 샘플에서 DNA를 분리하고, 하기 표 2에 기재된 암피실린 내성 유전자 특이적 프라이머 세트를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 95℃ 5분 후, 95℃ 1분, 55℃ 1분, 72℃ 1분, 30사이클이었다. PCR 산물을 실시예 2의 LFA-기반 바이오센서의 샘플 패드에 로딩하였다.

프라이머 명칭	프라이머 방향	서열(5'→3')	서열번호
AMP resistance gene primer (305F)	정방향	GATGCTGAAGATCAGTTGG	10
AMP resistance gene primer (1020R)	역방향	CGTTCATCCATAGTTGCC	11

도 4는 전기영동 또는 LFA-기반 바이오센서를 사용한 항생제 내성 유전자 검출 결과를 나타낸 것이다.

도 4에 나타낸 바와 같이, PCR 산물을 전기영동으로 확인한 결과와 LFA-기반 바이오센서를 통해 확인한 결과가 동일하다는 것을 알 수 있었다. 따라서, 전기영동 없이도 MagR-MazE 융합단백질을 이용한 LFA-기반 바이오센서를 통해 표적 물질을 간단히 검출할 수 있음을 확인하였다.

<110> SB Bioscience Co., Ltd. <120> Biosensor comprising a protein that binds to double-stranded DNA non-specifically with a nucleic acid sequence, or fusion protein comprising the same <130> PN200157 <160> 11 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 142 <212> PRT <213> Columba livia <400> 1 Met Lys Ser Ser His His His His His His Gly Ser Ser Val Ser Lys 1 5 10 15 Arg Lys Ile Gln Ala Thr Arg Ala Ala Leu Thr Leu Thr Pro Ser Ala 20 25 30 Val Gln Lys Ile Lys Glu Leu Leu Lys Asp Lys Pro Glu His Val Gly 35 40 45 Val Lys Val Gly Val Arg Thr Arg Gly Cys Asn Gly Leu Ser Tyr Thr 50 55 60 Leu Glu Tyr Thr Lys Ser Lys Gly Asp Ser Asp Glu Glu Val Val Gln 65 70 75 80 Asp Gly Val Arg Val Phe Ile Glu Lys Lys Ala Gln Leu Thr Leu Leu 85 90 95 Gly Thr Glu Met Asp Tyr Val Glu Asp Lys Leu Ser Ser Glu Phe Val 100 105 110 Phe Asn Asn Pro Asn Ile Lys Gly Thr Cys Gly Cys Gly Glu Ser Phe 115 120 125 Asn Ile Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Ser Asn Ile Gly Ser Gly 130 135 140 <210> 2 <211> 134 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 2 Met Lys Ser Ser His His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln 1 5 10 15 Ser Asn Ala Asp Asp Asp Asp Lys Gly Ile His Ser Ser Val Lys Arg 20 25 30 Trp Gly Asn Ser Pro Ala Val Arg Ile Pro Ala Thr Leu Met Gln Ala 35 40 45 Leu Asn Leu Asn Ile Asp Asp Glu Val Lys Ile Asp Leu Val Asp Gly 50 55 60 Lys Leu Ile Ile Glu Pro Val Arg Lys Glu Gly Gly Gly Gly Ser Gly 65 70 75 80 Gly Gly Gly Ser Gly Ile His Ser Ser Val Lys Arg Trp Gly Asn Ser 85 90 95 Pro Ala Val Arg Ile Pro Ala Thr Leu Met Gln Ala Leu Asn Leu Asn 100 105 110 Ile Asp Asp Glu Val Lys Ile Asp Leu Val Asp Gly Lys Leu Ile Ile 115 120 125 Glu Pro Val Arg Lys Glu 130 <210> 3 <211> 254 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MagR-MazE fusion protein <400> 3 Met Lys Ser Ser His His His His His His Gly Ser Ser Val Ser Lys 1 5 10 15 Arg Lys Ile Gln Ala Thr Arg Ala Ala Leu Thr Leu Thr Pro Ser Ala 20 25 30 Val Gln Lys Ile Lys Glu Leu Leu Lys Asp Lys Pro Glu His Val Gly 35 40 45 Val Lys Val Gly Val Arg Thr Arg Gly Cys Asn Gly Leu Ser Tyr Thr 50 55 60 Leu Glu Tyr Thr Lys Ser Lys Gly Asp Ser Asp Glu Glu Val Val Gln 65 70 75 80 Asp Gly Val Arg Val Phe Ile Glu Lys Lys Ala Gln Leu Thr Leu Leu 85 90 95 Gly Thr Glu Met Asp Tyr Val Glu Asp Lys Leu Ser Ser Glu Phe Val 100 105 110 Phe Asn Asn Pro Asn Ile Lys Gly Thr Cys Gly Cys Gly Glu Ser Phe 115 120 125 Asn Ile Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Ser Asn Ala Asp Asp Asp Asp Lys 130 135 140 Gly Ile His Ser Ser Val Lys Arg Trp Gly Asn Ser Pro Ala Val Arg 145 150 155 160 Ile Pro Ala Thr Leu Met Gln Ala Leu Asn Leu Asn Ile Asp Asp Glu 165 170 175 Val Lys Ile Asp Leu Val Asp Gly Lys Leu Ile Ile Glu Pro Val Arg 180 185 190 Lys Glu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ile His Ser 195 200 205 Ser Val Lys Arg Trp Gly Asn Ser Pro Ala Val Arg Ile Pro Ala Thr 210 215 220 Leu Met Gln Ala Leu Asn Leu Asn Ile Asp Asp Glu Val Lys Ile Asp 225 230 235 240 Leu Val Asp Gly Lys Leu Ile Ile Glu Pro Val Arg Lys Glu 245 250 <210> 4 <211> 765 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MagR-MazE fusion protein <400> 4 atgaaatctt ctcaccatca ccatcaccat ggttcttctg tatcaaaaag aaagatacaa 60 gctacaaggg cggcactgac tttgaccccg agcgcggtcc agaagattaa agagctgttg 120 aaggacaagc cggagcacgt gggcgtaaaa gttggcgtgc gcacccgtgg ttgcaatggt 180 ctctcctaca ccctggaata tacgaaaagc aaaggtgatt ctgatgagga ggtcgtgcag 240 gatggtgttc gtgttttcat cgagaaaaag gctcaactga ccttactggg cacggaaatg 300 gactacgtgg aagacaagct gtcgagcgaa tttgttttca acaacccgaa tattaagggc 360 acctgtggct gcggtgaaag ctttaacatc gaaaacctgt acttccaatc caatgcagac 420 gatgatgaca agggtattca ttcatcagtg aagcgttggg gtaactcgcc cgctgttcgc 480 attcctgcca cattaatgca ggctctgaac ttgaacatcg acgacgaagt taaaattgat 540 ttagtagacg gtaaattgat catcgaaccg gtgcgcaagg agggtggagg gggatcggga 600 gggggcggtt cgggaatcca tagcagtgta aagcgctggg gcaattcacc agcggtccgt 660 atccctgcaa cactgatgca agccctgaac ttaaatattg acgatgaagt caagatcgac 720 ttggtagatg gtaaacttat cattgagccg gtgcgtaagg agtaa 765 <210> 5 <211> 502 <212> DNA <213> Columba livia <400> 5 cctgcaggac tcgagttcta gaaataattt tgtttaactt taagaaggag atatacatat 60 gaaatcttct caccatcacc atcaccatgg ttcttctgta tcaaaaagaa agatacaagc 120 tacaagggcg gcactgactt tgaccccgag cgcggtccag aagattaaag agctgttgaa 180 ggacaagccg gagcacgtgg gcgtaaaagt tggcgtgcgc acccgtggtt gcaatggtct 240 ctcctacacc ctggaatata cgaaaagcaa aggtgattct gatgaggagg tcgtgcagga 300 tggtgttcgt gttttcatcg agaaaaaggc tcaactgacc ttactgggca cggaaatgga 360 ctacgtggaa gacaagctgt cgagcgaatt tgttttcaac aacccgaata ttaagggcac 420 ctgtggctgc ggtgaaagct ttaacatcga aaacctgtac ttccaatcca atattggaag 480 tggataacgg atccgcgatc gc 502 <210> 6 <211> 385 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 6 tacttccaat ccaatgcaga cgatgatgac aagggtattc attcatcagt gaagcgttgg 60 ggtaactcgc ccgctgttcg cattcctgcc acattaatgc aggctctgaa cttgaacatc 120 gacgacgaag ttaaaattga tttagtagac ggtaaattga tcatcgaacc ggtgcgcaag 180 gagggtggag ggggatcggg agggggcggt tcgggaatcc atagcagtgt aaagcgctgg 240 ggcaattcac cagcggtccg tatccctgca acactgatgc aagccctgaa cttaaatatt 300 gacgatgaag tcaagatcga cttggtagat ggtaaactta tcattgagcc ggtgcgtaag 360 gagtaataac attggaagtg gataa 385 <210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16s rRNA primer (410F) <400> 7 aagaaggcct tcgggttgta aagtac 26 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16s rRNA primer (907R) <400> 8 ccgtcaattc ctttaagttt 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16s rRNA primer (907R) <400> 9 ccgtcaattc ctttgagttt 20 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AMP resistance gene primer (305F) <400> 10 gatgctgaag atcagttgg 19 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AMP resistance gene primer (1020R) <400> 11 cgttcatcca tagttgcc 18

Claims

MagR(magnetoreceptor) 단백질, 또는 이의 단편 및 항독소 MazE 단백질, 또는 이의 단편의 다이머를 포함하고, 상기 MagR 단백질의 단편은 서열번호 1의 16 내지 132번째 아미노산 서열로 이루어진 것이고, 상기 항독소 MazE 단백질의 단편은 서열번호 2의 26 내지 74번째 아미노산 서열로 이루어진 것인 MagR-MazE 융합단백질.
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청구항 1에 있어서, 항독소 MazE 단백질의 단편의 모노머는 링커에 의해 연결된 것인 MagR-MazE 융합단백질.
청구항 1에 있어서, 상기 MagR-MazE 융합단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 것인 MagR-MazE 융합단백질.
청구항 1에 있어서, 상기 MagR 단백질, 또는 이의 단편은 비드에 특이적으로 결합하는 영역을 포함하며, 상기 항독소 MazE 단백질, 또는 이의 단편은 이중가닥 DNA (dsDNA)에 핵산 서열 비특이적으로 결합하는 영역을 포함하는 것인 MagR-MazE 융합단백질.
청구항 1의 융합단백질; 및,
상기 융합단백질과 연결된 비드를 포함하는 것으로서,
MagR-MazE 융합단백질-비드 컨쥬게이트를 포함하는 이중가닥 DNA 검출용 조성물.
청구항 7에 있어서, 상기 MazE 단백질 또는 이의 단편은 단일가닥 DNA (ssDNA)에의 결합능보다 dsDNA에의 결합능이 큰 것이고, 등전점이 9 이하인 것인 조성물.
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청구항 7에 있어서, 상기 비드는 자성 나노입자 또는 금 나노입자인 것인 조성물.
청구항 7에 있어서, 상기 MazE 단백질, 또는 이의 단편의 다이머는 MagR 단백질, 또는 이의 단편을 통해 상기 비드와 연결된 것인 조성물.
삭제
청구항 7의 조성물을 포함하는 이중가닥 DNA 검출용 키트.
청구항 1의 융합단백질; 및
상기 융합단백질과 연결된 비드를 포함하는 것으로서,
MagR-MazE 융합단백질-비드 컨쥬게이트를 포함하며, 상기 컨쥬게이트가 지지체 상에 고정된 것인, 이중가닥 DNA를 검출하기 위한 바이오센서.
청구항 15에 있어서, 상기 바이오센서는 전기화학적 센서, 또는 스트립 형태의 측방유동분석-기반 바이오센서인 것인 바이오센서.
청구항 16에 있어서, 상기 스트립 형태의 측방유동분석-기반 바이오센서는,
일단으로부터 타단 방향으로 순차적으로 배치된, (a) 샘플 패드, (b) 컨쥬게이트 패드, (c) 멤브레인, 및 (d) 흡수 패드를 포함하고,
상기 컨쥬게이트 패드에는 상기 MagR-MazE 융합단백질-비드 컨쥬게이트가 포함되어 있고,
상기 멤브레인 상에는 상기 컨쥬게이트 패드로부터 상기 흡수 패드 방향으로 테스트 영역 및 컨트롤 영역이 순차적으로 형성되어 있고,
상기 테스트 영역에는 상기 컨쥬게이트의 이중가닥 DNA에 핵산 서열 비특이적으로 결합하는 항독소 MazE 단백질 또는 이의 단편과 결합되는 표적 물질과 특이적으로 결합하는 제1 바인더가 고정되어 있고,
상기 컨트롤 영역에는 상기 표적 물질에는 특이적으로 결합하지 않으나 상기 이중가닥 DNA에 핵산 서열 비특이적으로 결합하는 항독소 MazE 단백질 또는 이의 단편과는 결합하는 제2 바인더가 고정되어 있는 것인, 측방유동분석-기반 바이오센서.
액상의 샘플을 청구항 15에 따른 바이오센서에 로딩시키는 단계; 및
상기 바이오센서에서 생성되는 신호를 측정하여 샘플 내의 이중가닥 DNA를 검출하는 단계를 포함하는, 이중가닥 DNA를 검출하는 방법.
청구항 18에 있어서, 상기 샘플은 개체로부터 분리된 검체에 대해 중합효소연쇄반응 (PCR)을 수행하여 얻은 PCR 산물인 것인 방법.
청구항 18에 있어서, 이중가닥 DNA를 정성적으로, 정량적으로, 또는 정성적 및 정량적으로 검출하는 것인 방법.