JPH09505144A

JPH09505144A - ｈｄｍ−２−特異的抗体の検出方法

Info

Publication number: JPH09505144A
Application number: JP7514228A
Authority: JP
Inventors: ツェントグラフ，ハンスヴァルテル; クライン，ラルフ; フライ，マンフレッド; マルテンス，レギーナ
Original assignee: ドイチェスクレプスフォルシュングスツェントルムシュティフトゥングデスエフェントリッヒェンレヒツ
Priority date: 1993-11-19
Filing date: 1994-11-18
Publication date: 1997-05-20
Also published as: DE4345249A1; DE4345249C2; EP0729580B1; ATE189525T1; DE59409128D1; WO1995014233A2; WO1995014233A3; EP0729580A1

Abstract

(57)【要約】本発明は体液中のｈｄｍ−２−特異的抗体の検出方法に関し、担体部材に結合されたｈｄｍ−２および／またはｈｄｍ−２−特異的抗体結合領域を含むその断片を体液とともに保温し、ｈｄｍ−２および／またはその断片に結合された特異的抗体（ａ）を、抗体（ａ）を標的とした標識された抗体（ｂ）と反応できるか、または標識されていない抗体（ｂ）と反応させ、後者を、抗体（ｂ）を標的とした標識された抗体（ｃ）と反応できるようにすることを特徴とするものである。さらに、本発明はこの目的のために利用できるキットに関する。さらに、本発明はｈｄｍ−２断片および同断片をコードしているＤＮＡ配列、ｈｄｍ−２−特異的結合領域を含む断片、およびそれらの製造工程に関する。

Description

【発明の詳細な説明】ｈｄｍ−２−特異的抗体の検出方法本発明は体液中のｈｄｍ−２−特異的抗体の検出方法に関する。さらに、本発明はこの目的のために利用可能なキットに関する。さらに、本発明は、ｈｄｍ− ２断片およびその断片をコードしているＤＮＡ配列、ｈｄｍ−２−特異的抗体の結合領域を含む断片、並びにそれらの製造工程に関する。ヒトゲノムはｈｄｍ−２（human-double-minute遺伝子２）と命名された遺伝子を有する。この遺伝子は大部分は、対応するネズミのｍｄｍ−２遺伝子（muri ne-double-minute遺伝子２）に相同である。ｈｄｍ−２遺伝子の発現産物は、一次構造が知られ、４９１個のアミノ酸を有するタンパク質（Oliner，J．D．et a l.，Nature，358(1992)，80-83を参照）である。このタンパク質を以下ｈｄｍ− ２と称する。ｈｄｍ−２遺伝子は肉腫中に増幅された型で頻繁に存在することが知られている。この場合、増加された抗体の発現もまた発見されている。このことはｈｄｍ −２を標的とした特異的抗体の存在により達成できる。従って、このような抗体の検出は特定のガンの診断のために利用できる。このように、ｈｄｍ−２−特異的抗体の検出方法を提供することが本発明の目的である。本発明に従えば、担体部材に結合されたｈｄｍ−２および／または担体部材に結合された、ｈｄｍ−２−特異的抗体結合領域を含むその断片を体液とともに保温し、ｈｄｍ−２および／またはその断片に結合した特異的抗体（ａ）を、抗体（ａ）を標的とした標識された抗体（ｂ）と反応できるようにするか、または標識されていない抗体（ｂ）と反応させ、後者を、抗体（ｂ）を標的とした標識された抗体（ｃ）と反応できるようにする工程において、これを達成する。「ｈｄｍ−２」という表現は、野生型配列を有するｈｄｍ−２タンパク質を含む。そのようなタンパク質はＡ−２０４（ヒト横紋筋肉腫細胞系統、腫瘍バンク、ドイツKrebsforschungzentrum、ハイデルベルグ）等の細胞から単離することができる。ｈｄｍ−２はまた、野生型配列とは異なる配列を有していても差支えない。このような配列は、１以上のアミノ酸の付加、欠失、および／または置換が行われていても差支えない。さらに、ｈｄｍ−２は融合タンパク質の一部であっても差支えない。この一つのタンパク質は、他のあらゆるｈｄｍ−２のように、遺伝子操作の後にそれを発現する細胞から単離することができる。このような細胞は原核細胞および真核細胞を含む。前者の例にはＢＬ２１（Studier，F．W．e t al.，Methods in Enzymology 185(1990)，60-89を参照）等のＥ．ｃｏｌｉ株があり、一方後者には特定の哺乳類細胞、酵母細胞および昆虫細胞が含まれる。遺伝子操作とは、当業者に知られている通常の工程を意味すると解され、それによりある配列の核酸を生成し細胞内に導入し、発現させる。当業者はこの目的のために適切な物質、例えばベクターや適切な条件（例えば、Maniatis，T．et al .，Cold Spring Harbor Laboratry，1982を参照）を知っている。今回の場合においては、ｈｄｍ−２−ｃＤＮＡはＡ−２０４細胞（前記を参照）より通常の工程により逆転写され、通常のＰＣＲ法により増幅された。ｃＤＮＡを配列に関して公表されたデータ（例えばＥＭＢＬコロニーバンク）と比較し、組換えベクターｐｅｔ９２／２を得るように公知のベクターｐｅｔ３ｄに挿入した。後者でｈｄｍ−２の発現のために細菌株ＢＬ２１（前記を参照）を形質転換した。ｈｄｍ−２誘導をＩＰＴＧの添加により達成した。細菌を沈殿させ、凍結融解した後リゾチームおよびＤＮａｓｅＩ処理を行った。破砕物をさまざまな濃度の尿素溶液中で保温し、続いて遠心分離し、放出されたｈｄｍ−２を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびそれに続く電気溶出により純粋な形で供与した。当業者は上記の工程、およびこの目的に必要な条件および物質を熟知している。本発明に従って、ｈｄｍ−２−特異的抗体の結合領域を含むｈｄｍ−２断片を供与する。これらの断片を以降、ｈｄｍ−２−ＡＫＢＲ断片と称する。ｈｄｍ− ２−ＡＫＢＲ断片は、好ましくは、ｈｄｍ−２のアミノ酸１−２８４、５８−２８４、および５８−４９１を含む（図１参照）。ｈｄｍ−２−ＡＫＢＲ断片の生成にはいくつかの工程を用いることができる。断片が構築され、ｈｄｍ−２の全長にわたり配分され、少くとも２つの断片がそれぞれオーバーラップしている領域を有し、該断片はｈｄｍ−２−特異的抗体と反応できる状態におかれ、抗体が結す重複領域が同定され、ｈｄｍ−２−ＡＫＢＲ断片として供与され、後者は必要に応じて上記サイクルの一回または複数回の繰り返しにおいて基礎として用いられる工程が好ましいことがわかった。この工程の基礎は、Ａ−２０４細胞（前記を参照）から得られたｈｄｍ−２− ｃＤＮＡである。ｃＤＮＡの全長にわたり配分されたそのＤＮＡ断片を通常のＰＣＲ法により増幅しそれぞれオーバーラップしている領域を有する少くとも２つの断片を得た。上記のように、増幅されたＤＮＡ断片を、ｐｅｔ３ｄ中に挿入し、形質転換とＩＰＴＧ誘導の後に細菌株ＢＬ２１中で発現させた。ｈｄｍ−２について上述したように、結果として生じたｈｄｍ−２断片を単離し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、続いて、標識された一般に入手可能な、例えばＪＦ２等のｈｄｍ−２−特異的抗体をｈｄｍ−２断片への結合に用いたウエスタンブロットを行った。これらの抗体のひとつと、オーバーラップしている領域を含む２つのｈｄｍ−２断片とが結合することにより、抗体の結合領域はこのオーバーラップ領域であると特定される。この領域がｈｄｍ−２−ＡＫＢＲと称される断片として供与される。この目的のために、例えば通常のＰＣＲ法が用いられる。上記のサイクルを、１回または数回、ｈｄｍ−２−ＡＫＢＲ断片に関し繰り返して、ｈｄｍ−２−特異的抗体の結合領域をさらに限定しても差支えない。この結合領域はアミノ酸数個まで狭めることができる。ある状況下でこの目的のために必要な短いｈｄｍ−２断片は、合成的に作ることができる。当業者は上記の工程およびその実行のために必要な物質および条件に通じている。ｈｄｍ−２−ＡＫＢＲ断片をコードしているＤＮＡ配列もまた本発明に従って提供する。これらのＤＮＡ配列は、好ましくは、ｈｄｍ−２のアミノ酸１−２８４、５８−２８４、および５８−４９１をコードするヌクレオチドを含む（図２参照）。ｈｄｍ−２および／またはｈｄｍ−２−ＡＫＢＲ断片は、本発明によれば担体部材に結合されている。もちろん、個々のｈｄｍ−２−ＡＫＢＲ断片または後者をｈｄｍ−２とともに結合することも可能である。タンパク質の結合に好適なあらゆる部材、特にマイクロタイタープレート、スモールチューブまたはパイプ、マイクロスフェアー（microspheres）およびスライドを担体部材として用いることができる。ｈｄｍ−２−ＡＫＢＲ断片が非常に小さい場合、特にペプチドには、通常の例えばＢＳＡ等の担体により担体部材への結合を生み出すことが好適である。このような結合は、担体なしのものと同様、従来の方法により得られる。今回の場合には、マイクロタイタープレートを担体部材として用いた。この目的のために、ｈｄｍ−２および／またはｈｄｍ−２−ＡＫＢＲ断片を炭酸塩バッファーおよび尿素リン酸塩バッファー中にそれぞれ取り込み、異なった程度に希釈しマイクロタイタープレートの穴に置いた。４℃で一晩保温し、続いて生理的バッファーで数回洗浄段階を行った。ｈｄｍ−２および／またはｈｄｍ−２−ＡＫＢＲ断片の結合は安定であった。結合されたｈｄｍ−２および／または結合されたｈｄｍ−２−ＡＫＢＲ断片は、本発明に従って体液と共に保温される。後者は動物の体、特に哺乳類、さらに特定して人間から得られるあらゆる液体をも含む。液体は好ましくは、血清、リンパ液、唾液および尿を含む。さらに、それらはまた、肺、脳、骨髄等の固形組織に加えて、肉腫同様、例えば結腸、直腸ガンおよびヘプトセルラー（heptocel lular）ガン等の腫瘍から単離できる液体も含む。保温は通常の工程に従って行う。今回の場合は、患者の血清を様々な程度に希釈し、マイクロタイタープレート中の結合されたｈｄｍ−２および／または結合されたｈｄｍ−２−ＡＫＢＲへ添加した。３７℃で１時間にわたり保温し、続いて生理的バッファー中で数回洗浄段階を行った。特異的抗ｈｄｍ−２抗体の結合は安定であった。本発明によると、そのような結合された抗体（以降は抗体（ａ）と称される。）を −抗体（ａ）を標的とした標識された抗体（ｂ）と反応させるか、または −標識されていない抗体（ｂ）と反応させ、後者を、抗体（ｂ）を標的とした標識された抗体（ｃ）と反応させる。標識は放射性または非放射性で実行できる。後者の場合は、他の通常のマーカーを用いることができる。特に、例えばフルオレセイン（florescein）イソチオシアネート等の染料、および例えばアルカリホスファターゼやペルオキシダーゼ等の酵素が好適である。ビオチン／ストレプトアビジン複合体を増幅システムとして用いることができる。マーカーは一般に利用できる。抗体（ｂ）あるいは（ｃ）の接合は、製造者の指示に従って行う。既に標識された抗体（ｂ）および（ｃ）もまた一般に利用可能である。標識されていてもいなくても、好適な抗体（ｂ）の選択は、使用する体液が由来する動物または動物種によって決まる。もし、例えば、ヒト由来の液に関する場合は、用いられる抗体（ｂ）はヒトイムノグロブリンを標的としたものである。これに対応して、もし抗体（ｃ）が付加的に用いられる場合には、それらは抗体（ｂ）の起源である動物または動物種に関連して選択される。当業者は、好適な抗体の選択に通じており、この選択はさらなる困難を伴わず行うことができる。結合された抗体（ａ）と、標識された抗体（ｂ）および標識されていない抗体（ｂ）それぞれ、および続いて標識された抗体（ｃ）との反応は、常法で行うことができる。今回の場合は、抗体（ｂ）についての両方の選択肢どちらにおいても、３７℃で１時間にわたり反応させた。数回の洗浄段階の後、第１の選択肢にあっては、マーカーに対応する基質溶液を、検出反応を引き起こすために添加する。これは製造者の指示に従って行う。第２の選択肢においては、洗浄段階のあとに、抗体（ｃ）を添加する。反応それ自体および検出反応を引き起こすことは、対応した方法で行う。本発明に従った工程は感度が高い。抗体（ｃ）をさらに用いた場合は特に高い。さらに、本発明はすべての研究室において迅速に実行可能である。この目的のために特別な安全対策をとる必要はない。故に、本発明に従った工程は、比較的大量の試験を行うために特に好適である。本発明によれば、上記の工程を実行するのに適したキットもまた提供する。本キットは、担体物質に結合されたｈｄｍ−２および／または担体物質に結合したｈｄｍ− ２−ＡＫＢＲ断片および標識された抗体（ｂ）、さらに通常の洗浄バッファーおよび、必要に応じて標識化に応じた基質、または、担体物質に結合されたｈｄｍ−２および／または担体物質に結合したｈｄｍ− ２−ＡＫＢＲ断片および標識されていない抗体（ｂ）および標識された抗体（ｃ）、を含む。本発明による工程に関連して上でなされた記述は、キットの標識化成分、並びに他の成分へも適用する。図面の簡単な説明図１は、好適なｈｄｍ−２−ＡＫＢＲ断片のアミノ酸配列を示す。図２は、図１に列記されたｈｄｍ−２−ＡＫＢＲ断片のＤＮＡ配列を示す。本発明を実施例によって説明する。実施例１：ｈｄｍ−２−およびＨｉｓ−ｈｄｍ−２融合タンパク質の発現（Ａ）ｈｄｍ−２の発現ｈｄｍ−２のｃＤＮＡを細胞系統Ａ−２０４（前記を参照）より「ヘキサマーランダムプライマー」を用いて逆転写し、オリゴプライマー「Ｆｈｄｍ−２−Ｂ」および「Ｒｈｄｍ−２」を用いて通常のＰＣＲ法により増幅した（配列「Ｆｈｄｍ−２−Ｂ」：CGC GGA TCC ATG TGC AAT ACC AAC ATG TCT G;「ＲＨＤＭ２」:C GC GGA TCC TCA GGG GAA ATA AGT TAG CAC AAT C）。増幅した配列を公表されたデータ（ＥＭＢＬコロニーバンク）と比較し、両方のＰＣＲプライマー中の制限酵素サイトＢａｍＨＩによりクローン化し、それによって全長コード領域を細菌株ＨＭＳ１７４中のベクターｐｅｔ３ｄ内に得た。結果として生成されたベクターｐｅｔ９３／９で細菌株ＢＬ２１（前記を参照）を形質転換し、その結果ｈｄｍ−２を発現させた。１００μｇ／ｍｌのアンピシリンと３０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含むＬＢ培地中で、細菌を３７℃で光学密度０．６（６００ｎｍ）まで培養した後、２ｍＭのＩＰＴＧを用いてｈｄｍ−２の誘導を３０℃で３時間に亘り行った。（Ｂ）Ｈｉｓ−ｈｄｍ−２融合タンパク質の発現ｈｄｍ−２ｃＤＮＡを細胞系統Ａ−２０４（前記を参照）から逆転写し、オリゴプライマー「Ｆｈｄｍ−２−Ｂ」および「Ｒｈｄｍ−２」（前記を参照）を用いてＰＣＲによって増幅した。増幅した配列を両方のＰＣＲプライマー中のＢａｍＨＩ切断により、ＢａｍＨＩで開裂させた公知の発現ベクターｐＱＥ−８中にクローン化した。このＮ末端に６個のヒスチジンを付加されたｈｄｍ−タンパク質を、細菌株Ｅ，ｃｏｌｉＳＧ１３００９（Gottesmann,S．et al.，J．Bacte riol．148(1981),265-273を参照）内で発現させた。１００μｇ／ｍｌのアンピシリンと２５μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ培地中で、細菌を３７℃で光学密度０．６まで増殖させた後、１ｍＭのＩＰＴＧを用いて、Ｈｉｓ−ｈｄｍ− ２融合タンパク質の誘導を、３７℃で６時間に亘り行った。実施例２：ｈｄｍ−２およびＨｉｓ−ｈｄｍ−２融合タンパク質の単離と精製（Ａ）ｈｄｍ−２の単離と精製４００ｍｌの実施例１の細菌培養（Ａ）を、ｈｄｍ−２の誘導に続いて、５００ｇ、１０分間の遠心分離によって沈殿させ、１００ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ８．０中で洗浄し、再び遠心分離した。凍結および融解に続いて、沈殿を、１．６ｍｌの細胞溶解バッファー（１０％シュクロースを含む５０ｍＭトリス塩酸ｐＨ８．０）中に再懸濁した。リゾチーム（終濃度２ｍｇ／ｍｌ）および０．５ＭのＥＤＴＡ（終濃度５０ｍＭ）をそれらに連続的に添加した。氷上で２０分間保温した後、ＭｇＣｌ₂（終濃度８０ｍＭ）およびＤＮａｓｅｌ（２５０μｇ）を添加し、続いて１０分間室温で保温した（最終体積６．５ｍｌ）。それらに１０μｌの０．１ＭのＰＭＳＦを添加し、混合物を１００００ｇで４℃、１５分間遠心した。この遠心分離段階は、沈殿を再懸濁しＰＭＳＦ（０．１Ｍ、１０μｌ）を含む１Ｍ、３Ｍおよび７Ｍの尿素それぞれとともに１０分間保温した後で、３回繰り返した。最後の遠心分離段階の上清はさらに以下のように精製した。１０％ポリアクリルアミドゲルでゲル電気泳動後、所望のタンパク質バンドを切り出し、０．２Ｍグリシン、０．５％ＳＤＳを含む２５ｍＭのトリス−塩酸ｐＨ８．８中で４℃で一晩、一般に入手可能なバイオトラップ溶出チャンバー内で電気溶出し、純粋な形のｈｄｍ−２を得た。（Ｂ）Ｈｉｓ−ｈｄｍ−２融合タンパク質の単離と精製２５０ｍｌの実施例１の細菌培養（Ｂ）を、Ｈｉｓ−ｈｄｍ−２融合タンパク質の誘導の後に沈殿させ、４０ｍｌのＰＢＳ中で１回洗浄した。１ｇの細菌の沈殿それぞれを３ｍｌの溶液Ａ中で１分間超音波粉砕し、中程度の速度でマグネチック・スターラー上で８から１２時間に亘り室温で攪拌した。その結果得られた懸濁液を、１５，０００ｒｐｍで３０分間室温で沈殿させた。得られた上清の２から６ｍｌを、一般に知られているニッケルーキレートクロマトグラフィー用カラム（Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂）上においた。カラム材を前もってカラム容積の３倍量の溶液Ａ（下記を参照）で洗浄した。細菌抽出物を充てんした後、カラムを溶液ＡからＦで続けて洗浄し、すなわちカラム容積の２−３倍量の対応する溶液により、タンパク質がそれ以上溶出しなくなるまで洗浄した。集めた画分のタンパク含量は、２８０ｎｍでの消失測定により分光学的に決定した。１０．Ｄ．は約１ｍｇタンパク質／ｍｌに相当する。Ｈｉｓ−ｈｄｍ−２融合タンパク質は溶液ＤまたはＥで溶出した後の画分に、通常はごく少量の含まれている細菌タンパク部分とともに含まれていた。この部分を除くために、溶出させたタンパク質は必要に応じて、精製されるべきタンパク質の大部分により組み合された画分のｐＨ値をｐＨ８．０まで調製し、続いて、それをカラム上におくことにより、再度Ｎｉ −ＮＴＡ樹脂カラムに結合させた。続いて、上記のように、溶液ＡからＦを用いて溶出を行った。溶出させたＨｉｓ−ｈｄｍ−２融合タンパク質の純度と品質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより試験した。用いた溶液の組成：溶液Ａ：６Ｍ塩酸グアニジン，０．１ＭＮａＨ₂ＰＯ₄，１０ｍＭβ−メルカプトエタノール，０．０１Ｍトリス塩酸，ｐＨ８．０溶液Ｂ：８Ｍ尿素、０．１ＭＮａＨ₂ＰＯ₄０．０１Ｍトリス塩酸、ｐＨ８．０Ｃ：８Ｍ尿素、０．１ＭＮａＨ₂ＰＯ₄０．０１Ｍトリス塩酸、ｐＨ６．３Ｄ：８Ｍ尿素、０．１ＭＮａＨ₂ＰＯ₄０．０１Ｍトリス塩酸、ｐＨ５．９Ｅ：８Ｍ尿素、０．１ＭＮａＨ₂ＰＯ₄０．０１Ｍトリス塩酸、ｐＨ４．５Ｆ：８Ｍ尿素、６Ｍ塩酸グアニジン、０．２Ｍ酢酸上記（Ｂ）の工程は、発現させたタンパク質の非常に迅速で有効な精製により際だっている。実施例３：ｈｄｍ−２ＡＫＢＲおよびＨｉｓ−ｈｄｍ−２−ＡＫＢＲ断片の作成（Ａ）ｈｄｍ−２−ＡＫＢＲ断片の作成細胞系統Ａ−２０４（前記を参照）から得られたｃＤＮＡの、２つのオーバーラップしているＤＮＡ配列を、オリゴマーペア「Ｆｈｄｍ２−Ｂ」／「Ｒｈｄｍ２−２８４」および「Ｆｈｄｍ２−５８」／「Ｒｈｄｍ２−２８４」により、通常のＰＣＲ法に従って増幅した。ひとつのＤＮＡ配列はｈｄｍ−２断片のアミノ酸１−２８４をコードし、一方他方はｈｄｍ−２断片のアミノ酸５８−２８４をコードしていた。用いたオリゴマプライマーの配列は以下のものである。増幅した配列を公表されたデータ（ＥＭＢＬコロニーバンク）と比較し、ＢａｍＨＩ制限酵素サイトによりベクターｐｅｔ３ｄ（前記を参照）中にクローン化した。配列は、形質転換およびＩＰＴＧ誘導の後で細菌株ＢＬ２１（前記を参照）中で発現させた。発現させた配列（ｈｄｍ−２断片）を実施例２（Ａ）でｈｄｍ−２について記述されているように単離し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、続いてｈｄｍ−２断片の結合のために一般に入手可能なｈｄｍ−２−特異的抗体を用いた通常のウエスタンブロット分析を行った。この抗体は両方のオーバーラップしているｈｄｍ−２断片に対して結合を示した。このオーバーラップしている領域、すなわちアミノ酸５８−２８４は、抗体の結合領域と考えられた。（Ｂ）Ｈｉｓ−ｈｄｍ−２−ＡＫＢＲ断片の作成細胞系統Ａ−２０４（前記を参照）から得られたｃＤＮＡの、２つのオーバーラップしているＤＮＡ配列を、オリゴマーペア「Ｆｈｄｍ−２−Ｂ」／「Ｒｈｄｍ−２−２８４」および「Ｆｈｄｍ−２−５８」／「Ｒｈｄｍ−２−２８４」により、通常のＰＣＲ法に従って増幅した。増幅した配列を公表されたデータ（ＥＭＢＬコロニーバンク）と比較し、ＢａｍＨＩ制限酵素サイトによりベクターｐＱＥ−８（前記を参照）中にクローン化した。配列は、形質転換およびＩＰＴＧ誘導の後で細菌株Ｅ．ｃｏｌｉＳＧ１３００９（前記を参照）中で発現させた。発現させた配列（Ｈｉｓ−ｈｄｍ−２断片）を、実施例２（Ｂ）でＨｉｓ−ｈｄｍ−２融合タンパク質について記述されているのと同様に単離し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、続いてｈｄｍ−２断片の結合のために一般に入手可能なｈｄｍ−２−特異的抗体を用いた従来技術のウエスタンブロット分析を行った。この抗体は両方のオーバーラップしているｈｄｍ−２断片に対して結合を示した。（Ａ）において行われた通り、オーバーラップしている領域、すなわちアミノ酸５８−２８４は、抗体の結合領域と考えられた。実施例４：ｈｄｍ−２による患者の血清中のｈｄｍ−２抗体特異的検出ＥＬＩＳＡを実行するために、実施例２（Ｂ）のｈｄｍ−２を尿素バッファー（３Ｍ尿素、０．１ＭＮａＨ₂ＰＯ₄，ｐＨ８．０）中に取り込んだ。９６穴プレートをコーティングするために、一穴につき１００μｌずつをそれぞれ２０ｎｇおよび８ｇの抗原とともに、１回は対照としての１％ＢＳＡとともに吸い上げた。４℃で一晩保温した後、続いてＰＢＳで３回短く洗浄段階を行った。次に、ポリマー担体のフリーの結合サイトをＰＢＳ中の１％ＢＳＡと３７℃で１時間に亘り保温することによりブロックした。試験すべき、小細胞気管支ガンをわずらった患者の血清を、１：１００で希釈し（０．０５％のＴｗｅｅｎ２０，１％ＢＳＡを含むＰＢＳ）、３７℃で１時間に亘りプレート上で保温した（「チェスボード滴定」）。ＰＢＳ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）での８回の洗浄段階の後、一般に入手可能なペルオキシダーゼ結合抗ヒト抗体ヤギ抗体（製造者の指示に従って希釈）を添加した。３７℃で３０分間に亘り保温し、続いて８回洗浄段階を行い、続いてＴＭＢ発展溶液（５０ｍＭ酢酸ナトリウム、０．４ｍＭ３，３´，５，５´−テトラメチル−ベンジジン−ジヒドロクロライド、４．４ｍＭＨ₂Ｏ₂）と室温で３０分以内でペルキシダーゼ検出反応を行った。２ＭＨＣｌで反応を停止した後、４５０ｎｍで分光学的に色の強度を決定した。ＢＳＡ対照の２倍以上の吸収値を陽性反応と評価した。表は、イムノブロットによる特異的抗体の決定と比較して、対応して行われたＥＬＩＳＡのデータを示している。両方の工程がほとんど完全に一致していることは、抗−ｈｄｍ−２ＥＬＩＳＡが、臨床物質の一連の試験に好適な方法であることを証明している。さらに、ＥＬＩＳＡはイムノブロットよりも高い感度を示している。このことはＥＬＩＳＡの最初の試験方法としての好適さを強調している。この表はイムノブロットとＥＬＩＳＡの結果が同一であること、および、ＥＬＩＳＡが最初の試験方法として好適であることを示唆するＥＬＩＳＡのより鋭敏な感度を示している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ // Ｃ１２Ｎ 1/21 9637−4ＢＣ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｐ 21/02 9162−4ＢＣ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者クライン，ラルフドイツ連邦共和国ディー―68259 マンハイムアレマンネンストラーセ 26 (72)発明者フライ，マンフレッドドイツ連邦共和国ディー―68259 マンハイムアレマンネンストラーセ 45 (72)発明者マルテンス，レギーナドイツ連邦共和国ディー―68799 ライリンゲンレシングストラーセ 12

Claims

【特許請求の範囲】１．体液中のｈｄｍ−２−特異的抗体の検出方法であって、担体部材に結合されたｈｄｍ−２および／またはｈｄｍ−２−特異的抗体結合部分を含む、担体部材に結合されたその断片を体液とともに保温し、ｈｄｍ−２および／またはその断片と結合した特異的抗体（ａ）を、 −抗体（ａ）を標的とした標識された抗体（ｂ）と反応できる状態にするか、または、 −標識されていない抗体（ｂ）と反応させ、後者を抗体（ｂ）を標的とした標識された抗体（ｃ）と反応できる状態にする。ことを特徴とする方法。２．前記体液が、血清、リンパ液、唾液、および尿並びに固体組織および腫瘍から得られる液を含むことを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。３．前記ｈｄｍ−２がｃＤＮＡ配列の発現によって得られることを特徴とする請求の範囲第１項または第２項記載の方法。４．前記ｈｄｍ−２断片がｈｄｍ−２のアミノ酸１−２８４、５８−２８４、５８−４９１を含むこととを特徴とする請求の範囲第１項または第２項記載の方法。５．前記担体部材がマイクロタイタープレート、スモールチューブまたはパイプ、マイクロスフェアーおよびスライドを含むことを特徴とする請求の範囲第１項ないし第４項いずれか１項記載の方法。６．第１の選択肢において抗体（ｂ）が酵素により標識されており、第２の選択肢において抗体（ｃ）がそれにより標識されていることを特徴とする請求の範囲第１項ないし第５項いずれか１項記載の方法。７．第１の選択肢において抗体（ｂ）が蛍光染料により標識されており、第２の選択肢において抗体（ｃ）がそれにより標識されていることを特徴とする請求の範囲第１項ないし第５項いずれか記載の方法。８．第１の選択肢において抗体（ｂ）が放射性により標識されており、第２の選択肢において抗体（ｃ）が放射性により標識されていることを特徴とする請求の範囲第１項ないし第５項いずれか記載の方法。９．担体部材と結合されたｈｄｍ−２および／またはｈｄｍ−２特異的抗体結合領域を含む、担体部材と結合されたその断片、および請求の範囲第１項の標識された抗体（ｂ）、並びに従来の洗浄バッファー、必要に応じて標識に対応する基質、または担体部材と結合されたｈｄｍ−２および／またはｈｄｍ−２特異的抗体結合領域を含む、担体部材と結合されたその断片、および請求の範囲第１項による、標識されていない抗体（ｂ）および標識された抗体（ｃ）、並びに従来の洗浄バッファー、必要に応じて標識に対応する基質、を含むキット。 10．ｈｄｍ−２−特異的抗体に対する結合領域を有するｈｄｍ−２断片。 11．ｈｄｍ−２のアミノ酸１−２８４，５８−２８４，および５８−４９１を含むことを特徴とする請求の範囲第10項記載の断片。 12．請求の範囲第10項記載の断片のＤＮＡ配列。 13．請求の範囲第11項記載の断片のＤＮＡ配列。 14．ｈｄｍ−２−特異的抗体に対する結合領域を有するｈｄｍ−２断片の製造工程であって、断片を常法により構築しｈｄｍ−２の全長にわたり配分し、少なくとも２つの断片がそれぞれオーバーラップしている領域を有し、該断片をｈｄｍ −２−特異的抗体と反応させ、前記抗体と結合されたオーバーラップしている領域を同定し、最初に決定された断片として常法により提供し、１回または複数回サイクルを繰り返すための基礎として後者を必要に応じて用いることを特徴とする工程。