JPH07507682A

JPH07507682A - Ｌプロテインに由来する免疫グロブリン結合性タンパク質およびその用途

Info

Publication number: JPH07507682A
Application number: JP5519106A
Authority: JP
Inventors: アングス・ロバート・トロウァン; アントニー・アトキンソン; ジョナサン・ポール・マーフィー; クライブ・ジェイムス・ダグリビー; オリバー・サイモン・ロレンス
Original assignee: アクティノバ・リミテッド
Priority date: 1992-05-07
Filing date: 1993-05-07
Publication date: 1995-08-31
Also published as: CA2135208C; ATE198768T1; DE69329877D1; DE69329877T2; CA2135208A1; DK0640135T3; AU4270293A; EP0640135B1; WO1993022439A1; AU672794B2; US6162903A; EP0640135A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】Ｌプロティンに由来する免疫グロブリン結合性タンパク質およびその用途この発明は、新規な免疫グロブリン結合性タンパク質、その製造法、およびそれをコードする組換えＤＮＡ分子に関する。

さらに詳しくは、本発明は、プロティンＬの選択された結合性領域に由来する繰り返し配列を含有する合成タンパク質およびそれをコードする組換えＤＮＡ分子に関する。

Ｈ鎖との相互作用により哺乳動物の免疫グロブリンと親和性のある表面タンパク質を発現する多数のグラム陽性細菌種が単離されている。これら免疫グロブリン結合性タンパク質のうちで最もよく知られているのは、タイプ１スタフイロコツカスプロテインＡおよびタイプ２ストレプトコツカスプロテインＧであり、これらはヒト免疫グロブリンのＦｃ領域上の主としてＣ２−Ｃ５境界と相互作用することが示されている。加えて、両プロティンはＦａｂ領域とも弱い相互作用をすることが示されているが、その場合も免疫グロブリンのＨ鎖によるものである。

最近、ペブトコッカス・マグヌス（Ｐ　ｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　＋＊ａｇｎｕｓ）からの新規タンパク質であるプロティンＬが報告されたが、このタンパク質は、ヒト、ウサギ、ブタ、マウスおよびラットの免疫グロブリンにＬ鎖との相互作用によってのみ結合することがわかった。ヒトにおいては、この相互作用はカッパ鎖としか起こらないことが示されている。カッパおよびラムダの両り鎖は異なるクラスに共通に存在するので、プロティンＬはすべてのヒトクラス、とりわけ多サブユニット形態の１２Ｍと強く結合し、同様に、プロティンＬＬ鎖結合を示す種におけるすべてのクラスに結合することが予想されている。

ペプトコッカスおよびペプトストレブトコッカス（ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）の両者とも、ヒト免疫グロブリンのカッパＬ鎖に結合するプロティンＬを産生ずることが報告されている。プロティンＬはビルレンス因子であることが提唱されている；ビルレンスでないベブトコッカスおよびベブトストレプトコッカスは、プロティンＬを発現もしないし、その構造遺伝子を有することもないと思われる（カスターン（Ｋａｓｔｅｒｎ）ら、１９９０）。

プロティンＬは、免疫グロブリンのすべてのクラスおよびサブクラスに存在するカッパし鎖に結合することが報告されているので、特に興味がもたれる。そのようなものとして、プロティンＬはＥＬＩＳＡおよびＲＩＡ法に使用できる有用な診断試薬であるに違いない。

ＥＰ−Ａ−０２５５４９７には、標準タンパク質精製法によるプロティンＬの精製および特徴付けの試みが記載されている。その後、ＥＰ−Ａ−０２５５４９７の著者らは、プロティンＬの性質および構造をさらに探求する多くの科学論文を発表しているが、現在のところ、該タンパク質を完全に特徴付けることは失敗に終わっている。それゆえ、最近、カスターン（Ｗ、　Ｋａｓｔｅｒｎ）らによる「プロティンＬ細菌の免疫グロブリン−結合性タンパク質および可能なビルレンス決定因子」と題する論文（Ｉ　ｎｆｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｉ　＋ｕ＋ｕｎｉｔｙ、　１９９０年５月、１２１７〜１２２２頁）において、プロティンＬのトリプシン断片のＮ−末端アミノ酸配列を決定し得られた配列情報を用いて該遺伝子を単離するためのプローブを構築することによるプロティンＬをコードする遺伝子を単離する試みが失敗に終わったことが記載されている。プロティンＬは免疫グロブリン結合特性のために有用ではあるが、プロティンＬの特定の領域が免疫グロブリン結合性に寄与しているかどうかを同定し、これら特定の領域を、合成し改良した免疫グロブリン結合性分子の構築の基礎として用いることができるようになることが望まれる。配列情報が得られていないため、免疫グロブリンカッパし鎖との複合体生成に関与する配列を同定することはこれまで可能ではなかった。

現在までのところ、プロティンＬの遺伝子を単離および特徴付ける問題は解決されておらず、そのためプロティンＬ製造の有意な改善が妨げられ、プロティンＬに由来する合成分子の開発が妨げられている。

この発明は、いまや単離されたプロティンＬをコードするｃＤＮＡ挿入物を完全に包含するｃＤＮＡ配列に基づいており、それゆえ上記問題を解決することができる。このｃＤＮＡ配列およびその最長の読み取り枠に対応するアミノ酸配列を図１に示しである。ノブナル配列の開始部はｒＳＳＪとしてマークされており、成熟タンパク質の開始部はｒＭＪとしてマークされている。図１に示す最長の読み取り枠の配列は、ＴＴＧ　（１０３）からＡＡＡ　（３１８３）までにわたっており、図示したＤＮＡは、非成熟プロティンＬをコードするヌクレオチド２０８からヌクレオチド３１８３にわたるコード領域を含む。

プロティンＣの特異的結合特性（免疫グロブリンのカッパし鎖に結合する能力を含む）は、該分子のアミノ酸配列内に認識し得るほどに繰り返された特徴を有する配列の存在によるものと思われる。

本明細書において用いる「認識し得るほどに繰り返された特徴」なる語は、アミノ酸配列が、それぞれ長さが２０〜４５アミノ酸（Ｄ繰り返しの場合には長さが４０〜９０アミノ酸）の少なくとも２つの配列からなり、これら配列が互いに少なくとも７５％、好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少な（とも９５％の相同性を有することを意味する。

図１に示すポリペプチド配列には種々の組の繰り返し配列が含まれ、そのうち少なくとも２つが免疫グロブリンカッパＬ鎖結合に関与していると思われる。

これら組の繰り返し配列は、そのＮ−末端にて以下のように分類される。

（１）ＡＩ、Ａ２およびＡ３；（２）ＢｌおよびＢ２；（３）Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３およびＣ４；（４）Ｚｌ、Ｚ２、Ｚ３およびＺ４：（５）Ｄｉ、Ｂ２、Ｂ３およびＢ４；これら各繰り返し配列（１）〜（４）は、２５〜４５アミノ酸の長さを有する。

カッパし鎖に結合する能力は、繰り返し配列Ａ、Ｂ、ＣおよびＺ（上記（１）〜（４））の１または２以上と関連すると思われる。

それゆえ、図１においてそのＮ−末端にてＡ１、Ａ２およびＡ３；ＢｌおよびＢ２；Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３およびＣ４：およびＺｌ、Ｚ２、ｚ３およびＺ４として分類される配列から選択される複数の認識し得るほどに繰り返された結合性ドメインからなる合成免疫グロブリン結合性分子を提供することが本発明の第一の側面の特徴である。該合成免疫グロブリン結合性分子は、該ドメインを２〜１５含むのが好ましい。これら選択された１または２以上のドメインは、図ＩＩこおＬｌてそのＮ−末端にてＡ１、Ａ２およびＡ３：Ｂ１およびＢ２；Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３およびＣ４；およびＺｌ、Ｚ２、Ｚ３およびＺ４として分類される配列と同一であるか、またはこれら配列と少なくとも７５％、好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の相同性を有することを条件として該配列から変化してよい。

そのＮ−末端にてＤｌ、Ｂ２、Ｂ３およびＢ４として分類された配列は、アルブミン結合性に関与していると思われ、本発明によって提供される合成結合性分子には、配列Ｄ１、Ｂ２、Ｂ３およびＢ４、またはこれら配列と少なくとも７５％、好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少な（とも９５％の相同性を有することを条件として該配列から変化した関連配列が含まれる。

以下に記載する本発明の一つの態様において、ドメインＣ１とＺｌおよび／またはＣ２とＺ２および／またはＣ３とＺ３および／またはＣ４とＺ４が１また１＝２以上の結合性領域として存在する合成免疫グロブ１ル結合性分子が提供される。

領域ＣＩＺ１はＣ１の第一のアミノ酸から始まり、ｚｌの最後のアミノ酸で終わる、等。

本発明の別の態様によれば、合成免疫グロブリン結合性分子は、下記から独立に選ばれる１または２以上の免疫グロブリン結合性領域を含む：（１）プロティンＬの領域Ｃ１ｚ１、（２）プロティンＬの領域Ｃ２Ｚ２、（３）プロティンＬの領域Ｃ３Ｚ３、（４）プロティンＬの領域Ｃ４Ｚ４、および（５）領域（１）、（２）、（３）または（４）の一つと少なくとも７５％の相同性を有し、該領域の免疫グロブ１ル結合活性を実質的に保持してＮるポリペプチド配列。

上記合成分子は、（１）プロティンＬのアルブミン結合活性および（２）プロティンＬの細胞壁結合活性、のうち１または両方を実質的に有しなし１の力（好ましい。

図に示す配列データは、プロティンＬの領域ＣＩＺ１、Ｃ２Ｚ２、Ｃ３Ｚ３およびＣ４’　Ｚ　４がそれぞれ長さが７１．７１．７４および７５アミノ酸残基であることを示している。本発明におけるこれら領域への言及は、これら正確な配列の変異体をも包含することを意図するものである。そのような一つの変異体は、該正確な配列の免疫グロブリン結合活性を実質的に保持し、１０まで、好ましくは５まで、非常に好ましくはわずかに２のアミノ酸が置換され、付加され、または欠失している。

他の変異体は、該正確な配列の免疫グロブリン結合活性を実質的に保持しながら、ＣＩＺｌ、Ｃ２Ｚ２、Ｃ３Ｚ３およびＣ４Ｚ４配列の一つと７５％またはそれ以上、好ましくは９０％またはそれ以上の程度の相同性を示す。

本発明の一つの態様において、上記合成分子の結合性領域を互いに直接ライゲートさせる。他の態様においては、リンカ−ポリペプチドによって結合性領域を互いに分離させ、各リンカ−の性質は該結合性ドメインの結合活性を妨害しないようなものである。リンカ−ポリペプチドは、存在する場合には、好ましくは長さが１０までのアミノ酸、最も好ましくは長さが５までのアミノ酸である。

本発明は多数の結合性領域を有する合成分子を包含するものであるが、合成分子はそのような領域を１〜４有するのが都合がよい。

本発明の好ましい態様において、合成分子はそのような領域を４つ有する。該４つの領域のそれぞれについて特定のＣ，Ｚ、ｔたはＣ，Ｚ、由来変異体配列を選択することは任意である。それゆえ、本発明の合成分子は、Ｃ，Ｚ、およびＣ− Ｚ・由来変異体配列の多数の可能な組み合わせを包含するものである。

本発明の特定の態様において、合成分子は４つの結合性領域を有し、各領域はＣＩＺｌまたはその変異体、Ｃ２Ｚ２またはその変異体、Ｃ３Ｚ３またはその変異体およびＣ４Ｚ４またはその変異体から選ばれる。そのような態様の例示は図２に示してあり、天然プロティンＬとして免疫グロブリンに結合するが天然プロティンＬとしてアルブミンまたは細胞壁には結合しない。

本発明の合成分子は、タンパク質分析、精製手順および当該技術分野でよく知られた方法に従った他の生化学的手順に使用する生成物を生成するのに都合よく用いることができる。

合成免疫グロブリン結合性分子は、たとえば、酵素結合抗体免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）に適するように酵素などの「レポーター」分子にライゲートさせることができる。他の例示において、「レポーター」分子は化学発光アッセイにおいて使用するのに適している。

本発明の合成分子はさらに、固体支持体に付着させるのに適した分子、たとえば、固体マトリックス上の他のシスティン残基に付着させるためのシスティン残基、または支持体上の亜鉛に付着させるためのヒスチジン、またはガラスを含む広範囲の表面に付着させるためのイガイ（■ｕｓｓｅｌ）由来粘着性タンパク質にライゲートすることができる。

それゆえ、本発明は、広範囲の生化学的応用において有用な新規合成免疫グロブリン結合性分子を提供する。これら合成分子は、領域Ｄ１、Ｂ２、Ｂ３およびＢ４を有せず、その結果、天然のプロティンＬのアルブミン結合性および細胞壁結合性を示さない場合は特に有利である。本発明の合成分子は、タンパク質分析、精製手順および当該技術分野でよく知られた方法に従った他の生化学的手順に使用する生成物を生成するのに都合よく用いることができる。

本発明の第二の側面によれば、本発明の第一の側面のいずれかの態様による合成分子をコードする挿入物を含有する組換えＤＮＡ分子を提供する。

本発明の第二の側面の一つの態様のヌクレオチド配列を図２に示す。

所望のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列が得られたら、該ポリペプチドを発現するように宿主細胞を形質転換し得るベクターを構築することは当業者にとって簡単なことである。

それゆえ、本発明の第三の側面に従って、本発明の第一の側面の合成分子の製造方法が提供され、該方法は、（ａ）該合成分子を発現できるように、宿主細胞を形質転換し得る発現ベクターで該宿主細胞を形質転換し、（ｂ）該形質転換した宿主細胞を培養し、ついで（ｃ）該合成分子を単離する工程からなる。

そのような一つの発現ベクターは以下に記載するｐＰＰＬ２であり、これは受託番号４０５３４にて１９９２年１２月２２日にＮ（ｊＭＢ（アバーディーン、スコツトランド、英国）に寄託しである。

つぎに本発明の例示的呼様を記載する。

図１は、プロティンＬをコードする遺伝子のヌクレオチド配列および該配列によってコードされるアミノ酸配列を示す。

図２は、本発明の一つの態様のヌクレオチド配列および該配列によってコードされるアミノ酸配列を示す。

図３は、２つの異なるプロティンＬ単離物および別々の結合性ドメインの機能を決定するために構築した欠失クローンの模式図を示す。

図３は、１　（ａ）カスター：／　（Ｋｇｓｔｅｒｎ）ら［Ｉ　ｎｆｅｃｔ、　Ｉ　ｍｍｕｎｏｌ、、５８．１９９２］によって決定されたドメイン構造、および（ｂ）マーフィー（Ｍｕｒｐｈｙ）ら［Ｅ　ｕｒ、　Ｊ　、　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、　１６訳１９９２］によって決定されたドメイン構造を示す。これら２つの図の間の斜線を施した部分は強い相同性の領域を示す。両分子について報告されている免疫グロブリン−カッパ結合性に関与するドメインおよび１　（ｂ）について報告されているアルブミン−結合性に関与するドメインを決定するため、欠失クローン（１，（ｂ）を発現する遺伝子から構築）を２．　（ａ。

Ｘ−Ｏｍａｔ　Ｓ　Ｘ−ｒａｙフィルムはコダックから得た。ＤＮＡリガーゼ、制限エンドヌクレアーゼおよび他のＤＮＡ−修飾酵素はベーリンガーから得た。

アガロース、アクリルアミド、ビスアクリルアミドおよびフェノールはベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズから得た。クロマトグラフィー媒体はファルマンアーＬＫＢ　（ウプサラ、スウェーデン）から得た。すべての免疫グロブリンおよび血清アルブミンはシグマから得た。他の試薬はすべてシグマまたはＢＤＨから得た。

タンク９６ウエルマイクロタイタープレートはギブコＢＲＬから購入した。

培地および培養条件大腸菌ＴＧＩを２ＸＹＴブロース（２％（ｗ／ｖ）　トリプトン７１％（Ｗ／Ｖ）酵母エキス／１％（ｗ／ｖ）ＮａＣ１）中、３７℃で一夜培養した。培地を２％（Ｗ／Ｖ）バクトーアガ−（ジフコ）で固化した。必要な場合は、形質転換体の選択および増殖のためにアンピノリン（５０μｇ／ｍｌ）を用いた。機能性β −ガラクトシダーゼの検出を、クロルインドリル−β−Ｄ−ガラクトシドを最終濃度６００μｇ／ｍｌで添加することにより、および必要な場合にはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドを最終濃度２００μｇ／ｍｌで添加することプラスミドＤＮＡの精製を、大腸菌からブリジ溶解（クルーウェル（Ｃ１ｅｖｅｌｌ）およびヘルシンキ（Ｈｅｌｓｉｎｋｉ）　、ＰＮＡＳ、米国、１９６９）およびＣｓＣ１／エチジウムブロマイド密度勾配遠心分離（ラドロフ（Ｒａｄｌｏｆｆ）ら、ＰＮＡＳ、米国、１９６７）により行った。

遺伝子操作手順ＤＮＡ修飾酵素を緩衝液中および供給者（ベーリンガー）の推奨する条件下で使用した。大腸菌の形質転換を本質的に以前に記載のようにして行った（コーエン（Ｃｏｈｅｎ）ら、ＰＮＡＳ、米国１９７２）　。ＤＮＡ断片の電気泳動を、トリス−酢酸緩衝ｌ＆（４０ｍＭ−トリス／２０ｍＭ−酢酸ナトリウム／２ｍＭ− ＥＤＴＡ、酢酸でｐＨ７，９に調整）中、垂直１％（ｗ／ｖ）−アガローススラブゲル上で行った。ＤＮＡ断片のサイズを、前以て制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩＩ［で消化したラムダファージＤＮＡの断片と比較することにより評価した。ＤＮＡ断片の精製を、本質的に以前に記載のようにして電気溶出（ｅｌｅｃｔｒｏｅｌｕｔｉｏｎ）により行った（マクドネル（ＭｃＤｏｎｎｅｌｌ）ら、Ｊ　、　Ｍｏｌ。

Ｂｉｏｌ、、１００．１９７７）。

欠失クローンの構築構築した欠失クローンの模式図を図３に示す。

Ａ、Ｂ、ＣおよびＺ繰り返しを単離するｐＰＰＬｌの構築を、図３（２ａ）に示すＤＮＡ断片を増幅することにより行った。発現を容易にするため、Ｎｄｅ１部位（ＣＡＴ　ＡＴＧ）をセンスプライマー中に導入しく５°−ＴＴＡ　ＡＡＴＣＡＴ　ＡＴＧ　ＴＣＡ　ＧＡＡ　ＡＣＡ−３°）、最後まで読み通すのを防ぐために停止コドンをアンチセンスプライマー中に導入した（５’　−ＣＣＴＧＧ　ＴＴＧＴＴＡ　ＴＴＴ　ＴＣＣＡＧＣＡＡＡ　Ｔ−３°）。この断片をＴＡクローニングベクター（アマーンヤム）中にクローニングし、引き続きＮｄｅｌ一部分Ｈｉｎｄ１［１（ＴＡクローニングベクターのポリリンカー中に存在するＨｉｎｄｌｌｒ部位で開裂）断片上に切り出し、Ｎｄｅｌ−Ｈｉｎｄｍ開裂した発現ベクターｐＭＴＬ１０１３（ブレーム（Ｂ　ｒｅｈｍ）ら、Ａｐｐｌ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｂ　１ｔｅｃｈｎｏ１．　、３６．１９９１）中にインフレームて再クローニングした。

ＣおよびＺ繰り返シノミヲ発現するｐＰＰＬ２は、ｐＰＰＬｌからＥＣ０Ｒｖ− ３ｐｅｌ　（ＴＡクローニングベクターのポリリンカーからもたらされた部位）消化により図３　（２ｂ）に示す遺伝子断片を切り出し、ついでＳｍａｌ−Ｘａｂ１開裂したｐＭＴＬ１０１３中にインフレームで再クローニングすることにより得た。

ＤおよびＥ繰り返しを発現するｐＰＰＬ３　（図３（２ｃ））は、Ｐｓｔｌ（ＰＰＬ読み取り枠の上流に位置する）一部分Ｈ４ｎｄＩ［Ｉ消化し、ついでＨｉｎｄｎＩ−Ｐｓｔｌ開裂したｐＭＴＬ２３　（チェンバーズ（ＣｈａＩＩＩｂｅｒｓ）ら、Ｇｅｎｅ、６８．１９８８）中にインフレームでクローニングすることにより得た。

旦９旦ＰＰＬ遺伝子の標的部位のいずれかの側でオリゴヌクレオチドを合成（ホスホルアミダイトを用いたアブライドバイオンステムズモデル３８０Ａ　ＤＮＡ合成機を用いた固相合成により合成）することによってＰＣＲを行い、ＰＣＲ−ノ＜− キングエルマーンータスジーンアンプ（ＰＣＲ−Ｐｅｒｋｉｎｇ　ＥＬｗｅｒ　Ｃｅｔｕｓ　ＧｅｎｅＡｍｐ）　”キットにおいて提供される方法および試薬を用いて複製連鎖反応を行うことによりＤＮＡ断片を生成させた。

細胞の超音波処理細胞懸濁液をＭＳＥＭｉ音波管に移し、超音波処理に供した（ＭＥＳソニプレノブ１５０ソニケータ−（ＭＳ　Ｅ　５ｏｎｉｐｒｅｐ　１５０　５ｏｎｉｃａｔｏｒ）を用い、４℃にて３０秒間隔で１８ＭＨｚで３×３０秒バースト）。

ＩｇＧ−セファロース４Ｂ上のアフィニティークロマトグラフィー超音波処理を用い、ＩｇＧ−セファロースＦＦ上のアフィニティークロマトグラフィーによる免疫グロブリン結合性タンパク質の小スケール精製のために細菌細胞を破砕した。培養液（３００ｍｌ）を−夜増殖させ、ついで遠心分離にかけ（４℃、１５０００ｇで１０分間）、１００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７，５，２５０ｍＭ　ＮａＣｌ　（３ｍｌ）中に再懸濁した。この懸濁液を超音波処理し、遠心分離にかけ（４℃、３００００ｇで１０分間）、上澄み液を、１００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７，５，２５０ｍＭ　ＮａＣｌ　（５ｍｌ）で平衡化し洗浄するＩｇＧ− セファ０−スＦＦの１ｍｌカラム（１，６ｃｍｘ０．９０ｃｍ内径）に通した。

１００ｍＭグリ／ンーＨＣｌ、ｐＨ２，０でタンパク質を溶出し、ＩＭＦリス、ｐＨ８，０を用いてｐＨを７５に上げた。

ＡＧＥ試料を還元条件下で可溶化し、５ＤＳ−ポリアクリルアミドスラブゲル上で電気泳動にかけた。レムリの方法を用い（レムリ、Ｎａｔｕｒｅ、　２２７．１９７０）、ＬＫＢ垂直電気泳動ユニット中でアクリルアミド（１２，５％、Ｗ　／　Ｖ　）スラブゲルを処理した。タンパク質をクマンーブリリアントブルーＲ−２５０で染色し、タンパク質のバンドをクロモスキャン−３（Ｃｈｒｏａ＋ｏｓｃａｎ−３）レーザー光学密度計（ジョイスーレープル（Ｊ　ｏｙｃｅ　−Ｌｏｅｂｌ）　、ゲーツヘッド、タインアンドウイア、英国）で走査して見かけのＭ、を評価した。

ＥＬＩＳＡ検出アッセイ以前に記載されたものとは修飾したＥＬＩＳＡ法を用い（ウオレンズ（Ｗａｒｅｎｅｓ）ら、Ｊ　、　Ｉ　ｍｌ１ｕｎｏ１．　Ｍｅｔｈｏｄｓ、、９３．１９８７）、免疫グロブリン結合性タンパク質を検出した。

免疫グロブリン結合性の検出５ＱｍＭ炭酸ナトリウム／重炭酸緩衝液（ｐＨ９，６）中のマウスＩｇＧ（１００μ１）（２，５μｇ／ｍｌ）のアリコートをマキノソープ（Ｍａｘｉｓｏｒｐ）プレートの各ウェルに加え、４℃にて一夜放置しこ。０．０５％（Ｖ／Ｖ）ツイーン２０を含有するＰＢＳＴ−リン酸緩衝食塩水で３回洗浄した後、組換え細菌の懸ｆＭの１００μｍのアリコートを一夜培養液からマキ／ソーブプレートに移した。ついで、イムノアッセイプレートを室温にて一夜放置した。ＰＢＳＴで洗浄した後、ＰＢＳＴ中のヒトＩｇＧ　（１００μ１）（ｌμｇ／ｍｌ）を各ウェルに加え、プレートを室温でさらに１時間放置した。さらに洗浄した後、ヤギ抗ヒ）ＩｇＧ（Ｆｃ特異的）西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体（ＰＢＳＴ中に１゜２０００に希釈）（１００μｍ）を各ウェルに加え、プレートを室温にてさらに１時間放置した。さらに洗浄した後、試薬（０１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６，０中の６０μｇ／ｍ１　３．３’、５．５’−テトラメチルベンジンニ塩酸塩、０００３％（ｙ／ｖ）過酸化水素）（１００μｌ）を各ウェルに加え、室温にて１０分間反応させた。この後、１１％（Ｖ／Ｖ）硫酸（５０μｌ）を各ウェルに加えて反応を停止させた。ついで、試薬ブランクに対してウェルの吸光度を４５０ｎｍにて読み取り、免疫グロブリン結合体タンパク質のレベルを測定した。

アルブミン結合性の検出アルブミン結合性を検出するため、サンドイッチの各工程において異なるアフィニティー試薬を用いた他は上記手順を繰り返した。第一の工程で、調べようとするタンパク質試料（超音波処理後に細胞上澄み液を回収することにより調製）をマキ／ソーブプレートに結合させた。ついで、プレートをヒト血清アルブミン（Ｈ３Ａ、１ａｇ／ｍｌ）とともにインキュベートし、ついでヤギ抗Ｈ５ＡＩｇＧ −西洋ワサビペルオキシダーゼ結合性（１：２０００希釈）を加えついで上記のようにして発色させることによりアルブミン結合性を検出した。

以下の結果が得られたｐＰＰＬｌおよびｐＰＰＬ２　（図２　（２ａ、ｂ）　）は、アルブミン結合性は示さずＩｇＧに結合することがＥＬ　Ｉ　ＳＡにより示された。対照的にｐＰＰＬ３　（図２　（２ｃ））はＨ３Ａには結合したがＩｇＧには結合しなかった。このことは、カッパ結合性はＣおよびＺ繰り返しが関与して起こったこと、およびアルブミン結合性はＤまたはＥ繰り返しに位置する別の部位で起こったことを示している。

本発明による合成免疫グロブリン結合性分子の精製溶液は、以下の方法を用いて得ることができる。

ｐＰＰＬ２で形質転換した宿生細胞を、たとえば４００１〜４０００１発酵槽中で増殖させる。ついで、発酵槽から細胞培養液を取り出し、遠心分離にかけて細胞ペーストを得、上澄み細胞培養液は廃棄する。

上記細胞ペーストをリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６，５）中で洗浄し、リゾチームを加えて細胞をたとえば３０〜６０分間の適当な期間溶解する。

つぎに、溶解した細胞を７０℃で１５分間加熱し、ついで１３０００ｒｐｍで２時間遠心分離にかけ、可溶性の粗製のタンパク質を得、これを遠心分離したベレットから除去し、−２０℃で貯蔵することができる。

合成分子の試料を得るため、貯蔵品から解凍したかまたは遠心分離から直接得た粗製のタンパク質を、リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６，５）で前置て平衡化したＱ−セファロースカラムで溶出する。カラムに加える前に、緩衝液と同じイオン強度となるように粗製タンパク質の溶液を希釈する。

タンパク質が洗い出されなくなるまでカラムを緩衝液で洗浄し、ついで５ＱｍＭＮａＣＩ溶液で洗浄してカラムに弱く結合しているタンパク質を除去する。ついで、カラムを溶出するのに用いたＮａＣｌ溶液の強度を段階的に増加させ、得られたタンパク質フラクンコンを別々に保持する。

本発明の合成タンパク質分子は、２７０〜２９０ｍＭのＮａＣ１で溶出するときに得られる。

上記で得られる例示のように、本発明の合成タンパク質分子は、免疫グロブリンのカッパし鎖への結合能のためバイオアッセイおよび他の生化学的応用にお（１て有利に用いることができる。本発明の合成タンパク質分子は、たとえば、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、診断、抗体精製に使用できる。

本出願が優先権を主張するＧＢ９２０９８０４．５の図１を本出願でも図１として用いたが、以下に示すように命名が異なる。

ＧＢ９２０９８０４．５　本出願Ａ１、Ａ２、Ａ３　Ａｌ、Ａ２、Ａ３Ｂ１．８２　Ｂｌ、Ｂ２Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４Ｄ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４　Ｚｌ、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４Ｅ１、Ｆｌ　＊ＤＩＥ２、Ｆ２　＊Ｄ２Ｅ３、Ｆ３　＊Ｄ３Ｅ４、Ｆ４　＊Ｄ４この出願は、第二の優先権出願であるＧＢ９２２６９２８．１と同じ命名を用いている。

＊ここでＤｌとしてマークされる配列は、本来Ｅ１としてマークされる配列と本来Ｆ１としてマークされる配列とからなる、等。

ＧＡＡ　丁丁丁　ＧＡＴ　丁ＴＡ　ＡＡＴ　ＡＧＣＡＴＴ　八人Ａ　ＴＧＣＡＡＡ　八人Ａ　丁丁丁　ＡＡＡ　ＡＧＣＡＧＧ　ＡＧＡ　１６Q ＡＡＧ　ＡＴＴ　ＡＡＴ　ＭＧ　ＡＡＡ　ＴＴＡ　ＴＴＡ　ＡＴＣＧＯＴ　ＣＣＡ　ＣＴｒ　ＧＣＡ　ＬＡＡ　ＧＣＡ　ＡＴＴ　ＯＴＡ　２T８ＡＡＴ　ＡＡＣＣ丁τ　ＴＣＡ　ＡＴＣＧＡＴ　ＧＡＡ　Ａ’Ｍ　Ａ０丁　ＧＡＴ　ＯＣＴ　７１丁　丁丁？　ＧＡＴ　ＴＡＴ　ＣＡＣ！５S ＧＡＴ　ＴＣＡ　ＧＣＴ　ＡＣＴ　ＡＣＴ　ＡＴＴ　入ＡＴ　ＧＣＡ　ＡＴＣＡＡＴ　ＧＡＧ　ＡＴＣＧＴＡ　ＧＣＡ　ＡＧＡ　ＧＣＡ　７RＢ丁τＡ　ＡＴＣＡＡＴ　ＡＡＡ　ＧＣＡ　ＡＡＡ　ＡＣＡ　ＧＴＴ　ＧＡＡ　ＧＧＣＧＴＡ　ＧＭ　ＧＣＡ　ＴＴＡ　ＡＡＧ　ＭＣ１９８６ＡＡＣＴＴ’Ａ　ＡＴＣＴττ　ＧＣＡ　ＧＡＴ　ＧＧＡ　ＡＡＧ　ＡＴＡ　（：ＡＡ　ＡＣＡ　ＧＣＡ　ＧＡＡ　ＴＴＣＡＡＡ　ＧＧｋ　T２ＢＦＩＯ，２ｃｏｓｒｔｓｗＤ補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）平成６年１１月７日階ン

Claims

【特許請求の範囲】１．図１中でそのＮ−末端にてＡ１、Ａ２およびＡ３；Ｂ１およびＢ２：Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３およびＣ４：およびＺ１、Ｚ２、Ｚ３およびＺ４として分類される配列から選はれる複数の認識し得るほどに繰り返された結合性ドメインからなる、合成免疫グロブリン結合性分子。２．２〜１５の該ドメインからなる請求項１に記載の合成分子。３．選はれた一つまたは複数の該ドメインが、図１中でそのＮ−末端にてＡ１、Ａ２およびＡ３：Ｂ１およびＢ２：Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３およびＣ４：およびＺ１、Ｚ２、Ｚ３およびＺ４として分類される配列と同一であるか、または該配列と少なくとも７５％、好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の相同性を有することを条件として該配列から変化したものである、請求項１または２に記載の合成免疫グロブリン結合性分子。４．該ドメインの長さが２０〜４５アミノ酸である請求項１〜３のいずれかに記載の合成分子。５．配列Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３およびＤ４、または該配列と少なくとも７５％、好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の相同性を有することを条件として該配列から変化した関連配列から選ばれるドメインをさらに含む、請求項１〜４のいずれかに記載の合成分子。６、結合性ドメインが配列Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、およびＺ４から選ばれる請求項１〜５のいずれかに記載の合成分子。７．そのＣ末端にてＺ１に結合したＣ１からなる結合性領域を含む請求項６に記載の合成分子。８．そのＣ末端にてＺ２に結合したＣ２からなる結合性領域を含む請求項６または７に記載の合成分子。９．そのＣ末端にてＺ３に結合したＣ３からなる結合性領域を含む請求項６、７または８に記載の合成分子。１０．そのＣ末端にてＺ４に結合したＣ４からなる結合性領域を含む請求項６〜９のいずれかに記載の合成分子。１１．ドメインＤ１、Ｄ２、Ｄ３およびＤ４のすべてが含まれない上記いずれかの請求項に記載の合成分子。１２．図２に示すアミノ酸配列を含む上記いずれかの請求記載の合成分子。１３．上記いずれかの請求項に記載の合成分子をコードするヌクレオチド配列。１４．請求項１３に記載の配列を含む組換えＤＮＡ分子。１５．（１）請求項１４に記載のＤＮＡコード配列によってコードされるポリペプチドを発現させるため、宿主細胞を形質転換し得る発現ベクターヲ生成し、（２）宿主細胞を該ベクターで形質転換し、（３）該宿主細胞を培養し、ついで（４）実質的に純粋な生成物を該宿主細胞から単離することを特徴とする、合成免疫グロブリン結合性分子の製造方法。１６．該ベクターがｐＰＰＬ２である請求項１５に記載の方法。