JPH02242683A - ストレプトリシン０抗原誘導体、その製造方法およびその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ストレプトリシンＯ（Ｓ　Ｌ　Ｏ）抗原、お
よびとりわけ診断試験におけるその用途に関するもので
ある。具体的には、本発明は、血ｌＰ！試材中の抗体を
検出し得る抗原部位を有している、非細胞溶解性かつ非
毒性のＳＬＯ誘導体の識別、構築および製造に関するも
のである。本発明はまた、抗原と抗体の結合の様な特異
結合特性に基づく診断試験におけるこれらのＳＬＯ誘導
体の用途に関するものである。

ＳＬＯは、ヒトの多数の疾病の原因となる５ｔｒｅｐ１
０ｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ｓ、ｐｙｏｇｅｎ
ｅｓ）によって産生される毒性細胞溶解性タンパクであ
る。感染の問、ＳＬＯをコードしている遺伝子が発現さ
れ、ｓ、　ｐｙｏｇｅｎｅｓによってＳＬＯが分泌され
る。、ＳＬＯの毒性は、その細胞溶解活性に密接に関係
しているらしい。

感染したヒト宿主はＳＬＯ分子上の抗原部位に対する抗
ＳＬＯ抗体を生じる。従って、ヒト血清中のこれらの抗
ＳＬＯ抗体を検出する診断試験は、Ｓ、　ｐｙｏｇｅｎ
ｅｓによる感染（過去または現在）を示す。

ヒト血清中の抗ＳＬＯ抗体の検出のために現在使用され
ている免疫診断検定は、不純な活性ＳＬＯタンパクを利
用している。これらの検定は通常、以下のステップから
なる： （ａ）患者から血清試料を採取する。

（ｂ）適当なバッファーで血清試料の段階希釈溶液を調
製する。

（Ｃ）各試験毎に、バッファーを含有するが血清を含有
しない対照を含ませる。

（ｄ）血清の各希釈溶液および対照に、標１ｆｆｉの活
性ＳＬＯを加える。

（ｅ）混合物を標準温度で標準時間インキュベートし、
混合物中の抗ＳＬＯ抗体を、加えられたＳＬＯと結合さ
せて中和する。

＜１＞各混合物に標準量の赤血球を加える。

（ｇ）混合物を標準温度で標準時間インキュベートし、
活性（非中和）ＳＬＯに、加えられた細胞を溶解させる
。

（ｈ）加えられたＳＬＯを中和した［ｆｉｔ　ｉＮの最
も高い希釈倍数、即ち加えられた赤血球を５０％より少
な（溶解する希釈倍数に対応する希釈倍数を求める。

即ち、血清試料が高濃度の抗ＳＬ○抗体を含有している
場合、活性ＳＬＯは高希釈倍数の血清まで中和され、従
って、赤血球は溶解されない。逆に、血清試料が低濃度
の抗ＳＬＯ抗体を含有している場合、低希釈倍数の試料
のみが中和され、高希釈倍数の試料では赤血球は相当量
溶解されるであろう。

しかしながら、これらの検定には多（の問題がある。検
定は困難であり、時間がかかり、試験設備を必要とする
。これらは上記の様に活性ＳＬＯを利用し、このタンパ
クは毒性かつ細胞溶解性であり、そのため、試験設備お
よび熟練した検査技師が必要である。ｓ、　ｐｙｏｇｅ
ｎｅｓ由来の精製ＳＬＯの製造は困難であり、経費がか
かり、とりわけ、ＳＬＯは、ｓ、　ｐｙｏｇｅｎｅｓに
よって産生されるプロテアーゼ類による分解に感受性で
あることも原因である。

抗ＳＬＯ抗体を検出するためのこの検定法にはまた、液
状形態で不安定な、ＳＬＯの不純品を使用する。即ち、
ＳＬＯ棉本は、各々のバイアルが一連の血清試験に十分
な物質を含有しているバイアル中凍結乾燥粉末として供
給される。使用前に、凍結乾燥粉末を適当な溶媒中で還
元しなければならない。しかしながら、還元されたＳＬ
Ｏは、たぶん不純物であるプロテアーゼの存在のために
、急速にその活性を失い、従って、短時間内に使用する
かまたは廃棄しなければならない。そのため、各血清試
料が試験室に到着した直後にこれらを試験することは不
経済である。この問題を克服するために、試験室は通常
、試料が凍結乾燥ＳＬＯのバイアルを経済的に使用し得
る十分な数になるまでこれらを貯蔵している。このこと
は、血清試料の採取と試験結果の人手のｕｆＩに１週間
までの遅れがあるかもしれないということを意味する。

本発明は、試験室の設備が十分でなくても行い得る、ヒ
ト血清中の抗ＳＬＯ抗体の迅速かつ簡便な検定法を提供
することによって、これらの問題を克服しようとするも
のである。この検定法はまた、血清試料の入手の直後に
行うことができる。

更に、この試験は、抗ＳＬ○抗体の存在を検出するため
に、試験赤血球の溶血を検定することに依存していない
。本発明は、少なくとも１個のエピトープ、好ましくは
免疫優性エピトープ（即ち、高濃度の抗体および／また
はエピトープに対して高親和性を有する抗体を誘導する
か／または血清試料中の抗体によって容易に検出される
抗原部位）を有する、ＳＬＯの非毒性かつ非細胞溶解性
誘導体を提供することによって、この問題を解決する。

この様な誘導体は、組換え技術を使用して好適に製造す
ることができる。本発明のＳＬＯ誘導体は、さらにタン
パク分解に耐性であるのが好ましい。

ＳＬＯ遺伝子は、Ｓ、　ｐｙｏｇｅｎｅｓのＤＮＡから
ＳＬＯ遺伝子を（ｑｌこれをＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　
ｃｏｌｉ（Ｅ、　ｃｏｔ　ｉ）中で複製し得る適当なベ
クターに押入し、この組換えレプリコンでＥ、ｃｏｌｉ
を形質転換することにより、Ｅ、ｃｏｌｉ中でクローニ
ングされた。クローニングされたＳＬＯ遺伝子を含有し
ている形質転換Ｅ、ｃｏｌｉおよびその子孫はこの遺伝
子を発現し、少量の活性ＳＬＯを産生ずる。クローニン
グされたＳＬＯ遺伝子の完全なヌクレオチド配列は決定
され、ＳＬＯのアミノ酸配列は、決定されたＤＮＡ配列
から推定された。このデータは、ケホーおよびティミス
（Ｋｅｈｏｅ　ａｎｄ　Ｔｉｍｆｆ１ｉｓ　１９８イ、
　Ｉｎｒｅｃｔ。

ｌｌＩｌｍｕｎ、　４３コ８０４−８１０）およびケホ
ー等（／Ｋｅｈｏｅ　ａｔ　ａｌ＋１９８７　Ｉｎｆｅ
ｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、　５５：３２２１！−３２３２）
によって発表された。

クローニングされたＳＬＯ遺伝子の完全なヌクレオチド
配列から推定されたアミノ酸配列から、１次ＳＬＯ遺伝
子産物はそのＮ末端に、産生微生物によるその分泌を導
く短いシグナル配列を有し、このシグナル配列は、Ｓ、
　ｐｙ□ｇｅｎｅｓの細胞質膜を通してＳＬＯが輸送さ
れる間に（培養上清に達する）、またはクローニングさ
れたＳＬＯ遺伝子のＥ、ｃｏｌｉ発現の際に（ペリプラ
ズムに達する）、除去されると推論することができる。

活性ＳＬＯの２種類の分子量形態が、ドデシル硫酸ナト
リウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ）によッテ検出された（Ｓｐｙｏｇｅｎｅｓ培養上
〆ｎ１およびクローニングされたＳＬＯ遺伝子を発現し
ているＥ、ｃｏｌｉのペリプラズムの両者において）。

これらは、約６３．０００（本来、約６９．０００と予
想される）の相対分子量（Ｍｒ）を有する薄いほうのバ
ンド（形態１ンおよび約５２，０００（本来、約６０，
０００と予想される）のＭｒを有する、より濃いバンド
（形態■）として見られる。産生微生物によるその分泌
の後、高分子量形態Ｉのタンパク分解的切断によって低
分子量形態■が製造されると推測することができる。

このタンパク分解的切断によって除去されるアミノ酸配
列は、形＠Ｉの＄ＬＯ分子のＮ末端からであるという証
拠がある。

文献における１つの報告は、活性ＳＬＯの３種類の分子
量形態を記載している。これらのうち２種類は、上記の
高および低分子量形態■およびＨに対応し、３番目の５
ＬＯ（形態■）は、上記の低分子量形態■より小さい約
１３．０００（約１００アミノ酸に相当する）のＭｒを
有している。これは、形態■は高分子量形態１より約２
００アミノ酸小さいということを示唆している。形態■
が、形態■のＮ末端またはＣ末端（または両者）に対応
する領域から更にアミノ酸を失っているが否かは知られ
ていない。

上に要約されたデータは、ＳＬＯのがなりの割合の部分
（即ち少なくとも分子の３分の１）がその細胞溶解毒性
を破壊せずに除去され得るということを示している。ま
た、比較的小さい数（５０より小さい）のアミノ酸から
なるペプチドである、Ｓ。

ｐｙｏｇｅｎｅｓによって産生された毒素、ＳＬｓを包
含する多数の細胞溶解毒素がある。従って、短いペプチ
ドでも細胞溶解性および毒性となり得るということが認
められた。

従って、本発明は、その細胞溶解毒性をｔ肖失している
が、少なくとも１１のエピトープを保持している、ＳＬ
Ｏタンパクの誘導体を製造するための解決法を提供する
。これか可能であるということは着手時には全く不明で
あったが、本発明は、これが事実上可能であることを証
明し、好適な誘導体を製造するための明解な指３１を提
供する。

本発明の目的の１つは、少なくとも１個の、野生型ＳＬ
Ｏに特有のエピトープを含有する、ストレプトリシン０
（ＳＬＯ）の非毒性かつ非細胞溶解性誘導体を提供する
ことである。

ＳＬＯタンパクを、ケホー等（１９８７、前掲）によっ
て報告された完全なＳＬＯ配列のａａ３８３のＮ末端の
領域内で変異させるのが好ましい。この変異は、アミノ
酸の置換、欠失、逆位、挿入または付加によるアミノ酸
配列の変更を意味するのが好ましい。該エピトープは、
報告された完全なＳＬＯタンパク配列のａａ３８３　５
７１領域内に存在するのが好ましい。

細胞酵性の原因である領域の変異以外に、ＳＬＯの少な
くとも１個のエピトープが保持される限り、例えばアミ
ノ酸の付加、欠失、置換、挿入または逆位によって、第
１図に示したＳＬＯのアミノ酸配列をその他の領域で変
更してもよい。この様な変異体は、突然変異誘発または
イン・ビトロＤ　Ｎ　Ａ　７４作によって合成的に製造
することらできるし、これらは天然のアレル変異から生
じることもある。ＳＬＯアミノ酸配列配列本明細書記載
のラムダプロティンフラグメントの様な外来のアミノ酸
に融合させてもよい。

本発明のもう１つの目的は、上記の様なストレプトリシ
ンＯの非毒性非細胞溶解性誘導体をコードしているＤＮ
Ａ配列を提供することである。本発明はまた、この様な
りＮＡ配列を含有する組換えクローニングベクター、適
当な形質転換宿主中でタンパクを産生ずるための組換え
発現ベクターおよびこの様な形質転換宿主細胞、とりわ
けＥｃｏｌｉ株を提供する。

本発明は更に、タンパクを発現するように形質転換され
た宿主細胞を培養することによってストレプトリシン０
の非毒性かつ非細胞溶解性タンパク誘導体を発現させ、
それからタンパクを回収することからなる方法を提供す
る。この様な方法において、宿主細胞はＥ、ｃｏｌｉと
することができる。

本発明はまた、上記ストレプトリシンＯの非毒性、非細
胞溶解性誘導体を使用することからなる、臨床試料中の
抗ＳＬＯ抗体の存在または非存在を検出するための方法
および該方法を１史用ｒる診断用キットを提供するもの
である。典型的診断法は、臨床試料を、適当な支持体に
固定化（、た本発明のＳＬＯ誘導体と接触させ、次いで
、例えば標識抗−くヒト）抗体によって、結合したＳＬ
Ｏ抗体を検出することからなる。

本発明の別の態様は、イムノアフィニティーによって動
物またはヒトの抗−８し○抗体をｆ１１ｉ’！ｉ２する
ために、本発明のＳＬＯ誘導体を使用することからなる
。これは、ＳＬＯに対するモノクローナル抗体を製造す
るための方法の一部分となろう。

この誘導体は、ＳＬＯに対する抗体を生じさせるための
免疫原として使用することもできる。これは、ポリクロ
ーナル抗血清の製造であうでもモノクローナル抗体の製
造であってもよい。

本発明をより容易に理解し得るように、以下に好ましい
態様を記載する。

組換えプラスミドｐＭＫ１５７を制限エンドヌクレ７−
セＦｓｐｌで消化することによって、クロ−ニングされ
たＳＬＯ遺伝子を倉イｆしているＤＮＡフラグメントを
作成し、ベクタープラスミドｐＵｃ１８のＳ　ｍａ　１
部位にクローニングした。これによって、Ｅ、　ｃｏｌ
　ｉ中、低濃度で活性ＳＬＯを発現する、ｐＭＫ２０６
と称される新規な組換えプラスミドを得た。親プラスミ
ド、ｐＭＫ１５７およびｐＵｃ１８の構造は、文献に記
載されている（ケホーおよびティミス、前掲、およびヤ
ニシュベロン等（Ｙａｎｉｇｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ　ｅｔ
　ａｔ、　　１９８５　Ｇｅｎｅ３３：１０３−１１９
））。

プラスミドｐＭＫ２０６は、５ＬＯｊ貴１云子の５゜末
端近くに位置する１個のＥｃｏＲ１部位、およびＳＬ○
遺伝遺伝列配列内置する１個のＩｔ　ｐａ　ＩおよびＥ
　ｃｏＲＶ部位を有している。プラスミドｐＭＫ２０６
をＥｃｏＲ＋およびＩ−１ｐａ　ｌの両者で消化し、こ
の消化によって作成される２個のＤＮＡフラグメントの
大きいほうを、ＰＬプロモーターおよびＮ遺伝子配列の
一部分を含有している、バタテリオファージラムダ由来
のＥｃｏＲ’ｌ　−Ｈｐａｌ　　ＤＮＡフラグメントに
ライゲートした。これにより、Ｓ　Ｌ　Ｏ遺伝子配列の
約２／３のフレーム内で融合したラムダＮ遺伝子の５゛
末端を有している、ｐＭＫ３０６と弥される組換えＤＮ
ＡＮプレフンが得うレル。ｐＭＫ３Ｑ５１：お１ｔ６Ｎ
−３１、Ｏｊｎ伝子蝕子融合物クレオチド配列を添付の
第１図に示す。

ＳＬＯ遺伝子由来の配列は、ヌクレオチド１００から始
まる。上記の様に、ヌクレオチド１−９９は、ラムダＮ
タンパク由来の３３個のＮ末端アミノ酸をコードし、ヌ
クレオチド１００およびそれ以遠は、完全なＳＬＯタン
パクのアミノ酸２３４から５７１をコードしている。温
度感受性ラムダｃｌリプレッサーを発現しているＥ、ｃ
ｏｌｉ株を、得られた組換え分子で形質転換した。

熱誘導した場合、形質転換株を起源とする培養物は、ラ
ムダＮタンパク由来の３３個のＮ末端アミノ酸に融合し
たＳＬＯのＣ末端２／３（約）を有している非細胞溶解
性産物を発現する。この産物は、高濃度（総細胞タンパ
クの０５％より高い）で発現され、ウマのポリクローナ
ル抗ＳＬＯ血清中抗体とよく反応する。しかしながら、
この産物は、Ｅ、　ｃｏｌ　ｉ中で分解に感受性であり
、低分子量の分解産物を生じることがわかった。このこ
とは、ＳＬＯのＣ末端２／３は、分解に感受性である部
位を有し、従って、望ましい抗原においては避けるべき
であることを示した。分解産物のサイズから、分解感受
性部位はＳＬＯアミノ酸配列配列央領域に対応すること
がわかった。抗原性が１呆持されるか否かは不明である
が、これらの分解感受性部位をコードしているＤＮＡが
欠失されたｐＭＫ３０６の誘導体は安定なＮ−ＳＬＯ融
合産物を発現するであろうと結論された。

ｐＭＫ３０７と称される新規な組換えプラスミドは、Ｈ
ｐａ　ｌおよびＥｃｏＲＶで消化して得られるｐＭＫ３
０６の小さなりＮＡフラグメントを欠失させることによ
って構築された。第１図について言うと、欠失された配
列は、ヌクレオチド１００〜５４６からなる。温度感受
性ラムダｃｌリプレ。

サーを含有しているＥ、　ｃｏｌ　ｉを、このプラスミ
ドで形質転換した。熱誘導した後、形質転換株を起源と
する培養物は、ＳＬＯのＣ末端１／３（約）にラムダＮ
タンパクの３３個のＮ末端アミノ酸が融合してなる安定
なＮ−３Ｌ○融合産物を発現する。

第１図はまた、プラスミドｐＭＫ３０６およびｐＭＫ３
０７における挿入体をコードしている５１７０ヌクレオ
チドについての推定アミノ酸配列を示す。この産物は非
細胞溶解性であり、Ｅ、　ｃｏｌ　ｉ中で高濃度で発現
される。これらの産生細胞を溶解したところ、得られた
Ｎ−ＳＬＯ融合産物の大部分は不溶性であることがわか
った。精製プロ）−コールは、この産物が抗ＳＬＯ抗体
を検出するために使用し得る形態で精製されるように計
画された。

Ｎ−Ｓ　ＬＯ融合産物がコードされているｐＭＫ３０７
は、以下の様にして精製された （ｉ）ｉｆｉ度感受性ラムうｃｌリプレッサーを発現し
、ｐＭＫ３０７を含有しているＥ、　ｃｏｌｉを、空気
を吹き込みながら３０°Ｃで増殖させ、対数相の培養を
、熱を導入してｃｌリプレッサーを不活化し、次いで、
３７℃で更に２時間インキュベートし： （１１）細胞を遠心により回収し、バッファー１（２５
１！＋Ｍ　Ｔｒｉｓ−Ｆ（Ｃ（１，ｐＨ８，０，ｌ　Ｏ
ｍＭ　ＮａＣ（！および１ｍＭＥＤＴＡ念有）で洗浄し
、次いで、洗浄した細胞を溶解（菌）シ： （ｉｉｉ　）　’）ゼイトを１０．　ＯＯＯｘｉｒで１
０分間遠心してベレットを回収し、８Ｍ尿尿素含有バッ
フアート溶解し、次いで、得られた抗原をイオン交換ク
ロマトグラフィーによって更に精製し；（ｉｖ）生成物
である抗原を含有しているクロマトグラフィーカラムか
らの両分をゲル電気泳動によって識別して集め、 （ｖ）集めた画分をバッファー１にス・１して透析し、
透析画分中の不溶性物質を、Ｏ１％（ｖ／ｖ）の終濃度
までＳＤＳを加えることによって溶解した。

精製した産物は、溶血力価検定（例えば、前記先行技術
の検定）によってイン・ビトロで非細胞溶解性であるこ
と、およびハツカネズミの静脈内免疫によってイン・ビ
ボで非毒性であることが証明された。

精製した融合産物を、Ｄｏｔ−Ｂｌｏｔ装置を使用し、
フィルターの一定の領域に種々の量の精製産物を固定化
することによって、血清中の抗ＳＬＯ抗体を検出するそ
の活性について試験した。次いで、常法により、抗原を
担持している固形支持体をイムノブロッティングする。

このイムノブロッティング試験では、適当な希釈倍数の
血清を一次抗体として使用する。結合しなかった抗体を
除去するために洗浄した後、通常の抗体検出系によって
、結合した抗体の存在を検出することができる。

精製した産物は、感度のよい、特異的かつ定量的方法に
て、ヒト血清中の抗Ｓ　１．、　Ｏ抗体を検出すること
がわかり、得られた結果は、同一の血清を前記の通常の
検定法によって検定した時に得られた結果に匹敵した。

本発明は、ＳＬＯの細胞溶解および毒性活性が、好適な
エピトープの少なくとも１つから離れていることを初め
て開示した。本発明は、この様なエピトープが存在する
領域（完全な配列のａａ３８３５７１　（Ｋｅｈｏａ　
ｅｔ　ａ１、　　ｆ９８７、前ｔ６）に相当する第１図
に示したａａ１８３−３７１）、および細胞溶解および
毒性活性は完全な配列のａａ２３／ｌのＮ末端配列の存
在を必要とするらしいことを開示した。しかしながら、
その他の好適なエピトープか、細胞溶解および細胞毒性
活性から離れている完全なＳＬＯ配列のａａ２３４−３
８２のＮ末’ＪＷＡ領域、またはａａ２３４のＮ末端に
さえ存在するかもしねないという可能性がある。従って
、当業者は、所望により、完全な配列のａａ２３４のＮ
末端領域由来の別のこの様なエピトープを常法により試
験することによって、識別することができ、見出だされ
たら、これらを上記と全く同様に使用することができる
。本発明は、その広い概念において、その変異によって
その細胞溶解および細胞毒性活性を消失しているがエピ
トープを保持しているＳＬＯ誘導体を提供するものであ
る。この変異は、例えばａａ３８３のアミノ酸Ｎ末端領
域の欠失、押入、逆位、付加、置換等によるものであっ
てもよい。

別法として、または更に、タンパクを化学的に変異させ
て、少なくとも１個の好適なエピトープを保持しなから
細胞溶解性および細胞毒性活性を破壊してもよい。

【図面の簡単な説明】

第１図は、レプリコンｐＭＫ３０６におけるＮ５ＬＯ遺
伝子融合のヌクレオチド配列を示す模式図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、少なくとも１個の、野生型ストレプトリシンＯに特
   有のエピトープを有している、ストレプトリシンＯの非
   毒性かつ非細胞溶解性誘導体。 ２、ストレプトリシンＯタンパクを完全なストレプトリ
   シンＯ配列のａａ３８３のＮ末端領域内で変異させた請
   求項１に記載のストレプトリシンＯ誘導体。 ３、変異がアミノ酸の置換、欠失、逆位、挿入または付
   加によるアミノ酸配列の変更を意味する請求項２に記載
   のストレプトリシンＯ誘導体。 ４、変異がストレプトリシンＯタンパクの完全な配列か
   らのａａ２３４のＣ末端領域におよんでいる請求項２ま
   たは請求項３に記載のストレプトリシンＯ誘導体。 ５、該エピトープがストレプトリシンＯタンパクの完全
   な配列のａａ３８３−５７１領域内に存在する請求項１
   から４のいずれかに記載のストレプトリシンＯ誘導体。 ６、タンパク分解に耐性である請求項１から５のいずれ
   かに記載のストレプトリシンＯ誘導体。 ７、該誘導体をコードしているＤＮＡから、組換え宿主
   細胞中でタンパクを発現させることからなる請求項１か
   ら６のいずれかに記載のストレプトリシンＯ誘導体の製
   造方法。 ８、請求項１から６のいずれかに記載のストレプトリシ
   ンＯ誘導体に抗ストレプトリシンＯ抗体を結合させる工
   程を含む該抗体の精製方法。 ９、対象を請求項１から６のいずれかに記載のストレプ
   トリシンＯ誘導体で免疫することからなる抗ストレプト
   リシンＯ抗体を生じさせる方法。 １０、請求項１から６のいずれかに記載のストレプトリ
   シンＯ誘導体を、試料中の抗ストレプトリシンＯ抗体へ
   の該誘導体の結合を検出するための補助成分と共に含有
   してなる、臨床試料中の抗ストレプトリシンＯ抗体の存
   在または非存在を検出するための診断用キット。 １１、臨床試料を、請求項１から６のいずれかに記載の
   ストレプトリシンＯ誘導体と接触させ、試料中の抗スト
   レプトリシンＯ抗体と該誘導体の結合を検出することか
   らなる、臨床試料中の抗ストレプトリシンＯ抗体の存在
   または非存在の検出方法。