KR20210092203A - 면역글로불린의 fc 도메인에 대한 결합 친화도가 결여된 신규 삼중-나선 폴리펩티드 및 이의 용도 - Google Patents

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KR20210092203A
KR20210092203A KR1020217013252A KR20217013252A KR20210092203A KR 20210092203 A KR20210092203 A KR 20210092203A KR 1020217013252 A KR1020217013252 A KR 1020217013252A KR 20217013252 A KR20217013252 A KR 20217013252A KR 20210092203 A KR20210092203 A KR 20210092203A
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에릭 피들러
울리히 하우프츠
마들렌 츠바르크
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나피고 프로타인스 게엠베하
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Abstract

본 발명은 단백질 공학 및 정제 분야에 관한 것으로서, 구체적으로 삼중-나선 구조를 가지며 면역글로불린의 Fc 도메인에 대한 결합 친화도가 결여된 신규 폴리펩티드에 관한 것이다. 본 발명은 또한 치료 및 진단에서뿐만 아니라 친화도 크로마토그래피와 같은 기술 응용분야에서 신규 비-Fc 결합 폴리펩티드의 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 삼중-나선 구조를 갖는 폴리펩티드의 면역글로불린의 Fc 도메인에 대한 결합 친화도를 감소시키는 방법에 관한 것이다.

Description

면역글로불린의 FC 도메인에 대한 결합 친화도가 결여된 신규 삼중-나선 폴리펩티드 및 이의 용도
본 발명은 단백질 공학 및 정제 분야에 관한 것으로서, 구체적으로 삼중-나선 구조 (triple-helical structure)를 가지며 면역글로불린의 Fc 도메인에 대한 결합 친화도 (binding affinity)가 결여된 신규 폴리펩티드에 관한 것이다. 본 발명은 또한 치료 및 진단에서뿐만 아니라 친화도 크로마토그래피와 같은 기술 응용분야에서 신규 비-Fc 결합 폴리펩티드의 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 삼중-나선 구조를 갖는 폴리펩티드의 면역글로불린의 Fc 도메인에 대한 결합 친화도를 감소시키는 방법에 관한 것이다.
재조합으로 생성된 폴리펩티드의 다운스트림 처리에는 일반적으로 숙주 세포에서 발현된 폴리펩티드의 정제를 포함한다. 정제 공정은 전형적으로 하나 이상의 크로마토그래피 단계를 포함하고, 친화도 크로마토그래피는 종종 포착 단계 (capture step)로서 사용된다. 친화도 크로마토그래피는 단일 단계로 순수하고 농축된 생성물을 수득하는 간단하고 강력한 방법이지만, 효율적이고 표적화된 단백질 정제뿐만 아니라 기술 응용분야 예컨대 친화도 크로마토그래피, 또는 치료 및 진단에서 사용하기에 적합한 새로운 분자의 개발을 가능하게 하는 진보된 수단에 대한 지속적인 요구가 있다.
본 발명은 삼중-나선 구조를 가지며 면역글로불린의 Fc 도메인에 대한 결합 친화도가 결여된 신규 폴리펩티드를 제공함으로써 이러한 요구를 충족시킨다. 이들 신규 폴리펩티드는 단백질의 Fc-비의존적 정제로 인해 친화도 크로마토그래피에서 정확한 포착을 가능하게 하기 때문에 특히 유리하다. 더욱이, 면역글로불린의 Fc 도메인에 대한 결합 친화도가 결여된 신규 삼중-나선 폴리펩티드는 기술 응용분야뿐만 아니라 치료 및 진단에도 유용한 고도로 선택적인 표적-특이적 분자의 확인을 허용하는 라이브러리 생성을 가능하게 한다. 이러한 개요는 예시일 뿐이며, 따라서 반드시 본 발명에 의해 해결되는 모든 과제를 설명하는 것은 아니다.
본 개시내용은 하기 항목 1 내지 15를 제공하며, 이에 특별히 한정되지 않는다:
1. 삼중-나선 구조를 갖는 폴리펩티드로서, 여기에서 나선 1, 2 및 3은 이들의 위치와 관련하여 각각 서열번호: 1의 위치 7-19, 23-37 및 40-56에 상응하고, 상기 폴리펩티드는:
a) 서열번호: 1의 위치 13에 상응하는 위치에 아스파르트산 (D) 및 글루탐산 (E)으로부터 선택된 산성 아미노산; 및
b) 서열번호: 1의 위치 31에 상응하는 위치에 아르기닌 (R), 리신 (K) 및 히스티딘 (H) 중 어느 하나로부터 선택된 염기성 아미노산을 포함하는 삼중-나선 구조를 갖는 폴리펩티드.
2. 항목 1에 있어서, 상기 폴리펩티드는 표면 플라스몬 공명 (Surface Plasmon Resonance: SPR)에 의해 결정시에 면역글로불린의 Fc 도메인에 대해 검출 가능한 결합 친화도를 갖지 않는 삼중-나선 구조를 갖는 폴리펩티드.
3. 항목 1 또는 2에 있어서, 상기 폴리펩티드는
a) 서열번호: 1의 위치 13에 상응하는 위치에 아스파르트산 (D); 및/또는
b) 서열번호: 1의 위치 31에 상응하는 위치에 아르기닌 (R)을 포함하는 삼중-나선 구조를 갖는 폴리펩티드.
4. 항목 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 서열번호: 1의 위치 10, 14 및 35에 상응하는 하나 이상의 위치에 세린 (S)을 추가로 포함하는 삼중-나선 구조를 갖는 폴리펩티드.
5. 항목 1 내지 4 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질.
6. 표적 단백질에 대한 결합 친화도를 갖는 항목 1 내지 4 중 어느 하나에 따른 삼중-나선 구조를 갖는 폴리펩티드를 생성하는 방법으로서,
a) 항목 1 내지 4 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 폴리펩티드를 제공하는 단계;
b) 상기 a)의 하나 이상의 폴리펩티드를 표적 단백질과 접촉시키는 단계;
c) 상기 표적 단백질에 결합된 항목 1 내지 4 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드를 포함하는 복합체를 확인하는 단계;
d) 상기 표적 단백질에 결합할 수 있는 항목 1 내지 4 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드를 수득하는 단계를 포함하는 방법.
7. 항목 1 내지 4 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드, 또는 항목 5에 따른 융합 단백질, 또는 항목 6의 방법에 의해 수득된 표적 단백질에 대한 결합 친화도를 갖는 폴리펩티드를 포함하는 조성물.
8. 기술 응용분야 (technical applications)에 사용하기 위한, 항목 1 내지 4 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드, 또는 항목 5에 따른 융합 단백질, 또는 항목 6의 방법에 의해 수득된 표적 단백질에 대한 결합 친화도를 갖는 폴리펩티드.
9. 친화도 크로마토그래피에 사용하기 위한, 항목 1 내지 4 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드, 또는 항목 5에 따른 융합 단백질, 또는 항목 6의 방법에 의해 수득된 표적 단백질에 대한 결합 친화도를 갖는 폴리펩티드.
10. 약제 (medicament), 진단제 (diagnostic agent) 및/또는 예후제 (prognostic agent)로서 사용하기 위한, 항목 1 내지 4 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드, 또는 항목 5에 따른 융합 단백질, 또는 항목 6의 방법에 의해 수득된 표적 단백질에 대한 결합 친화도를 갖는 폴리펩티드, 또는 항목 7에 따른 조성물.
11. 삼중-나선 구조를 갖는 폴리펩티드의 면역글로불린의 Fc 도메인에 대한 결합 친화도를 감소시키는 방법으로서,
a) 나선 1 및 나선 2 내에 적어도 2개의 아미노산 위치를 돌연변이를 위해 선택하는 단계로서, 상기 나선 1 및 2는 이들의 위치와 관련하여 각각 서열번호: 1의 위치 7-19 및 23-37에 상응하고, 상기 돌연변이를 위한 적어도 2개의 아미노산 위치는 서열번호: 1의 아미노산 서열에서 위치 13 및 31에 상응하는 단계; 및
b) 돌연변이를 위해 선택된 상기 적어도 2개의 아미노산 위치를 돌연변이시키는 단계로서, 서열번호: 1의 위치 13에 상응하는 위치에서 아스파르트산 (D) 및 글루탐산 (E)으로부터 선택된 산성 아미노산에 대한 아미노산의 치환, 및 서열번호: 1의 위치 31에 상응하는 위치에서 아르기닌 (R), 리신 (K) 및 히스티딘 (H) 중 어느 하나로부터 선택된 염기성 아미노산에 대한 아미노산의 치환을 포함하는 단계를 포함하는 방법.
12. 항목 11에 있어서, 상기 돌연변이는 서열번호: 1의 위치 13에 상응하는 위치에서 아스파르트산 (D)에 대한 아미노산의 치환 및 서열번호: 1의 위치 31에 상응하는 위치에서 아르기닌 (R)에 대한 아미노산의 치환을 포함하는 방법.
13. 항목 11 또는 12에 있어서, 상기 돌연변이는 서열번호: 1의 아미노산 서열에서 위치 10, 14 및 35에 상응하는 위치에서 세린 (S)에 대한 하나 이상의 아미노산의 치환을 추가로 포함하는 방법.
14. 항목 6 및 11 내지 13 중 어느 하나의 방법에 의해 수득 가능하거나 또는 수득되거나, 또는 이에 따라 제조되는 삼중-나선 구조를 갖는 폴리펩티드.
15. 항목 1 내지 4 및 14 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드, 또는 항목 5에 따른 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
본 발명의 이러한 요약은 제한되지 않으며, 본 발명의 다른 양상 및 구체예는 하기 설명, 실시예 및 도면으로부터 명백해질 것이다.
도 1: 면역글로불린 Fc-영역, 특히 IgG1 Fc 영역에 대한 결합 친화도가 결여된 서열번호: 9의 폴리펩티드를 나타낸다. SPR 분광법 (BIAcore)을 사용한 무-표지 상호작용 분석법 (label-free interaction assays)을 통한 분석. 실선 = Fc 결합 단백질 (서열번호: 17); 점선 = 서열번호: 9의 폴리펩티드. 굴절률의 변화를 실시간으로 측정하고, 응답 또는 공명 단위 [response or resonance unit: RU] 대 시간 [초]으로 플로팅하였다.
도 2: 서열번호: 16의 Fc 결합 단백질 (실선)과 비교하여, 면역글로불린 Fc-영역, 특히 IgG1 Fc 영역에 대한 결합 친화도가 결여된 서열번호: 1, 2, 3, 5, 7의 폴리펩티드 (점선)를 나타낸다. SPR 분광법 (BIAcore)을 사용한 무-표지 상호작용 분석법을 통한 분석. 모든 농도 = 1 μM. 굴절률의 변화를 실시간으로 측정하고, 응답 또는 공명 단위 [RU] 대 시간 [초]으로 플로팅하였다.
도 3: Ig 결합 단백질 서열번호: 16 또는 야생형 단백질 A 도메인 C 또는 도메인 A 또는 도메인 Z와 비교하여, 면역글로불린 Fc-영역, 특히 IgG1 Fc 영역에 대한 결합 친화도가 결여된 서열번호: 1, 2, 3, 5, 7의 폴리펩티드 (점선)를 나타낸다. SPR 분광법 (BIAcore)을 사용한 무-표지 상호작용 분석법을 통한 분석. 모든 농도 = 10 μM. 굴절률의 변화를 실시간으로 측정하고, 응답 또는 공명 단위 [RU] 대 시간 [초]으로 플로팅하였다.
도 4: 친화도 크로마토그래피 후에 특이적 표적 결합 특성 (BP)을 갖는 단백질 A 유도체에 융합된 서열번호: 1 (비-Fc-결합 단백질)의 융합 단백질의 개선된 정량화 (quantification)를 나타낸다. 상기 결합 단백질 또는 융합 단백질의 회수율은 제조자의 지침에 따라 샌드위치 면역분석법 (sandwich immunoassay)에 의해 정량화되었다. BP1, Cys 및 His10을 갖는 결합 단백질 1; BP2, Cys 및 His10을 갖는 결합 단백질 2; BP3, Cys 및 His10을 갖는 결합 단백질 2; 융합 1, 융합 단백질 서열번호: 1 - BP2 - 서열번호: 1; 융합 2, 융합 단백질 서열번호: 1 - BP1; 융합 3, 융합 단백질 BP1 - 서열번호: 1; 융합 4, 융합 단백질 서열번호: 1 - BP3; 융합 5, 융합 단백질 BP3 - 서열번호: 1. 회수율 (recovery)은 측정된 신호 대 내부 표준의 관계를 나타낸다.
본 발명은 예를 들어 표면 플라스몬 공명 (SPR)에 의해 결정시에, 면역글로불린의 Fc 도메인에 대해 검출 가능한 결합 친화도를 갖지 않는 삼중-나선 구조를 갖는 신규 폴리펩티드를 제공한다. 본 발명의 폴리펩티드는 단백질 공학 및 정제 분야의 간극을 채우는 진보되고 강력한 수단을 나타낸다. 특히, 상기 신규 폴리펩티드는 면역글로불린 Fc-영역에 대한 상기 변경된 결합 친화도로 인해 단백질 정제에 있어서 유리한 효과를 제공한다. 구체적으로, 알려진 Ig-결합 단백질과 비교하여, 본 발명이 제공하는 신규 폴리펩티드는 Fc-융합 단백질 또는 항체 자체가 상기 Fc-도메인으로부터의 간섭없이 표적 단백질로서 사용될 수 있도록 한다. 따라서, 본 발명의 신규 폴리펩티드는 표적 단백질의 Fc-비의존적 정제로 인해 친화도 크로마토그래피에서 정확한 포착을 가능하게 하기 때문에 특히 유리하다. 면역글로불린의 Fc 도메인에 대한 검출 가능한 결합 친화도의 결여 (SPR에 의해 결정됨)는 삼중-나선 구조를 갖는 폴리펩티드가 나선 1에서 아스파르트산 (D) 및 글루탐산 (E)으로부터 선택된 산성 아미노산을 서열번호: 1의 위치 13에 상응하는 위치에 포함하고, 나선 2에서 아르기닌 (R), 리신 (K) 및 히스티딘 (H) 중 어느 하나로부터 선택된 염기성 아미노산을 서열번호: 1의 위치 31에 상응하는 위치에 포함하는 경우 달성될 수 있고, 상기 나선 1, 2 및 3은 이들의 위치와 관련하여 각각 서열번호: 1의 위치 7-19, 23-37 및 40-56에 상응한다.
본 발명의 신규 폴리펩티드는 특히 효율적이고 표적화된 단백질 정제를 제공할뿐만 아니라 라이브러리 디자인을 위한 새로운 개념에 기반하여 새로운 가치있는 분자의 확인을 가능하게 한다. 특히, 삼중-나선 구조를 갖는 신규 비-Fc 결합 폴리펩티드는 기술 응용분야뿐만 아니라 치료 및 진단에서도 유용한 고도로 선택적인 표적-특이적 분자를 확인할 수 있는 라이브러리 생성을 가능하게 한다. 본 발명의 비-Fc 결합 폴리펩티드는 본 발명자들에 의해 확인된 특정 아미노산 치환에 기반하고, 확대된 실험 옵션을 명확하게 제공하며 결합 단백질을 확인하기 위해 디자인된 선택 전략의 성공률을 증가시킬 수 있는 신규 라이브러리 디자인을 가능하게 한다. 예를 들어, 적절한 방법, 예컨대 SPR에 의해 결정시에 검출 가능한 Fc 결합 친화도를 갖지 않는 라이브러리 스캐폴드 (library scaffold)는 Fc-부분에 관한 위양성 히트 (false positive hits)가 적은 선택 및 스크리닝 방법에서 Fc 도메인과 융합된 표적 단백질에 대해 이러한 라이브러리의 적용을 가능하게 한다. 사실상, 이는 새로운 표적-특이적 결합 분자의 더 광범위한 세트의 생성을 허용하고, 이들 각각은 추가로 변경된 표적 특이성을 특징으로 하며, 특히 적절한 방법, 예컨대 SPR에 의해 결정시에 여전히 검출 가능한 Fc 결합 친화도를 갖지 않는다.
본 발명이 하기에서 더 상세히 기재되기 전에, 본 발명은 본원에 기재된 특정 방법론, 프로토콜 및 시약이 다양할 수 있기 때문에 이에 제한되지 않는다는 것을 이해해야 한다. 또한, 본원에서 사용된 용어는 특정 양상 및 구체예를 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위를 제한하려는 의도는 아님을 이해해야 하며, 본 발명은 첨부된 청구범위에 의해 반영된다. 달리 정의하지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 이는 단백질 공학 및 정제 분야의 숙련자를 포함하고, 또한 기술 응용분야 예컨대 친화도 크로마토그래피에서뿐만 아니라, 치료 및 진단에서 사용하기 위한 새로운 표적-특이적 결합 분자를 개발하는 분야의 숙련자도 포함한다.
바람직하게는, 본원에서 사용되는 용어는 "A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", Leuenberger, H.G.W, Nagel, B. and Kolbl, H. eds. (1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland)에 기재된 바와 같이 정의된다.
본 출원 및 청구범위 전반에 걸쳐, 문맥이 달리 요구하지 않는 한, 단어 "포함하다 (comprise)" 및 파생어 예컨대 "포함한다 (comprises)" 및 "포함하는 (comprising)"은 명시된 정수 또는 단계, 또는 정수들 또는 단계들의 그룹의 포함을 의미하지만, 임의의 다른 정수 또는 단계, 또는 정수들 또는 단계들의 그룹을 배제하지 않는 것으로 이해될 것이다. 상기 용어 "포함하다(포함한다)" 또는 "포함하는"은 "구성된다 (consists of)" 또는 "구성되는 (consisting of)"으로의 제한이 어떤 이유로든 어느 정도까지 필요한 경우, 상기로의 제한을 포함할 수 있다.
여러 문헌 (예: 특허, 특허 출원, 과학 간행물, 제조자의 사양, 지침, GenBank 수탁번호 서열 제출서 등)이 본 출원 전반에 걸쳐 인용될 수 있다. 본원에서 어떠한 것도 본 발명이 선행 발명으로 인해 이러한 개시내용을 선행할 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본원에 언급된 일부 문헌은 "참조로 통합된 (incorporated by reference)" 것으로 특징화될 수 있다. 이러한 통합된 참고문헌의 정의 또는 교시와 본 명세서에 언급된 정의 또는 교시가 상충하는 경우, 본 출원의 텍스트가 우선한다.
본원에 언급된 모든 서열은 이의 전체 내용 및 개시내용과 함께, 본 출원의 개시내용의 일부를 형성하는 첨부된 서열 목록에 개시되어 있다.
본 출원에 사용된 중요 용어의 일반적 정의
용어 "단백질 (protein)" 및 "폴리펩티드 (polypeptide)"는 2개 이상의 아미노산들이 펩티드 결합에 의해 연결된 임의의 사슬을 지칭하고, 생성물의 특정 길이를 지칭하는 것은 아니다. 따라서, "펩티드 (peptides)", "단백질 (protein)", "아미노산 사슬 (amino acid chain)" 또는 2개 이상의 아미노산의 사슬을 지칭하는데 사용되는 임의의 다른 용어는 "폴리펩티드 (polypeptide)"의 정의 내에 포함되고, 용어 "폴리펩티드 (polypeptide)"는 이러한 용어 대신에 또는 이러한 용어와 상호 교환 가능하게 사용될 수 있다. 용어 "폴리펩티드 (polypeptide)"는 또한 당 분야에 잘 알려진 글리코실화 (glycosylation)와 같은 폴리펩티드의 번역-후 변형의 생성물을 지칭하는 것으로 의도된다.
용어 "삼중-나선 구조 (triple-helical structure)" 또는 "3-나선 구조 (three-helix structure)"는 3-나선 번들 (three-helix bundles)을 갖는 폴리펩티드를 지칭하고, 여기서 상기 폴리펩티드는 적어도 48개의 아미노산, 바람직하게는 적어도 50개의 아미노산, 더 바람직하게는 적어도 58개의 아미노산, 더욱 바람직하게는 58개의 아미노산을 포함하고, 나선 1은 아미노산 잔기 7-19를 포함하며, 나선 2는 아미노산 잔기 23-37을 포함하고, 나선 3은 아미노산 잔기 40-56을 포함한다. 구체적으로, 나선 1, 2 및 3은 이들의 위치와 관련하여, 본질적으로 각각 서열번호: 1의 위치 7-19, 23-37 및 40-56에 상응한다. 다양한 구체예에서, 삼중-나선 구조를 갖는 폴리펩티드는 56, 57 또는 58개의 아미노산, 바람직하게는 58개의 아미노산으로 구성된다.
따라서, 본 발명에 의해 제공되는 폴리펩티드는 3개의 나선을 포함하고, 여기서 나선 1, 나선 2 및 나선 3은 서열번호: 1의 서열에서 아미노산 위치에 대해 하기 아미노산 위치를 포함한다: 나선 1: 서열번호: 1의 아미노산 서열의 위치 7-19에 본질적으로 상응하는 아미노산 위치; 나선 2: 서열번호: 1의 아미노산 서열의 위치 23-37에 본질적으로 상응하는 아미노산 위치; 나선 3: 서열번호: 1의 아미노산 서열의 위치 40-56에 본질적으로 상응하는 아미노산 위치. 본원에는 본 발명에 의해 제공된 삼중-나선 구조를 갖는 폴리펩티드의 구체예가 추가로 개시되고, 여기서 나선 1은 이의 위치와 관련하여 서열번호: 1의 아미노산 서열의 위치 6-19에 본질적으로 상응하고; 나선 2는 이의 위치와 관련하여 서열번호: 1의 아미노산 서열의 위치 23-37에 본질적으로 상응하며; 나선 3은 이의 위치와 관련하여 서열번호: 1의 아미노산 서열의 위치 40-56에 본질적으로 상응한다.
본원에 개시된 바와 같이, 본 발명에 따른 삼중-나선 구조를 갖는 폴리펩티드는 삼중-나선 구조를 갖는 폴딩된 폴리펩티드 (folded polypeptide)로 기재될 수 있다. 본원에 추가로 개시된 바와 같이, 본 발명에 따른 삼중-나선 구조를 갖는 폴리펩티드는 3-나선 번들 구조로 폴딩된 폴리펩티드로 기재될 수 있다.
용어 "집단 (population)" 및 "라이브러리 (library)"는 본원에서 상호 교환 가능하게 사용될 수 있다. 라이브러리는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 집단일 수 있다. 즉, 상기 라이브러리는 폴리펩티드 또는 핵산 분자 (폴리뉴클레오티드)의 집단 또는 혼합물 또는 복수의 형태를 취할 수 있다. 라이브러리는 변이체의 컬렉션 (collection)일 수 있다.
용어 "변형 (modification)" 또는 "아미노산 변형 (amino acid modification)"은 폴리펩티드 서열의 특정 위치에서 아미노산의 치환, 결실 또는 삽입을 지칭하며, 치환은 또 다른 아미노산에 의한 치환을 의미한다. 알려진 유전자 코드, 재조합 및 합성 DNA 기술을 고려하여, 당업자는 이러한 아미노산 변이체를 코딩하는 DNA를 용이하게 제작할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "변이체 (variant)" 또는 "유도체 (derivative)"는 아미노산 서열이 다른 아미노산 서열과 적어도 하나의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입에 의해 상이한 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명에 따른 용어 "변이체"는 예를 들어 서열번호: 1과 비교하여 최대 20개의 아미노산이 치환된 서열번호: 1에 기반한 폴리펩티드를 지칭할 수 있다. 본 발명에 따른 변이체는 본원에 정의된 바와 같이 삼중-나선 모티프를 특징으로 한다. 일부 구체예에서, 서열번호: 1의 폴리펩티드의 변이체는 서열번호: 1의 아미노산 서열에 대해, N-말단에서 최대 6개의 아미노산 잔기의 결실 및/또는 C-말단에서 최대 4개의 아미노산 잔기의 결실을 포함할 수 있다.
용어 "Fc 영역 (Fc region)" 및 "Fc 도메인 (Fc domain)"은 본원에서 상호 교환 가능하게 사용될 수 있다. 상기 Fc 영역은 면역글로불린의 테일 영역 (tail region), 특히 예를 들어 Fc 수용체라고 하는 세포 표면 수용체와 상호작용하는 항체의 테일 영역이다. 따라서, 상기 Fc 영역 또는 Fc 도메인은 면역글로불린, 특히 항체의 Fc 영역 또는 Fc 도메인을 의미한다. 다양한 구체예에서, 상기 Fc 영역은 포유동물 IgG (항체)로부터 유래되고, 인간 (human) IgG, 마우스 (mouse) IgG, 래트 (rat) IgG, 염소 (goat) IgG, 소 (bovine) IgG, 기니피그 (guinea pig) IgG 및 토끼 (rabbit) IgG를 포함한다. 상기 Fc 영역은 또한 인간 IgM 또는 인간 IgA로부터 유래할 수 있다. 다양한 구체예에서, 상기 Fc 영역은 인간 IgG (항체), 예컨대 인간 IgG1 (항체), 인간 IgG2 (항체) 또는 인간 IgG4 (항체), 더욱 바람직하게는 인간 IgG1 (항체)로부터 유래한다. 다양한 구체예에서, 상기 Fc 영역은 서열번호: 18 또는 서열번호: 19의 아미노산 서열을 갖는 인간 IgG1 Fc 영역, 또는 서열번호: 18 또는 서열번호: 19의 아미노산 서열에 대해 적어도 95%, 바람직하게는 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "표적 (target)" 또는 "표적 단백질 (target protein)"은 특정 결합 단백질에 의해 인식되는 항원 또는 에피토프를 갖는 단백질 또는 펩티드 또는 이의 단편 등을 지칭한다.
본원에 기재된 바와 같이, "Fc 결합 (Fc binding)"은 높은 선택성 및 친화도로 대부분의 IgG의 Fc-영역과의 상호작용을 의미하는 것으로 간주될 수 있다. 상기 결합 부위는 Fc 영역의 CH2 도메인 및 CH3 도메인 사이의 힌지 영역 (hinge region)에 위치한 컨센서스 결합 부위 (consensus binding site)로 알려진 보존 영역에 존재한다.
본원에 기재된 바와 같이, "비-Fc 결합 폴리펩티드 (non-Fc binding polypeptide)"는 Fc 결합이 없는, 즉 하기에 기재되는 적절한 방법, 예를 들어 SPR 분석에 의해 결정시에, IgG의 Fc-영역과의 검출 가능한 상호작용이 없는 폴리펩티드를 지칭한다.
용어 "결합 친화도 (binding affinity)" 및 "결합 활성 (binding activity)"은 본원에서 상호 교환 가능하게 사용될 수 있고, 이는 본 발명의 폴리펩티드가 다른 단백질, 펩티드, 또는 이의 단편 또는 도메인에 결합하는 능력을 지칭한다. 결합 친화도는 전형적으로 평형 해리 상수 (KD)에 의해 측정 및 보고되고, 이는 이분자 상호작용 (bimolecular interactions)의 세기를 평가하고 순위를 매기는데 사용된다. 결합 친화도 및 해리 상수는 정량적으로 측정될 수 있다. 결합 친화도를 결정하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있고, 예를 들어 하기 방법으로부터 선택될 수 있다: 표면 플라스몬 공명 (surface plasmon resonance: SPR), 효소-결합 면역흡착 분석법 (enzyme-linked immunosorbent assay: ELISA), 역학적 배제 분석 (kinetic exclusion analysis: KinExA assay), 생물층 간섭계 (Bio-layer interferometry: BLI), 유세포분석법 (flow cytometry), 형광 분광법 기술 (fluorescence spectroscopy techniques), 등온 적정 열량 측정법 (isothermal titration calorimetry: ITC), 분석용 초고속 원심분리 (analytical ultracentrifugation), 방사면역분석법 (radioimmunoassay: RIA 또는 IRMA), 및 증강 화학발광 (enhanced chemiluminescence: ECL). 전형적으로, 해리 상수 KD는 20℃ 내지 30℃ 범위의 온도에서 결정된다. 달리 구체적으로 지시되지 않으면, 본원에 언급된 KD 값은 25℃에서 SPR에 의해 결정된다. SPR에 의해 결정되는 면역글로불린의 Fc 도메인에 대해 검출 가능한 결합 친화도를 갖지 않는 폴리펩티드는 25℃에서 SPR에 의해 결정되는 면역글로불린의 Fc 도메인에 대해 검출 가능한 결합 친화도를 갖지 않는 폴리펩티드를 의미한다. 가장 널리 사용되는 SPR-기반 시스템은 BIAcore AB에서 제조된 BIAcore이다. 본 발명의 다양한 구체예에서, 면역글로불린의 Fc 도메인에 대한 결합 친화도는 BIAcore SPR 시스템에 의해 결정될 수 있다. 다양한 구체예에서, 분석물의 농도는 1 μM이다 (도 1 및 도 2 참조). 다양한 다른 구체예에서, 분석물의 농도는 10 μM이다 (도 3 참조). 따라서, 본 발명의 다양한 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 SPR에 의해 결정되는 면역글로불린의 Fc 도메인에 대해 검출 가능한 결합 친화도를 갖지 않고, 상기 SPR 분석법에서 분석물의 농도는 1 μM이고, 바람직하게는 상기 결합 친화도는 25℃에서 결정된다. 본 발명의 다양한 다른 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 SPR에 의해 결정되는 면역글로불린의 Fc 도메인에 대해 검출 가능한 결합 친화도를 갖지 않고, 상기 SPR 분석법에서 분석물의 농도는 10 μM이고, 바람직하게는 상기 결합 친화도는 25℃에서 결정된다. 상기 Ig Fc 도메인에 대한 결합 친화도는 서열번호: 17의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 (예를 들어, 도 1 참조)를 참조하거나, 또는 대안으로서 서열번호: 16의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 (예를 들어, 도 2 또는 도 3 참조)를 참조하여 측정될 수 있다. 상기 서열번호: 16 및 서열번호: 17의 서열은 하기와 같이 위치 1, 11, 35 및 42에서 상이하다: 서열번호: 16: 1I, 11A, 35R, 42L; 및 서열번호: 17: 1N, 11S, 35K, 42K. 대안으로서, 상기 Fc 결합 친화도는 임의의 단백질 A 야생형 도메인 또는 이의 유도체, 예를 들어 도메인 C (서열번호: 20) 또는 도메인 A (서열번호: 21) 또는 도메인 Z (서열번호: 22)를 참조하여 결정될 수 있고, 예를 들어 도 3을 참조한다.
용어 "융합 단백질 (fusion protein)"은 적어도 제1 단백질이 적어도 제2 단백질에 유전적으로 결합된 단백질에 관한 것이다. 융합 단백질은 원래 별개의 단백질을 코딩하는 2개 이상의 유전자들의 결합을 통해 형성된다. 따라서, 융합 단백질은 단일의 선형 폴리펩티드로 발현되는 동일하거나 또는 상이한 단백질들의 다량체 (multimer)를 포함할 수 있다.
본원에서 사용된, 용어 "링커 (linker)"는 이의 가장 광범위한 의미로 적어도 2개의 다른 분자들을 공유 결합시키는 분자를 지칭한다.
용어 "아미노산 서열 동일성 (amino acid sequence identity)"은 2개 이상의 단백질의 아미노산 서열의 동일성 (또는 차이)의 정량적 비교를 지칭한다. 참조 폴리펩티드 서열에 대한 "아미노산 서열 동일성 퍼센트 (%)"는 서열들을 정렬하고, 최대 서열 동일성 퍼센트를 달성하기 위해 필요하다면 갭을 도입한 후에, 참조 폴리펩티드 서열의 아미노산 잔기와 동일한 서열의 아미노산 잔기의 퍼센트로서 정의된다. 서열 동일성을 결정하기 위해, 쿼리 단백질 (query protein)의 서열을 참조 단백질 또는 폴리펩티드의 서열, 예를 들어 서열번호: 1의 폴리펩티드의 서열에 대해 정렬한다. 서열 정렬 방법은 당 분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 서열번호: 1의 아미노산 서열에 대한 임의의 폴리펩티드의 아미노산 서열 동일성의 정도를 결정하기 위해, 무료로 이용 가능한 SIM Local 유사도 프로그램 (SIM Local similarity program)이 바람직하게 사용된다 (Huang and Webb Miller (1991), Advances in Applied Mathematics, 12: 337-357). 다중 정렬 분석의 경우, ClustalW를 사용할 수 있다 (Thompson et al. (1994) Nucleic Acids Res., 22: 4673-4680).
본 발명의 구체예에 대한 상세한 설명
본 발명의 신규 폴리펩티드는 예를 들어 SPR에 의해 결정시에, 면역글로불린의 Fc 도메인에 대해 검출 가능한 결합 친화도를 나타내지 않는다. 면역글로불린 Fc 도메인에 대한 결합 친화도의 결여는 삼중-나선 구조를 갖는 폴리펩티드가 나선 1에서 아스파르트산 (D) 및 글루탐산 (E)으로부터 선택된 산성 아미노산을 서열번호: 1의 위치 13에 상응하는 위치에 포함하고, 나선 2에서 아르기닌 (R), 리신 (K) 및 히스티딘 (H) 중 어느 하나로부터 선택된 염기성 아미노산을 서열번호: 1의 위치 31에 상응하는 위치에 포함하는 경우 달성될 수 있고, 상기 나선 1, 2 및 3은 이들의 위치와 관련하여 각각 서열번호: 1의 위치 7-19, 23-37 및 40-56에 상응한다. 하기 표 1은 검출 가능한 면역글로불린 Fc 결합이 결여된 삼중-나선 폴리펩티드의 예를 나타낸다.
Figure pct00001
Figure pct00002
하기 표 2는 Fc 결합이 없는 삼중-나선 폴리펩티드의 특정 아미노산을 요약한 것이다. 위치 10, 13, 14, 31 및 35는 서열번호: 1의 위치에 상응한다. D = 아스파르트산, R = 아르기닌, S = 세린.
Figure pct00003
따라서, 본 발명은 폴리펩티드가 하기를 포함하는 비-Fc 결합 폴리펩티드를 제공한다: 서열번호: 1의 위치 13에 상응하는 위치에 아스파르트산 및 글루탐산으로부터 선택된 산성 아미노산; 및 서열번호: 1의 위치 31에 상응하는 위치에 아르기닌, 리신 및 히스티딘 중 어느 하나로부터 선택된 염기성 아미노산.
위치 10, 14, 35에서 특정 아미노산에 의한 구조적 특성 규명. 본 발명의 다양한 구체예에서, 본원에 개시된 비-Fc 결합 폴리펩티드는, 서열번호: 1의 다양한 구체예에서, 서열번호: 1-15, 23-30 중 어느 하나의 위치 10, 14 및/또는 35에 상응하는 하나 이상의 위치에서 바람직하게는 세린 (S), 트레오닌 (T), 글루타민 (Q), 아스파라긴 (N), 히스티딘 (H)으로부터 선택된 극성 측쇄를 갖는 아미노산 잔기를 포함하는 것을 구조적으로 추가로 특징으로 한다. 다양한 구체예에서, 상기 폴리펩티드는, 서열번호: 1의 다양한 구체예에서, 서열번호: 1-15, 23-30 중 어느 하나의 위치 10 또는 14 또는 35, 또는 위치 10 및 14, 또는 위치 10 및 35, 또는 위치 14 및 35, 또는 위치 10, 14 및 35에 상응하는 위치에서 극성 측쇄를 갖는 아미노산 잔기를 포함하는 것을 구조적으로 추가로 특징으로 한다. 바람직하게는, 본원에 개시된 비-Fc 결합 폴리펩티드는, 서열번호: 1의 다양한 구체예에서, 서열번호: 1-15, 23-30 중 어느 하나의 위치 10, 14 및 35에 상응하는 하나 이상의 위치에서 세린을 포함하는 것을 구조적으로 추가로 특징으로 한다. 일부 구체예에서, 본원에 개시된 비-Fc 결합 폴리펩티드는, 서열번호: 1의 다양한 구체예에서, 서열번호: 1-15, 23-30 중 어느 하나의 위치 13에 상응하는 위치에서 산성 아미노산, 및 서열번호: 1의 다양한 구체예에서, 서열번호: 1-15, 23-30 중 어느 하나의 위치 31에 상응하는 위치에서 염기성 아미노산에 추가하여, 서열번호: 1의 다양한 구체예에서, 서열번호: 1-15, 23-30 중 어느 하나의 위치 10, 14 및 35에 상응하는 모든 위치에서 세린을 포함하는 것을 구조적으로 추가로 특징으로 한다.
변이체 . 또한 본원에는 서열번호: 1의 다양한 구체예에서, 서열번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 중 어느 하나에 대해 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드가 개시되고, 상기 폴리펩티드는, 서열번호: 1의 다양한 구체예에서, 서열번호: 1-15, 23-30 중 어느 하나의 위치 13에 상응하는 위치에서 아스파르트산 및 글루탐산으로부터 선택된 산성 아미노산; 및 서열번호: 1의 다양한 구체예에서, 서열번호: 1-15, 23-30 중 어느 하나의 위치 31에 상응하는 위치에서 아르기닌, 리신 및 히스티딘 중 어느 하나로부터 선택된 염기성 아미노산을 포함하고, 단 상기 폴리펩티드는 예를 들어 SPR에 의해 결정시에 IgG Fc에 대해 검출 가능한 결합 활성을 갖지 않는다.
다양한 바람직한 구체예에서, 서열번호: 1의 다양한 구체예에서, 서열번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 것으로 정의된 본 발명의 임의의 비-Fc 결합 폴리펩티드는, 서열번호: 1의 다양한 구체예에서, 서열번호: 1-15, 및 23-30 중 어느 하나의 아미노산 서열에 대해 적어도 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78% 또는 79%의 서열 동일성을 가질 수 있다. 추가 구체예에서, 상기 비-Fc 결합 폴리펩티드는, 서열번호: 1의 다양한 구체예에서, 서열번호: 1-15, 및 23-30 중 어느 하나의 아미노산 서열에 대해 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 상기 비-Fc 결합 폴리펩티드는, 서열번호: 1의 다양한 구체예에서, 서열번호: 1-15, 및 23-30 중 어느 하나의 아미노산 서열에 대해 적어도 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87% 또는 88%의 서열 동일성을 갖는다. 바람직한 구체예에서, 상기 비-Fc 결합 폴리펩티드는, 서열번호: 1의 다양한 구체예에서, 서열번호: 1-15, 및 23-30 중 어느 하나의 아미노산 서열에 대해 적어도 89%의 서열 동일성을 갖는다. 다른 구체예에서, 상기 비-Fc 결합 폴리펩티드는, 서열번호: 1의 다양한 구체예에서, 서열번호: 1-15, 및 23-30 중 어느 하나의 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 또는 95%의 서열 동일성을 갖는다.
서열번호: 1-15, 및 23-30의 비-Fc 결합 폴리펩티드의 모든 변이체는 본원에서 정의된 삼중-나선 구조를 갖고, 위치 13에 산성 아미노산 및 위치 31에 염기성 아미노산을 가지며, 면역글로불린의 Fc 도메인에 대해 검출 가능한 결합 친화도를 갖지 않고, 바람직하게는 예를 들어 표면 플라스몬 공명에 의해 결정시에 면역글로불린의 Fc 도메인에 대해 검출 가능한 결합 친화도를 갖지 않는다.
다량체 . 본 발명의 일 구체예에서, 상기 비-Fc 결합 단백질은 1, 2, 3, 4, 바람직하게는 1 또는 2개의 비-Fc 결합 단백질이 서로 연결된 것을 포함하며, 즉 상기 비-Fc 결합 단백질은 예를 들어 단량체, 이량체, 삼량체 또는 사량체일 수 있다. 본 발명의 다량체는 일반적으로 당업자에게 잘 알려진 재조합 DNA 기술에 의해 인공적으로 생성된 융합 단백질이다. 본원에 개시된 비-fc 결합 단백질은 일반 유기 합성 전략, 고체상-보조 합성 기술과 같은 많은 통상적이고 잘 알려진 기술 중 어느 하나에 의해 또는 상업적으로 입수 가능한 자동 합성기에 의해 제조될 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 다량체는 동종-다량체이고, 예를 들어 비-Fc 결합 단백질의 아미노산 서열이 동일하다. 다른 구체예에서, 상기 다량체는 이종-다량체이고, 예를 들어 비-Fc 결합 단백질의 아미노산 서열이 상이하다.
융합 단백질. 일 구체예에 따르면, 본원에는 본 출원 전반에 걸쳐 개시된 비-Fc-결합 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질이 제공된다. 일 구체예에 따르면, 본원에는 본 출원 전반에 걸쳐 개시된 하나 이상, 예를 들어 2개의 비-Fc-결합 폴리펩티드(들)를 포함하는 융합 단백질이 제공된다. 보다 구체적으로, 상기 융합 단백질은 본 출원 전반에 걸쳐 개시된 하나 이상의 비-Fc-결합 폴리펩티드(들) 및 개시된 폴리펩티드와 구별되는 추가의 폴리펩티드를 포함한다. 다양한 구체예에서, 본원에 개시된 비-Fc 결합 폴리펩티드와 구별되는 추가의 폴리펩티드는 표적 결합 단백질, 바람직하게는 사전-정의된 표적에 대한 결합 친화도를 갖는 면역글로불린-결합 폴리펩티드 또는 유비퀴틴 뮤테인 (ubiquitin mutein)이다. 표적 결합 단백질은 사전-정의된 표적, 바람직하게는 단백질 표적에 결합하는 능력을 가진 폴리펩티드이다. 따라서, 일부 구체예는 본원에 개시된 1개 또는 2개의 비-Fc 결합 폴리펩티드(들) 및 면역글로불린-결합 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 따라서, 다른 구체예는 본원에 개시된 1개 또는 2개의 비-Fc 결합 폴리펩티드(들) 및 사전-정의된 표적에 대한 친화도를 갖는 결합 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 따라서, 다른 구체예는 본원에 개시된 1개 또는 2개의 비-Fc 결합 폴리펩티드(들) 및 인간 혈청 단백질 유비퀴틴의 유도체, 예를 들어 잘 알려진 아필린 (Affilin®) 분자를 포함하는 유비퀴틴-기반 결합 단백질 (유비퀴틴 뮤테인)을 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 이러한 융합 단백질은 또한 사전-정의된 표적 단백질을 정제하기 위해 친화도 크로마토그래피에서 사용하기에 특히 적합하다.
일부 구체예에서, 융합 단백질은 예를 들어 하기 조합을 포함할 수 있다 (N-말단에서 C-말단으로):
(a) 비-Fc 결합 단백질 - 표적 결합 단백질;
(b) 표적 결합 단백질 - 비-Fc 결합 단백질;
(c) 비-Fc 결합 단백질 - 표적 결합 단백질 - 비-Fc 결합 단백질;
(d) 비-Fc 결합 단백질 - 비-Fc 결합 단백질 - 표적 결합 단백질;
(e) 표적 결합 단백질 - 비-Fc 결합 단백질 - 비-Fc 결합 단백질, 및/또는
(f) 표적 결합 단백질 - 비-Fc 결합 단백질 - 비-Fc 결합 단백질 - 표적 결합 단백질.
일부 구체예에서, 융합 단백질은 서열번호: 1-15, 23-30의 그룹으로부터 선택된 비-Fc 결합 단백질, 또는 이에 대해 적어도 90%의 동일성을 갖는 비-Fc 결합 단백질을 포함할 수 있다. 일부 바람직한 구체예에서, 융합 단백질은 서열번호: 1 또는 서열번호: 2로부터 선택된 비-Fc 결합 단백질을 포함할 수 있다. 일부 바람직한 구체예에서, 융합 단백질은 서열번호: 27 또는 서열번호: 28로부터 선택된 비-Fc 결합 단백질, 또는 이에 대해 적어도 90%의 동일성을 갖는 비-Fc 결합 단백질을 포함할 수 있다.
이러한 융합 단백질은 친화도 크로마토그래피 중에 또는 후에 여과된 (leached) 단백질 A 또는 단백질 A 유도체 또는 다른 면역글로불린 결합 단백질을 검출하기 위한 단백질 A 여과 분석법 (Protein A leaching assays)에 사용하기에 특히 적합하다. 단백질 A 또는 단백질 A 유도체 또는 다른 면역글로불린 결합 단백질은 실시예에 기재된 바와 같이 샌드위치 면역분석법에 의해 정량화된다. 바람직하게는, 여과 분석법에 사용되는 융합 단백질은 본원에 기재된 1개 또는 2개의 비-Fc-결합 폴리펩티드(들) 및 Ig 결합 단백질 (바람직하게는 단백질 A 또는 단백질 A 유도체 또는 인공 Ig 결합 단백질)을 포함한다. 비-Fc-결합 폴리펩티드를 포함하는 이러한 융합 단백질의 모이어티는 Ig 결합 단백질의 기능을 방해하지 않는다. 적어도 하나의 비-Fc-결합 단백질에 융합되는 경우 단백질 A 유도체의 개선된 검출 가능성에 대한 예가 개시되어 있고, 도 4를 참조한다.
상기 융합 단백질은 단백질 A-기반 Ig 결합 단백질을 안정화시키는데 적합할 수 있다. 예를 들어, N- 또는 C-말단에서 비-Fc-결합 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질로 발현되는 경우 단백질의 발현이 향상된다.
더욱이, 본원에 개시된 적어도 하나의 비-Fc 결합 폴리펩티드 및 Ig 결합 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질은 매트릭스까지의 거리가 유리하게 영향을 받기 때문에 친화도 크로마토그래피에서 사용하기에 특히 적합하다.
상기 융합 단백질의 모이어티들은 서로 헤드-투-테일 (head-to-tail)로 직접 연결될 수 있거나, 또는 링커에 의해 연결될 수 있으며, 상기 링커는 바람직하게는 펩티드 링커이다. 다양한 구체예에서, 펩티드 링커는 상기 융합 단백질의 두 부분을 입체적으로 분리하는 아미노산 서열로 간주될 수 있다. 전형적으로, 이러한 링커는 1 내지 10개의 아미노산으로 구성된다.
융합 단백질은 본원에 기재된 폴리펩티드와 구별되는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자와 비-Fc-결합 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 유전적으로 융합 또는 조합함으로써 형성된 단백질로 특성화될 수 있다. 따라서, 상기 융합 단백질은 함께 번역되는 2개 이상의 유전자들의 산물로서 간주될 수 있다 (이들 간에 정지 코돈이 없음).
라이브러리. 일부 구체예는 서열번호: 1-15, 23-30에 개시된 바와 같이 단량체 비-Fc-결합 단백질들 중 어느 하나의 스캐폴드 서열 (scaffold sequences)로부터 유래되거나 또는 이에 기반하거나 또는 이에 의해 정의된, 신규 폴리펩티드의 집단을 제공하며, 이는 특정 바람직한 라이브러리에 대한 기초를 형성한다. 본 발명에 개시된 이러한 작은 단량체 스캐폴드 서열에 기반한 라이브러리의 이점은 구조적 안정성이 높아서, 이러한 라이브러리로부터 확인된 단백질이 가혹한 조건을 견딜 수 있다. 또한, 이러한 단백질의 비-Fc 결합 특성은 여러 응용분야에서 유리할 것이다.
일부 구체예는 삼중-나선 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 면역글로불린의 Fc 도메인에 대해 검출 가능한 결합 친화도가 결여된 폴리펩티드의 집단을 제공한다. 바람직하게는, 면역글로불린의 Fc 도메인에 대해 검출 가능한 결합 친화도가 결여된 폴리펩티드의 집단은 서열번호: 1-15, 23-30, 예를 들어 서열번호: 1 또는 서열번호: 27의 아미노산 서열에 대해 70% 내지 90%, 바람직하게는 70% 내지 85%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 구체예는 예를 들어 서열번호: 1 또는 서열번호: 27의 스캐폴드에 기반한 복수의 변이체를 포함하는 라이브러리를 제공한다. 본원에 제공된 라이브러리는 예를 들어 폴리펩티드의 서열 다양성을 포함할 수 있고, 이들 각각은 선택적으로 상이한 아미노산 서열을 포함한다. 라이브러리 구성원들 간 서열 차이는 라이브러리에 존재하는 다양성에 대해 역할을 한다. 무작위로 변형된 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열은 다수의 위치에서 뉴클레오티드 또는 아미노산에 의해 치환, 삽입 또는 결실된 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열이다.
이러한 라이브러리는 예를 들어 서열번호: 1의 위치 13에 상응하는 위치에 산성 아미노산; 및 서열번호: 1의 다양한 구체예에서, 서열번호: 1-15, 23-30 중 어느 하나의 위치 31에 상응하는 위치에 염기성 아미노산을 적어도 갖는 서열번호: 1 또는 서열번호: 27의 변이체 폴리펩티드를 포함하고, 본원에 기재된 바와 같이 서열번호: 1의 다양한 구체예에서, 서열번호: 1-15, 23-30 중 어느 하나의 위치 10, 14 및 35에 상응하는 위치에서 특정 아미노산 잔기를 추가로 특징으로 할 수 있다. 추가로, 일부 구체예에서, 상기 라이브러리는 사전-선택된 비-Fc 표적에 대한 신규 상호작용 부위를 생성하기 위해 무작위로, 예를 들어 서열번호: 1 또는 서열번호: 27의 3개의 나선들 중 2개의 나선 각각에서 적어도 5개의 아미노산 치환, 즉 적어도 10개의 아미노산을 갖는, 서열번호: 1의 다양한 구체예에서, 서열번호: 1-15, 23-30 중 어느 하나의 변이체 비-Fc 결합 폴리펩티드를 포함한다. 본원에 개시된 라이브러리는 바람직하게는 나선 3 및 나선 1, 또는 나선 3 및 나선 2에서 무작위 아미노산 위치를 갖는, 서열번호: 1의 다양한 구체예에서, 서열번호: 1-15, 23-30 중 어느 하나의 변이체 폴리펩티드를 포함한다.
따라서, 본 발명의 일부 구체예는 서열번호: 1의 다양한 구체예에서, 서열번호: 1-15, 23-30 중 어느 하나와 같은 비-Fc-결합 단백질, 또는 상응하는 삼중 나선 단백질에 기반한 라이브러리에 관한 것이고, 상기 라이브러리의 화합물은 3개의 나선들 중 2개의 나선에서 10 내지 16개의 무작위 위치를 갖는 하기 비-Fc 결합 단백질(들) 중 하나를 포함한다: a) 서열번호: 31 및 서열번호: 32에 제시된 바와 같이, 나선 2에서 위치 25, 26, 28, 29, 30, 32, 33, 35, 36, 37로부터 선택된 위치에서 적어도 5개 이상의 돌연변이 및 나선 3에서 위치 42, 43, 44, 46, 47, 50, 54로부터 선택된 위치에서 적어도 5개 이상의 돌연변이를 포함하고, b) 서열번호: 33 및 서열번호: 34에 제시된 바와 같이, 나선 1에서 위치 7, 8, 10, 11, 14, 15, 18, 20으로부터 선택된 위치에서 적어도 5개 이상의 돌연변이 및 나선 3에서 위치 42, 43, 46, 47, 49, 50, 53, 54로부터 선택된 위치에서 5개 이상의 돌연변이를 포함한다. 나선 1, 나선 2 및 나선 3에서 상기 위치의 확인은, 서열번호: 1의 다양한 구체예에서, 서열번호: 1-15, 23-30 중 어느 하나의 상응하는 위치와 관련하여 이해된다. 일부 구체예에서, 치환은 C, G, N 또는 P를 제외한 임의의 아미노산에 의해 수행될 수 있다. 이는 시스테인이 반응성 아미노산이고 다른 시스테인-함유 폴리펩티드와 디설파이드 결합을 형성할 수 있기 때문이며; 글리신 및 프롤린은 나선형 구조를 불안정하게 하는 것으로 알려져 있고; 마지막으로, 아스파라긴은 부식 처리에 특히 민감하여, 분해를 유도한다.
일부 구체예에서, 삼중-나선 구조를 갖는 비-Fc 결합 폴리펩티드는 서열번호: 31, 32, 33 또는 34 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성된다.
라이브러리 생성 방법. 본원에 기재된 라이브러리에 추가하여, 본 발명은 이러한 라이브러리를 생성하는 방법을 제공한다. 라이브러리 합성을 위한 최신 방법으로서, 적합한 삼중항 기술 (triplet technology) (Morphosys Slonomics)은 예컨대 20개의 천연 아미노산의 분포 또는 아미노산의 선택으로 무작위 라이브러리를 합성할 수 있다. 예컨대, 7 내지 16개의 위치에서 20개의 천연 아미노산의 무작위 분포를 가정하면, 서열번호: 1 또는 서열번호: 2-15, 23-30의 폴리펩티드의 207 내지 2016개의 이론적 고유 변이체의 풀 (pool)을 생성한다. 이러한 유전자/단백질 풀은 서열번호: 1 또는 서열번호: 2-15, 23-30의 비-Fc 결합 단백질의 상이한 변이체의 라이브러리를 구성한다.
라이브러리 디스플레이. 상기 라이브러리는 RNA에 대한 접합체로서 리보솜, 박테리오파지, 바이러스, 박테리아 또는 효모 세포의 표면에 디스플레이될 수 있고, 바람직하게는 리보솜 및 박테리오파지에 디스플레이되며, 각 표적에 대해 반복된 패닝 (panning) 라운드를 수행할 수 있다. 본 발명에 따른 접촉은 바람직하게는 파지 디스플레이, 리보솜 디스플레이, mRNA 디스플레이 또는 세포 표면 디스플레이, 효모 표면 디스플레이 또는 박테리아 표면 디스플레이 방법과 같은 적절한 제시 및 선택 방법에 의해, 바람직하게는 파지 디스플레이 방법 또는 리보솜 디스플레이 방법에 의해 수행된다. 본원에 언급된 방법은 당업자에게 알려져 있다.
본원에 기재된 파지 디스플레이 절차에서, 서열번호: 1의 재조합 변이체 또는 상응하는 비-Fc 결합 스캐폴드 아미노산 서열의 재조합 변이체는 사상 파지 (filamentous phage)에 제시되고, 상기 제시된 변이체의 코딩 DNA는 동시에 파지 엔벨로프 (phage envelope) 내에 단일가닥 형태로 패킹되어 제시된다. 따라서, 친화도 농축의 프레임에서, 소정의 특성을 갖는 변이체가 라이브러리로부터 선택될 수 있고, 이들의 유전자 정보는 각각 적절한 박테리아의 감염에 의해 증폭되거나 또는 다른 농축 사이클에 추가될 수 있다. 서열번호: 1의 변이체 또는 상응하는 비-Fc 결합 스캐폴드 아미노산 서열의 파지 표면에서의 제시는 상기 파지의 신호 서열 및 캡시드 또는 표면 단백질의 유전자 융합에 의해 달성된다. 더욱이, 상기 코딩된 단백질은 친화도 크로마토그래피에 의한 검출 및/또는 정제를 위한 친화성 태그 또는 항체 에피토프와 같은 기능적 요소 또는 친화도 농축 과정에서 단백질의 특이적 절단을 위한 프로테아제 인식 서열을 추가로 함유할 수 있다.
라이브러리로부터 선택하는 방법. 다른 양상에서, 본 발명은 서열번호: 1의 스캐폴드의 변이체 또는 상응하는 비-Fc 결합 스캐폴드 아미노산 서열의 변이체를 포함하는 라이브러리로부터 선택하는 방법에 관한 것으로서, 하나 이상의 상기 변이체는 표적 단백질 또는 표적 펩티드에 대한 특이적 결합 친화도를 가지며, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: a) 서열번호: 1의 스캐폴드의 변이체 또는 상응하는 비-Fc 결합 스캐폴드 아미노산 서열의 변이체를 포함하는 라이브러리를 제공하는 단계; (b) 서열번호: 1의 하나 이상의 변이체 폴리펩티드 또는 상응하는 비-Fc 결합 스캐폴드 아미노산 서열 및 표적 단백질 또는 펩티드를 상호작용하도록 하기에 충분한 시간 및 조건하에 상기 표적 단백질 또는 표적 펩티드와 상기 라이브러리를 접촉시키는 단계; 및 (c) 10-5 내지 10-12 M의 범위의 상기 표적 단백질에 대한 특정 결합 친화도 (KD)를 갖는 서열번호: 1의 하나 이상의 변이체 폴리펩티드 또는 상응하는 비-Fc 결합 스캐폴드 아미노산 서열을 상기 라이브러리로부터 선택 (확인)하는 단계.
변이체의 선별 절차. 서열번호: 1의 변이체 또는 상응하는 비-Fc 결합 스캐폴드 아미노산 서열의 변이체의 단리와 관련하여 선별 절차에 적합하고, 상기 기재된 융합 단백질에 대한 유전자 카세트 (gene cassette)가 삽입되는 박테리아 벡터를 파지미드 (phagemid)로서 지칭한다. 무엇보다도, 상기는 사상 파지 (예: M13 또는 f1)의 유전자간 영역 (intergenic region) 또는 이의 일부를 함유하고, 이는 헬퍼 파지 (helper phages)에 의해 파지미드를 운반하는 박테리아 세포의 중복감염 (superinfection)의 경우, 파지 캡시드 (phage capsid)로 파지미드 DNA의 공유적으로 폐쇄된 가닥의 패키징을 유도한다.
수득된 파지 입자는 당업자에게 알려진 방법에 의해 본원에 제시된 서열번호: 1의 변이체 또는 본원에 개시된 상응하는 비-Fc 결합 스캐폴드 아미노산 서열의 변이체의 임의의 표적으로의 결합과 관련하여 선택될 수 있다. 이러한 목적을 위해, 제시된 서열번호: 1의 변이체 또는 상응하는 비-Fc 결합 스캐폴드 아미노산 서열의 변이체는 표적 물질에 일시적으로 고정될 수 있고, 비-결합 변이체가 분리된 후에 특이적으로 용출될 수 있다. 이러한 방식으로 수득된 파지 입자는 선택된 표적에 대한 결합 특성을 갖는 서열번호: 1의 변이체 또는 상응하는 비-Fc 결합 스캐폴드 아미노산 서열의 변이체의 선택 및 증폭의 연속적인 사이클에 의해 재증폭 및 농축될 수 있다.
농축된 파지 풀로부터 서열번호: 1의 변이체 또는 상응하는 비-Fc 결합 스캐폴드 아미노산 서열의 변이체는 개별 단백질 발현을 위한 발현 벡터로 클로닝된다. 바람직하게는, 본원에 개시된 서열번호: 1의 변이체 또는 상응하는 비-Fc 결합 스캐폴드 아미노산 서열의 변이체의 발현은 자동화된 고-처리량 스크리닝 플랫폼에서 ELISA와 같은 확립된 기술에 의해 특정 결합 단백질에 대한 스크리닝을 가능하게 한다. 그 다음에 원하는 결합 특성을 가진 확인된 클론을 서열 분석하여 아미노산 서열을 밝힐 수 있다. 상기 확인된 단백질은 예를 들어 본원에 기재된 확인된 서열의 변경 및 반복된 파지 디스플레이, 리보솜 디스플레이, 패닝 및 스크리닝 단계에 기반하여 추가 라이브러리를 생성함으로써 추가 성숙 단계 (maturation steps)를 수행할 수 있다. 상기 발현된 단백질은 표적 단백질과 접촉하여 파트너들이 서로 결합할 수 있다. 이러한 과정을 통해 주어진 표적 단백질에 대한 결합 활성을 갖는 단백질을 확인할 수 있다.
본 발명은 당업자가 서열번호: 1의 변이체 또는 상응하는 비-Fc 결합 스캐폴드 아미노산 서열의 변이체의 선택된 레퍼토리를 농축시킬 수 있고, 이는 기능적이고 주어진 표적에 결합할 수 있으며, 단 적절한 방법 예컨대 SPR에 의해 결정시에 면역글로불린의 Fc 도메인에 대한 검출 가능한 결합 친화도를 갖지 않는다.
폴리펩티드의 생성 방법. 본 발명은 사전-정의된 표적 단백질에 대한 결합 친화도를 갖는 본원에 개시된 신규 비-Fc 결합 폴리펩티드를 생성하는 방법을 추가로 제공하고, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: (i) 본원에 개시된 폴리펩티드의 집단을 제공하는 단계; (ii) 상기 (i)의 폴리펩티드의 집단을 표적 단백질과 접촉시키는 단계; (iii) 상기 표적 단백질에 결합된 본원에 개시된 비-Fc 결합 폴리펩티드를 포함하는 복합체를 확인하는 단계; 및 (iv) 상기 표적 단백질에 결합할 수 있는 본원에 개시된 비-Fc 결합 폴리펩티드를 수득하는 단계. 비특이적 결합 폴리펩티드는 여러 세척 단계들에 의해 제거될 수 있다. 상기 표적 단백질에 대한 특이적 결합 친화도를 갖는 단백질이 표적 단백질과 남아 있다. 표적 단백질로부터 용출된 후에, 폴리펩티드는 증폭될 수 있고, 상기 표적 단백질과의 접촉 단계를 1회 이상 수행할 수 있다. 본 개시내용은 전술한 방법에 의해 수득되거나 또는 수득 가능하거나, 또는 생성되거나 또는 제조된 표적 분자에 대한 결합 친화도를 갖는 이러한 비-Fc 결합 폴리펩티드를 포함한다.
표적 분자에 대한 결합 친화도를 갖는 신규 비-Fc 결합 폴리펩티드를 생성하는 방법은 단계 (iii) 후 및 단계 (iv) 전에, 상기 표적 단백질에 대한 폴리펩티드의 결합 친화도를 결정하는 추가 단계를 포함할 수 있다. 상기 결합 친화도는 본원의 기재된 바와 같이 결정될 수 있다.
일부 구체예는 서열번호: 1의 다양한 구체예에서, 서열번호: 1-15, 23-30의 비-Fc 결합 단백질들 중 어느 하나의 폴리펩티드로부터 유래된 변이체 단백질을 생성하는 방법을 나타내고, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: (i) 각 나선 3 및 나선 2에서 적어도 5개의 선택된 위치, 또는 각 나선 3 및 나선 1에서 적어도 5개의 선택된 위치에서 변형된 서열번호: 1-15, 23-30 중 어느 하나의 폴리펩티드의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 분자의 뉴클레오티드 삼중체를 돌연변이 유발시키는 단계, (ii) 하나 이상의 변이체 핵산 분자(들)를 수득하는 단계, (iii) 상기 (ii)에서 수득된 하나 이상의 변이체 핵산 분자(들)를 적절한 발현 시스템에서 발현시키는 단계, 및 (iv) 하나 이상의 변이체 단백질을 선택 및/또는 단리에 의해 농축시키는 단계.
상기 돌연변이 유발은 본원에 기재된 양상 및 구체예에 따른 임의의 구조적 기술적 특징을 고려한다.
기술 응용분야에서 신규 폴리펩티드의 용도. 또한, 본원에는 기술 응용분야, 바람직하게는 친화도 크로마토그래피에 사용하기 위한, 본원에 기재된 방법에 의해 수득된 표적 단백질에 대한 결합 친화도를 갖는 신규 폴리펩티드를 포함하는, 본 발명의 신규 폴리펩티드의 용도가 제공된다.
본원에 기재된 바와 같이, 친화도 크로마토그래피 (친화도 정제 (affinity purification)라고도 함)는 분자들 간의 특이적 결합 상호작용을 사용한다. 예를 들어, 서열번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30의 비-Fc 결합 단백질들 중 어느 하나 및 이에 대해 적어도 90% 동일한 단백질을 포함하는 융합 단백질이 본원에 기재된 바와 같이 여과 분석법에 사용될 수 있다. 또한, 서열번호: 1-15, 23-30의 비-Fc 결합 단백질들 중 어느 하나 및 적어도 90% 동일한 단백질은 본원에 기재된 바와 같이 단백질을 고체 지지체에 결합시키기 위한 스페이서 (spacer)로서 고정될 수 있다. 단백질 고정화 방법 및 친화도 크로마토그래피 방법은 단백질 공학 및 정제 분야에서 잘 알려져 있으며, 표준 기술 및 장비를 사용하여 이 분야의 숙련가가 용이하게 수행할 수 있다.
다양한 구체예에서, 친화도 정제 방법은 친화도 분리 매트릭스 (affinity separation matrix)로부터 이에 특이적으로 결합하지 않는 일부 또는 모든 분자를 제거하기에 충분한 조건하에 수행되는 1회 이상의 세척 단계들을 추가로 포함할 수 있다. 개시된 용도 및 방법에 적합한 친화도 분리 매트릭스는 본원에 기재된 양상 및 구체예에 따라, 당업자에게 알려진 매트릭스이다.
고체 지지체로의 접합. 본 발명의 다양한 양상 및/또는 구체예에서, 본원에 개시된 임의의 방법에 의해 생성되거나 또는 수득된 신규 폴리펩티드를 포함하는 본원에 개시된 신규 폴리펩티드는 고체 지지체에 접합된다. 본 발명의 일부 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 상기 폴리펩티드의 고체 지지체에 대한 부위-특이적 공유 결합을 위한 부착 부위를 포함한다. 특정 부착 부위는 이에 제한되지 않고, 천연 아미노산, 예컨대 시스테인 또는 리신을 포함하고, 이는 고체상의 반응성 그룹 또는 고체상과 단백질 사이의 링커와 특정 화학 반응을 가능하게 한다.
일부 구체예에서, 상기 비-Fc 결합 단백질은 또한 N- 및/또는 C-말단에 추가의 아미노산 잔기, 예를 들어 N- 및/또는 C-말단에 태그가 있거나 또는 태그가 없는 추가 서열을 포함할 수 있다.
친화도 분리 매트릭스. 다른 구체예에서, 본원에 기재된 임의의 방법에 의해 확인된 폴리펩티드를 포함하는, 비-Fc 결합 폴리펩티드를 포함하는 친화도 분리 매트릭스가 제공된다. 다양한 구체예에서, 상기 친화도 분리 매트릭스는 친화도 정제 매트릭스일 수 있다.
바람직한 구체예에서, 상기 친화도 분리 매트릭스는 고체 지지체이다. 상기 친화도 분리 매트릭스는 본 발명에 의해 제공되는 적어도 하나의 비-Fc 결합 폴리펩티드를 포함한다. 따라서, 본원에 개시된 폴리펩티드의 임의의 신규 비-Fc 결합 단백질은 친화도 (분리/정제) 매트릭스에 의해 단백질의 분리 및/또는 정제에서의 용도를 포함한다.
친화도 크로마토그래피를 위한 고체 지지체 매트릭스는 당 분야에 알려져 있고, 예를 들어 아가로스 및 안정화된 아가로스 유도체, 셀룰로스 또는 셀룰로스 유도체, 제어된 기공 유리 (controlled pore glass), 모노리스 (monolith), 실리카, 산화 지르코늄, 산화 티탄 또는 합성 폴리머, 및 다양한 조성물의 하이드로겔을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
고체 지지체 매트릭스의 형태 (formats)는 임의의 적합한 잘 알려진 종류일 수 있다. 본 발명의 신규 단백질 또는 폴리펩티드를 결합하기 위한 이러한 고체 지지체 매트릭스는 예를 들어 하기 중 하나를 포함하지만 이에 한정되지 않는다: 컬럼, 모세관, 입자, 멤브레인, 필터, 모노리스, 파이버, 패드, 겔, 슬라이드, 플레이트, 카세트, 또는 크로마토그래피에 일반적으로 사용되고 당업자에게 알려진 임의의 다른 형태.
일 구체예에서, 상기 매트릭스는 비드 (beads)로도 알려진 실질적으로 구형 입자, 예를 들어 세파로스 (Sepharose) 또는 아가로스 (Agarose) 비드로 구성된다. 입자 형태의 매트릭스는 패킹 베드 (packed bed)로 사용되거나 또는 확장 베드 (expanded beds)를 포함한 현탁 형태로 사용될 수 있다. 본 발명의 다른 구체예에서, 상기 고체 지지체 매트릭스는 멤브레인, 예를 들어 하이드로겔 멤브레인이다. 일부 구체예에서, 상기 친화도 정제는 본 발명의 단백질이 공유 결합되는 매트릭스로서 멤브레인을 포함할 수 있다. 상기 고체 지지체는 또한 카트리지 내의 멤브레인 형태일 수 있다.
일부 구체예에서, 상기 친화도 정제는 본 발명의 신규 단백질이 공유 결합된 고체 지지체 매트릭스를 함유하는 크로마토그래피 컬럼을 포함한다. 본 발명의 신규 단백질 또는 폴리펩티드는 기존의 커플링 기술을 통해 적합한 고체 지지체 매트릭스에 부착될 수 있다. 단백질 리간드를 고체 지지체에 고정시키는 방법은 단백질 공학 및 정제 분야에 잘 알려져 있고, 표준 기술 및 장비를 사용하여 이 분야의 숙련자가 용이하게 수행할 수 있다.
조성물. 또한, 본원에 기재된 해당하는 방법에 의해 수득된 표적 단백질에 대한 결합 친화도를 갖는 신규 비-Fc 결합 폴리펩티드를 포함하는, 본 출원 전반에 걸쳐 개시된 비-Fc 결합 폴리펩티드를 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 다양한 구체예에서, 이러한 조성물은 진단적으로 또는 치료적으로 유효한 용량 또는 양의 신규 비-Fc 결합 폴리펩티드를 포함한다. 투여되는 단백질의 양은 특히 치료할 유기체, 질병 타입, 환자의 연령 및 체중, 및 다른 요인에 따라 좌우될 수 있다.
다양한 구체예에서, 상기 조성물은 비-Fc 결합 폴리펩티드 및 진단적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 진단용 조성물이다. 다양한 다른 구체예에서, 상기 조성물은 비-Fc 결합 폴리펩티드 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물이다. 상기 조성물은 선택적으로 당업자에게 알려진 추가 보조제 및 부형제를 함유한다. 이들은 예를 들어, 안정화제, 계면 활성제, 염, 완충제, 착색제 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
적어도 하나의 비-Fc 결합 폴리펩티드를 포함하는 조성물은 당 분야에 알려진 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 약학적 제제의 타입은 치료할 특정 타입의 질병, 투여 경로, 질병의 중증도, 치료할 환자 및 의학 분야의 숙련가에게 알려진 다른 요인에 따라 좌우될 수 있다.
추가로 본원에 기재된 해당하는 방법에 의해 수득된 표적 단백질에 대한 결합 친화도를 갖는 신규 폴리펩티드를 포함하는, 임의의 신규 비-Fc 결합 폴리펩티드의 용도, 또는 본원에 기재된 조성물의 약제, 진단제, 및/또는 예후제로서의 용도가 본원에 제공된다.
삼중-나선 구조를 갖는 폴리펩티드의 면역글로불린의 Fc 도메인에 대한 결합 친화도를 감소시키는 방법. 본 발명은 또한 삼중-나선 구조를 갖는 폴리펩티드의 면역글로불린의 Fc 도메인에 대한 결합 친화도를 감소 또는 약화시키는 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: (a) 나선 1 및 나선 2 내에 적어도 2개의 아미노산 위치를 돌연변이를 위해 선택하는 단계로서, 상기 나선 1 및 2는 이들의 위치와 관련하여 각각 서열번호: 1의 위치 7-19 및 23-37에 상응하고, 상기 돌연변이를 위한 적어도 2개의 아미노산 위치는 서열번호: 1의 아미노산 서열에서 위치 13 및 31에 상응하는 단계; 및 (b) 돌연변이를 위해 선택된 상기 적어도 2개의 아미노산 위치를 돌연변이시키는 단계로서, 서열번호: 1의 위치 13에 상응하는 위치에서 아스파르트산 및 글루탐산으로부터 선택된 산성 아미노산에 대한 아미노산의 치환, 및 서열번호: 1의 위치 31에 상응하는 위치에서 아르기닌, 리신 및 히스티딘 중 어느 하나로부터 선택된 염기성 아미노산에 대한 아미노산의 치환을 포함하는 단계. 바람직하게는, 상기 돌연변이는 서열번호: 1의 위치 13에 상응하는 위치에서 아스파르트산에 대한 아미노산의 치환, 및 서열번호: 1의 위치 31에 상응하는 위치에서 아르기닌에 대한 아미노산의 치환을 포함한다.
본원에 기재된 방법의 또 다른 바람직한 구체예에서, 상기 돌연변이는, 서열번호: 1의 다양한 구체예에서, 서열번호: 1-15, 23-30 중 어느 하나의 아미노산 서열에서 위치 10, 14 및 35에 상응하는 위치에서 임의의 아미노산 잔기, 바람직하게는 극성 측쇄를 갖는 임의의 아미노산 잔기, 더 바람직하게는 세린, 트레오닌, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘으로부터 선택된 임의의 아미노산 잔기, 더욱 바람직하게는 세린에 대한 하나 이상의 아미노산의 치환을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명은 삼중-나선 구조를 갖는 폴리펩티드의 면역글로불린의 Fc 도메인에 대한 결합 친화도를 감소 또는 약화시키는 본원에 기재된 방법에 따라 제조된 삼중-나선 구조를 갖는 폴리펩티드를 포함한다.
상기 돌연변이는 서열번호: 1의 다양한 구체예에서, 서열번호: 1-15, 23-30 중 어느 하나의 아미노산 서열에서 위치 10 및 14, 또는 위치 10 및 35, 또는 위치 14 및 35, 또는 위치 10, 14 및 35에 상응하는 위치에서 아미노산 잔기, 바람직하게는 극성 측쇄를 갖는 아미노산 잔기에 대한 아미노산의 치환을 포함할 수 있다.
바람직하게는, 상기 돌연변이는 서열번호: 1의 다양한 구체예에서, 서열번호: 1-15, 23-30 중 어느 하나의 아미노산 서열에서 위치 10, 14 및 35에 상응하는 위치에서 세린에 대한 하나 이상의 아미노산의 치환, 더 바람직하게는 서열번호: 1의 다양한 구체예에서, 서열번호: 1-15, 23-30 중 어느 하나의 각각 위치 10 및 14, 10 및 35, 및 14 및 35에 상응하는 위치를 포함한, 서열번호: 1의 다양한 구체예에서, 서열번호: 1-15, 23-30 중 어느 하나의 아미노산 서열에서 위치 10, 14 및 35에 상응하는 위치에서 2개의 아미노산의 치환을 포함한다. 특히 바람직한 구체예에서, 상기 돌연변이는 서열번호: 1의 다양한 구체예에서, 서열번호: 1-15, 23-30 중 어느 하나의 아미노산 서열에서 위치 10, 14 및 35에 상응하는 위치에서 세린에 대한 모든 아미노산의 치환을 포함한다.
다른 바람직한 구체예에서, 상기 돌연변이는 서열번호: 1의 다양한 구체예에서, 서열번호: 1-15, 23-30 중 어느 하나의 아미노산 서열에서 위치 10, 14 및 35에 상응하는 위치에서, 더 바람직하게는 서열번호: 1의 다양한 구체예에서, 서열번호: 1-15, 23-30 중 어느 하나의 각각 위치 10 및 14, 10 및 35, 및 14 및 35에 상응하는 위치를 포함한, 서열번호: 1의 다양한 구체예에서, 서열번호: 1-15, 23-30 중 어느 하나의 위치 10, 14 및 35에 상응하는 2개의 위치에서 트레오닌에 대한 하나 이상의 아미노산의 치환을 포함한다.
특히 바람직한 구체예에서, 상기 돌연변이는 서열번호: 1의 다양한 구체예에서, 서열번호: 1-15, 23-30 중 어느 하나의 아미노산 서열에서 위치 10, 14 및 35에 상응하는 위치에서 트레오닌에 대한 모든 아미노산의 치환을 포함한다. 본원에 기재된 바와 같이, 서열번호: 1의 다양한 구체예에서, 서열번호: 1-15, 23-30 중 어느 하나의 위치 10, 14 및 35에 상응하는 위치들 중 어느 하나에서 세린 잔기가 트레오닌 잔기보다 바람직하다.
본원에 기재된 방법의 다양한 구체예에서, 상기 돌연변이는 서열번호: 1의 다양한 구체예에서, 서열번호: 1-15, 23-30 중 어느 하나의 위치 13에 상응하는 위치에서 아스파르트산에 대한 아미노산의 치환, 및 서열번호: 1의 다양한 구체예에서, 서열번호: 1-15, 23-30 중 어느 하나의 위치 31에 상응하는 위치에서, 서열번호: 1의 다양한 구체예에서, 서열번호: 1-15, 23-30 중 어느 하나의 위치 31에 상응하는 위치에서 아르기닌, 리신 및 히스티딘 중 어느 하나로부터 선택된 염기성 아미노산에 대한 아미노산의 치환을 포함할 수 있다. 상기 돌연변이는 또한 서열번호: 1의 위치 13에 상응하는 위치에서 글루탐산에 대한 아미노산의 치환, 및 서열번호: 1의 다양한 구체예에서, 서열번호: 1-15, 23-30 중 어느 하나의 위치 31에 상응하는 위치에서, 서열번호: 1의 다양한 구체예에서, 서열번호: 1-15, 23-30 중 어느 하나의 위치 31에 상응하는 위치에서 아르기닌, 리신 및 히스티딘 중 어느 하나로부터 선택된 염기성 아미노산에 대한 아미노산의 치환을 포함할 수 있다.
본원에 기재된 방법의 다른 바람직한 구체예에서, 상기 돌연변이는 서열번호: 1의 다양한 구체예에서, 서열번호: 1-15, 23-30 중 어느 하나의 위치 13에 상응하는 위치에서 아스파르트산 또는 글루탐산에 대한 아미노산의 치환, 및 서열번호: 1의 다양한 구체예에서, 서열번호: 1-15, 23-30 중 어느 하나의 위치 31에 상응하는 위치에서 아르기닌에 대한 아미노산의 치환을 포함할 수 있다. 본원에 기재된 방법의 다른 바람직한 구체예에서, 상기 돌연변이는 서열번호: 1의 다양한 구체예에서, 서열번호: 1-15, 23-30 중 어느 하나의 위치 13에 상응하는 위치에서 아스파르트산 또는 글루탐산에 대한 아미노산의 치환, 및 서열번호: 1의 다양한 구체예에서, 서열번호: 1-15, 23-30 중 어느 하나의 위치 31에 상응하는 위치에서 리신에 대한 아미노산의 치환을 포함할 수 있다. 본원에 기재된 방법의 다른 바람직한 구체예에서, 상기 돌연변이는 서열번호: 1의 다양한 구체예에서, 서열번호: 1-15, 23-30 중 어느 하나의 위치 13에 상응하는 위치에서 아스파르트산 또는 글루탐산에 대한 아미노산의 치환, 및 서열번호: 1의 다양한 구체예에서, 서열번호: 1-15, 23-30 중 어느 하나의 위치 31에 상응하는 위치에서 히스티딘에 대한 아미노산의 치환을 포함할 수 있다.
본원에 기재된 방법의 추가의 바람직한 구체예에서, 상기 돌연변이는 서열번호: 1의 다양한 구체예에서, 서열번호: 1-15, 23-30 중 어느 하나의 위치 13에 상응하는 위치에서 아스파르트산에 대한 아미노산의 치환, 및 서열번호: 1의 다양한 구체예에서, 서열번호: 1-15, 23-30 중 어느 하나의 위치 31에 상응하는 위치에서 리신에 대한 아미노산의 치환을 포함할 수 있다. 본원에 기재된 방법의 다른 바람직한 구체예에서, 상기 돌연변이는 서열번호: 1의 다양한 구체예에서, 서열번호: 1-15, 23-30 중 어느 하나의 위치 13에 상응하는 위치에서 아스파르트산에 대한 아미노산의 치환, 및 서열번호: 1의 다양한 구체예에서, 서열번호: 1-15, 23-30 중 어느 하나의 위치 31에 상응하는 위치에서 히스티딘에 대한 아미노산의 치환을 포함할 수 있다. 본원에 기재된 방법의 다른 바람직한 구체예에서, 상기 돌연변이는 서열번호: 1의 다양한 구체예에서, 서열번호: 1-15, 23-30 중 어느 하나의 위치 13에 상응하는 위치에서 글루탐산에 대한 아미노산의 치환, 및 서열번호: 1의 다양한 구체예에서, 서열번호: 1-15, 23-30 중 어느 하나의 위치 31에 상응하는 위치에서 아르기닌에 대한 아미노산의 치환을 포함할 수 있다. 본원에 기재된 방법의 다른 바람직한 구체예에서, 상기 돌연변이는 서열번호: 1의 다양한 구체예에서, 서열번호: 1-15, 23-30 중 어느 하나의 위치 13에 상응하는 위치에서 글루탐산에 대한 아미노산의 치환, 및 서열번호: 1의 다양한 구체예에서, 서열번호: 1-15, 23-30 중 어느 하나의 위치 31에 상응하는 위치에서 리신에 대한 아미노산의 치환을 포함할 수 있다. 본원에 기재된 방법의 다른 바람직한 구체예에서, 상기 돌연변이는 서열번호: 1의 다양한 구체예에서, 서열번호: 1-15, 23-30 중 어느 하나의 위치 13에 상응하는 위치에서 글루탐산에 대한 아미노산의 치환, 및 서열번호: 1의 다양한 구체예에서, 서열번호: 1-15, 23-30 중 어느 하나의 위치 31에 상응하는 위치에서 히스티딘에 대한 아미노산의 치환을 포함할 수 있다.
삼중-나선 구조를 갖는 폴리펩티드의 면역글로불린의 Fc 도메인에 대한 결합 친화도를 감소 또는 약화시키는 본원에 기재된 방법은 본원에 기재된 바와 같이 서열번호: 1의 다양한 구체예에서, 서열번호: 1-15, 23-30 중 어느 하나의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 것을 추가로 특징으로 하는 삼중-나선 구조를 갖는 폴리펩티드의 결합 친화도를 감소 또는 약화시키는 단계를 포함한다. 이는 본원에 개시된 서열번호: 1-15, 23-30의 임의의 변이체 비 Fc 결합 폴리펩티드를 포함하고, 특히 이는 서열번호: 1의 다양한 구체예에서, 서열번호: 1-15, 23-30 중 어느 하나의 아미노산 서열에 대한 서열 동일성 퍼센트와 관련하여 보다 구체적으로 특징으로 한다. 따라서, 본 발명은 삼중-나선 구조를 갖는 폴리펩티드의 면역글로불린의 Fc 도메인에 대한 결합 친화도를 감소 또는 약화시키는 방법을 포함하고, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
서열번호: 1의 다양한 구체예에서, 서열번호: 1-15, 23-30 중 어느 하나의 아미노산 서열에서 위치 13 및 31을 선택하는 단계; 및 b) 돌연변이를 위해 선택된 상기 적어도 2개의 아미노산 위치를 돌연변이시키는 단계로서, 서열번호: 1의 다양한 구체예에서, 서열번호: 1-15, 23-30 중 어느 하나의 위치 13에 상응하는 위치에서 아스파르트산 (D) 및 글루탐산 (E)으로부터 선택된 산성 아미노산에 대한 아미노산의 치환, 및 서열번호: 1의 다양한 구체예에서, 서열번호: 1-15, 23-30 중 어느 하나의 위치 31에 상응하는 위치에서 아르기닌 (R), 리신 (K) 및 히스티딘 (H) 중 어느 하나로부터 선택된 염기성 아미노산에 대한 아미노산의 치환을 포함하는 단계.
다양한 구체예에서, 본원에 개시된 삼중-나선 구조를 갖는 폴리펩티드의 면역글로불린의 Fc 도메인에 대한 결합 친화도를 감소시키는 방법에 의해 생성되거나, 제조되거나, 또는 수득되거나, 또는 수득 가능한 삼중-나선 구조를 갖는 폴리펩티드는 적절한 방법 예컨대 표면 플라스몬 공명에 의해 결정시에 면역글로불린의 Fc 도메인에 대한 검출 가능한 결합 친화도를 갖지 않는다.
바람직한 구체예는 서열번호: 1의 다양한 구체예에서, 서열번호: 1-15, 23-30 중 어느 하나의 변이체 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구체예는 삼중-나선 구조를 가지며, 서열번호: 1의 다양한 구체예에서, 서열번호: 1-15, 23-30 중 어느 하나의 아미노산 서열에 대해 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 비-Fc 결합 폴리펩티드를 포함하고, 상기 폴리펩티드는 a) 서열번호: 1의 다양한 구체예에서, 서열번호: 1-15, 23-30 중 어느 하나의 위치 13에 상응하는 위치에 산성 아미노산 잔기, 바람직하게는 아스파르트산 (D) 잔기를 포함하고; b) 서열번호: 1의 다양한 구체예에서, 서열번호: 1-15, 23-30 중 어느 하나의 위치 31에 상응하는 위치에 염기성 아미노산 잔기, 바람직하게는 아르기닌 (R) 잔기를 포함한다. 바람직하게는, 이러한 폴리펩티드는 나선 3에서 적어도 5, 6, 7 또는 8개의 아미노산 치환을 포함하고, 상기 나선 3은 서열번호: 1의 다양한 구체예에서, 서열번호: 1-15, 23-30 중 어느 하나의 위치 40-56, 바람직하게는 서열번호: 1의 위치 42, 43, 44, 46, 47, 49, 50, 51, 53 및 54에 상응하는 위치로부터 선택된 위치에 아미노산 잔기를 포함한다. 또한, 이러한 단백질은 나선 1의 아미노산 잔기 및 나선 1에 바로 인접한 제1 잔기를 포함하는 위치에서 적어도 6, 7 또는 8개의 아미노산 치환을 포함하고, 상기 나선 1은 서열번호: 1의 다양한 구체예에서, 서열번호: 1-15, 23-30 중 어느 하나의 위치 7-19, 바람직하게는 위치 7, 8, 10, 11, 14, 15, 18 및 20에 상응하는 위치로부터 선택된 위치에 아미노산 잔기를 포함한다. 일부 구체예에서, 이러한 단백질은 나선 3에서 적어도 5, 6, 7 또는 8개의 아미노산 치환, 및 나선 2의 아미노산 잔기를 포함하는 위치에서 적어도 5, 6, 7 또는 8개의 아미노산 치환을 포함하고, 상기 나선 3은 서열번호: 1의 다양한 구체예에서, 서열번호: 1-15, 23-30 중 어느 하나의 위치 40-56, 바람직하게는 서열번호: 1의 위치 42, 43, 44, 46, 47, 49, 50, 51, 53 및 54에 상응하는 위치로부터 선택된 위치에 아미노산 잔기를 포함하며, 상기 나선 2는 서열번호: 1의 다양한 구체예에서, 서열번호: 1-15, 23-30 중 어느 하나의 위치 23-37, 바람직하게는 위치 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 35, 36 및 37에 상응하는 위치로부터 선택된 위치에 아미노산 잔기를 포함한다.
폴리뉴클레오티드, 벡터, 숙주 세포. 일 구체예는 본원에 개시된 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 핵산 분자를 포함한다. 추가 구체예는 또한 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 폴리펩티드를 포함한다. 추가로 본 발명의 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 핵산 분자를 포함하는 벡터, 특히 발현 벡터뿐만 아니라 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 예를 들어, 본원에 개시된 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드는 적절한 숙주에서 발현될 수 있고, 이와 같이 생성된 단백질은 단리될 수 있다. 벡터는 단백질-코딩 정보를 숙주 세포로 전달하는데 사용될 수 있는 임의의 분자 또는 엔티티 (entity) (예: 핵산, 플라스미드, 박테리오파지 또는 바이러스)를 의미한다. 본 발명에 적용될 수 있는 적합한 벡터는 당 분야에 알려져 있다.
또한, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산 또는 벡터를 포함하는 단리된 세포가 제공된다. 적합한 숙주 세포는 원핵생물 또는 진핵생물, 예를 들어 숙주 세포 또는 벡터를 운반하는 비-인간 숙주 (세포)를 포함한다. 숙주 세포는 핵산 서열로 형질전환되었거나 또는 형질전환될 수 있고, 이에 의해 관심 유전자를 발현하는 세포이다. 적합한 박테리아 발현 숙주 세포 또는 시스템은 당 분야에 알려져 있다. 당 분야에 알려진 다양한 포유동물 또는 곤충 세포 배양 시스템이 또한 사용되어 재조합 단백질을 발현할 수 있다.
본 발명의 단백질을 생성하는 방법. 추가 구체예에서, 기재된 비-Fc 결합 폴리펩티드를 생성하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 하기 단계(들)를 포함한다: (a) 비-Fc 결합 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건하에 (적절한) 숙주 세포를 배양하여 상기 비-Fc 결합 폴리펩티드를 수득하는 단계; 및 (b) 선택적으로 상기 비-Fc 결합 폴리펩티드를 단리하는 단계. 원핵세포 또는 진핵세포 숙주를 배양하는데 적합한 조건은 당업자에게 잘 알려져 있다.
비-Fc 결합 폴리펩티드는 일반 유기 합성 전략, 고체상-보조 합성 기술과 같은 임의의 통상적이고 잘 알려진 기술에 의해 또는 상업적으로 입수 가능한 자동 합성기에 의해 제조될 수 있다. 이들은 또한 기존의 재조합 기술 단독으로 또는 기존의 합성 기술과 조합하여 제조될 수 있다.
일 구체예에서, 본원에 상세하게 기재된 바와 같이, 비-Fc 결합을 제조하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: (a) 비-Fc 결합 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 제공하는 단계; (b) 상기 핵산 분자를 발현 벡터에 도입하는 단계; (c) 상기 발현 벡터를 숙주 세포에 도입하는 단계; (d) 배양 배지에서 상기 숙주 세포를 배양하는 단계; (e) 상기 숙주 세포를 상기 비-Fc 결합 폴리펩티드의 발현에 적합한 배양 조건으로 처리하여, 이에 의해 비-Fc 결합 폴리펩티드를 생성하는 단계; 선택적으로 (f) 상기 단계 (e)에서 생성된 단백질 또는 폴리펩티드를 단리하는 단계; 및 (g) 선택적으로 상기 단백질 또는 폴리펩티드를 본원에 기재된 고체 매트릭스에 접합시키는 단계. 본 발명의 다양한 구체예에서, 상기 비-Fc 결합 폴리펩티드의 생성 단계는 무-세포 (cell-free) 인 비트로 전사 및 번역에 의해 수행된다.
우선권 출원 EP 18 205 679.6의 개시내용은 그 전체가 본원에 참고로 통합되고, 이는 EP 18 205 679.6의 전체 개시내용이 본 출원의 개시내용의 일부를 형성하는 것으로 간주된다는 것을 의미한다.
실시예
하기 실시예는 본 발명의 추가 예시를 위해 제공된다. 그러나 본 발명은 이에 한정되지 않으며, 하기 실시예는 단지 상기 설명에 기초하여 본 발명의 실행 가능성을 보여준다. 본 발명의 완전한 개시를 위해, 본 출원에 인용된 문헌을 참조하고, 이는 참조로 본 출원에 완전히 통합된다.
실시예 1. 단백질의 발현 및 정제
모든 구조체를 T7 프로모터의 조절하에 저 카피 플라스미드 시스템 (low copy plasmid system)을 사용하여 대장균 (Escherichia coli) BL21 (DE3)에서 발현시켰다. 단백질은 배지 (자가유도 배지)에 포함된 락토스에 의한 유도 후에 가용성 형태로 세포질에서 (cytoplasmatically) 생성하였다. BL21 (DE3) 적격 세포 (competent cells)를 발현 플라스미드로 형질전환시키고, 선택적 아가 플레이트 (카나마이신) 상에 전개시키고, 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 50 μg/ml 카나마이신이 보충된 3 ml의 2xYT 배지 중에 단일 콜로니로부터 전배양물 (precultures)을 접종하고, 배양 튜브의 통상의 오비탈 진탕기에서 200 rpm으로 37℃에서 6시간 동안 배양하였다. 1L 삼각 플라스크 (Erlenmeyer flasks)에서 50 μg/ml 카나마이신이 보충된 300 ml의 ZYM-5052 (0.5% 글리세롤, 0.2% 락토스, 0.05% 글루코스, 0.5% 효모 추출물, 1.0% 카사미노산, 25 mM Na2HPO4, 25 mM KH2PO4, 5 mM Na2SO4, 2 mM MgSO4 및 미량 원소; Studier 2005 참조) 중에 3 mL의 전배양물로 주 배양물을 접종하였다. 배양물을 오비탈 진탕기로 옮기고, 30℃ 및 200 rpm에서 인큐베이션하였다. 재조합 단백질 발현은 글루코스를 대사작용시킨 후에 락토스가 세포에 들어가도록 함으로써 유도되었다. 세포를 밤새 대략 17시간 동안 성장시켜서 최종 OD600이 약 2-4에 도달하였다. 수확 전에, 상기 OD600을 측정하고, 0.6/OD600으로 조정된 샘플을 회수하고, 펠렛화하고, -20℃에서 동결시켰다. 바이오매스를 수집하기 위해, 세포를 22℃에서 15분 동안 12000xg로 원심분리하였다. 펠렛을 칭량하였다 (습식 중량). 세포를 처리 전에 -20℃에서 보관하였다.
친화성 태그를 가진 단백질을 친화도 크로마토그래피 및 크기 배제에 의해 정제하였다. 친화도 크로마토그래피 정제 후에,
Figure pct00004
kta 시스템 및 SuperdexTM 200 HiLoad 16/600 컬럼 (GE Healthcare)을 사용하여 크기 배제 크로마토그래피 (SE HPLC 또는 SEC)를 수행하였다. 상기 SEC 컬럼은 120 ml의 부피를 가지며, 2 CV로 평형화하였다. 상기 샘플을 1 ml/분의 유속으로 적용하였다. 신호 세기가 10 mAU에 도달하면 분획물 수집을 시작하였다. SDS-PAGE 분석 후에, 양성 분획물을 모으고, 이들의 단백질 농도를 측정하였다. 추가 분석으로는 SDS-PAGE, SE-HPLC 및 RP-HPLC를 포함하였다. 단백질 농도는 몰 흡광 계수 (molar absorbent coefficient)를 사용하여 280 nm에서 흡광도 측정에 의해 결정하였다. 역상 크로마토그래피 (RP-HPLC)는 Dionex HPLC 시스템 및 PLRP-S (5 μm, 300 Å) 컬럼 (Agilent)을 사용하여 수행하였다.
실시예 2. 표면 플라스몬 공명 ( SPR )에 의한 단백질 분석
500-1500 RU IgG1-Fc-도메인 (off-리간드)을 CM-5 센서 칩 (GE Healthcare)에 고정시키고; 상기 칩을 SPR 러닝 버퍼로 평형화하였다. 표면-노출된 카복실산 기는 EDC 및 NHS의 혼합물을 통과시킴으로써 활성화시켜서 반응성 에스테르기를 수득하였다. 리간드 결합 시에, 단백질 분석물을 상기 표면에 축적시켜서 굴절률을 증가시켰다. 이러한 굴절률의 변화는 실시간으로 측정하고, 응답 또는 공명 단위 대 시간으로 플로팅하였다. 상기 분석물을 30 μl/분의 유속으로 일련으로 희석하여 상기 칩에 적용하였다. 결합은 120초 동안 수행하였고, 해리는 360초 동안 수행하였다. 각 실행 후에, 상기 칩 표면을 30 μl의 재생 버퍼 (10 mM HCL)로 재생시키고, 러닝 버퍼로 평형화하였다. 결합 연구는 BIAcore 3000 (GE Healthcare)을 사용하여 수행하였고; 데이터 평가는 Langmuir 1:1 모델 (RI=0)을 사용하여, 제조자가 제공한 BIAevaluation 3.0 소프트웨어를 통해 수행하였다. 평가된 해리 상수 (KD)는 off-표적 (off-target)에 대해 표준화하여, 표시하였다. 도 1은 IgG1-Fc에 대한 서열번호: 17의 폴리펩티드 및 서열번호: 9의 폴리펩티드의 결합 친화도를 나타낸다. 굴절률의 변화를 실시간으로 측정하고, 응답 또는 공명 단위 [RU] 대 시간 [초]으로 플로팅하였다.
상기 IgG-Fc 도메인에 대한 결합 친화도는 서열번호: 17 (도 1 참조) 또는 서열번호: 16 (도 2 및 도 3 참조) 또는 야생형 단백질 도메인 (도 3 참조) 또는 도메인 Z (도 3 참조)를 참조하여 측정하였다. 상기 데이터를 1:1 Langmuir 모델로 피팅한 후에, c27에 대해 3 nM의 KD 값이 계산되었고, 서열번호: 9에 대해 KD 값은 계산될 수 없었다 (도 1 참조). 예를 들어, 서열번호: 16은 IgG1 결합에 대해 KD = 1.15 nM을 갖고, 도메인 C (서열번호: 20)는 IgG1 결합에 대해 KD = 3.87 nM을 갖는다.
실시예 3. 본 발명의 비- Fc 결합 단백질을 갖는 융합 단백질을 사용한 여과 분석법
친화도 크로마토그래피에서 낮은 수준의 여과된 단백질 A 유도체 또는 면역글로불린 결합 단백질을 결정하는 것은 신뢰할 수 있는 결과를 수득하기 위해 중요하다. 천연 및 재조합 단백질 A의 검출을 위한 단백질 A ELISA 키트 (Repligen, Cat. No. 9000-1)를 제조자 지침에 따라 여과 분석법에 사용하였다. 하기 융합 단백질들을 시험하였다:
표적에 대한 결합 친화도를 갖는 단백질 BP1 또는 BP3에 대해 N-말단에 융합된 서열번호: 1, 표적에 대한 결합 친화도를 갖는 단백질 BP1 또는 BP3에 대해 C-말단에 융합된 서열번호: 1, 및 표적에 대한 결합 친화도를 갖는 단백질 BP2에 대해 N-말단 및 C-말단에 융합된 서열번호: 1. BP1, BP2 및 BP3은 표적에 대한 특정 친화도를 갖는 삼중 나선 구조를 갖는 58개의 아미노산의 단백질이다. 예를 들어, BP3은 서열번호: 1에 대해 75.8%의 동일성을 갖고, BP3은 서열번호: 1과 비교하여 나선 2 및 나선 3에서 변형을 갖는 비-Fc-결합 단백질이다. 도 4는 특이적 표적 결합 특성을 갖는 유도체와 서열번호: 1의 융합 단백질의 향상된 회수율을 보여준다.
실시예 4. 라이브러리 제작, 라이브러리의 클로닝 , 변이체의 선택
라이브러리 제작 및 라이브러리의 클로닝 .
스캐폴드 서열번호: 1 (PAdelFc):
IAAKFDEAQSAADSEILHLPNLTEEQRNAFRQSLSDDPSVSLEVLGEAQKLNDSQAPK
밑줄은 아미노산 잔기 7-19 (나선 1), 아미노산 잔기 23-37 (나선 2) 및 아미노산 잔기 40-56 (나선 3)이다.
무작위 아미노산 위치를 포함하는 라이브러리를 삼중항 기술 (ThermoFisher Scientific - GeneArt, Germany)에 의해 합성하거나, 또는 합성 트리뉴클레오티드 포스포르아미다이트 (ELLA deisBiotech)에 의해 생성된 무작위 올리고뉴클레오티드에 의해 자체적으로 합성하여, 무작위 위치에서 시스테인 및 다른 아미노산 잔기가 배제된 동시에 잘-균형을 이룬 아미노산 분포를 달성하였다. PAdelFc (서열번호: 1)를 나선 3 및 나선 2, 또는 나선 3 및 나선 1에서 적어도 5개의 아미노산 위치에서 무작위화하였다. 서열번호: 1에 기반하여 하기 라이브러리를 생성하였다:
Figure pct00005
라이브러리 PA02 (서열번호: 31): 나선 2에서 무작위 위치 (25, 26, 28, 29, 30, 32, 33, 35, 36) 및 나선 3에서 무작위 위치 (42, 43, 44, 46, 47, 50, 54).
Figure pct00006
라이브러리 PA12 (서열번호: 32): 나선 2에서 무작위 위치 (25, 29, 30, 32, 33, 36, 37) 및 나선 3에서 무작위 위치 (43, 46, 47, 50, 51).
Figure pct00007
라이브러리 PA03 (서열번호: 33): 나선 1에서 무작위 위치 (7, 8, 10, 11, 14, 15, 18, 20) 및 나선 3에서 무작위 위치 (42, 43, 46, 47, 49, 50, 53, 54).
Figure pct00008
라이브러리 PA13 (서열번호: 34): 나선 1에서 무작위 위치 (7, 8, 11, 14, 15, 18) 및 나선 3에서 무작위 위치 (42, 46, 49, 50, 53).
PA02 및 PA03에 상응하는 cDNA 라이브러리를 ThermoFisher Scientific에 의해 GeneArt Strings DNA 단편으로 제공하였다. 나선 1 내지 3을 포함하는 코딩 영역을 PCR로 증폭시켰다. 전장 라이브러리 분자를 중복 연장 PCR (overlap extension PCR: oePCR)로 생성하였고, 여기서 비-무작위 영역은 주형 서열로서 PAdelFc를 사용하여 증폭시켰다.
PA12 및 PA13의 클로닝은 무작위 올리고뉴클레오티드 (ELLA Biotech)를 사용하여 수행하였다. 상기 PAdelFc 서열은 주형으로 제공되었다. 전장 PA12는 나선 1 및 무작위 나선 2를 포함하는 하나의 단편과 무작위 나선 3을 포함하는 다른 단편의 oePCR로 생성하였다. PA13의 코딩 영역을 무작위 올리고뉴클레오티드 및 PAdelFc 서열을 주형으로 사용하여 1회의 PCR 단계로 수득하였다.
모든 생성된 라이브러리 PCR 산물을 당업자에게 알려진 표준 방법을 사용하여 변형된 pCD87SA 파지미드 (본원에서 pCD33-OmpA라고 함)와 결찰하였다. 상기 pCD33-OmpA 파지미드는 OmpA 선도 서열 및 CT-pIII에 대한 직접 융합을 포함한다. 상기 결찰 혼합물의 알리코트 (aliquots)를 대장균 SS320 (Lucigen)의 전기천공에 사용하였다. 당업자에게 알려진 바와 같이, 재조합 유전자 방법을 수립하였다.
TAT 파지 디스플레이에 의한 1차 선택. 나이브 (naive) 라이브러리를 파지 디스플레이를 선택 시스템으로 사용하여 표적에 대해 농축하였다. 라이브러리를 보유한 파지미드 pCD33-OmpA로 적격 박테리아 SS320 세포 (Lucigene)를 형질전환시킨 후에, 파지 증폭 및 정제를 당업자에게 알려진 표준 방법을 사용하여 수행하였다. 선택을 위해, 상기 표적 단백질을 Dynabeads® 단백질 A 또는 Dynabeads® 단백질 G 상에 상기 표적의 Fc-융합으로 고정시켰다. 파지 인큐베이션 중에 표적 농도는 200 nM (제1 라운드)에서 100 nM (제2 라운드) 및 50 nM (제3 라운드)로 낮추었다. 표적 파지 복합체를 상등액으로부터 자기로 (magnetically) 분리하고, 여러 번 세척하였다. 표적 결합된 파지를 트립신에 의해 용출하였다. Fc-결합 변이체의 파지 라이브러리를 고갈시키기 위해, 제2 및 제3 라운드 전에 IgG1의 고정된 Fc-단편 (Athens Research & Technology)을 사용한 파지의 사전선택을 수행하였다. 표적 특이적 파지 풀을 확인하기 위해, 각 선택 라운드의 용출되고 재증폭된 파지를 파지 풀 ELISA (phage pool ELISA)로 분석하였다. 배지 결합 마이크로타이터 플레이트 (medium binding microtiter plate) (Greiner Bio-One)의 웰을 각각 표적-Fc (2.5 μg/ml) 및 IgG1의 Fc-단편 (2.5 μg/ml)으로 코팅하였다. 결합된 파지를 α-M13 HRP-접합된 항체 (GE Healthcare)를 사용하여 검출하였다.
표적 결합 파지 풀의 발현 벡터로의 클로닝 . 파지 풀 ELISA에서 표적에 대한 특이적 결합을 보여주는 선택 풀을 당 분야에 알려진 방법에 따라 PCR로 증폭시키고, 적절한 제한 뉴클레아제로 절단하고, Strep-Tag II (IBA GmbH)를 포함하는 발현 벡터 pET-28a (Merck, Germany)의 유도체로 결찰시켰다.
단일 콜로니 히트 분석. BL21 (DE3) 세포 (Merck, Germany)의 형질전환 후에, 카나마이신-저항성 단일 콜로니를 성장시켰다. 표적-결합 변형된 스캐폴드 변이체의 발현은 자가유도 배지를 사용하여 384 웰 플레이트 (Greiner Bio-One)에서 배양하여 수행하였다 (Studier, 2005, Protein Expr. Purif. 41(1):207-234). 세포를 수확한 후에, 각각 BugBuster 시약 (Novagen)에 의해 화학적 또는 효소적으로 및 동결/해동 사이클에 의해 기계적으로 용해시켰다. 원심분리 후에, 수득된 상등액을 High Bind 384 ELISA 마이크로타이터 플레이트 (Greiner Bio-One) 상에 고정된 표적을 사용하여 ELISA로 스크리닝하였다. 결합된 단백질의 검출은 Strep-Tactin® HRP 접합체 (IBA GmbH)와 TMB-Plus 기질 (Biotrend, Germany)와 조합하여 수행하였다. 0.2M H2SO4 용액을 부가하여 반응을 정지시키고, 플레이트 판독기에서 450 nm 대 620 nm으로 측정하였다.
성숙 선택 및 분석. 친화도 성숙 (affinity maturation)을 위해 2회의 패닝 라운드를 수행하였다. 표적의 Fc-융합은 각각 제1 및 제2 라운드에서 50 nM 및 5 nM의 농도로 사용하였다. 두 라운드 모두에 대해, IgG1의 Fc-단편을 사용한 사전선택을 수행하였다. 특이적 표적 결합에 대해 성숙하고 선택된 풀을 분석하기 위해, 파지 풀 ELISA를 수행한 후에 양성 풀을 발현 벡터 pET-28a로 클로닝하고, 본원에 기재된 바와 같이 ELISA를 히트 (hit)시켰다.
SEQUENCE LISTING <110> Navigo Proteins GmbH <120> NOVEL TRIPLE-HELICAL POLYPEPTIDES LACKING BINDING AFFINITY FOR THE FC DOMAIN OF IMMUNOGLOBULIN AND USES THEREOF <130> NP36 PAdelFc <160> 34 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PAdelFc (27+ with 10S, 13D, 14S, 31R, 35S) <400> 1 Ile Ala Ala Lys Phe Asp Glu Ala Gln Ser Ala Ala Asp Ser Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Arg Gln 20 25 30 Ser Leu Ser Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Val Leu Gly Glu Ala 35 40 45 Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 2 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PAdelFc (27+ with 13D 31R) <400> 2 Ile Ala Ala Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ala Ala Asp Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Arg Gln 20 25 30 Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Val Leu Gly Glu Ala 35 40 45 Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 3 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PAdelFc (27+ with 13D 31R 35S) <400> 3 Ile Ala Ala Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ala Ala Asp Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Arg Gln 20 25 30 Ser Leu Ser Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Val Leu Gly Glu Ala 35 40 45 Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 4 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PAdelFc (27+ with 10S 13D 31R) <400> 4 Ile Ala Ala Lys Phe Asp Glu Ala Gln Ser Ala Ala Asp Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Arg Gln 20 25 30 Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Val Leu Gly Glu Ala 35 40 45 Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 5 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> #PAdelFc (27+ with 10S 13D 31R 35S) <400> 5 Ile Ala Ala Lys Phe Asp Glu Ala Gln Ser Ala Ala Asp Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Arg Gln 20 25 30 Ser Leu Ser Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Val Leu Gly Glu Ala 35 40 45 Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 6 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PAdelFc (27+ with 13D 14S 31R) <400> 6 Ile Ala Ala Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ala Ala Asp Ser Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Arg Gln 20 25 30 Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Val Leu Gly Glu Ala 35 40 45 Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 7 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PAdelFc (27+ with 10S 13D 14S 31R) <400> 7 Ile Ala Ala Lys Phe Asp Glu Ala Gln Ser Ala Ala Asp Ser Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Arg Gln 20 25 30 Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Val Leu Gly Glu Ala 35 40 45 Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 8 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PAdelFc (27+ with 13D 14S 31R 35S) <400> 8 Ile Ala Ala Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ala Ala Asp Ser Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Arg Gln 20 25 30 Ser Leu Ser Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Val Leu Gly Glu Ala 35 40 45 Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 9 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PAdelFc (27 with 10S, 13D, 14S, 31R, 35S) <400> 9 Asn Ala Ala Lys Phe Asp Glu Ala Gln Ser Ser Ala Asp Ser Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Arg Gln 20 25 30 Ser Leu Ser Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Val Leu Gly Glu Ala 35 40 45 Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 10 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PAdelFc (14+ with 13D, 31R) <400> 10 Ile Ala Ala Lys His Asp Lys Asp Gln Gln Ala Ala Asp Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Arg Gln 20 25 30 Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Gly Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro 50 55 <210> 11 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PAdelFc (14+ with 10S, 13D, 14S, 31R, 35S) <400> 11 Ile Ala Ala Lys His Asp Lys Asp Gln Ser Ala Ala Asp Ser Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Arg Gln 20 25 30 Ser Leu Ser Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Gly Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro 50 55 <210> 12 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PAdelFc (50+ with 13D 31R) <400> 12 Ile Asp Ala Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ala Ala Asp Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Arg Gln 20 25 30 Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Ser Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro 50 55 <210> 13 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PAdelFc (50+ with 10S, 13D, 14S, 31R, 35S) <400> 13 Ile Asp Ala Lys Phe Asp Glu Ala Gln Ser Ala Ala Asp Ser Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Arg Gln 20 25 30 Ser Leu Ser Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Ser Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro 50 55 <210> 14 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PAdelFc (54+ with 13D 31R) <400> 14 Ile Asp Ala Gln His Asp Glu Asp Gln Gln Ala Ala Asp Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Arg Gln 20 25 30 Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Leu Glu Ile Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 15 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PAdelFc (54+ with 10S, 13D, 14S, 31R, 35S) <400> 15 Ile Asp Ala Gln His Asp Glu Asp Gln Ser Ala Ala Asp Ser Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Arg Gln 20 25 30 Ser Leu Ser Asp Asp Pro Ser Gln Ser Leu Glu Ile Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 16 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 27+ <400> 16 Ile Ala Ala Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Val Leu Gly Glu Ala 35 40 45 Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 17 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 27 <400> 17 Asn Ala Ala Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Val Leu Gly Glu Ala 35 40 45 Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 18 <211> 218 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG1 Fc region <400> 18 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 1 5 10 15 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 20 25 30 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 35 40 45 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 50 55 60 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 65 70 75 80 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 85 90 95 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 100 105 110 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 115 120 125 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 130 135 140 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 145 150 155 160 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 165 170 175 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 180 185 190 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 195 200 205 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215 <210> 19 <211> 218 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG1 Fc <400> 19 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 1 5 10 15 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 20 25 30 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 35 40 45 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 50 55 60 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 65 70 75 80 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 85 90 95 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 100 105 110 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 115 120 125 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 130 135 140 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 145 150 155 160 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 165 170 175 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 180 185 190 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 195 200 205 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215 <210> 20 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> domain C <400> 20 Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 21 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> domain A <400> 21 Ala Asp Asn Asn Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 22 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> domain Z <400> 22 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 23 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PAdelFc (24+ 13D 31R) <400> 23 Ile Ala Ala Gln His Asp Lys Glu Gln Gln Ala Ala Asp Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Arg Gln 20 25 30 Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Gly Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 24 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PAdelFc (24+ 10S 13D 14S 31R 35S) <400> 24 Ile Ala Ala Gln His Asp Lys Glu Gln Ser Ala Ala Asp Ser Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Arg Gln 20 25 30 Ser Leu Ser Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Gly Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 25 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PAdelFc (26+ 13D 31R) <400> 25 Ile Ala Ala Gln His Asp Lys Asp Gln Gln Ala Ala Asp Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Arg Gln 20 25 30 Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 26 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PAdelFc (26+ 10S 13D 14S 31R 35S) <400> 26 Ile Ala Ala Gln His Asp Lys Asp Gln Ser Ala Ala Asp Ser Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Arg Gln 20 25 30 Ser Leu Ser Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 27 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PAdelFc (60+ 13D 31R) <400> 27 Ile Asp Ala Lys Phe Asp Glu Ala Ala Gln Ala Ala Asp Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Arg Gln 20 25 30 Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Ala Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro 50 55 <210> 28 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PAdelFc (60+ with 10S, 13D, 14S, 31R, 35S) <400> 28 Ile Asp Ala Lys Phe Asp Glu Ala Ala Ser Ala Ala Asp Ser Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Arg Gln 20 25 30 Ser Leu Ser Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Ala Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro 50 55 <210> 29 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PAdelFc (59+ 13D 31R) <400> 29 Ile Asp Ala Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ala Ala Asp Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Arg Gln 20 25 30 Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Ala Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro 50 55 <210> 30 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PAdelFc (59+ with 10S, 13D, 14S, 31R, 35S) <400> 30 Ile Asp Ala Lys Phe Asp Glu Ala Gln Ser Ala Ala Asp Ser Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Arg Gln 20 25 30 Ser Leu Ser Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Ala Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro 50 55 <210> 31 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PA02 <220> <221> Xaa <222> (25)..(25) <223> can be any amino acid except C, G, N, P <220> <221> Xaa <222> (26)..(26) <223> can be any amino acid except C, G, N, P <220> <221> Xaa <222> (28)..(28) <223> can be any amino acid except C, G, N, P <220> <221> Xaa <222> (29)..(29) <223> can be any amino acid except C, G, N, P <220> <221> Xaa <222> (30)..(30) <223> F, H, or Y <220> <221> Xaa <222> (32)..(32) <223> can be any amino acid except C, G, N, P <220> <221> Xaa <222> (33)..(33) <223> can be any amino acid except C, G, N, P <220> <221> Xaa <222> (35)..(35) <223> can be any amino acid except C, G, N, P <220> <221> Xaa <222> (36)..(36) <223> can be any amino acid except C, G, N, P <220> <221> Xaa <222> (42)..(42) <223> can be any amino acid except C, G, N, P <220> <221> Xaa <222> (43)..(43) <223> can be any amino acid except C, G, N, P <220> <221> Xaa <222> (44)..(44) <223> I, L, T, or V <220> <221> Xaa <222> (46)..(46) <223> can be any amino acid except C, G, N, P <220> <221> Xaa <222> (47)..(47) <223> can be any amino acid except C, G, N, P <220> <221> Xaa <222> (50)..(50) <223> can be any amino acid except C, G, N, P <220> <221> Xaa <222> (54)..(54) <223> can be any amino acid except C, G, N, P <400> 31 Ile Ala Ala Lys Phe Asp Glu Ala Gln Ser Ala Ala Asp Ser Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Arg Xaa 20 25 30 Xaa Leu Xaa Xaa Asp Pro Ser Val Ser Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Ala 35 40 45 Gln Xaa Leu Asn Asp Xaa Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 32 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PA12 <220> <221> Xaa <222> (25)..(25) <223> H, E, V, A, L, Y, W, K, I, Q, T, or R <220> <221> Xaa <222> (29)..(29) <223> H, E, V, A, L, Y, W, K, I, Q, T, or R <220> <221> Xaa <222> (33)..(33) <223> H, E, V, A, L, Y, W, K, I, Q, T, or R <220> <221> Xaa <222> (36)..(36) <223> H, E, V, A, L, Y, W, K, I, Q, T, or R <220> <221> Xaa <222> (37)..(37) <223> H, E, V, A, L, Y, W, K, I, Q, T, or R <220> <221> Xaa <222> (43)..(43) <223> H, E, V, A, L, Y, W, K, I, Q, T, or R <220> <221> Xaa <222> (46)..(46) <223> H, E, V, A, L, Y, W, K, I, Q, T, or R <220> <221> Xaa <222> (47)..(47) <223> H, E, V, A, L, Y, W, K, I, Q, T, or R <220> <221> Xaa <222> (50)..(50) <223> H, E, V, A, L, Y, W, K, I, Q, T, or R <220> <221> Xaa <222> (51)..(51) <223> H, E, V, A, L, Y, W, K, I, Q, T, or R <220> <221> Xaa <222> (54)..(54) <223> H, E, V, A, L, Y, W, K, I, Q, T, or R <400> 32 Ile Ala Ala Lys Phe Asp Glu Ala Gln Ser Ala Ala Asp Ser Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Xaa Gln Arg Asn Xaa Phe Arg Gln 20 25 30 Xaa Leu Ser Xaa Xaa Pro Ser Val Ser Leu Xaa Val Leu Xaa Xaa Ala 35 40 45 Gln Xaa Xaa Asn Asp Xaa Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 33 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PA03 <220> <221> Xaa <222> (7)..(7) <223> A, L, M, F, W, K, Q, E, S, V, I, Y, H, R, D, or T <220> <221> Xaa <222> (8)..(8) <223> A, L, M, F, W, K, Q, E, S, V, I, Y, H, R, D, or T <220> <221> Xaa <222> (10)..(10) <223> A, L, M, F, W, K, Q, E, S, V, I, Y, H, R, D, or T <220> <221> Xaa <222> (11)..(11) <223> A, L, M, F, W, K, Q, E, S, V, I, Y, H, R, D, or T <220> <221> Xaa <222> (14)..(14) <223> A, L, M, F, W, K, Q, E, S, V, I, Y, H, R, D, or T <220> <221> Xaa <222> (15)..(15) <223> A, L, M, F, W, K, Q, E, S, V, I, Y, H, R, D, or T <220> <221> Xaa <222> (18)..(18) <223> A, L, M, F, W, K, Q, E, S, V, I, Y, H, R, D, or T <220> <221> Xaa <222> (20)..(20) <223> A, L, M, F, W, K, Q, E, S, V, I, Y, H, R, D, or T <220> <221> Xaa <222> (42)..(42) <223> A, L, M, F, W, K, Q, E, S, V, I, Y, H, R, D, or T <220> <221> Xaa <222> (43)..(43) <223> A, L, M, F, W, K, Q, E, S, V, I, Y, H, R, D, or T <220> <221> Xaa <222> (46)..(46) <223> A, L, M, F, W, K, Q, E, S, V, I, Y, H, R, D, or T <220> <221> Xaa <222> (47)..(47) <223> A, L, M, F, W, K, Q, E, S, V, I, Y, H, R, D, or T <220> <221> Xaa <222> (49)..(49) <223> A, L, M, F, W, K, Q, E, S, V, I, Y, H, R, D, or T <220> <221> Xaa <222> (50)..(50) <223> A, L, M, F, W, K, Q, E, S, V, I, Y, H, R, D, or T <220> <221> Xaa <222> (53)..(53) <223> A, L, M, F, W, K, Q, E, S, V, I, Y, H, R, D, or T <220> <221> Xaa <222> (54)..(54) <223> A, L, M, F, W, K, Q, E, S, V, I, Y, H, R, D, or T <400> 33 Ile Ala Ala Lys Phe Asp Xaa Xaa Gln Xaa Xaa Ala Asp Xaa Xaa Ile 1 5 10 15 Leu Xaa Leu Xaa Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Arg Gln 20 25 30 Ser Leu Ser Asp Asp Pro Ser Val Ser Xaa Xaa Val Leu Xaa Xaa Ala 35 40 45 Xaa Xaa Leu Asn Xaa Xaa Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 34 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PA13 <220> <221> Xaa <222> (7)..(7) <223> H, E, V, A, L, Y, W, K, I, Q, T, or R <220> <221> Xaa <222> (8)..(8) <223> H, E, V, A, L, Y, W, K, I, Q, T, or R <220> <221> Xaa <222> (11)..(11) <223> H, E, V, A, L, Y, W, K, I, Q, T, or R <220> <221> Xaa <222> (14)..(14) <223> H, E, V, A, L, Y, W, K, I, Q, T, or R <220> <221> Xaa <222> (15)..(15) <223> H, E, V, A, L, Y, W, K, I, Q, T, or R <220> <221> Xaa <222> (18)..(18) <223> H, E, V, A, L, Y, W, K, I, Q, T, or R <220> <221> Xaa <222> (42)..(42) <223> H, E, V, A, L, Y, W, K, I, Q, T, or R <220> <221> Xaa <222> (46)..(46) <223> H, E, V, A, L, Y, W, K, I, Q, T, or R <220> <221> Xaa <222> (49)..(49) <223> H, E, V, A, L, Y, W, K, I, Q, T, or R <220> <221> Xaa <222> (50)..(50) <223> H, E, V, A, L, Y, W, K, I, Q, T, or R <220> <221> Xaa <222> (53)..(53) <223> H, E, V, A, L, Y, W, K, I, Q, T, or R <400> 34 Ile Ala Ala Lys Phe Asp Xaa Xaa Gln Ser Xaa Ala Asp Xaa Xaa Ile 1 5 10 15 Leu Xaa Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Arg Gln 20 25 30 Ser Leu Ser Asp Asp Pro Ser Val Ser Xaa Glu Val Leu Xaa Glu Ala 35 40 45 Xaa Xaa Leu Asn Xaa Ser Gln Ala Pro Lys 50 55

Claims (15)

  1. 삼중-나선 구조 (triple-helical structure)를 갖는 폴리펩티드로서, 여기에서 나선 1, 2 및 3은 이들의 위치와 관련하여 각각 서열번호: 1의 위치 7-19, 23-37 및 40-56에 상응하고, 상기 폴리펩티드는:
    a) 서열번호: 1의 위치 13에 상응하는 위치에 아스파르트산 (D) 및 글루탐산 (E)으로부터 선택된 산성 아미노산; 및
    b) 서열번호: 1의 위치 31에 상응하는 위치에 아르기닌 (R), 리신 (K) 및 히스티딘 (H) 중 어느 하나로부터 선택된 염기성 아미노산을 포함하는 삼중-나선 구조를 갖는 폴리펩티드.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 폴리펩티드는 표면 플라스몬 공명 (Surface Plasmon Resonance: SPR)에 의해 결정시에 면역글로불린의 Fc 도메인에 대해 검출 가능한 결합 친화도를 갖지 않는 삼중-나선 구조를 갖는 폴리펩티드.
  3. 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 폴리펩티드는
    a) 서열번호: 1의 위치 13에 상응하는 위치에 아스파르트산 (D); 및/또는
    b) 서열번호: 1의 위치 31에 상응하는 위치에 아르기닌 (R)을 포함하는 삼중-나선 구조를 갖는 폴리펩티드.
  4. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호: 1의 위치 10, 14 및 35에 상응하는 하나 이상의 위치에 세린 (S)을 추가로 포함하는 삼중-나선 구조를 갖는 폴리펩티드.
  5. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질.
  6. 표적 단백질에 대한 결합 친화도를 갖는 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 따른 삼중-나선 구조를 갖는 폴리펩티드를 생성하는 방법으로서,
    a) 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 폴리펩티드를 제공하는 단계;
    b) 상기 a)의 하나 이상의 폴리펩티드를 표적 단백질과 접촉시키는 단계;
    c) 상기 표적 단백질에 결합된 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 포함하는 복합체를 확인하는 단계;
    d) 상기 표적 단백질에 결합할 수 있는 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 수득하는 단계를 포함하는 방법.
  7. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드, 또는 청구항 5에 따른 융합 단백질, 또는 청구항 6의 방법에 의해 수득된 표적 단백질에 대한 결합 친화도를 갖는 폴리펩티드를 포함하는 조성물.
  8. 기술 응용분야 (technical applications)에 사용하기 위한, 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드, 또는 청구항 5에 따른 융합 단백질, 또는 청구항 6의 방법에 의해 수득된 표적 단백질에 대한 결합 친화도를 갖는 폴리펩티드.
  9. 친화도 크로마토그래피에 사용하기 위한, 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드, 또는 청구항 5에 따른 융합 단백질, 또는 청구항 6의 방법에 의해 수득된 표적 단백질에 대한 결합 친화도를 갖는 폴리펩티드.
  10. 약제 (medicament), 진단제 (diagnostic agent) 및/또는 예후제 (prognostic agent)로서 사용하기 위한, 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드, 또는 청구항 5에 따른 융합 단백질, 또는 청구항 6의 방법에 의해 수득된 표적 단백질에 대한 결합 친화도를 갖는 폴리펩티드, 또는 청구항 7에 따른 조성물.
  11. 삼중-나선 구조를 갖는 폴리펩티드의 면역글로불린의 Fc 도메인에 대한 결합 친화도를 감소시키는 방법으로서,
    a) 나선 1 및 나선 2 내에 적어도 2개의 아미노산 위치를 돌연변이를 위해 선택하는 단계로서, 상기 나선 1 및 2는 이들의 위치와 관련하여 각각 서열번호: 1의 위치 7-19 및 23-37에 상응하고, 상기 돌연변이를 위한 적어도 2개의 아미노산 위치는 서열번호: 1의 아미노산 서열에서 위치 13 및 31에 상응하는 단계; 및
    b) 돌연변이를 위해 선택된 상기 적어도 2개의 아미노산 위치를 돌연변이시키는 단계로서, 서열번호: 1의 위치 13에 상응하는 위치에서 아스파르트산 (D) 및 글루탐산 (E)으로부터 선택된 산성 아미노산에 대한 아미노산의 치환, 및 서열번호: 1의 위치 31에 상응하는 위치에서 아르기닌 (R), 리신 (K) 및 히스티딘 (H) 중 어느 하나로부터 선택된 염기성 아미노산에 대한 아미노산의 치환을 포함하는 단계를 포함하는 방법.
  12. 청구항 11에 있어서, 상기 돌연변이는 서열번호: 1의 위치 13에 상응하는 위치에서 아스파르트산 (D)에 대한 아미노산의 치환 및 서열번호: 1의 위치 31에 상응하는 위치에서 아르기닌 (R)에 대한 아미노산의 치환을 포함하는 방법.
  13. 청구항 11 또는 12에 있어서, 상기 돌연변이는 서열번호: 1의 아미노산 서열에서 위치 10, 14 및 35에 상응하는 위치에서 세린 (S)에 대한 하나 이상의 아미노산의 치환을 추가로 포함하는 방법.
  14. 청구항 6 및 11 내지 13 중 어느 한 항의 방법에 따라 제조되는 삼중-나선 구조를 갖는 폴리펩티드.
  15. 청구항 1 내지 4 및 14 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드, 또는 청구항 5에 따른 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
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