CN107849095A - 酸性pH范围内的抗体结合能力降低的抗体结合性蛋白质 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种蛋白A配体，其在固定化于载体而制作亲和分离基质时，在酸性pH范围内的抗体结合能力降低。本发明提供一种蛋白质，其特征在于，其含有在序列号1～5所述的来自蛋白A的E、D、A、B或C结构域的氨基酸序列中将Fc结合部位的疏水性氨基酸残基置换为其它疏水性氨基酸残基或极性无电荷氨基酸残基而得到的氨基酸序列，并且所述蛋白质与上述置换前相比，在酸性pH范围内的抗体结合能力降低。

Description

酸性pH范围内的抗体结合能力降低的抗体结合性蛋白质
技术领域
本发明涉及一种特征在于酸性pH范围内的抗体结合能力降低的抗体结合性蛋白质。
背景技术
抗体具有与被称为抗原的物质特异性结合的功能、以及与其它生物分子、细胞协作将具有抗原的因子无毒化并除去的功能。抗体这一名称是重视这种与抗原结合的功能的命名，作为物质则被称为“免疫球蛋白(Ig)”。
近年来，随着基因工程学、蛋白质工程学和细胞工程学的发展，被称为抗体药物的利用了抗体所具有的功能的药品的开发正在活跃地进行。抗体药物与以往的药物相比更特异性地作用于靶分子，因此可以期待减轻副作用且得到高治疗效果的优点，有助于实际改善各种病态。
另一方面，抗体药物由于要大量给药于生物体，因此据说与其它重组蛋白药品相比其纯度对品质的影响更大。因此，为了制造纯度高的抗体，通常使用亲和色谱等手法，该手法中利用使用与抗体特异性结合的分子作为配体的吸附材料。
作为抗体药物进行开发的基本上是单克隆抗体，使用重组培养细胞技术等大量地进行生产。“单克隆抗体”是指由来自单一抗体产生细胞的克隆得到的抗体。在分子结构上，现在上市的抗体药物几乎全部是免疫球蛋白G(IgG)亚型。作为对IgG抗体具有亲和性的免疫球蛋白结合性蛋白质，广泛已知的是蛋白A。蛋白A是革兰氏阳性菌中的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)所生产的细胞壁蛋白质的1种，由信号序列S、5个免疫球蛋白结合性结构域(E结构域、D结构域、A结构域、B结构域、C结构域)和作为细胞壁结合结构域的XM区域构成(非专利文献1)。在抗体药物制造工序中的初期纯化工序(捕获工序)中，通常利用在水不溶性载体上固定化有蛋白A作为配体的亲和色谱用柱(以下记作蛋白A柱)(非专利文献1、非专利文献2、非专利文献3)。
为了改良蛋白A柱的性能，进行了各种技术开发。从配体方面着手的技术开发也在进行中。最初利用天然型的蛋白A作为配体，但也可看到多种将通过蛋白质工程学方式加以改造的重组蛋白A作为配体来改良柱的性能的技术。
作为代表性的重组蛋白A，可以列举除去了无免疫球蛋白结合活性的XM区域的重组蛋白A(rProtein ASepharose(注册商标)、GE Healthcare Japan制)。以除去了XM区域的重组蛋白A为配体的柱与以往产品相比具有抑制蛋白质的非特异吸附的优点，现在工业上也在广泛使用。
此外有如下发明：利用向蛋白A中导入1个Cys的变异的重组蛋白A(专利文献1)或导入有多个Lys的变异的重组蛋白A(专利文献2)作为配体的发明。这些技术在向水不溶性载体的固定化中显示出效果，在抗体与柱的结合容量、固定化配体的泄露降低方面具有优点。
作为加以改造后的重组蛋白A，还广泛已知利用在B结构域中导入有变异的改造结构域(称为Z结构域)作为配体的技术(非专利文献1、非专利文献4、专利文献3)。Z结构域是对B结构域导入将第29位的Gly置换为Ala的变异的改造结构域。需要说明的是，Z结构域中还同时导入有将B结构域第1位的Ala置换为Val的变异，这是目的在于基因工程学上容易制作将多个结构域连接而成的编码基因的变异，对结构域的功能不产生影响(例如专利文献4中有使用将Z结构域第1位的Val置换为Ala的变异体的实施例)。
已知Z结构域具有与B结构域相比耐碱性也高，在使用杀菌、洗涤效果高的碱溶液进行洗涤、从而使柱重复使用的优点。发明了以Z结构域为基础、将Asn置换为其它氨基酸而进一步赋予耐碱性的配体(专利文献5、专利文献6)，工业上已经开始使用。
从而，已经广泛确认向蛋白A的免疫球蛋白结合性结构域(E、D、A、B和、C结构域)导入将第29位的Gly置换为Ala的变异的方法的有用性。实际上，在1987年公开该“G29A”的变异后开发的关于改造蛋白A的现有技术中，也导入了该“G29A”的变异(专利文献2、专利文献4、专利文献6)。
作为Z结构域的另一个特征，可以列举对免疫球蛋白的Fab区域的结合能力弱(非专利文献5)。由于该特征而具有如下优点：在用酸使所结合的抗体解离的工序中，抗体容易解离(非专利文献1、专利文献7)。如果抗体容易解离，则能够用更少体积的洗脱液回收更高浓度的含抗体洗脱液。近年来，在抗体药物制造中，每1批细胞培养液量已经超过10000升，抗体表达水平在近几年已经提高到10g/L(非专利文献6)。必然要求作为下游的纯化工序以增大处理规模来应对，非常期待能够以少量的洗脱液回收更高浓度的含抗体洗脱液的技术改良。
除了Z结构域以外，作为改造蛋白A、配体，也进行了以蛋白A的C结构域为基础的研究(专利文献4)。这些配体的特征在于，有效利用野生型C结构域本来所具有的高耐碱性，作为代替以B结构域为基础而制作的Z结构域的新的基质、结构域而受到关注。但是，对C结构域进行检验的结果是，存在在用酸使结合于C结构域的抗体解离的工序中抗体难以解离的缺点。非专利文献2、专利文献4中公开了C结构域对免疫球蛋白的Fab区域的结合能力强，推测该特征是难以用酸使抗体解离的原因。为了改善该缺点，使用导入有将第29位的Gly置换为Ala的变异的C结构域检验了抗体酸解离特性，结果可见与野生型的C结构域相比抗体更容易解离的倾向，但仍不充分。已知抗体在低pH下会发生聚集或者抗体活性降低。这样的现象不仅在抗体的制造中成为纯化工序的负担(工序数增加、收率降低)，而且作为药品有时会带来严重的副作用。因此，需要能够在更高pH下洗脱的蛋白A色谱载体。作为与提高抗体酸解离特性有关的变异，已知第33位的Ser的置换、第18位的His的置换以及各种氨基酸残基向His的置换等(专利文献8、9、10)。
另一方面，虽然对于蛋白A的变异导入已经进行了很多研究，但就蛋白A的抗体部位、特别是Fc结合部位而言，有时会由于导入氨基酸置换变异而引起抗体结合活性的显著降低。其中，第13位的Phe、第17位的Leu、第31位的Ile等疏水性氨基酸残基是对于与Fc的结合而言不可或缺的氨基酸残基(非专利文献7、8)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:美国专利第6399750号说明书
专利文献2:日本特开2007-252368号公报
专利文献3:美国专利第5143844号说明书
专利文献4:日本特开2006-304633号公报
专利文献5:欧洲专利第1123389号说明书
专利文献6:国际公开第03/080655号
专利文献7:美国专利申请第2006/0194950号说明书
专利文献8:国际公开第2011/118699号
专利文献9:国际公开第2012/087231号
专利文献10:国际公开第2012/165544号
非专利文献
非专利文献1:Hober S.等著、“J.Chromatogr.B”2007年、848卷、40-47页
非专利文献2:Low D.等著、“J.Chromatogr.B”、2007年、848卷、48-63页
非专利文献3:Roque A.C.A.等著、“J.Chromatogr.A”、2007年、1160卷、44-55页
非专利文献4:Nilsson B.等著、“Protein Engineering”、1987年、1卷、107-113页
非专利文献5:Jansson B.等著、“FEMS Immunology and MedicalMicrobiology”、1998年、20卷、69-78页
非专利文献6:稻川淳一等著、“分离技术”、2008年、38卷、201-207页
非专利文献7:O’Seaghdha M.等著、“FEBS J”、2006年、273卷、4831-4841页
非专利文献8:Tsukamoto M.等著、“J.Biol.Eng.”、2014年、8卷、15
发明内容
发明要解决的问题
本发明的问题在于，提供一种在固定化于载体而制作亲和分离基质时、在酸性pH范围内的抗体结合能力降低的蛋白A配体。
用于解决问题的方案
本发明人们对具有氨基酸置换变异的繁多的重组蛋白A变异体的活性进行了比较研究，结果发现，通过将Fc结合部位的疏水性氨基酸残基置换为其它疏水性氨基酸残基或极性无电荷氨基酸残基，从而能够解决上述问题，直至完成了本发明。
即，本发明涉及一种蛋白质，其特征在于，其含有在序列号1～5所述的来自蛋白A的E、D、A、B或C结构域的氨基酸序列中将Fc结合部位的疏水性氨基酸残基置换为其它疏水性氨基酸残基或极性无电荷氨基酸残基而得到的氨基酸序列，并且所述蛋白质与上述置换前相比，在酸性pH范围内的抗体结合能力降低。
优选Fc结合部位的疏水性氨基酸残基为对应于C结构域的第5位的Phe、对应于C结构域的第13位的Phe、对应于C结构域的第17位的Leu或对应于C结构域的第31位的Ile。
优选其它疏水性氨基酸残基为Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Phe或Trp。
优选极性无电荷氨基酸残基为Ser、Thr、Gln、Asn、Tyr或Cys。
优选以下所示的氨基酸残基中的90％以上被保留，所述氨基酸残基为：Gln-9、Gln-10、Tyr-14、Pro-20、Asn-21、Leu-22、Gln-26、Arg-27、Phe-30、Leu-34、Pro-38、Ser-39、Leu-45、Leu-51、Asn-52、Gln-55和Pro-57(残基号对应于C结构域)。
优选对应于C结构域的第40位的氨基酸为Val以外的氨基酸。
优选上述氨基酸序列是进一步将疏水性氨基酸残基、酸性氨基酸残基或极性无电荷氨基酸残基置换为碱性氨基酸残基而得到的。
此外，本发明涉及将2个以上上述蛋白质连接而得到的包含多个结构域的蛋白质。
此外，本发明涉及编码上述蛋白质的DNA。
此外，本发明涉及包含上述DNA的载体。
此外，本发明涉及用上述载体转化宿主细胞而得到的转化体。
此外，本发明涉及上述蛋白质的制造方法，其使用：利用了上述DNA的无细胞蛋白质合成系统、或上述转化体。
此外，本发明涉及亲和分离基质，其是将上述蛋白质作为亲和配体固定化在由水不溶性的基材构成的载体而得到的。
优选上述亲和分离基质能与含有免疫球蛋白的Fc区域的蛋白质结合。
优选含有免疫球蛋白的Fc区域的蛋白质为免疫球蛋白G或免疫球蛋白G衍生物。
此外，本发明涉及上述亲和分离基质的制造方法，其包含如下步骤：将上述蛋白质作为亲和配体固定在由水不溶性的基材构成的载体。
此外，本发明涉及含有免疫球蛋白的Fc区域的蛋白质的纯化方法，其包含：使含有免疫球蛋白的Fc区域的蛋白质吸附于上述亲和分离基质。
优选包含下述(a)～(b)的工序：(a)使包含含有免疫球蛋白的Fc区域的蛋白质的液体吸附于上述亲和分离基质的工序；(b)使pH3.5以上的洗脱液与亲和分离基质接触，将上述含有免疫球蛋白的Fc区域的蛋白质洗脱的工序。
优选被洗脱的含有免疫球蛋白的Fc区域的蛋白质中所含的、源自宿主的蛋白质和/或含有免疫球蛋白的Fc区域的蛋白质的聚集体的含量减少。
发明的效果
本发明的蛋白质在作为亲和配体固定化于载体而制作亲和分离基质时，亲和分离基质在酸性pH范围内的抗体结合能力降低。从而，能够在比以往更高的pH下洗脱抗体。
附图说明
图1是葡萄球菌属(Staphylococcus)的蛋白A的E、D、A、B和C结构域的序列比较表。
图2是使用C-G29A.2d亲和分离基质的洗脱试验结果。
图3是使用改造型C-G29A.2d亲和分离基质的实施例8的洗脱试验结果。
具体实施方式
本发明的蛋白质，其特征在于，其含有在序列号1～5所述的来自蛋白A的E、D、A、B或C结构域的氨基酸序列中将Fc结合部位的疏水性氨基酸残基置换为其它疏水性氨基酸残基或极性无电荷氨基酸残基而得到的氨基酸序列，所述蛋白质与上述置换前相比，在酸性pH范围内的抗体结合能力降低。
蛋白A是包含作为免疫球蛋白结合性结构域的E、D、A、B和C结构域的蛋白质。E、D、A、B和C结构域是能够结合于免疫球蛋白的互补决定区(CDR)以外的区域的免疫球蛋白结合性结构域，任一结构域均具有结合于免疫球蛋白的Fc区域、Fab区域和Fab区域中的尤其是Fv区域的活性。需要说明的是，本发明中对蛋白A的来源没有特别限定，优选来自葡萄球菌属(Staphylococcus)的蛋白A。
“蛋白质”这一术语包括具有多肽结构的所有分子，片段化的或通过肽键而连接的多肽链也包括在“蛋白质”这一术语中。此外，“结构域”是蛋白质的高级结构中的单元，是指由数十到数百个氨基酸残基序列构成且足以表现出某种物理化学功能或生物化学功能的蛋白质的单元。
来自结构域的氨基酸序列是指置换氨基酸前的氨基酸序列。来自结构域的氨基酸序列并非仅限于蛋白A的E、D、A、B或C结构域的野生型氨基酸序列，通过氨基酸的置换、插入、缺失和化学修饰而部分性改造过的氨基酸序列且具有与Fc区域的结合能力蛋白质，则也包含在来自结构域的氨基酸序列中。作为来自结构域的氨基酸序列，可以列举例如：构成序列号1～5所述的葡萄球菌属的蛋白A的E、D、A、B和C结构域的氨基酸序列，此外可以列举：对于蛋白A的E、D、A、B和C结构域导入有将对应于C结构域的29位的Gly置换为Ala的变异的氨基酸序列所构成的蛋白质。此外在B结构域中导入有A1V和G29A这样的变异的Z结构域也具有与Fc区域的结合能力，因此也属于来自结构域的氨基酸序列。来自结构域的氨基酸序列优选化学稳定性高的结构域或其变异体。
来自结构域的氨基酸序列具有与Fc区域的结合能力。来自结构域的氨基酸序列与序列号1～5所述的蛋白A的E、D、A、B或C结构域的序列同源性优选为85％以上，更优选为90％以上，进一步优选为95％以上。
本发明的蛋白质含有在来自蛋白A的E、D、A、B或C结构域的氨基酸序列中将Fc结合部位的疏水性氨基酸残基置换为其它疏水性氨基酸残基或极性无电荷氨基酸残基而得到的氨基酸序列。
氨基酸的置换是指：去除原氨基酸且在其位置上追加不同种类的另一氨基酸的变异。需要说明的是，关于置换氨基酸的变异的表述，表述为在置换位置的序号前记入野生型或非变异型的氨基酸、在置换位置的序号后记入发生变异的氨基酸。例如，将第29位的Gly置换为Ala的变异表述为G29A。
作为Fc结合部位的疏水性氨基酸残基，可以列举：对应于C结构域的第5位的Phe、对应于C结构域的第13位的Phe、对应于C结构域的第17位的Leu、对应于C结构域的第31位的Ile。需要说明的是，“对应于”是指：如图1所示那样对蛋白A的E、D、A、B和C结构域进行对齐时，在纵列上位于同一位置。
作为进行置换的其它疏水性氨基酸残基，可以列举：Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Phe、Trp，其中优选Ala、Val、Leu、Ile、Phe。在此，其它疏水性氨基酸残基是指与成为置换对象的原疏水性氨基酸残基不同的疏水性氨基酸残基。例如，在成为置换对象的原氨基酸残基为对应于C结构域的第5位或第13位的Phe时，作为其它疏水性氨基酸残基可以列举上述其它氨基酸残基中的除Phe以外的氨基酸残基。在成为置换对象的原氨基酸残基为对应于C结构域的第17位的Leu时，作为其它疏水性氨基酸残基，可以列举上述其它氨基酸残基中的除Leu以外的氨基酸残基。在成为置换对象的原氨基酸残基为对应于C结构域的第31位的Ile时，作为其它疏水性氨基酸残基可以列举上述其它氨基酸残基中的除Ile以外的氨基酸残基。
作为进行置换的极性无电荷氨基酸残基，可以列举：Ser、Thr、Gln、Asn、Tyr、Cys，其中优选Ser、Thr、Gln、Asn、Tyr。
作为更具体的置换方式，可以列举：对应于C结构域的第5位的Phe向Ala、Tyr的置换；对应于C结构域的第13位的Phe向Tyr的置换；对应于C结构域的第17位的Leu向Ile、Val、Thr的置换；对应于C结构域的第31位的Ile向Leu、Ser、Thr、Val的置换。其中，优选C结构域中的F5A、F5Y、C结构域中的F13Y；C结构域中的L17I、L17V、L17T；C结构域中的I31L、I31S、I31T、I31V；B结构域中的I31L、I31T。
关于Fc结合部位的氨基酸置换的个数，只要与置换前相比在酸性pH范围内的抗体结合能力降低则没有特别限定，从维持变异导入前的蛋白质的立体结构和维持中性范围内的抗体结合能力的观点出发，优选为4个以下，更优选为2个以下。作为置换2个氨基酸的方式，可以列举例如：C结构域中的L17I与I31L的置换；在E、D、A或B结构域中，对对应于C结构域的第17位和第31位的位置的氨基酸同样进行置换的方法。
只要与置换前相比在酸性pH范围内的抗体结合能力降低，则除了将Fc结合部位的疏水性氨基酸残基置换为其它疏水性氨基酸残基或极性无电荷氨基酸残基以外，还可以包含任意的氨基酸置换。作为这样的氨基酸置换，可以列举C结构域中的G29A的置换。此外可以列举E、D、A或B结构域中的对应于C结构域的第29位的位置的氨基酸的同样的置换。
进而，作为任意的氨基酸置换，可以列举对应于C结构域的第40位的Val向Val以外的氨基酸残基的置换，具体而言，可以列举C结构域中的V40Q的置换。此外可以列举疏水性氨基酸残基、酸性氨基酸残基或极性无电荷氨基酸残基向碱性氨基酸残基的置换，具体而言，可以列举C结构域中的A12R、L19R、L22R、Q26R、Q32R、S33H、V40H的置换或者E、D、A、B或B结构域中的同样的置换。
在序列号1～5所述的来自蛋白A的E、D、A、B或C结构域的氨基酸序列中将Fc结合部位的疏水性氨基酸残基置换为其它疏水性氨基酸残基或极性无电荷氨基酸残基而得到的氨基酸序列、与序列号1～5中记载的蛋白A的E、D、A、B或C结构域的序列同源性优选为85％以上，更优选为90％以上，进一步优选为95％以上。
在本发明的蛋白质中，以下所示的氨基酸残基中，优选90％以上被保留，更优选95％以上被保留，所述氨基酸残基为：Gln-9、Gln-10、Tyr-14、Pro-20、Asn-21、Leu-22、Gln-26、Arg-27、Phe-30、Leu-34、Pro-38、Ser-39、Leu-45、Leu-51、Asn-52、Gln-55和Pro-57(残基号对应于C结构域)。
本发明的蛋白质，其特征在于，与置换前相比，在酸性pH范围内的抗体结合能力降低。作为酸性pH范围，可以列举弱酸性范围，具体而言，可以列举pH3～6的范围。
酸性范围内的抗体结合能力可以通过使用IgG琼脂糖的pH梯度洗脱试验(实施例1)、使用分子间相互作用解析装置测定酸性pH范围内的抗体结合能力、固定化有配体的亲和分离基质的抗体洗脱试验(实施例5)进行评价。例如，在使用IgG琼脂糖的pH梯度洗脱试验的情况下，与变异导入前(例如C-G29A.2d)的蛋白质相比，在酸性范围内的抗体结合能力降低的变异体在更高的pH下洗脱。在以由变异导入前的蛋白质的洗脱峰的峰顶算出的洗脱pH为基准时，变异体的洗脱pH优选高0.05以上，更优选高0.1以上。此外，固定化有配体的亲和分离基质的抗体洗脱试验中，对使用高pH的洗脱液(例如pH4)洗脱抗体时、固定化有变异导入前(例如C-G29A.2d)的配体的亲和分离基质、与固定化有变异体的亲和分离基质的各自的抗体回收率进行比较。与固定化有变异导入前的配体的亲和分离基质相比，固定化有变异体的亲和分离基质的抗体回收率优选高1％以上，更优选高5％以上。
本发明的蛋白质可以为仅包含导入有上述氨基酸置换的单个结构域的蛋白质，也可以为将2个以上的导入有上述氨基酸置换的结构域连接而得到的包含多个结构域的蛋白质。
当为包含多个结构域的蛋白质时，所连接的蛋白质既可以是来自同种结构域的蛋白质(均二聚体、均三聚体等均聚体)，也可以是来自不同种类的结构域的蛋白质(异二聚体、异三聚体等异源聚合体)。所连接的蛋白质的个数优选为2个以上，更优选为2～10个，进一步优选为2～6个。
在包含多个结构域的蛋白质中，作为单体蛋白质彼此、单结构域彼此的连接方式，可以列举：不借助作为接头的氨基酸残基而直接连接的方法，或通过1个或多个氨基酸残基连接的方法，但不限于这些。对连接中所使用的氨基酸残基的个数没有特别限定，连接方式和连接数只要不会导致单体蛋白质的3维立体结构不稳定则没有特别限定。
此外，以上述蛋白质、或上述包含多个结构域的蛋白质为构成成分之一、与功能不同的其它蛋白质融合而成的融合蛋白也包含在本发明的蛋白质中。作为融合蛋白的例子，可以列举：融合有白蛋白、GST(谷胱甘肽S-转移酶)、MBP(麦芽糖结合蛋白)的蛋白质作为例子，但不限于这些。通过以与GST、MBP的融合蛋白形式进行表达，从而能够容易地进行蛋白质的纯化。此外，在融合有DNA适体等核酸、抗生素等药物、PEG(聚乙二醇)等高分子时，只要发挥与本发明相同的效果则也包含在本发明的蛋白质中。
本发明还涉及编码上述蛋白质的DNA。关于DNA，只要将构成其的碱基序列翻译而得的氨基酸序列构成本发明的蛋白质即可。这样的碱基序列可以利用通常使用的公知方法、例如聚合酶链反应(以下简记为PCR)法取得。此外，还能够通过公知的化学合成法来合成，进而还能够由DNA文库得到。该碱基序列的密码子可被简并密码子置换，只要翻译时编码同一氨基酸则不必与本来的碱基序列相同。
本发明的DNA通过对编码野生型或变异型的蛋白A的结构域的以往公知的DNA位点特异性地导入变异而得到。位点特异性变异的导入可以按照以下方式用重组DNA技术、PCR法等进行。
利用重组DNA技术进行的变异导入例如可以通过盒式变异法来进行，所述盒式变异法是指：在编码本发明的蛋白质的基因中在希望导入变异的目标位点的两侧存在适当的限制酶识别序列时，将这些限制酶识别序列部分用上述限制酶切断而除去包含期望导入变异的位点的区域后，插入通过化学合成等得到的仅目标位点导入有变异的DNA片段。
此外，利用PCR进行的位点特异性变异导入例如可以通过双引物法进行，所述双引物法是指：以编码蛋白质的双链质粒为模板，使用含有与+链和-链互补的变异的2种合成寡聚引物来进行PCR。
此外，编码包含多个结构域的蛋白质的DNA可以通过将仅期望个数的编码本发明的单体蛋白质(1个结构域)的DNA串联连接而制作。例如，就编码包含多个结构域的蛋白质的DNA的连接方法而言，可以在DNA序列中导入适当的限制酶位点，将用限制酶片段化的双链DNA通过DNA连接酶进行连接。限制酶位点可以为1种，也可以导入多个不同种类的限制酶位点。或者，编码包含多个结构域的蛋白质的DNA还可以通过对编码蛋白A的DNA(例如国际公开第06/004067号)应用上述变异导入法来制作。在此，在编码包含多个结构域的蛋白质的DNA中、编码各单体蛋白质的碱基序列同源时，可能在宿主中引发同源重组，因此所连接的编码单体蛋白质的DNA的碱基序列间的序列同源性为90％以下，更优选为85％以下。
本发明的载体中含有上述编码蛋白质或包含多个结构域的蛋白质的碱基序列、和以能够作用于该碱基序列的方式连接的在宿主中发挥作用的启动子。通常可以通过将编码上述蛋白质的DNA连接或插入到载体中而得到。
用于插入基因的载体只要是能够在宿主中自主复制的载体则没有特别限定，可以使用质粒DNA、噬菌体DNA作为载体。关于用于插入基因的载体，例如在使用大肠杆菌作为宿主时，可以列举pQE系载体(QIAGEN公司制)、pET系载体(Merck公司制)和pGEX系载体(GEHealthcare Japan制)的载体等。在使用短芽孢杆菌属细菌作为宿主时，可以使用例如作为枯草杆菌载体公知的pUB110或pHY500(日本特开平2-31682号公报)、pNY700(日本特开平4-278091号公报)、pNU211R2L5(日本特开平7-170984号公报)、pHT210(日本特开平6-133782号公报)或作为大肠杆菌与短芽孢杆菌属细菌的穿梭载体的pNCMO2(日本特开2002-238569号公报)等。
通过用载体转化宿主，可以得到转化体。作为宿主，没有特别限定，在廉价地大量生产方面，可适当使用大肠杆菌、枯草杆菌、短芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属、链霉菌属(Streptomyces)、棒状杆菌属(Corynebacterium)等细菌(真细菌)。可以更优选枯草杆菌、短芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属、链霉菌属(Streptomyces)、棒状杆菌属(Corynebacterium)等革兰氏阳性菌。可以进一步优选作为适合大量生产蛋白A的适合例(国际公开第06/004067号)而公知的短芽孢杆菌属细菌。
作为短芽孢杆菌属细菌，没有特别限定，可以列举例如土壤短芽孢杆菌(Brevibacillus agri)、波茨坦短芽胞杆菌(Brevibacillus borstelensis)、短小短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)、中孢短芽孢杆菌(Brevibacillus centrosporus)、桥石短芽胞杆菌(Brevibacillus choshinensis)、美丽短芽胞杆菌(Brevibacillus formosus)、污染短芽孢杆菌(Brevibacillus invocatus)、侧孢短芽胞杆菌(Brevibacilluslaterosporus)、沼泽短芽孢杆菌(Brevibacillus limnophilus)、副短小短芽孢杆菌(Brevibacillus parabrevis)、罗伊氏短芽孢杆菌(Brevibacillus reuszeri)、嗜热红色短芽胞杆菌(Brevibacillus thermoruber)。优选短小短芽孢杆菌47株(JCM6285)、短小短芽孢杆菌47K株(FERM BP-2308)、短小短芽孢杆菌47-5Q株(JCM8970)、桥石短芽胞杆菌HPD31株(FERM BP-1087)和桥石短芽胞杆菌HPD31-OK株(FERM BP-4573)。根据提高生产量等目的，可以使用上述短芽孢杆菌属细菌的蛋白酶缺陷株、高表达株或芽胞形成能力缺陷株之类的变异株(或诱导株)。如果具体列举，可以使用作为来自桥石短芽胞杆菌HPD31的蛋白酶变异株的桥石短芽胞杆菌HPD31-OK(日本特开平6-296485号公报)、不具有芽胞形成能力的桥石短芽胞杆菌HPD31-SP3(国际公开第05/045005号)。
作为向宿主细胞导入载体的方法，可以列举例如：使用钙离子的方法、电穿孔法、原生质体法、乙酸锂法、农杆菌感染法、基因枪法或聚乙二醇法等，但不限于这些。此外，作为使宿主表现出所得到的基因的功能的方法，还可以列举使本发明中得到的基因整合到基因组(染色体)的方法等。
通过使用了上述转化体或DNA的无细胞蛋白质合成系统，可以制造蛋白质。
在使用转化体制造蛋白质时，可以通过用培养基培养转化细胞并在培养菌体中(也包括菌体周质区域中)或培养液中(菌体外)生成、蓄积本发明的蛋白质来制造，可以从该培养物中采集期望的蛋白质。
在使用转化细胞制造蛋白质时，还能够在转化体的细胞内和/或周质区域内蓄积蛋白质。这种情况下，蓄积在细胞内时，在可以防止表达蛋白质的氧化、也不存在与培养基成分的副反应方面是有利的；蓄积在周质区域内时，在可以抑制细胞内蛋白酶所引起的分解方面是有利的。另一方面，在制造蛋白质时，还能够使蛋白质分泌到转化体的细胞外。这种情况下，不需要菌体破碎、提取的工序，因此在降低制造成本方面是有利的。
用培养基培养本发明的转化细胞的方法按照通常用于培养宿主的方法来进行。用于培养所得到的转化体的培养基只要能够高效率、高收量地生产该蛋白质则没有特别限制。具体而言，可以使用葡萄糖、蔗糖、甘油、多聚蛋白胨、肉浸膏、酵母浸提物、水解酪蛋白氨基酸等碳源、氮源。此外，可根据需要添加钾盐、钠盐、磷酸盐、镁盐、锰盐、锌盐、铁盐等无机盐类。在使用营养缺陷性的宿主细胞时，添加生育所要求的营养物质即可。此外，如果需要也可以添加青霉素、红霉素、氯霉素、新霉素等抗生素。
进而，为了抑制存在于菌体内外的来自宿主的蛋白酶所引起的该目标蛋白质分解、低分子化，可以以适当浓度添加公知的各种蛋白酶抑制剂，即苯甲基磺酰氟(PMSF)、苯甲脒、4-(2-氨基乙基)-苯磺酰氟(AEBSF)、抗蛋白酶、胰凝乳蛋白酶抑制剂(Chymostatin)、亮抑肽酶、胃蛋白酶抑制剂A、膦酰二肽、抑蛋白酶肽(Aprotinin)、乙二胺四乙酸(EDTA)和/或其他市售的蛋白酶抑制剂。
进而，为了使本发明的蛋白质正确地折叠，例如还可以利用GroEL/ES、Hsp70/DnaK、Hsp90、Hsp104/ClpB等分子伴侣。这种情况下，例如可以通过共表达或融合蛋白化等手法使其与本发明的蛋白质共存。需要说明的是，为了使本发明的蛋白质正确折叠，还有如下方法：将有助于正确折叠的添加剂加入到培养基中、和在低温下进行培养等手法，但不限于这些。
作为培养以大肠杆菌为宿主而得到的转化细胞的培养基，可以列举LB培养基(蛋白胨1％、酵母浸提物0.5％、NaCl 1％)或2×YT培养基(蛋白胨1.6％、酵母浸提物1.0％、NaCl 0.5％)等。
作为培养以短芽孢杆菌属细菌为宿主而得到的转化体的培养基，可以列举TM培养基(蛋白胨1％、肉浸膏0.5％、酵母浸提物0.2％、葡萄糖1％、pH7.0)或2SL培养基(蛋白胨4％、酵母浸提物0.5％、葡萄糖2％、pH7.2)等。
此外，通过在培养温度15～42℃、优选20～37℃下在通气搅拌条件下好氧培养数小时～数天，从而在培养细胞内(包括周质区域内)或培养溶液(细胞外)中蓄积并回收本发明的蛋白质。根据情况也可以关闭通气进行厌氧培养。
在分泌生产重组蛋白时，可以在培养结束后通过离心分离、过滤等常规分离方法将培养细胞与含有分泌生产出的蛋白质的上清分离，从而回收所生产的重组蛋白。
此外，在培养细胞内(包括周质区域内)蓄积时，例如也可以通过从培养液中利用离心分离、过滤等方法采集菌体、然后将该菌体利用超声波破碎法、弗氏细胞压碎器法等破碎和/或添加表面活性剂等而可溶化，从而回收在细胞内蓄积生产的蛋白质。
在通过无细胞蛋白质合成系统制造本发明的蛋白质时，作为无细胞蛋白质合成系统，没有特别限定，例如可以使用来自原核细胞、来自植物细胞、来自高等动物细胞的合成系统等。
本发明的蛋白质的纯化可以单独通过亲和色谱、阳离子或阴离子交换色谱、凝胶过滤色谱等或将它们适当组合而进行。
得到的纯化物质为目标蛋白质这一点的确认，可以通过常规方法、例如SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳、N末端氨基酸序列分析、蛋白质印迹等来进行。
将通过上述方法生产的蛋白质作为亲和配体固定化于由水不溶性基材构成的载体，从而可以制造亲和分离基质。在此，“亲和配体”是基于以抗原与抗体的结合为代表的特异性的分子间亲和力、从某一分子集合中选择性捕集(结合)目标分子的物质(官能团)的术语，本发明中是指与免疫球蛋白特异性结合的蛋白质。本说明书中简单表述为“配体”时，也与“亲和配体”意思相同。
作为本发明中使用的由水不溶性基材构成的载体，可以列举：玻璃珠、硅胶等无机载体；由交联聚乙烯醇、交联聚丙烯酸酯、交联聚丙烯酰胺、交联聚苯乙烯等合成高分子或结晶性纤维素、交联纤维素、交联琼脂糖、交联葡聚糖等多糖类构成的有机载体；以及将这些组合得到的有机-有机、有机-无机等复合载体等。作为市售品，可以例示出作为多孔质纤维素凝胶的GCL2000、烯丙基葡聚糖与甲撑双丙烯酰胺共价交联而成的SephacrylS-1000、作为甲基丙烯酸酯系载体的Toyopearl、作为琼脂糖系交联载体的琼脂糖CL4B和作为纤维素系交联载体的Cellufine等。但是本发明中的水不溶性载体并非仅限于例示的这些载体。
此外就本发明中使用的水不溶性载体而言，从本亲和分离基质的使用目的和方法来看期望表面积大，优选为具有很多适当大小的细孔的多孔质。作为载体的形态，可以为珠状、整块状、纤维状、膜状(包括中空纤维)等中的任一种，可以选择任意形态。
关于配体的固定化方法，例如可以通过利用存在于配体的氨基、羧基或巯基的以往的偶联法结合于载体。作为偶联法，可以列举：使载体与溴化氰、表氯醇、二缩水甘油醚、甲苯磺酰氯、三氟乙磺酰氯(tresyl chloride)、肼和高碘酸钠等反应而将载体活化(或向载体表面导入反应性官能团)、与作为配体进行固定化的化合物进行偶联反应，从而固定化的方法；以及，向存在有载体和作为配体进行固定化的化合物的体系中加入碳二亚胺之类缩合试剂或戊二醛之类在分子中具有多个官能团的试剂，通过缩合、交联而进行固定化的方法。
此外，可以在配体与载体之间导入由多个原子构成的间隔分子，也可以在载体上直接固定化配体。因此，为了固定化，可以对本发明的蛋白质进行化学修饰，也可以添加对固定化有用的氨基酸残基。作为对固定化有用的氨基酸，可以列举具有对固定化于侧链的化学反应有用的官能团的氨基酸，可以列举例如：侧链含有氨基的Lys、侧链含有巯基的Cys。本发明的本质在于，本发明中对蛋白质赋予的效果也同样地被赋予于固定化有该蛋白质作为配体的基质，为了固定化而进行任何修饰、改造时也都包含在本发明的范围内。
亲和分离基质是固定化本发明的蛋白质而得到的，因此能够基于本发明的蛋白质本身的活性而与含有免疫球蛋白的Fc区域的蛋白质结合。因此利用本发明的蛋白质和亲和分离基质，能够通过亲和柱/亲和色谱纯化法来分离纯化含有免疫球蛋白的Fc区域的蛋白质。“含有免疫球蛋白的Fc区域的蛋白质”是含有蛋白A所结合的Fc区域侧的部位的蛋白质。但是，只要蛋白A能够与其结合则也并非必需是完整地含有Fc区域的蛋白质。
作为含有免疫球蛋白的Fc区域的蛋白质，可以列举免疫球蛋白G或免疫球蛋白G衍生物，但不限于这些。
上述“免疫球蛋白G衍生物”是统称蛋白A所能结合的改造型人工蛋白质的名称，例如将人免疫球蛋白G的部分结构域置换为其它物种的免疫球蛋白G的结构域而融合后的嵌合型免疫球蛋白G；将人免疫球蛋白G的CDR(Complementarity Determinig Regions，互补决定区)部分置换为其它物种抗体的CDR部分而融合后的人型化免疫球蛋白G；对Fc区域的糖链加以分子改造而得的免疫球蛋白G；使人免疫球蛋白G的Fv区域与Fc区域融合而得的人工免疫球蛋白G等；使有用蛋白质与人免疫球蛋白G的Fc区域融合而得的融合蛋白等。作为有用蛋白质，可以列举各种受体、细胞因子、激素、酶。例如，作为受体，可以列举TNF受体、VEGF受体、CTLA4的细胞外区域；作为细胞因子，可以列举血小板生成素受体肽；作为激素，可以列举GLP-1肽；作为酶，可以列举凝血因子VIII、凝血因子IX、磷酸酶。
此外，虽然宽泛地将所结合的区域定义为Fab区域(特别是Fv区域)和Fc区域，但抗体的立体结构已经明确，因此成为本发明的蛋白质和亲和分离基质所结合的对象的蛋白质也可以是通过蛋白质工程学手段在保持蛋白A所结合的区域的立体结构的基础上对Fab区域、Fc区域实施了进一步改造(片段化等)的蛋白质。
通过使含有免疫球蛋白的Fc区域的蛋白质与含有固定化于载体的配体的亲和分离基质接触、从而使含有免疫球蛋白的Fc区域的蛋白质吸附于亲和分离基质的工序；以及、使pH3.0以上的洗脱液与亲和分离基质接触、将含有免疫球蛋白的Fc区域的蛋白质洗脱的工序，从而可以对含有免疫球蛋白的Fc区域的蛋白质进行纯化。
就抗体样蛋白质的纯化方法的第一工序而言，通过使含有免疫球蛋白的Fc区域的蛋白质与含有固定化于载体的配体的亲和分离基质接触，从而使含有免疫球蛋白的Fc区域的蛋白质吸附于亲和分离基质。具体而言，在将包含含有免疫球蛋白的Fc区域的蛋白质的缓冲液调节为中性后，使该溶液通过填充有亲和分离基质的亲和柱，从而吸附含有免疫球蛋白的Fc区域的蛋白质。作为缓冲液，可以列举例如：柠檬酸、2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、双(2-羟乙基)氨基(三羟甲基)甲烷(Bis-Tris)、N-(2-乙酰氨基)亚胺基二乙酸(ADA)、哌嗪-1,4-双(2-乙磺酸)(PIPES)、N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙磺酸(ACES)、3-(N-吗啉代)-2-羟基丙磺酸(MOPSO)、N,N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)、3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)、N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸(TES)、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)、三乙醇胺、3-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]丙磺酸(EPPS)、三(羟甲基)甲基甘氨酸(Tricine)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、甘氨酰甘氨酸、N-二羟乙基甘氨酸、N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)、或杜尔贝科磷酸缓冲生理盐水等缓冲液。使含有免疫球蛋白的Fc区域的蛋白质吸附于亲和分离基质时的pH优选为pH6.5～8.5，更优选为pH7～8。使抗体样蛋白质吸附于亲和分离基质时的温度优选为1～40℃，更优选为4～25℃。
在第一工序之后，可以使适量的纯净的缓冲液通过亲和柱而洗涤柱内部。在该时刻，期望的抗体样蛋白质吸附于柱内的亲和分离基质。为了洗涤而使用的缓冲液可以使用与第一工序中使用的缓冲液相同的缓冲液。
就含有免疫球蛋白的Fc区域的蛋白质的纯化方法的第二工序而言，使pH3.5以上的洗脱液与亲和分离基质接触，将含有免疫球蛋白的Fc区域的蛋白质洗脱。作为洗脱液，可以列举例如：柠檬酸缓冲液、乙酸缓冲液、磷酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、甲酸缓冲液、丙酸缓冲液、γ-氨基丁酸缓冲液、乳酸缓冲液。
关于洗脱液的pH，只要为pH3.0以上就能够回收抗体，但如果使用更高pH的洗脱液则能够避免抗体的聚集、活性降低，因此是优选的。具体而言，更优选pH3.5以上，进一步优选pH3.6以上，进一步更优选pH3.75以上，特别优选pH3.8以上，最优选pH3.9以上，进而最优选pH4.0以上。洗脱液的pH的上限优选为pH6.0。
在从亲和分离基质洗脱抗体时，还可以使用多个pH的洗脱液分阶段地进行洗脱。此外，如果使用不同pH的2种以上洗脱液(例如pH6和pH3)以梯度洗脱使pH具有梯度来进行洗脱，则能够更高度地进行纯化，因此是优选的。本发明的亲和分离基质特别是能够在高pH条件下洗脱抗体，因此梯度洗脱中优选在其部分过程中含有pH4～6的洗脱液。吸附时、洗涤时、洗脱时的缓冲液还可以添加表面活性剂(例如Tween20、Triton-X100)、离液剂(例如尿素、胍)、氨基酸(例如精氨酸)。
同样，洗脱含有免疫球蛋白的Fc区域的蛋白质时的填充有亲和分离基质的亲和柱内的pH优选为pH3.0以上，更优选为pH3.5以上，进一步优选为pH3.6以上，进一步更优选为pH3.75以上，特别优选为pH3.8以上，最优选为pH3.9以上，进而最优选为pH4.0以上。当以pH3.0以上的条件进行洗脱时，可以降低对抗体的损伤(Ghose S.等、Biotechnology andbioengineering、2005年、92卷、6号)。此外，洗脱含有免疫球蛋白的Fc区域的蛋白质时的填充有亲和分离基质的亲和柱内的pH的上限优选为pH6.0。通过本发明的纯化方法，能够使含有免疫球蛋白的Fc区域的蛋白质在更中性侧的酸性洗脱条件下解离，在酸性条件下洗脱含有免疫球蛋白的Fc区域的蛋白质时的洗脱峰、洗脱曲线更尖锐。通过使色谱的洗脱峰、洗脱曲线变得更尖锐，从而可以用体积更少的洗脱液回收更高浓度的含有抗体的洗脱液。
洗脱含有免疫球蛋白的Fc区域的蛋白质时的温度优选为1～40℃，更优选为4～25℃。
通过本发明的纯化方法回收的含有免疫球蛋白的Fc区域的蛋白质的回收率优选为90％以上，更优选为95％以上。回收率例如通过下述式算出。
回收率(％)＝(洗脱出的含有免疫球蛋白的Fc区域的蛋白质的浓度(mg/mL)×洗脱出的液量(ml))÷(所进样的含有免疫球蛋白的Fc区域的蛋白质的浓度(mg/mL)×所进样的液量(ml))×100
本发明的纯化方法可以降低来自用于表达含有免疫球蛋白的Fc区域的蛋白质的宿主的蛋白质(HCP)的混入。此外，还可以降低含有免疫球蛋白的Fc区域的蛋白质的聚集体的混入。这些蛋白质的混入可能使抗体制造中的纯化工序的负担增大(工序数增加、收率降低)，杂蛋白作为药品可能导致严重的副作用，本发明的纯化方法则能够避免这些问题。
本发明的亲和分离基质对于将含有免疫球蛋白的Fc区域的蛋白质和来自宿主的蛋白质分离是有效的。成为宿主细胞蛋白质的来源的宿主细胞是能够表达含有免疫球蛋白的Fc区域的蛋白质的细胞，特别是可列举已建立基因重组技术的CHO细胞、大肠杆菌作为例子。来自这些宿主的蛋白质可通过市售的免疫检测试剂盒来定量。例如使用CHO HCP ELISA试剂盒(Cygnus公司)可以对来自CHO细胞的蛋白质进行定量。
本发明的亲和分离基质从包含含有免疫球蛋白的Fc区域的蛋白质的聚集体的溶液、例如相对于洗脱液中的含有免疫球蛋白的Fc区域的蛋白质的总量至少含有1％、5％或10％的聚集体的溶液纯化出非聚集的含有免疫球蛋白的Fc区域的蛋白质，对于除去聚集体而言是有效的。聚集体的含量例如可以通过凝胶过滤色谱进行分析、定量。
本发明的亲和分离基质可以通过使完全不损害配体化合物、载体的基材的功能的程度的适当的强酸性或强碱性的纯净的缓冲液(也有时为含有适当的变性剂或有机溶剂的溶液)从其中通过而进行洗涤，从而再利用。
本发明的蛋白质和亲和分离基质对含有免疫球蛋白的Fc区域的蛋白质的亲和性例如可以通过使用表面等离子激元共振原理的Biacore系统(GEHealthcare Japan制)等生物传感器进行测试。关于本发明的蛋白质所具有的、对免疫球蛋白的亲和性，在通过后述的Biacore系统测定对人免疫球蛋白G制剂的亲和性时，结合常数(KA)优选为106(M-1)以上，更优选为107(M-1)以上。
作为测定条件，只要是能够检测本发明的蛋白质结合于免疫球蛋白的Fc区域时的结合信号的条件即可，可以通过在温度20～40℃(恒定温度)、pH6～8的中性条件下进行测定来简单地进行评价。
作为结合对象的免疫球蛋白分子，可以列举例如：作为多克隆抗体的γ球蛋白“Nichiyaku”(人免疫球蛋白G)(日本制药公司制)、市售药品中的单克隆抗体。
关于亲和性差异，本领域技术人员可以按照以下方式容易地进行检验：以相同的测定条件得到对相同免疫球蛋白分子的结合反应曲线，利用解析时得到的结合参数对变异导入前的蛋白质和导入变异后的蛋白质进行比较，从而进行检验。
作为结合参数，例如可以使用结合常数(KA)、解离常数(KD)(永田等著、“生体物質相互作用のリアルタイム解析実験法(生物物质相互作用的实时解析实验法)”、Springer-Verlag Tokyo、1998年、41页)。本发明的各结构域的变异体与Fab的结合常数可以利用Biacore系统如下求出：在传感器芯片上固定化属于VH3亚家族的免疫球蛋白的Fab片段，在温度25℃、pH7.4的条件下用流路中添加有各结构域变异体的实验体系求出。需要说明的是，某些文献中有时会将结合常数表述为亲和常数，两者的定义基本相同。
实施例
以下基于实施例更详细地说明本发明，但本发明不受这些实施例限定。本实施例中，重组DNA的制作、操作等只要没有特别声明则按照下述的实验方案来实施。(1)T.Maniatis，E.F.Fritsch，J.Sambrook著、“Molecular Cloning/ALaboratory Manual”、第2版(1989)、Cold Spring Harbor Laboratory刊(美国)。(2)村松正实编著“实验室指南基因工程学”、第3版(1996)、丸善株式会社出版。此外，本实施例中使用的试剂、限制酶等只要没有特别声明则使用市售品。
对于实施例中取得的各种蛋白质，以“表述结构域的字母-所导入的变异(野生型则为Wild)”的形式来表述。例如，蛋白A的野生型C结构域表述为“C-wild”，导入有变异G29E的C结构域变异体表述为“C-G29E”。关于同时导入有2种变异的变异体的表述，则用斜线并列所述。例如，导入有变异G29E和变异S13L的C结构域变异体表述为“C-G29E/S13L”。此外，多个单结构域连接而成的蛋白质则在单结构域(period)之后添加所连接的个数和“d”来表述。例如，5个导入有变异G29E和变异S13L的C结构域变异体连接而成的蛋白质表述为“C-G29E/S13L.5d”。
(实施例1)使用IgG固定化载体评价C结构域变异体的抗体结合能力
利用委托方式，全合成了改造型C-G29A.2d的人工合成基因(EurofinsGenomicsK.K.制)，该基因在编码向蛋白A的C结构域体中导入有G29A变异的C-G29A.2d(序列号6)的DNA的5’末端添加PstI识别位点、3’末端添加XbaI识别位点而成的DNA(序列号7)中导入有表1所述的氨基酸置换变异。将该亚克隆后的表达质粒用限制酶PstI和XbaI(宝生物公司制)消化，将取得的DNA片段连接到用相同限制酶消化过的短芽孢杆菌表达用载体pNCMO2(宝生物公司制)中，从而制备在短芽孢杆菌表达用载体pNCMO2中插入有编码改造型C-G29A.2d的氨基酸序列的DNA的表达质粒。需要说明的是，质粒的制备中使用了大肠杆菌JM109株。
用所得到的质粒转化桥石短芽胞杆菌SP3株(宝生物公司制)，培育分泌生产改造型C-G29A.2d的基因重组体。将该基因重组体用含有60μg/mL的新霉素的30mL的A培养基(多聚蛋白胨3.0％、酵母浸提物0.5％、葡萄糖3％、硫酸镁0.01％、硫酸铁0.001％、氯化锰0.001％、氯化锌0.0001％)在30℃振荡培养3天。
将通过上述步骤表达的C-F5A/G29A.2d、C-F5Y/G29A.2d、C-F5G/G29A.2d、C-F5M/G29A.2d、C-F13Y/G29A.2d、C-F13W/G29A.2d、C-L17I/G29A.2d、C-L17I/G29A/I31L.2d、C-L17T/G29A.2d、C-L17V/G29A.2d、C-G29A/I31L.2d、C-G29A/I31F.2d、C-G29A/I31N.2d、C-G29A/I31L/S33H.2d、C-G29A/I31L/V40Q.2d、C-G29A/I31S.2d、C-G29A/I31T.2d、C-G29A/I31V.2d的氨基酸序列分别记载于序列表的序列号10～27。
培养后，通过离心分离(15000rpm、25℃、5分钟)从培养液除去菌体后，用高效液相色谱测定培养上清中的改造型C-G29A.2d的浓度。用IgG固定化载体按照下述条件实施培养上清中的改造型C-G29A.2d和C-G29A.2d的洗脱试验。
＜使用IgG固定化载体的洗脱试验的条件＞
载体：IgG Sehparose FF(GE Healthcare公司制)
柱：OMNIFIT柱(Diba Industries公司制)、柱直径0.66cm、柱床高度6.4cm、柱体积：2.19mL
流速：0.8mL/分钟、接触时间2.7分钟
上样量：470μL(配体浓度1.3mg/mL)
平衡化缓冲液：50mM Tris盐酸、150mM NaCl缓冲液pH7.5
洗脱条件：50mM柠檬酸缓冲液pH6.0→50mM柠檬酸缓冲液pH3.0(20CV)
算出以C-G29A.2d的洗脱pH为基准时的改造型C-G29A.2d的洗脱pH之差。将结果示于表1。任一改造型C-G29A.2d与C-G29A.2d相比，从IgG固定化载体洗脱的pH都高。该结果表明：固定化有改造型C-G29A.2d的载体与固定有C-G29A.2d的载体相比，可以在更高的pH下洗脱抗体。
[表1]
(实施例2)使用分子间相互作用解析装置评价C结构域变异体的抗体结合能力
使用利用了表面等离子激元共振的生物传感器Biacore 3000(GEHealthcare公司制)解析实施例1中所取得的各种蛋白质与免疫球蛋白的亲和性。本实施例中，利用由人血浆分级出的人免疫球蛋白G制剂(此后记作人IgG)。
将人IgG固定化于传感器芯片，使各种蛋白质流到芯片上，检测两者的相互作用。人IgG向传感器芯片CM5的固定化通过使用了N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和N-乙基-N’-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)的胺偶联法进行，使用乙醇胺进行封闭(传感器芯片、固定化用试剂均为GEHealthcare公司制)。人IgG溶液是将γ球蛋白“Nichiyaku”(日本制药公司制)按照1.0mg/mL溶解于标准缓冲液(20mM NaH2PO4-Na2HPO4、150mM NaCl、pH7.4)而制备的。将人IgG溶液用固定化用缓冲液(10mMCH3COOH-CH3COONa、pH5.0)稀释100倍，按照Biacore 3000附带的说明书将人IgG固定到传感器芯片上。此外，对于芯片上的另一流动池，在通过EDC/NHS活化后进行固定乙醇胺的处理，从而准备作为阴性对照的参照池。
各种蛋白质用运行缓冲液(20mM NaH2PO4-Na2HPO4、150mM NaCl、0.005％P-20、pH7.4)适当制备成10～1000nM的范围(对于各中蛋白质，制备3种蛋白质浓度不同的溶液)、将各蛋白质溶液以流速20μL/分钟向传感器芯片添加30秒。在测定温度25℃下依次观测添加时(结合相、30秒)和添加结束后(解离相、60秒)的结合反应曲线。各观测结束后添加Glycine-HCl10mM pH3.0(GE Healthcare公司制)使传感器芯片再生(30秒)(目的在于除去残留于传感器芯片上的添加蛋白质，确认所固定化的人IgG的结合活性基本完全恢复。)。
对于所得到的结合反应曲线(减去参照池的结合反应曲线后的结合反应曲线)，使用系统附带的软件BIAevaluation进行基于1：1的结合模型的拟合解析，算出结合速率常数(kon)、解离速率常数(koff)和结合常数(KA＝kon/koff)。将结果示于表2。
如表2所示，改造型C-G29A.2d与人IgG的结合参数和C-G29A.2d(对照)为同等程度。具体而言，与人IgG的结合常数在任一配体的情况下均显示为108M-1以上。任一改造型C-G29A.2d在中性pH范围均具有与变异导入前的C-G29A.2d同等程度的抗体结合能力。
[表2]
(实施例3)使用IgG固定化载体评价B结构域变异体的抗体结合能力
利用委托方式，全合成了改造型B-G29A.2d的人工合成基因(Eurofins GenomicsK.K.制)，该基因在编码向蛋白A的B结构域体导入有G29A变异的B-G29A.2d(序列号8)的DNA的5’末端插入PstI识别位点、3’末端插入XbaI识别位点而成的DNA(序列号9)中导入有表3所述的氨基酸置换变异。与实施例1同样地重组、表达，对于得到的培养上清，用IgG固定化载体实施洗脱试验。
将通过上述步骤表达的B-G29A/I31L.2d、B-G29A/I31T.2d的氨基酸序列分别记载于序列表的序列号28～29。
将洗脱试验的结果示于表3。与B-G29A.2d相比，任一改造型B-G29A.2d从IgG固定化载体洗脱的pH均高。该结果表明：实施例1所示的变异不仅限于C结构域，对B结构域也产生了同样的效果。
[表3]
(实施例4)使用分子间相互作用解析装置评价B结构域变异体的抗体结合能力
与实施例2同样地解析实施例3中所取得的各种蛋白质与免疫球蛋白的亲和性。将结果示于表4。改造型B-G29A.2d对人IgG的结合参数与B-G29A.2d(对照)为同等程度。任一改造型B-G29A.2d均在中性pH范围内具有与变异导入前的B-G29A.2d同等程度的抗体结合能力。
[表4]
(实施例5)改造型C-G29A.2d亲和分离基质的抗体洗脱试验
对与实施例1同样培养而得到的培养物进行离心分离，分离出菌体，向培养上清中添加乙酸而将pH调节为4.5后，静置一小时使目标蛋白质沉淀。通过离心分离回收沉淀，将其溶解于缓冲液(50mM Tris-HCl、pH8.5)。然后，通过利用了HiTrap Q柱(GE HealthcareBio-Sciences制)的阴离子交换色谱纯化目标蛋白质。具体而言，将目标蛋白质溶液添加于用阴离子交换用缓冲液A(50mM Tris-HCl、pH8.0)平衡化后的HiTrap Q柱，用阴离子交换用缓冲液A洗涤后，分取通过利用阴离子交换缓冲液A和阴离子交换缓冲液B(50mM Tris-HCl、1M NaCl、pH8.0)的盐浓度梯度在过程中洗脱出的目标蛋白质。将所分取的目标蛋白质溶液对超纯水进行透析，将透析后的水溶液作为最终纯化样品。需要说明的是，通过使用柱的色谱进行的蛋白质纯化均利用AKTAavant系统(GE Healthcare Bio-Sciences制)来实施。
作为水不溶性基材，使用市售的活化型预装柱“Hitrap NHS activated HP”1mL(GE Healthcare公司制)。该柱以交联琼脂糖为基质且导入有蛋白质性配体固定化用的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)基。按照制品手册固定化最终纯化样品作为配体，从而分别制备亲和分离基质。
具体而言，制备1mL的将最终纯化样品用偶联缓冲液(0.2M碳酸钠、0.5M NaCl、pH8.3)稀释成终浓度约13mg/mL的溶液。将用冰浴冷却后的1mM HCl以流速1mL/分钟分流2mL，将该操作进行3次而除去柱中的异丙醇。然后立即以相同流速添加此前制备的样品稀释溶液1mL，将柱的上下封闭，在25℃静置30分钟，从而将所取得的蛋白质固定化于柱。然后解除封闭，以相同流速流入偶联缓冲液3mL，回收未反应蛋白质。然后，将流入封闭用缓冲液(0.5M乙醇胺、0.5M NaCl、pH8.3)2mL的操作实施3次，将流入洗涤用缓冲液(0.1M乙酸、0.5MNaCl、pH4.0)2mL的操作实施3次，最后流入标准缓冲液(20mM NaH2PO4-Na2HPO4、150mMNaCl、pH7.4)2mL，从而完成亲和分离柱的制作。使用所得到的亲和分离基质，按照下述条件实施抗体洗脱试验。作为对照，对同样制备的C-G29A.2d亲和分离基质也进行试验。测定洗脱液的吸光度并算出抗体回收率。将结果示于表5。
＜使用改造型C-G29A.2d亲和分离基质的抗体洗脱试验的条件＞
柱：预装柱Hitrap NHS activated HP”1mL(GE Healthcare公司制)(包含固定化有各配体的载体的柱)
流速：0.33mL/分钟、接触时间3.0分钟
上样液：γ球蛋白“Nichiyaku”(日本制药公司制)5mL(配体浓度1mg/mL)
平衡化缓冲液：杜尔贝科磷酸缓冲生理盐水(Sigma-Aldrich公司制)
洗脱条件：
洗脱1：50mM柠檬酸缓冲液(4CV)、试验A：pH4.0、试验B：pH3.75、试验C：pH3.5、
洗脱2：50mM柠檬酸缓冲液pH3.0(4CV)
[表5]
与C-G29A.2d的亲和分离基质相比，使用改造型C-G29A.2d制备的亲和分离基质在高pH(4.0～3.5)下洗脱液中的抗体回收率高。该结果表明：在实施例1所示的使用IgG琼脂糖的试验中洗脱pH高的配体，在使用固定化有配体的亲和分离基质并在高pH下洗脱时，抗体回收率提高。
(实施例6)使用IgG固定化载体评价C结构域变异体的抗体结合能力
利用委托方式，全合成了改造型C-G29A.2d的人工合成基因(Eurofins GenomicsK.K.制)，该基因在编码向蛋白A的C结构域体中导入有G29A变异的C-G29A.2d(序列号6)的DNA的5’末端添加有PstI识别位点、3’末端添加有XbaI识别位点而成的DNA(序列号7)中导入有表6所述的氨基酸置换变异。
将通过上述步骤表达的C-F5G/G29A.2d、C-F5M/G29A.2d、C-F13W/G29A.2d、C-G29A/I31F.2d、C-G29A/I31N.2d的氨基酸序列分别记载于序列表的序列号30～34。
与实施例1同样制备质粒后，培育基因重组体，得到含有改造型C-G29A.2d的培养液。使用IgG固定化载体，通过与实施例1相同的条件实施培养上清中的改造型C-G29A.2d和C-G29A.2d的洗脱试验。
算出以C-G29A.2d的洗脱pH为基准时的改造型C-G29A.2d的洗脱pH之差。将结果示于表6。与C-G29A.2d相比，任一改造型C-G29A.2d从IgG固定化载体洗脱的pH均高。该结果表明：与固定化有C-G29A.2d的载体相比，固定化有改造型C-G29A.2d的载体能够在更高pH下洗脱抗体。
[表6]
(实施例7)使用分子间相互作用解析装置评价C结构域变异体的抗体结合能力
使用利用表面等离子激元共振的生物传感器Biacore 3000(GE Healthcare公司制)，通过与实施例2相同的条件解析实施例6中所取得的各种蛋白质与免疫球蛋白的亲和性。作为免疫球蛋白，使用人IgG。
如表7所示，改造型C-G29A.2d与人IgG的结合参数与C-G29A.2d(对照)为同等程度。具体而言，任一配体与人IgG的结合常数均显示为109M-1以上。任一改造型C-G29A.2d在中性pH范围内均具有与变异导入前的C-G29A.2d同等程度的抗体结合能力。
[表7]
(实施例8)改造型C-G29A.2d亲和分离基质的、抗体与来自宿主的杂质的分离行为评价
使用实施例5中得到的固定化有C-G29A/I31L.2d的亲和分离基质和含有TNF受体-Fc融合蛋白(依那西普)的CHO细胞培养上清(Bioceros公司制)，按照下述条件实施抗体洗脱试验。作为对照，还实施了使用同样制备的C-G29A.2d亲和分离基质的洗脱试验。测定洗脱液的吸光度，算出抗体回收率。来自宿主的杂质(HCP)使用CHO HCP ELISA试剂盒(Cygnus公司制)进行定量。将对照的使用C-G29A.2d亲和分离基质的结果示于图2，将使用改造型C-G29A.2d亲和分离基质的结果示于图3。
＜使用改造型C-G29A.2d亲和分离基质的抗体洗脱试验的条件＞
柱：预装柱Hitrap NHS activated HP”1mL(GE Healthcare公司制)(含有固定化有各配体的载体的柱)
流速：1mL/分钟(仅样品上样时为0.33mL/分钟、接触时间3.0分钟)
上样液：含有TNF受体-Fc融合蛋白的CHO细胞培养上清(Bioceros公司制)16.1mL(浓度0.62mg/mL)
平衡化缓冲液：杜尔贝科磷酸缓冲生理盐水(Sigma-Aldrich公司制)
洗脱条件：
洗脱1：50mM柠檬酸缓冲液(pH6→pH3)的梯度洗脱(20CV)
洗脱2：50mM柠檬酸缓冲液pH3.0(5CV)
如图2～3所示，与C-G29A.2d的亲和分离基质相比，TNF受体-Fc融合蛋白在高pH下从使用改造型C-G29A.2d制备的亲和分离基质被洗脱。此外，就洗脱级分中所含的来自宿主的杂质量而言，利用了使用改造型C-G29A.2d制备的亲和分离基质时较低。具体而言，关于峰顶的级分的HCP含量，在C-G29A.2d亲和分离基质的情况下为4187ppm，在改造型C-G29A.2d亲和分离基质的情况下为3109ppm。该结果表明：在实施例1的使用IgG琼脂糖的试验中洗脱pH高的配体，与改造前的配体相比，能够降低洗脱液中的来自宿主的杂质量。
序列表
<110> 株式会社钟化(KANEKA CORPORATION)
<120> 酸性pH范围内的抗体结合能力降低的抗体结合性蛋白质
<130> B150469WO01
<150> JP 2015-145004
<151> 2015-07-22
<160> 34
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 56
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)
<400> 1
Ala Gln His Asp Glu Ala Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Gln Val Leu Asn
1 5 10 15
Met Pro Asn Leu Asn Ala Asp Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu
20 25 30
Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Val Leu Gly Glu Ala Gln Lys
35 40 45
Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 2
<211> 61
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)
<400> 2
Ala Asp Ala Gln Gln Asn Lys Phe Asn Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe
1 5 10 15
Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly
20 25 30
Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Thr Asn Val Leu
35 40 45
Gly Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys
50 55 60
<210> 3
<211> 58
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)
<400> 3
Ala Asp Asn Asn Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 4
<211> 58
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)
<400> 4
Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 5
<211> 58
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)
<400> 5
Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 6
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> C 结构域突变
<400> 6
Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Lys Phe Asn
50 55 60
Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu
65 70 75 80
Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro
85 90 95
Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala
100 105 110
Gln Ala Pro Lys
115
<210> 7
<211> 359
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> mutation
<223> C 结构域突变
<400> 7
ctgcagataa caaatttaac aaagaacaac aaaacgcttt ctacgaaatc ctgcacttgc 60
caaaccttac tgaagaacaa cgtaatgctt tcatccaatc cctgaaagat gatccatctg 120
tatccaaaga aattttggca gaggctaaaa aacttaacga cgctcaggcg cctaaggctg 180
ataacaaatt caataaagaa cagcaaaacg ctttttatga aatccttcac ctgccaaatc 240
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ataacaaatt caataaagaa cagcaaaacg ctttttatga aatccttcac ctgccaaatc 240
ttaacgaaga acaacgcaac gcattcattc aaagcttgaa ggatgaccct tcccaaagcg 300
caaatttgct ggctgaagca aaaaagttga atgatgcgca agcaccaaaa taatctaga 359
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Gln Ala Pro Lys
115
<210> 34
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> C-G29A/I31N.2d
<400> 34
Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Asn Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Lys Phe Asn
50 55 60
Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu
65 70 75 80
Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Asn Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro
85 90 95
Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala
100 105 110
Gln Ala Pro Lys
115

Claims (19)

1.一种蛋白质，其特征在于，其含有在序列号1～5所述的来自蛋白A的E、D、A、B或C结构域的氨基酸序列中将Fc结合部位的疏水性氨基酸残基置换为其它疏水性氨基酸残基或极性无电荷氨基酸残基而得到的氨基酸序列，并且
所述蛋白质与所述置换前相比，在酸性pH范围内的抗体结合能力降低。
2.根据权利要求1所述的蛋白质，其中，
Fc结合部位的疏水性氨基酸残基为对应于C结构域的第5位的Phe、对应于C结构域的第13位的Phe、对应于C结构域的第17位的Leu或对应于C结构域的第31位的Ile。
3.根据权利要求1或2所述的蛋白质，其中，
其它疏水性氨基酸残基为Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Phe或Trp。
4.根据权利要求1或2所述的蛋白质，其中，
极性无电荷氨基酸残基为Ser、Thr、Gln、Asn、Tyr或Cys。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的蛋白质，其中，
以下所示的氨基酸残基中的90％以上被保留，所述氨基酸残基为：
Gln－9、Gln－10、Tyr－14、Pro－20、Asn－21、Leu－22、Gln－26、Arg－27、Phe－30、Leu－34、Pro－38、Ser－39、Leu－45、Leu－51、Asn－52、Gln－55、和Pro－57，
其中，残基号对应于C结构域。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的蛋白质，其中，
对应于C结构域的第40位的氨基酸为Val以外的氨基酸。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的蛋白质，其中，
所述氨基酸序列是进一步将疏水性氨基酸残基、酸性氨基酸残基或极性无电荷氨基酸残基置换为碱性氨基酸残基而得到的。
8.一种蛋白质，其是将2个以上权利要求1～7中任一项所述的蛋白质连接而得的包含多个结构域的蛋白质。
9.一种DNA，其编码权利要求1～8中任一项所述的蛋白质。
10.一种载体，其含有权利要求9所述的DNA。
11.一种转化体，其是用权利要求10所述的载体转化宿主细胞而得到的。
12.权利要求1～8中任一项所述的蛋白质的制造方法，其使用：利用了权利要求9所述的DNA的无细胞蛋白质合成系统、或权利要求11所述的转化体。
13.一种亲和分离基质，其是将权利要求1～8中任一项所述的蛋白质作为亲和配体固定化在由水不溶性的基材构成的载体而得到的。
14.根据权利要求13所述的亲和分离基质，其特征在于，其能与含有免疫球蛋白的Fc区域的蛋白质结合。
15.根据权利要求14所述的亲和分离基质，其中，
含有免疫球蛋白的Fc区域的蛋白质为免疫球蛋白G或免疫球蛋白G衍生物。
16.一种权利要求13～15中任一项所述的亲和分离基质的制造方法，其包含如下步骤：
将权利要求1～8中任一项所述的蛋白质作为亲和配体固定在由水不溶性的基材构成的载体。
17.一种含有免疫球蛋白的Fc区域的蛋白质的纯化方法，其包含：
使含有免疫球蛋白的Fc区域的蛋白质吸附于权利要求13～15中任一项所述的亲和分离基质。
18.根据权利要求17所述的纯化方法，其包含下述(a)～(b)的工序：
(a)使包含含有免疫球蛋白的Fc区域的蛋白质的液体吸附于权利要求13～15中任一项所述的亲和分离基质的工序；
(b)使pH3.5以上的洗脱液与亲和分离基质接触，将所述含有免疫球蛋白的Fc区域的蛋白质洗脱的工序。
19.根据权利要求18所述的纯化方法，其中，
被洗脱的含有免疫球蛋白的Fc区域的蛋白质中所含的、源自宿主的蛋白质和/或含有免疫球蛋白的Fc区域的蛋白质的聚集体的含量减少。
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