CN102516371A - 一种突变的免疫球蛋白-结合蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种免疫球蛋白-结合蛋白，其中至少一个天冬酰胺残基突变为除了谷氨酰胺或天冬氨酸之外的氨基酸，与亲本分子相比该突变在pH值最高达13-14时赋予了增加的化学稳定性。蛋白可例如获自能够与免疫球蛋白分子的除互补决定区(CDR)之外的其它区域结合的蛋白，诸如蛋白A，且优选地为葡萄球菌蛋白A的B-结构域。本发明也涉及一种用于亲和性分离的基质，其含有作为偶联于固相载体的配体免疫球蛋白-结合蛋白，在其中的蛋白配体中至少有一个天冬酰胺残基已突变为除了谷氨酰胺之外的氨基酸。

Description

一种突变的免疫球蛋白-结合蛋白
本申请是申请日为2003年3月20日，申请号为03806793.5的、发明名称和本发明相同的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及突变体蛋白领域，更具体地涉及一种与亲本分子相比显示出提高的稳定性的突变体蛋白以及涉及一种生产本发明的突变体蛋白的方法。本发明也涉及一种亲和性分离基质，其中本发明的突变蛋白质被用作亲和配体。
背景技术
在生物技术和制药工业中的大量的应用需要广泛关注污染物的严格去除。
这些污染物可以是例如色谱分析方法中固定相或基质吸附的非洗脱分子，诸如非目的的生物分子或微生物，包括例如蛋白质、碳水化合物、脂类、细菌和病毒。通常进行目的产物的第一次洗脱之后从基质去除这些污染物，以便在随后的应用之前再生基质。此类去除通常包括被称为就地清洗(CIP)的方法，其中使用了能够从固定相洗脱污染物的试剂。通常使用的这类试剂为流经所述固定相的碱性溶液。目前最广泛使用的净化和清洁试剂是NaOH，且其浓度可依据污染的程度和本性在0.1直至例如1M的范围内。已知NaOH是一种能实现多途径地减少污染物诸如微生物、蛋白质、脂类和核酸的有效CIP试剂。NaOH的另一个优点是其可以很容易地被去除而不用任何进一步的处理。然而，此方案涉及将基质暴露于超过13的pH值。对于许多含有蛋白亲和配体的亲和层析基质来说，这样的碱性环境是非常粗糙的条件，并且因此由于配体对所涉及的高pH值的不稳定性而导致了基质能力的降低。
因此广泛的研究集中于开发对碱性pH值具有增大的耐受能力的基因工程蛋白质配体。例如，Gulich等(Susanne Gülich，MartinLinhult，Per-
Figure BSA00000633024500011
Nygren，Mathias Uhlén，Sophia Hober，Journal ofBiotechnology 80(2000)，169-178：对碱性条件的稳定性可被工程改造到蛋白配体中)提出通过蛋白质工程来增加结合链球菌白蛋白的结构域(ABD)在碱性环境中的稳定特性。以前，人们表明了天冬酰胺和谷氨酰胺残基在碱性条件下的结构修饰，诸如肽主链的脱酰胺化和裂解是在碱性溶液处理后活性损失的主要原因，且天冬酰胺是两个中最敏感的(Geiger，T.，和S.Clarke.1987.肽中天冬酰胺酰和天冬氨酰残基的脱酰胺化、异构化和外消旋作用。J.Biol.Chem.262：785-794)。已知脱酰胺化速率是高度特异性和构象依赖的(Kosky，A.A.，U.O.Razzaq，M.J.Treuheit，和D.N.Brems.1999.α-螺旋对天冬酰胺残基稳定性的影响：不同螺旋性的肽中的脱酰胺化速率。Protein Sci.8：2519-2523；Kossiakoff，A.A.1988.三级结构是蛋白脱酰胺化的主要决定因素。Science.240：191-194；和Lura，R.，和V.Schirch.1988.肽的构象在天冬酰胺酰残基的脱酰胺化速率和机制中的作用。Biochemistry.27：7671-7677)，且最短的脱酰胺化的半衰期与序列-天冬酰胺-甘氨酸-和-天冬酰胺-丝氨酸相关。相应地，Giilich等人创造了一种ABD的突变体，其中天然ABD的所有四个残基已被亮氨酸(一个残基)，天冬氨酸(两个残基)和赖氨酸(一个残基)所替代。此外，Giilich等人报道了他们的突变体显示出类似于天然蛋白的靶蛋白结合特性，而且含有工程改造的配体的亲和层析柱在重复暴露于碱性条件之后，比利用父本的非工程改造的配体制备的柱显示出较高的结合能力。因此，断定其中的所有四个天冬酰胺残基可被替代而对结构和功能没有任何显著的影响。
因此，Giilich等人针对结合链球菌白蛋白的结构域进行了研究。然而，亲和层析也用于纯化其它分子诸如例如用于药物应用的免疫球蛋白的操作流程中。一类特别有趣的亲和性试剂是能够特异性结合于抗体分子的不可变部分的蛋白质，此类相互作用不依赖于抗体的抗原结合特异性。此类试剂可广泛地用于通过亲和性色谱层析从不同的样品诸如但不限于获自原种的血清或血浆制品或细胞培养物中回收免疫球蛋白。此蛋白的一个实例为含有能够结合于来自不同种的IgG免疫球蛋白的Fc和Fab部分的结构域的葡萄球菌蛋白A。
基于葡萄球菌蛋白A(SpA)的试剂取决于其高度的亲和性和选择性在生物技术领域找到了广泛的应用，例如，用在捕获和纯化以及检测抗体的亲和层析中。目前，基于SpA的亲和性培养基可能是最广泛应用的从不同样品包括来自细胞培养物的工业原料来分离单克隆抗体及其片段的亲和性培养基。因此，含有蛋白A-配体的不同基质可市售得到，例如以天然蛋白A的形式(例如，Protein A Sepharose，AmershamBiosciences，Uppsala，瑞典)且也包括以重组蛋白质A(例如，ProteinA Sepharose，Amersham Biosciences，Uppsala，瑞典)的形式市售的。更具体地，在所述商品化的重组蛋白质A产物上进行的遗传操作的目的在于促进其对载体的附着。
因此，在此领域需要获得能够结合免疫球蛋白的蛋白配体，特别是通过其Fc-片段结合免疫球蛋白的蛋白配体，这些蛋白配体也对一种或多种利用碱性试剂的净化方法有耐性。
发明概述
本发明的一个目的是提供一种突变的免疫球蛋白结合蛋白配体，其在增加的pH值下显示出提高的稳定性，因此与亲本分子相比对在碱性条件下的净化有提高的耐性。
本发明的另一个目的是提供这样的一种蛋白配体，其特异性地结合于免疫球蛋白诸如IgG、IgA和/或IgM的Fc-片段。
本发明的再一个目的是提供一种如上所述的蛋白配体，其在碱性条件下比亲本分子显示出能保持较长时间的亲和性。
本发明进一步的目的是提供一种亲和性分离基质，其含有能够优选地通过它们的Fc-片段结合免疫球蛋白诸如IgG、IgA和/或IgM的突变蛋白配体，这些配体与亲本分子的配体相比在碱性条件下显示出提高的耐性。
上述所限定的一或多个目的可通过所附的权利要求书来实现。
附图的简要说明
图1显示了SpA的5个同源结构域(E，D，A，B和C)的氨基酸比对。
图2(a)和(b)说明了在对本发明的突变蛋白进行碱处理(原位清洗)之后获得的与不稳定的蛋白Z相比较的结果。
图3显示了如实施例4(a)所述在插入载体中之后编码Z(N23T/N3AN6D)-Cys的基因。
图4显示了实施例4(a)所述的质粒pAY91的质粒图谱。
图5显示了如实施例4(b)所述在插入载体中之后编码Z(N23T/N3A/N6D)的基因。
图6显示了实施例5所述质粒pAY100的质粒图谱的实例。
图7显示了根据实施例6的用于将KpnI-位点导入到具有SPA启动子和信号序列的载体中的衔接子。
图8显示了如实施例6所描述的质粒pAY104，其含有用于导入含有KpnI-位点的衔接子的SPA启动子和信号序列。
图9显示了根据实施例6在插入衔接子之后产生的质粒pAY128。
图10显示了实施例6的构建的克隆盒，其中在原始的衔接子下加了下划线。
图11显示了如实施例6所述的在插入Z(N23T/N3A/N6D)-Cys-四聚体之后的质粒pAY114。
图12显示了实施例7的构建的克隆盒，其中在原始的衔接子下加了下划线。
图13显示了根据实施例7在插入衔接子之后产生的质粒pAY129。
图14显示了如实施例7所述在插入Z(N23T/N3A/N6D)四聚体-Cys之后的质粒pAY125。
图15为实施例8所述的通过分离人IgG(hIgG)而获得的色谱图。
图16显示了表示实施例8的基质的保持动态的结合能力的图表。
定义
术语“蛋白”在此处用来描述蛋白质及其片段。因此，具有三维结构的氨基酸的任意链也包括在术语“蛋白”中，相应地也包括蛋白片段。
术语蛋白的“功能性变体”是指一种变异的蛋白，其中与本发明定义的亲和性和稳定性有关的功能基本上被保持。因此，一个或多个与所述功能不相关的氨基酸可被替换。
术语“亲本分子”是指以在导入本发明的突变之前的形式存在的相应蛋白。
术语“结构稳定性”是指分子的三维形式的完整性，而“化学稳定性”是指承受化学降解的能力。
术语“结合Fc片段的”蛋白是指该蛋白能够结合于免疫球蛋白的Fc片段。然而，其没有排除结合Fc片段的蛋白也可以结合其它的区区域，诸如免疫球蛋白的Fab区域。
在本说明书中，若非引用其全称，氨基酸被用常规的单字码符号来表示。
突变通过交换位置的编号来定义，前面是野生型或非突变的氨基酸，后面是突变的氨基酸。因此，例如，在位置23处的天冬酰胺突变为苏氨酸被表示为N23T。
发明详述
在一个方面，本发明涉及一种能够结合于免疫球蛋白分子的除互补决定区(CDR)之外的其它区域的免疫球蛋白结合蛋白，其中亲本的免疫球蛋白-结合蛋白的至少一个天冬酰胺残基已突变为除了谷氨酰胺之外的氨基酸，与亲本分子相比该突变赋予了增加的在碱性pH值下的化学稳定性。增加的稳定性是指突变蛋白对于免疫球蛋白的初始亲合力基本上被保持所持续的一段时间，如下面将要讨论的。
通过本发明获得的对于靶蛋白的保留的亲合力在某种程度上取决于保留的突变体蛋白的空间构象。突变蛋白质对免疫球蛋白的亲合力可以例如由技术人员利用生物传感器技术通过例如Biacore 2000标准装备(Biacore AB，Uppsala，瑞典)来测定，如将在以下实验部分所描述的。在上下文中，可以理解术语“基本上”保持是指突变蛋白显示出具有与亲本分子同一数量级的对于免疫球蛋白的亲合力。相应地在初始阶段，突变蛋白的结合能力与亲本分子的相当。然而，由于下面所讨论的突变蛋白的在时间上保持化学稳定性，其所保持的结合能力将比在碱性环境中的亲本分子的结合能力更缓慢地减少。环境可以被定义为碱性的，意思是增加的pH值，例如高于大约10，诸如最高达大约13或14，即10-13或10-14通常表示碱性的条件。或者，条件可通过NaOH的浓度来定义。其可最高达大约1.0M，诸如0.7M或特别是大约0.5M，相应地在0.7M-1.0M的范围内。
本发明的突变蛋白的增加的化学稳定性可被本领域的技术人员很容易地证实，例如通过用NaOH以0.5M浓度进行常规处理，如下面实验部分所描述的。在此上下文中，可以理解与上所述类似地，“增加的”稳定性是指与亲本分子相比初始稳定性被保持较长的一段时间。尽管人们已经报道了关于结合链球菌白蛋白的结构域的类似的突变(Gulich等人，同上)，然而众所周知与在碱性环境中降解的蛋白敏感性有关的脱酰胺化的速率是高度序列和构象依赖的。由于ABD的氨基酸序列与免疫球蛋白-结合蛋白诸如单独的结构域葡萄球菌蛋白A没有氨基酸序列相似性，其不会出现好象Gulich等人的教导也可应用于免疫球蛋白-结合蛋白的情况。然而，本发明第一次表明了免疫球蛋白-结合蛋白的一个或多个天冬酰胺残基的突变令人惊讶地提供了增加的化学稳定性以及在pH大于大约10，诸如最高达大约13或14的环境中的降低的降解速率。
因此，本发明提供了一种突变蛋白，其是有用的，例如作为蛋白配体用于选择性地吸附免疫球蛋白，诸如来自哺乳动物种类诸如人的IgG，IgA和/或IgM，优选地为IgG的亲和层析中。吸附的目的可用于产生纯化产物，诸如纯的免疫球蛋白组分或来自已经除去免疫球蛋白的液体，或用于检测样品中免疫球蛋白的存在。本发明的配体显示出足以耐受常规的碱洗达较长的一段时间的化学稳定性，这使得该配体成为用于再生柱所必需的有成本效益的大规模操作的有吸引力的候选物。
相应地，在本发明的蛋白中，一个或多个天冬酰胺(N)残基已经突变为选自由下列氨基酸组成的组的氨基酸：甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)、谷氨酸(E)、精氨酸(R)、组氨酸(H)、赖氨酸(K)或脯氨酸(P)，或任意经修饰的对不希望的脱酰胺化和异构化不敏感的氨基酸。可选择地，一个或多个天冬酰胺(N)残基已突变为谷氨酰胺(Q)。
免疫球蛋白-结合蛋白可以是任意的具有天然免疫球蛋白-结合能力的蛋白，诸如葡萄球菌蛋白A(SpA)或链球菌G蛋白(SpG)。为了回顾其它的此种蛋白，参见例如Kaonvall，G.，Jonsson，K.Receptins：用于对哺乳动物蛋白质具有结合特性的天然的和工程改造的微生物蛋白的展开谱的新的术语，J.Mol.Recognit.1999Jan-Feb；12(1)：38-44，综述。
在一个实施方案中，本发明为一种突变蛋白，其至少包括免疫球蛋白-结合蛋白的结合区域并且其中在所述区域内存在至少一个此种天冬酰胺突变。相应地，在此实施方案中，本发明的突变蛋白包括至少大约75％，诸如至少大约80％或优选地至少大约95％的SEQ ID NO.1或2的序列，条件是在位置21处没有天冬酰胺突变。
在本申请的说明书中，SEQ ID NO 1限定了SpA的B-结构域的氨基酸序列，而SEQ ID NO 2限定了被称为Z蛋白的蛋白。
Z蛋白是获自SpA的B-结构域的合成的构建体，其中在位置29的甘氨酸已替换为丙氨酸，且已公开在文献中，参见例如Stahl等人，1999：生物技术中的亲和性融合：关注A蛋白和G蛋白，生物方法技术百科全书：发酵，生物催化和生物分离。M.C.Fleckinger和S.W.Drew，editors.John Wiley和Sons Inc.，New York，8-22。此外，蛋白Z被用作亲和层析中的配体。然而，尽管蛋白Z与SpAB-结构域相比对除了NaOH之外的某些化学试剂显示出增加的化学稳定性，但是，其在增加的pH值的条件下仍然是不稳定的，不能满足经济工厂中所期望的许多CIP再生步骤的需求。
在一个实施方案中，上述的突变蛋白含有SEQ ID NO 1或2的氨基酸序列，或是其功能性变体。在上下文中的术语“功能性变体”包括任意类似的序列，其包括在增加pH值的环境中在不影响突变体蛋白对免疫球蛋白的亲合力或其增加的化学稳定性的氨基酸位置上的一或多个其它的变化。
在一个有利的实施方案中，本发明的突变选自由N23T；N23T和N43E；N28A；N6A；N11S；N11S和N23T以及N6A和N23T组成的组；且其中亲本分子包括由SEQ ID NO 2所限定的序列。如上所述，为了获得对于作为在碱性条件中具有长时间持续的高度结合能力的配体有用的突变体蛋白，避免使位置21处的天冬酰胺残基突变。在一个实施方案中，在位置3处的天冬酰胺残基没有突变。
在最有利的实施方案中，在本发明的蛋白中，位于亮氨酸残基和谷氨酰胺残基之间的天冬酰胺残基已突变为例如苏氨酸残基。因此，在一个实施方案中，序列SEQ ID NO 2的位置23处的天冬酰胺残基已突变为例如苏氨酸残基。在一个特定的实施方案中，序列SEQ ID NO 2的位置43处的天冬酰胺残基也已经突变为例如谷氨酸。在该实施方案中，其中氨基酸43已经突变，其看起来最有利地与至少一个其它的突变，诸如N23T相结合。
本发明的关于可以认为SpA和蛋白Z的B-结构域的不同天冬酰胺残基对突变蛋白的亲合力和稳定性特性具有不同的贡献的发现是完全出乎意料的，尤其由于上述讨论的Gulich等人的教导已断定所有的ABD的天冬酰胺残基可被突变而没有任何内在的差别。
因此，本发明包括上述讨论的单体突变体蛋白。然而，这种蛋白单体可结合为多聚体蛋白，诸如二聚体、三聚体、四聚体、五聚体等等。相应地，本发明的另一个方面是一种由至少一个本发明的突变体蛋白与一个或多个其它的单元，优选地同样为本发明的突变体蛋白组成的多聚体。因此，本发明是例如由两个重复单元组成的二聚体。
在一个实施方案中，本发明的多聚体包括通过优选范围为0到15个氨基酸，诸如5-10个氨基酸的一段氨基酸序列连接的单体单元。这种连接的本性优选地不破坏蛋白单元的空间构象。此外，所述连接优选地在碱性环境中同样是充分稳定的，不损害突变的蛋白单元的特性。
在目前最好的实施方案中，多聚体是含有突变N23T的蛋白Z的四聚体，其中连接单元的长度为5-10个氨基酸。在一个实施方案中，多聚体含有序列VDAKFN-Z(N23T)-QAPKVDAKFN-Z(N23T)QAPKC。在另一个实施方案中，多聚体含有序列VDAKFD-Z(N23T)-QAPKVDAKFD-Z(N23T)-ZQAPKC。
在一个特定的实施方案中，多聚体也含有一个或多个葡萄球菌蛋白A的E，D，A，B，和C结构域。在此实施方案中，优选位于环形区域的天冬酰胺残基已经突变为更加水解-稳定的氨基酸。在一个实施方案中，由于对结构稳定性有利的原因，SEQ ID NO.1的位置29处的甘氨酸残基也已经突变，优选地突变为丙氨酸残基。同样地，避免位置52处的天冬酰胺残基的突变对于结构稳定性也是有利的，因为人们已经发现其对蛋白A分子的α-螺旋二级结构的含量有贡献。
在进一步的方面，本发明涉及编码上述突变体蛋白或多聚体的核酸。相应地，本发明包括了可用于通过已建立的生物技术方法在重组的宿主中表达来生产突变体蛋白的DNA序列。因此，本发明的另一个方面是一种表达系统，其能够产生上述的突变体蛋白。细菌宿主可被方便地用于下面所描述的实验部分中。在一个可选择的实施方案中，本发明为一种已被遗传操作来表达本发明突变体蛋白的细胞系。用于实现此目的的方法，参见例如Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratoryv Manual(2nd ed)，vols.1-3，Cold Spring HarborLaboratory，(1989)。
当然，一旦确定了目的序列，本发明的突变体蛋白可选择地通过合成方法来生产。
相应地，本发明同样包括生产本发明的突变体蛋白或多聚体的生物技术方法或合成方法。
在另一个方面，本发明涉及一种用于亲合分离的基质，该基质含有包含与固相载体偶联的免疫球蛋白-结合蛋白的配体，其中在该蛋白中的至少一个天冬酰胺残基已突变为除了谷氨酰胺之外的氨基酸。本发明的基质，当与由作为配体的亲本分子组成的基质相比时，在两种或多种利用间歇式碱洗分离的过程中显示出增加的结合能力。突变的蛋白配体优选地为结合Fc-片段的蛋白，并且可用于选择性结合IgG、IgA和/或IgM，优选IgG。
本发明的基质可含有如上所述的任意实施方案中作为配体的突变体蛋白。在最优选的实施方案中，在固相载体上的本发明的配体含有如上所述的多聚体。
本发明的基质的固相载体可以是任意合适的众所周知的种类。常规的亲和性分离基质通常具有有机特性且基于将其亲水性表面暴露于所用的水性介质的聚合物，即将羟基-OH)、羧基(-COOH)、羧氨基(-CONH2，可以是N-取代的形式)、氨基(-NH2，可以是取代的形式)、寡-或聚氧化乙烯基团暴露在它们的外表面上，如果存在，也暴露在内表面上。在一个实施方案中，聚合物可以例如基于多糖，诸如右旋糖酐、淀粉、纤维素、支链淀粉、琼脂糖等等，有利地其已例如与双环氧化物、表卤醇、1，2，3-三卤取代的低级烃交联，来提供合适的多孔性和刚性。在最优选的实施方案中，固相载体是多孔的琼脂糖珠。本发明所用的载体可根据标准方法很容易地制备，诸如反向悬浮液凝胶化(SHjerten：Biochim Biophys Acta 79(2)，393-398(1964)。可选择的，基体基质是市售的产品，诸如SepharoseTM FF(AmershamBiosciences，Uppsala，瑞典)。在一个对于大规模的分离尤其有利的实施方案中，载体已被改造来增加其刚性，由此使得基质更适用于高流速。
可选择的，固相载体基于合成的聚合物，诸如聚乙烯醇、聚羟烷基丙烯酸酯、聚羟烷基甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸酯等等。在为疏水性聚合物，诸如基于二乙烯基-和单乙烯基-取代苯的基质的情况下，基质的表面常常被亲水化来将上述的亲水基团暴露于周围的水性液体。根据标准方法很容易地生产此种聚合物，参见例如“通过悬浮聚合作用改进基于聚合物载体的苯乙烯”(R ArshadyChimica e L′Industria70(9)，70-75(1988))。可选择的，使用市售的产品，诸如SourceTM(Amersham Biosciences，Uppsala，瑞典)。
在另一个可选择的实施方案中，本发明的固相载体含有具有无机特性的载体，例如硅石、氧化锆等等。
在又一个实施方案中，固相载体为其它的形式，诸如表面、芯片、毛细管或过滤器。
关于本发明基质的形状，在一个实施方案中，基质为多孔整料的形式。在一个可选择的实施方案中，基质是以多孔的或无孔的珠子或粒子的形式。
珠子或粒子形式的基质可用作填充床或以悬浮的形式使用。悬浮的形式包括被称为膨胀床和纯的悬浮液的那些，其中粒子或珠子自由地移动。在为整料，填充床和膨胀床的情况下，分离方法通常使用常规的带有浓度梯度的层析分离法。在为纯的悬浮液的情况下，使用分批的方式。
可以通过利用例如存在于配体中的氨基和/或羧基基团的常规偶联技术将配体附着于载体。双环氧化物、表氯醇、CNBr、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)等等是公知的偶联试剂。在载体和配体之间，可导入一种被成为间隔子的分子，其将会增加配体的有效性并促进配体与载体的化学偶联。可选择地，配体可通过非共价键，诸如物理吸附或生物特性的吸附附着于载体上。
在一个有利的实施方案中，配体通过硫醚键与载体相偶联。进行这种偶联的方法在本领域是众所周知的，并且本领域的技术人员利用标准技术和设备很容易地进行。在一个有利的实施方案中，首先为配体提供一个用于随后偶联的末端半胱氨酸残基。本领域的技术人员同样很容易地进行合适的纯化步骤。
如上所述，对免疫球蛋白的亲和性即配体的结合特性，从而也是基质的容量在通过用碱性试剂处理时基本上没有改变。通常，为了进行亲和性分离基质的就地洗净，所用的碱性试剂为NaOH且其浓度最高达0.75M，诸如为0.5M。
因此，另一种表征本发明基质的方式是，由于上述讨论的突变，在用0.5 MNaOH处理7.5h之后，其结合能力将减少到小于大约70％，优选地小于大约50％且更优选的小于大约30％，例如大约为28％。
在进一步的方面，本发明涉及一种分离免疫球蛋白，诸如IgG、IgA和/或IgM的方法，其中使用了本发明的突变体蛋白、多聚体或基质。因此，本发明包含了层析分离的方法，其中通过吸附于如上所述的突变体蛋白或多聚体或基质来从液体中分离至少一种靶化合物。目的产物可以为分离的化合物或液体。因此，本发明在此方面涉及了亲和层析，其是一种广泛使用且众所周知的分离技术。简言而之，在第一个步骤中，让含有靶化合物，优选为上述抗体的溶液，在允许靶化合物吸附到存在于所述基质上的配体上的条件下流经分离基质。例如通过pH和/或盐浓度即溶液中的离子强度来控制此条件。应注意不要超过基质的容量，即流动应充分地慢来允许进行令人满意的吸附。在此步骤中，溶液的其它组分将基本上不受阻碍地通过。任选择地，然后洗涤基质，例如用水溶液洗涤，来除去保留的和/或松驰结合的物质。正如以上所讨论的，通过利用碱性试剂的洗涤步骤基质被最有利地利用。在下一步骤中，让用作洗脱液的第二溶液在提供脱附作用即释放靶化合物的条件下流经该基质。此条件通常通过改变pH、盐浓度即离子强度、疏水性等等来提供。各种洗脱方式是已知的，诸如梯度洗脱和步进式洗脱。也可以通过一种含有竞争性物质的第二溶液来提供洗脱，竞争性物质将取代基质上的目的抗体。亲和层析原理的综述，参见，例如Wilchek，M.，和Chaiken，I.2000。亲和层析的概述，MethodsMol.Biol.147：1-6。
在一个可选择的实施方案中，本发明的突变体蛋白被用作该方法中的先导化合物，其中有机化合物被模型化而与其三维结构相类似。此所谓的模型化合物被称为模拟物。模拟物的设计、合成和测试可用于避免随机筛选大量的分子。简言之，此方法包括测定对于一种特性诸如对于结合免疫球蛋白关键的和重要的蛋白的特定部分。一旦鉴定了这些部分，就可以依据它的物理性能，例如立体化学、键、大小、电荷等，利用来自诸如分光技术、X射线衍射数据和NMR的数据而将其结构模型化。
计算分析、相似性映射及其它技术可用于此方法。对于此方法的重要考虑是合成化合物的容易程度、药学上可接受、体内降解的模式等等。
最后，本发明也包括上述突变体蛋白的其它应用，诸如用于分析方法、用于医学目的，例如用于诊断、阵列等等。
附图的详细说明
图1显示了SpA的五个同源性结构域(E，D，A，B和C)的氨基酸比对。横线表明氨基酸是相同的。三个方框显示了Tashiro及其同事测定的Zwt的α-螺旋(Tashiro等，1997)。天冬酰胺残基以及B结构域中的一个甘氨酸残基被替换，在附图中被加上了下划线。同样，也显示了Zwt和Z(N23T)的氨基酸比对。
图2(a)、2(b)说明了在碱处理(就地清洗)之后本发明的突变体蛋白质与去稳定的蛋白Z与相比较的结果。在通过常规的亲和层析方式进行重复的CIP-处理之后的能力的比较。0.5M的NaOH用作洗净剂。该方案进行16轮次且每一轮用碱处理的持续时间为30分钟。图2(a)显示了Z(F30A)及其变体的失活模式，而图2(b)显示了Zwt和Z(N23T)的失活模式。
图3显示了如实施例4(a)所述，在插入载体中之后编码Z(N23T/N3AN6D)-Cys的基因。突变用*标记。
图4显示了实施例4(a)所述的质粒pAY91的质粒图谱，其含有编码实施例4(a)所述编码Z(N23T/N3AN6D)-Cys的基因。
图5显示了如实施例4(b)所述，在插入载体中之后编码Z(N23T/N3A/N6D)的基因。突变用*标记。
图6显示了实施例5中所述的表达四聚体Z(N23T/N3AN6D)-Cys的质粒pAY100的质粒图谱的实例。
图7显示了根据实施例6的用于将KpnI-位点导入到具有SPA启动子和信号序列的载体中的衔接子。
图8显示了如实施例6所述的质粒pAY104，其含有用于导入含有KpnI-位点的衔接子的SPA启动子和信号序列。
图9显示了根据实施例6在插入衔接子之后产生的质粒pAY128。
图10显示了实施例6构建的克隆盒，其中原始的衔接子被加上了下划线。
图11显示了如实施例6所述，在插入Z(N23T/N3A/N6D)-Cys-四聚体之后的质粒pAY114。
图12显示了实施例7构建的克隆盒，其中原始的衔接子被加上了下划线。
图13显示了根据实施例7，在插入衔接子之后产生的质粒pAY129。
图14显示了如实施例7所述的在插入Z(N23T/N3A/N6D)四聚体-Cys之后的质粒pAY125。
图15为获自实施例8所述操作的色谱图，其中第一个峰对应于流通的材料，而第二个峰对应于洗脱的hIgG。
图16显示了实施例8的表示保持动态结合能力的基质的图表。自上而下分别表示Z(N23T/N3A/N6D)二聚体-Cys、Z(N23T/N3A)二聚体-Cys、Z(N23T)二聚体-Cys和Z(N23T/K4G)二聚体-Cys。由于软件问题，缺少Z(N23T/N3A)二聚体-Cys的最后两个测定点。
实验部分
在下面，将通过实施例的方式来描述本发明，这些实施例仅用于说明的目的而不应被理解为对附加的权利要求所定义的本发明范围的限定。所有下面以及其它地方所给出的参考被通过引用在此合并。
在此部分，由于原始形式的Z已具有显著的但非充分的对碱处理的稳定性，因此由于突变而引起的稳定性的小的改变的假定将难以在实验室测试中进行评价。
因此，抑制基因突变的方法(Kotsuka，T，.S.Akanuma，M.Tomuro，A.Yamagishi，和T.Oshima.1996，通过抑制基因突变的方法进一步稳定极端嗜热的生物嗜热栖热菌的3-异丙基苹果酸脱氢酶。J Bacteriol.178：723-727；和Sieber，V.，A.Pluckthun，以及F.X.Schmidt.1998，通过基于噬菌体的方法来选择具有增加的稳定性的蛋白质。NatureBiotechnology.16：955-960)被用来提供具有降低的结构稳定性的Z结构域的变体。根据此策略，Z蛋白的不稳定变体，在这里表示为Z(F30A)(Cedergren等，1993，上述)被用作支架来用于随后导入与碱性稳定性的研究相关的其它突变。此突变体的结合特性类似于天然蛋白Z，因为F30不涉及Fc-结合。
此外，Zwt表示野生型的Z结构域不含有F30A取代。
实验策略
为了分析在碱性条件下造成不稳定性的Z结构域中的天冬酰胺，进行了突变分析。为了能够检测Z结构域的碱性稳定性的改善，决定利用一种突变的变体Z(F30A)，因为Z结构域已具有对碱性条件显著的但不充分的稳定性。先前已经显示Z(F30A)具有对IgG的亲和性也即类似于野生型的亲和性，以及由于通常参与疏水核心的氨基酸的突变而具有显著降低的结构稳定性(Cedergren等，1993，同上文；Jendeberg，L.，B.Persson，R.Anderson，R.Karlsson，M.Uhlen，和B.Nilsson.1995，利用胞质基因共振检测蛋白A结构域和人Fc之间相互作用的动力学分析，Journal of Molecular Recognitiosl，8270-278)。Z-结构域为由58个氨基酸构成，包括八个天冬酰胺的3-螺旋束(N3，N6，N11，N21，N23，N28，N43和N52)(图1)(Nilsson，B.，T.Moks，B.Jansson，L.Abrahmsen，A.Elmblad，E.Holmgren，C.Henrichson，T.A.Jones，和M.Uhlen，1987，一种基于葡萄球菌蛋白A的合成的结合IgG的结构域.Protein Eng.1：107-113)。为了评价在碱性条件下不同的天冬酰胺对失活率的影响，将其中的7个残基替换为其它的氨基酸。因为N3位于结构域的柔性氨基末端，其被从研究中排除。假定这些氨基酸的降解不影响单体配体的活性并且因此在本分析中是不可检测的，所述分析测定保留的活性。此外，因为氨基酸位于结构域的结构部分的外部，认为其在结构域的多聚化而获得蛋白A类分子的过程中是容易被替换的。为了方便蛋白设计，人们进行了来自蛋白A的其它结构域的同源性序列的比较(附图1)(Gulich等，2000a)。从比较中可断定，天冬酰胺11被替换为丝氨酸并且天冬酰胺23被替换为苏氨酸最后天冬酰胺43被替换为谷氨酸。因为当注视同源序列时可替的是天冬氨酸，因此天冬酰胺6被替换为丙氨酸，也已报道天冬氨酸在碱性条件中是敏感的。蛋白A的所有五个结构域在其它位置(21，28，52)都具有天冬酰胺。因此，将它们替换为丙氨酸。
实施例1：突变体蛋白Z的诱变、表达和纯化
材料和方法
利用两步聚合酶链式反应技术进行定点诱变(Higuchi等，1988)。将质粒pDHZF30A(Cedergren等，1993)用作模板。通过Interactiva合成编码不同的天冬酰胺替换和A29G替换的寡核苷酸(Interactiva Biotechnologie GmbH，Ulm，德国)。依据Sambrook描述的操作方式(Sambrook等，1987)，将限制性内切酶XbaI和HindIII(MBI Fermentas Inc.，Amhurst，NY)用于克隆到载体pDHZ(Jansson等，1996)。为了产生pTrpZ，通过利用质粒pKN1Z作为模板进行PCR来扩增Z结构域(Nord等，1995)。用XbaI和PstI时片段进行限制性酶切并连接到已用相同的酶进行了限制性酶切的载体pTrpABDT1T2中(Kraulis等，1996)。使用MegaBACE 1000 DNA测序系统(Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)来证明插入片段的正确序列。在基于双脱氧法的循环测序方案中根据生产商的建议利用MegaBACE终止剂化学作用(Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)(Sanger等，1977)。在克隆过程中，使用大肠杆菌菌株RR1AM15(American Type Culture Collection，Rockville，MA)，而为了表达不同的基因产物则利用017(Olsson，M.O.，和L.A.Isaksson.1979.大肠杆菌中rpsD突变的分析。I：在核糖体蛋白S4.中具有不同变化的突变体的比较。Molec.gen.Genet.169：251-257)。
根据Gülich描述的方案进行Z(F30A)和不同构建体的生产和纯化(Gülich等，2000b，参见上面)。根据Kraulis等人描述的规程进行Z和pZ(N23T)的生产(Kraulis，P.J.，P.Jonasson，P.-A.Nygren，M.Uhlen，L.Jendeberg，B.Nilsson，和J.Kordel.1996，链球菌G蛋白的血清白蛋白-结合结构域是一种3-螺旋束：异核NMR研究。FEBSlett.378：190-194)。冻干相应的组分。通过利用特定的吸光率系数在280纳米处测定吸光率来估计蛋白的量，a(1g-1cm-1)，Z 0.156；Z(N23T)，0.169；Z(F30A)，Z(F30A，N43E)，Z(F30A，N23T，N43E)0.157；Z(F30A，N6A)，Z(F30A，N11S)，Z(F30A，N21A)，Z(F30A，N23T)，Z(F30A，N28A)，Z(F30A，N52A)，Z(F30A，N6A，N23T)，Z(F30A，N11S，N23T)0.158。通过氨基酸分析来确定浓度(BMC，Uppsala，Sweden)。利用Phast系统通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析同质性(Laemmli，U.K.1970，结构蛋白在噬菌体T4的头部装配过程中的裂解，Nature.227：680-685)。根据生产商的建议在还原条件下将冻干的蛋白装载高密度凝胶(AmershamBiosciences，Uppsala，Sweden)上并用用考马斯亮蓝染色。通过质谱分析进一步证实同质性和分子量。
为了进行CD光谱，在磷酸盐缓冲液(8.1mM K2HPO4，1.9mM KH2PO4，pH 7.5)中制备浓度为10pM的蛋白样品。利用J-720分光偏振计(JASCO，Tokyo，Japan)在路径长度为0.1cm的石英小池中在室温下以10nm min-1的扫描速度记录250到200nm的远UV区域的光谱。每一光谱是五个累积扫描的平均数并且将最后的光谱转化为平均残基重叠率(MRE)(deg cm2 dmol-1)。
结果(实施例1)
所有的Z变体都在大肠杆菌中在37℃下成功地在胞内产生并且显示出相同的表达水平，由SDS-PAGE估计大约为50mg/l。通过IgG亲和层析将蛋白完全纯化。
纯化之后，用SDS-PAGE分析样品(数据未显示)，并且冻干和储存来用于进一步的分析。蛋白Z及其不同突变体的分子量同样通过质谱分析来证实。数据证实了所有突变体的正确的氨基酸含量(数据未显示)。同样，通过圆二色谱(CD)设备进行结构分析，因为它以前已被证明适用于检测α-螺旋蛋白的结构变化(Johnson，C.W，Jr.1990.蛋白质的二级结构和圆二色性：应用指导，Proteins.7：205-214；以及Nord，K.，J.Nilsson，B.Nilsson，M.Uhlen，和P.-
Figure BSA00000633024500161
Nygren.1995.α-螺旋细菌的受体结构域的组合文库，Prot.eng 8：601-608)。所有光谱都在208纳米处和在222nm处显示出最小值以及在195nm附近显示出最大值，这表明了突变体和亲本分子具有类似的结构。然而，Z(F30A，N52A)似乎具有比野生型Z以及另一个突变体稍微较低的α-螺旋度(数据未显示)。
实施例2：生物特异性的相互作用分析
材料和方法
缔合和解离状态的亲和性以及动力学常数的差异被通过BiacoreTm2000装置(Biacore，Uppsala，Sweden)来检测。根据生产商的建议，通过将胺偶合到CM5传感器芯片(Biacore)的羧基化的右旋糖酐层来固定人的多克隆IgG和HSA(阴性参照)。IgG的固定产生大约2000RU。以10种不同的浓度(100-550nM)在HBS(10mM HEPES，0.15MNaCl，3.4mM EDTA，0.005％表面活性剂P20，pH 7.4)中制备Z、ZF30A以及不同的突变体。以随机顺序和30μl min-1的流速将样品注射到表面作为复制本。使用10mM的HCl来再生表面。利用BIA评价3.0.2b软件(BiacoreAB)分析数据。从IgG表面的信号中扣除用HSA固定的对照表面的信号。
采用1∶1兰格缪尔模型并计算表观动力学常数和亲和性常数。同样，计算与天然分子相关的自由结合能(AAG＝-RT1n Kaff，mutant/Kaff， native)的变化。
结果(实施例2)
为了测定Z变体对IgG的亲和性的差异，利用Biacore进行表面胞质团共振(SPR)。目的是比较本发明的不同突变的Z变体的亲和性与亲本分子的亲和性。如上所述，由于亲本Z的结构域的高度碱性稳定性，决定使用包括F30A突变的Z的结构去稳定的变体(Cedergren，L.，R.Andersson，B.Jansson，M.Uhlen，和B.Nilsson.1993.葡萄球菌蛋白A和人IgG1之间相互作用的突变分析，Proteineng.6：441-448)。因此，重要的是首先证实尽管发生了突变但是仍保留了突变分子和IgG之间亲和性。从下表1可见，Z(F30A)的亲和性没有受到显著的影响。亲和性的细微的变化给Z(F30A)和IgG的复合物带来了比亲本分子Z和IgG稍微更高的稳定性。这些与较早的Jendeberg等报道的结果(Cedergren等，1993，同上；Jendeberg等，1995，同上)一致。分析所有的用Z(F30A)作为支架构建的突变体并与它们的亲本分子(Z(F30A))相比较。结果显示了总体上亲和性没有显著地受突变的影响，表明了没有一个本发明的天冬酰胺突变对于与IgG的结合是非常重要的(参见下表1)。在包括N21A或N43E突变在内的所有Z变体中，仅仅观察到稍微较低的亲合常数。对于具有N23T突变的突变体而言，令人惊讶地，其亲和性甚至看上去稍微更高一些。同样，在为N28A-突变的情况下，亲和性的降低是细微的，并且如果突变用作例如蛋白配体，则不能期待其具有任意实质的影响。此外，包括N28A-突变的所有构建体具有显著增加的关闭-速率。对于包括N23T突变的突变体而言，稍微增加的亲和性似乎是由于增加的开启-速率的引起的。
同样，N6A-突变产生了较高的开启-速率，但因为随突变而生的还有增加的关闭-速率，因此亲和性常数没有受到影响。
表1 利用Biacore对不同Z的结构域进行的动力学研究的概述。
Figure BSA00000633024500181
Zwt被用作不同的测定过程中的内标。分别相对于Zwt和Z(F30A)计算了自由结合能的差异。
实施例3：对碱性条件的稳定性
材料和方法
通过固定于标准的亲和性基质来分析作为亲和配体的结构域Z的变体的特性。利用N-羟基琥珀酰亚胺的化学作用按照生产商的建议把Z、Z(F30A)和突变的变体共价偶联于HiTrapTM亲和柱(AmershamBiosciences，Uppsala，Sweden)上。用TST和0.2 MHAc，pH3.1对柱进行脉冲。在TST中配制人的多克隆IgG并过量注射到柱上。在AKTATM Explorer 10(Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)上进行标准的亲合层析流程16个循环。将一个CIP-步骤整合到每一循环之间。洗净剂为0.5M NaOH且每一脉冲的接触时间为30分钟，结果形成7.5小时的总接触时间。在280纳米处检测洗脱的物质。
结果(实施例3)
利用NHS-化学作用将Z、Z(F30A)及其突变体共价吸附到HiTrapTM柱上。过量加载IgG并且在每一循环之后测定洗脱的IgG的量来测定柱的总容量。
在每一循环之间，用由0.5M NaOH组成的CIP处理来处理柱。在16个脉冲之后，得到7.5小时的总接触时间，具有Z(F30A)-基质的柱显示出容量降低70％。图2a中的降解数据显示四个替换的天冬酰胺(N6，N11，N43和N52)对本实验中突变体所遭受的碱性条件较少地敏感。相反，N23看起来对Z(F30A)的稳定性是非常重要的。尽管有不稳定的F30A-突变，但是，Z(F30A，N23T)仅仅显示出28％的容量降低。因此，Z(F30A，N23T)几乎与Zwt一样是稳定的，并且由此几乎与作为支架的具有Z(F30A)的最稳定的变体一样稳定。具有两个其它突变Z(F30A，N23T，N43E)的Z(F30A)-结构域也显示出与Z(F30A，N23T)相同的降解模式。N28替换为丙氨酸也提高了Z(F30A)对碱性条件的稳定性。令人惊讶地，用Z(F30A，N21A)作为亲和配体的柱当曝露于NaOH时与亲本分子相比显示出容量的急剧损失。这些数据使得Z(N23T)成为IgG的亲和纯化的配体的非常优越的候选物。
为了最后证明策略的可靠性，利用分子的一种结构去稳定的变体来使得稳定性上的小变化是可检测的，将N23T-突变引入到亲本的Z-结构域。亲本的Z-结构域和Z(N23T)被偶联于HiTrap-柱上并以与已提到的突变体相同的方式暴露于碱性条件。如可从图2b观察到的，当Z(N23T)-突变体暴露于高pH时，它显示出比Zwt更高的稳定性。
实施例4：具有和没有C-末端半胱氨酸的Z-突变体的单体的构建
将三个不同的突变：K4G、N3A和双重突变N3A/N6D导入编码Z(N23T)的基因。
最初将突变导入到两个不同的载体中：一个在C-末端具有半胱氨酸，另一个没有半胱氨酸。进行这些操作来随后促进具有一个单C-末端半胱氨酸的多聚体的构建。
实施例4(a)：含有半胱氨酸的单体的构建
作为构建的模板，使用表示为“pGEM ZN23T”的质粒。其已经在Z-基因中含有N23T-突变。
用此质粒作为模板和下列两个寡核苷酸进行PCR-反应：
AFFI-63：TTT TTT GTA GAC AAC GGA TTC AAC AAA GAA C
GRTO-40：GAT CTG CTG CAG TTA GCA TTT CGG CGC CTG AGC ATC
         ATT TAG
用于K4G-突变，
AFFI-64：TTT TTT GTA GAC GCC AAA TTC AAC AAA GAA C
GRTO-40：GAT CTG CTG CAG TTA GCA TTT CGG CGC CTG AGC ATC
         ATT TAG
用于N3A-突变，以及
AFFI-65：TTT TTT GTA GAC GCC AAA TTC GAC AAA GAA C
GRTO-40：GAT CTG CTG CAG TTA GCA TTT CGG CGC CTG AGC ATC
         ATT TAG
用于N3A/N6D-突变。
PCR反应管含有：0,5μl模板pGEM ZN23T[500ng/μl]、5pmol的每一引物(Interactiva，Thermo Hybaid GmbH，Ulm，Germany)、5μl的dNTP混合物([10mM]，Applied Biosystems，CA，USA)、5μl的PCR-缓冲液10x(Applied Biosystems，CA，USA)、0,1μl的AmpliTaq([5U/μl]，Applied Biosystems，CA，USA)以及无菌水至50μl的终体积。PCR-程序由下列组成：94℃ 2分钟，然后30个循环的96℃ 15秒、50℃ 15秒、72℃ 1分钟以及最后的72℃ 1分钟。通过GeneAmpX PCR System 9700(Applied Biosystems，CA，USA)进行PCR反应。
通过1％琼脂糖凝胶分析PCR产物，并且在证实获得正确大小的产物后，用
Figure BSA00000633024500211
PCR纯化试剂盒(QIAGEN GmbH，Hilden，德国)进行纯化。
按照Sambrook(Sambrook等)的建议，用限制性酶AccI和PstI(New England Biolabs，NEB，MA，USA)裂解PCR产物。
在琼脂糖凝胶上分析裂解产物，并在连接之前用
Figure BSA00000633024500212
凝胶提取试剂盒(QIAGEN GmbH，Hilden，Germany)从琼脂糖中纯化裂解产物。将片段被连接到已用酶AccI和PstI裂解的表示为“-protA-stab-(multi9)”的载体中，并通过加入T4 DNA连接酶和连接缓冲液(MBI Fermentas，Lithuania)进行纯化，以及随后转化到RRIΔM15-细胞(ATCC，MA，USA)中。构建体分别被命名为pAY87(Z(N23T/K4G)-Cys)、pAY89(Z(N23T/N3A)-Cys)和pAY91(Z(N23T/N3A/N6D)-Cys)。
利用MegaBACETM I000 DNA测序系统(Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)来验证插入片段的正确序列。按照生产商的建议将MegaBACE终止子化学作用(Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)用于基于双脱氧法(Sanger等，1977)的循环测序流程中。
实施例4(b)：不含有半胱氨酸的单体的构建
用“pTrp(-N)ZN23T-Cys”表示的质粒被用作构建的模板。这些质粒已含有具有N23T突变的基因。
用此质粒作为模板和下列两个寡核苷酸进行PCR-反应：
AFFI-63：TTT TTT GTA GAC AAC GGA TTC AAC AAA GAA C
GRTO-41：GAT CTC GTC TAC TTT CGG CGC CTG AGC ATC ATT TAG
用于K4G-突变，
AFFI-64：TTT TTT GTA GAC GCC AAA TTC AAC AAA GAA C
GRTO-41：GAT CTC GTC TAC TTT CGG CGC CTG AGC ATC ATT TAG
用于N3A-突变，
AFFI-65：TTT TTT GTA GAC AAC GGA TTC AAC AAA GAA C
GRTO-41：GAT CTC GTC TAC TTT CGG CGC CTG AGC ATC ATT TAG
用于N3A/N6D-突变。
PCR反应管含有：0,5μl模板Trp(-N)ZN23T-Cys[500ng/μl]、5pmol的每一引物(Interactiva，Thermo Hybaid GmbH，Ulm，Germany)、5μl的dNTP-混和物([10mM]，Applied Biosystems，CA，USA)，5μl的PCR-缓冲液10x(Applied Biosystems，CA，USA)、0,1μl的AmpliTaq([5U/μl]，Applied Biosystems，CA，USA)以及无菌水至50μl的终体积。PCR-程序由下列组成：94℃ 2分钟，然后30个循环的96℃ 15秒、50℃ 15秒、72℃ 1分钟以及最后的72℃ 1分钟。通过GeneAmpX PCR System 9700(Applied Biosystems，CA，USA)进行PCR反应。
按照生产商的说明(Promega，WI，USA)，直接将PCR产物TA-克隆到载体pGEM中，随后转化到RRIΔM15-细胞(ATCC，MA，USA)中。构建体分别被命名为pAY86(Z(N23T/K4G)、pAY88(Z(N23T/N3A)和pAY90(Z(N23T/N3A/N6D)。
利用MegaBACETM I000 DNA测序系统(Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)来验证插入片段的正确序列。按照生产商的建议将MegaBACE终止剂化学作用(Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)用于基于双脱氧法(Sanger等，1977)的循环测序流程中。
实施例5：在pTrp-载体中编码具有C-末端半胱氨酸的单体以及 寡聚体的基因的构建
用限制性酶Accl裂解上述所有的质粒pAY86至pAY91(总共六个质粒)。结果使得Z突变体完全地从pAY86-，pAY88-和pAY90-载体中释放以及在pAY87-、pAY89-和pAY91-载体中的基因的3-末端产生一个单一的开口。
将裂解的载体用小牛肠碱性磷酸酶(CIAP，MBI Fermentas，Lithuania)按照生产商的说明进行处理。实施此步骤来进行5’-末端的去磷酸，从而避免载体的自身连接。
在琼脂糖凝胶上分析释放的Z-突变体片段，并且随后从琼脂糖中纯化，然后将片段连接到下列的打开的载体上：
从pAY86到pAY87的片段
从pAY88到pAY89的片段
从pAY90到pAY91的片段
为了进行连接反应，将不同比例的片段与载体混合，结果产生一系列不同的多聚体，正如所料，获得了从二聚体到五聚体。
不同的多聚体被转化到RRIΔM15-细胞(ATCC，MA，USA)中，并且如上所述，通过皇家技术学院(Royal Institute of Technology)的测序设备进行分析来验证正确的序列。新构建的质粒被表示在下表中：
表2 构的建质粒的概括
  质粒编号pAY   由构建体表达的蛋白
  86   Z(N23T/K4G)
  87   Z(N23T/K4G)-Cys
  88   Z(N23T/N3A)
  89   Z(N23T/N3A)-Cys
  90   Z(N23T/N3A/N6D)
  91   Z(N23T/N3A/N6D)-Cys
  92   Z(N23T/K4G)二聚体-Cys
  93   Z(N23T/N3A)二聚体-Cys
  94   Z(N23T/N3A/N6D)二聚体-Cys
  95   Z(N23T/K4G)三聚体-Cys
  96   Z(N23T/N3A)三聚体-Cys
  97   Z(：N23T/N3A/N6D)三聚体-Cys
  98   Z(N23T/K4G)四聚体-Cys
  99   Z(N23T/N3A)四聚体-Cys
  100   Z(N23T/N3A/N6D)四聚体-Cys
  101   Z(N23T/K4G)五聚体-Cys
  102   Z(N23T/N3A)五聚体-Cys
  103   Z(N23T/N3A/N6D)五聚体-Cys
上述的质粒载体，除pAY86，pAY88和pAY90外，都具有Trp启动子、Trp前导序列和卡那霉素(Km)抗性的基因。而pAY86，pAY88和pAY90具有氨苄青霉素抗性基因。
实施例6：pK4-载体中编码具有C-末端半胱氨酸的单体和寡聚体 的基因的构建
如表2中总结的，编码蛋白质的基因被转入到含有SPA启动子和信号序列的载体中。为了能够进行该方法，构建含有限制性酶KpnI(NewEngland Biolabs，NEB，MA，USA)切割位点的衔接子。通过两个寡核苷酸(Interactiva，Thenno Hybaid GmbH，Ulm，Germany)来构建衔接子。
用FspI和PstI(New England Biolabs，NEB，MA，USA)裂解质粒pAY104(pK4-cys-ABDstabdimer)。通过琼脂糖凝胶纯化载体并除去释放的片段以及用
Figure BSA00000633024500241
凝胶提取试剂盒(QIAGEN GmbH，Hilden，Germany)，从琼脂糖中纯化保留的载体。
在连接缓冲液(MBI Fermentas，Lithuania)中混合两个寡聚物AFFI-88和AFFI-89，并加热到50℃，并且加入裂解的质粒载体和T4DNA连接酶(MBI Fermentas，Lithuania)，之后冷却混合物至室温。进行连接反应后，将产物转化到RRIΔM15-细胞中并如上所述验证正确的序列。产生的质粒用pAY128表示。
然后用限制性酶KpnI和PstI裂解质粒pAY128，并在琼脂糖凝胶上分析裂解的载体质粒，随后用
Figure BSA00000633024500242
凝胶提取试剂盒(QIAGENGmbH，Hilden，Germany)从琼脂糖中纯化质粒。在进行琼脂糖凝胶分离后，将从pAY86到pAY103的表达两个突变的Z-基因的Z(N23T/N3A)和Z(N23T/N3A/N6A)片段用KpnI和PstI(New England Biolabs，NEB，MA，USA)裂解、分离和纯化。不同的片段被连接到来自pAY128的裂解载体中，所产生的质粒，在验证正确的序列之后，被表示为pAY107至pAY116，概括在表3中。
表3 具有SPA启动子和信号序列的构建的质粒的概括
  质粒编号pAY   由构建体表达的蛋白
  107   Z(N23T/N3A)-Cys
  108   Z(N23T/N3A/N6D)-Cys
  109   Z(N23T/N3A)二聚体-Cys
  110   Z(N23T/N3A/N6D)二聚体-Cys
  111   Z(N23T/N3A)三聚体-Cys
  112   Z(N23T/N3A/N6D)三聚体-Cys
  113   Z(N23T/N3A)四聚体-Cys
  114   Z(N23T/N3A/N6D)四聚体-Cys
  115   Z(N23T/N3A)五聚体-Cys
  116   Z(N23T/N3A/N6D)五聚体-Cys
实施例7：在pK4-载体中从N-末端融合到具有C-末端半胱氨酸的 单体和寡聚体的蛋白A构建编码E-基因(E’)的一部分的基因
编码表2中概括的蛋白质的基因被转入到含有SPA启动子和信号序列以及编码蛋白A的E-区域(E’)的基因一部分的载体中。人们较早前已表明了添加成熟的蛋白A(区域E)的N-末端的结合IgG的部分或其部分，可提高正确的加工以及也促进基因产物分泌到周围的培养基中(Abrahmsen等，1985)。
通过两个寡核苷酸(Interactiva，Thermo Hybaid GmbH，Ulm，德国)构建含有限制性酶Kpnl切割位点以及来自蛋白A(E’)的区域E的一部分的衔接子。
用FspI和PstI(New England Biolabs，NEB，MA，USA)裂解质粒pAY104(pK4-cys-ABDstabdimer)。在琼脂糖凝胶上纯化载体并除去释放的片段以及用
Figure BSA00000633024500251
凝胶提取试剂盒(QIAGEN GmbH，Hilden，德国)从琼脂糖中纯化保留的载体。在连接缓冲液中混合两种寡聚物并加热到75℃，将混合物冷却至室温然后加入裂解后的质粒载体和T4 DNA连接酶(MBI Fermentas，Lithuania)。进行连接反应后，将产物转化到RRIΔM15-细胞中，并且如上所述验证正确的序列。产生的质粒被表示为pAY129。
然后用限制性酶KpnI和PstI裂解质粒pAY129，并通过琼脂糖凝胶分析裂解的载体质粒，随后用凝胶提取试剂盒(QIAGENGmbH，Hilden，Germany)从琼脂糖中纯化裂解的载体。在琼脂糖凝胶分离后，将从pAY86到pAY103的表达两个突变的Z-基因的Z(N23T/N3A)和Z(N23T/N3A/N6A)片段用KpnI和PstI裂解、分离和纯化。将不同片段连接到来自pAY129的裂解载体中，所产生的质粒，在验证正确的序列之后，被表示为pAY118至pAY127，如表4中所概括。
表4 具有SPA启动子和信号序列以及来自蛋白A-E’的区域E的一部分的构建的质粒的概括。
  质粒no.pAY   由构建体表达的蛋白
  118   E’-Z(N23T/N3A)-Cys
  119   E’-Z(N23T/N3A/N6D)-Cys
  120   E’-Z(N23T/N3A)二聚体-Cys
  121   E’-Z(N23T/N3A/N6D)二聚体-Cys
  122   E’-Z(N23T/N3A)三聚体-Cys
  123   E’-Z(N23T/N3A/N6D)三聚体-Cys
  124   E’-Z(N23T/N3A)四聚体-Cys
  125   E’-Z(N23T/N3A/N6D)四聚体-Cys
  126   E’-Z(N23T/N3A)五聚体-Cys
  127   E’-Z(N23T/N3A/N6D)五聚体-Cys
实施例8：对碱性条件的稳定性
为了评价蛋白质对碱性条件的稳定性，在高pH值的环境中测定四种不同的蛋白。不同的蛋白为Z(N23T)二聚体-Cys、Z(N23T/K4G)二聚体-Cys、Z(N23T/N3A)二聚体-Cys和Z(N23T/N3A/N6D)二聚体-Cys。
将(Z(N23T)二聚体-Cys)、(Z(N23T/N3A)二聚体-Cys)、(Z(N23T/N3A/N6D)二聚体Cys)和(Z(N23T/K4G)二聚体-Cys)培养在发酵罐中。纯化收获的培养基并在碱性测定之前利用常规的方法偶联到HF琼脂糖(Amersham Biosciences，Uppsala，瑞典)上。
与HF琼脂糖偶联的蛋白表示如下：
●  Z(N23T)二聚体-Cys         U631049
●  Z(N23T/Ik4G)二聚体-Cys    U631079
●  Z(N23T/N3A)二聚体-Cys     U631064
●  Z(N23T/N3A/N6D)二聚体-Cys U631063
将基质装载到柱(HR5/2，Amersham Biosciences，Uppsala，瑞典)中，使终体积为0.1到0.3ml。所用的纯化设备为具有路径长度为2mm的UV样品流动池的AKTATM Explorer 10(AmershamBiosciences，Uppsala，瑞典)。
所使用的缓冲液含有
●  流动缓冲液(Running buffer)：25mM Tris-HCl，1mM EDTA，200mM NaCl，0.05％ Tween 20，5mM醋酸铵，pH 8.0
●  洗脱缓冲液：0.2M乙酸(HAc)，pH 3.1
●  就地清洗(CIP)缓冲液：0.5M NaOH
典型的色谱运行周期由下列组成：
●  用流动缓冲液平衡柱
●  以0,2毫升/分钟施加10mg的人的多克隆IgG(hIgG)样品
●  彻底洗去未结合的蛋白质
●  用洗脱缓冲液以1.0ml/min进行洗脱
●  用流动缓冲液再平衡
用CIP-缓冲液就地清洗(CIP)，柱基质和0,5M NaOH之间的接触时间为1小时
●  用流动缓冲液再平衡
在每轮运行周期中加载的hIgG的量远远超过柱的总动态结合容量，因为在所有的情况下当将样品加载在柱上时未结合的蛋白的贯穿量相当的大。
在包括上述步骤的一个循环之后，一个新的循环开始，其再次包括一个小时的与0.5M氢氧化钠的接触。为了测定柱的动态结合容量的降低，将洗脱峰的峰面积与当基质没有与氢氧化钠接触时的洗脱峰的原始的峰面积相比较。设定原始的峰面积为100％的结合容量，则可观察到hIgG的结合容量的降低。用纯化系统附带的UNICORNTM软件计算峰面积。
每一循环重复21次，使得对于不同的基质，基质和氢氧化钠之间的总接触时间为20小时。归一化的峰面积显示在下文(附图16)的图表中。对于每一突变体，重复21个循环。
Z(N23T/N3A/N6D)二聚体-Cys和Z(N23T/N3A)二聚体-Cys与最初产生的Z(N23T)二聚体-Cys相比显示出提高的耐碱性条件的稳定性。
Figure ISA00000633024700021
Figure ISA00000633024700031

Claims (21)

1.一种能够结合于免疫球蛋白分子的除互补决定区(CDR)之外的其它区域的免疫球蛋白-结合蛋白，其中SEQ ID NO.1或2所定义的亲本免疫球蛋白-结合蛋白或其功能性变体的至少一个天冬酰胺残基，已经突变为除了谷氨酰胺之外的其它氨基酸，与亲本分子相比，该突变赋予了在碱性pH值下的提高的化学稳定性。
2.根据权利要求1的蛋白，它是Fc片段-结合蛋白。
3.根据权利要求1或2的蛋白，其中所述的突变选自由N23T；N23T和N43E；N28A；N6A；N11S；N11S和N23T；以及N6A和N23T组成的组；并且其中亲本分子含有SEQ ID NO.2定义的序列。
4.根据前述任意一项权利要求的蛋白，其中位置23处的天冬酰胺残基已经突变，优选地突变为苏氨酸残基。
5.根据前述任意一项权利要求的蛋白，其中位置43处的天冬酰胺残基也已经突变，优选地突变为谷氨酸残基。
6.一种包含前述任意一项权利要求的突变蛋白单元的多聚体，其含有两个或多个重复单元。
7.根据权利要求6的多聚体，其中所述的蛋白单元通过最高包含大约15个氨基酸的元件来连接。
8.根据权利要求6或7的多聚体，它也含有一个或多个葡萄球菌蛋白A的E、D、A、B和C结构域。
9.根据权利要求6-8中任意一项的多聚体，它是四聚体。
10.根据权利要求9的多聚体，其中每一蛋白单元为SEQ IDNO.2定义的蛋白并且另外含有突变N23T。
11.一种编码权利要求1-10中任意一项的蛋白或多聚体的核酸。
12.一种表达系统，其含有权利要求11的核酸。
13.一种用于亲和层析的基质，其中多个含有权利要求1-5中任意一项的免疫球蛋白-结合蛋白的配体已偶联于固相载体上。
14.根据权利要求13的基质，其中所述的配体含有一个或多个权利要求6-10中任意一项的多聚体。
15.根据13或14的基质，所述的其中配体已通过硫醚键偶联于载体上。
16.根据权利要求13-15中任意一项的基质，其中所述的载体是一种天然的聚合物质，例如多糖。
17.根据权利要求13-16中任意一项的基质，其提供了对选自由IgG、IgA和IgM组成的组，优选IgG的免疫球蛋白的选择性结合。
18.根据权利要求13-17中任意一项的基质，在通过间歇式碱洗的两次或更多次分离过程中，其中，所述的配体具有高于亲本蛋白分子的结合容量。
19.根据权利要求18的基质，其中所述的碱洗用NaOH来进行，并且其浓度最高为大约1M，例如大约为0.5M。
20.一种分离免疫球蛋白，例如IgG、IgA和/或IgM的方法，其中使用权利要求1-10中任意一项的突变体蛋白或多聚体或权利要求13-19中任意一项的基质。
21.一种层析方法，其中通过吸附于权利要求1-10中任意一项的突变体蛋白或多聚体或权利要求13-19中任意一项的基质来从液体中分离至少一种靶化合物。
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