CN111057153B - 一种免疫球蛋白结合蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

一种免疫球蛋白结合蛋白及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供的一种免疫球蛋白结合蛋白包括蛋白A的B结构域，蛋白G的C2结构域，蛋白L的B3结构域的变异体或其任意1‑3项变异体的组合，通过蛋白A、蛋白G和蛋白L不同的结合特性具有一定的互补性，是反应性更广、亲和力更高的耐碱性多功能型IBP分子。本发明中用3步层析法纯化蛋白,能稳定蛋白质量，保证蛋白纯度大于97％，内毒素水平低于1Eu/mg，符合临床用蛋白的要求。用所纯化的免疫球蛋白结合蛋白合成的免疫吸附填料稳定性增加,能有效地提高填料的使用次数，延长了填料的使用寿命。

Description

一种免疫球蛋白结合蛋白及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物医学材料及血液净化领域，具体涉及一种免疫球蛋白结合蛋白及其制备方法和应用。
背景技术
自身免疫性疾病是由于机体自身抗体的变异，对抗自身组织，引起对全身组织器官的损害而导致的一系列症状和疾病，是目前难以对付的、威胁人类健康与生命的主要疾病之一，一直以来都没有有效的治疗方法。目前，自身免疫性疾病主要的治疗方法是应用免疫抑制药物和血浆置换。前者是通过药物抑制机体的免疫系统，减轻体内抗体对抗自身组织和器官的损害，从而以达到减轻症状、延缓疾病进展的目的。由于它抑制了机体所有抗体的产生，毒副作用较大，而且对很多自身免疫性疾病及其症状治疗效果不理想；后者是通过定期地用正常人体血浆替换病人体内血浆，以清除机体内变异的免疫球蛋白。由于输入异体血浆，可能导致：1)交叉感染；2)过敏反应；3)出血倾向等。因此，寻求自身免疫性疾病更好的治疗方法是目前医学领域的一个重大研究课题。
蛋白A免疫吸附是将天然或重组的蛋白A通过共价键偶联至载体合成免疫吸附剂，通过体外循环的方法，能有效地清除血液中的免疫球蛋白。商品化的蛋白A免疫吸附柱Immunosorba和Prosorba(二者均为德国Fresenius公司产品)在1999-2001年相继获得了美国食品和药物管理局(FDA)的认证用于治疗特发性血小板减少性紫瘫和类风湿性关节炎(Prosorba)以及带有抑制因子的血友病(Immunosorba)。2015年费森尤斯推出新的吸附柱LIGASORB，用于治疗急性的自身免疫性疾病，配基是基因工程重组的蛋白A，载体是聚甲基丙烯酸酯，一次性使用。临床应用结果表明，基于亲和层析原理的蛋白A免疫吸附血液净化治疗，对自身免疫性疾病具有独特的治疗效果：1)对很多免疫抑制药物治疗效果不理想的自身免疫性疾病具有更好的治疗效果，2)对机体几乎没什么毒副作用，3)克服了血浆置换的副作用，4)与免疫抑制药物同时应用，可将免疫抑制药物的用量降到最低，以减少免疫抑制药物的毒副作用等。随着医学的快速发展，器官移植应用越来越普遍。蛋白A免疫吸附血液净化治疗在器官移植中的作用越来越重要，应用越来越广泛：1)在器官移植前进行蛋白A免疫吸附血液净化治疗可减少排斥反应发生的概率；2)在器官配型时，应用蛋白A免疫吸附血液净化治疗，可排除因ABO血型不符而导致的配型问题；3)当出现排斥反应迹象时，应用蛋白A免疫吸附血液净化治疗，可防止排斥反应的发生；4)器官移植后，应用蛋白A免疫吸附血液净化治疗，可减小免疫抑制药物的用量，从而减少免疫抑制药物的毒副作用等。同时，越来越多的研究表明，对于恶性肿瘤，蛋白A免疫吸附血液净化治疗也有很好的辅助治疗效果，能增强恶性肿瘤的化疗和放疗效果，可能的原因是由于免疫吸附清除了肿瘤患者体内产生的免疫抑制复合物。
免疫球蛋白结合蛋白(Immunoglobulin-binding proteins,IBP)是一类来源于细菌、能选择性吸附哺乳动物(包括人)的免疫球蛋白的蛋白分子。这类分子往往包含一定程度的重复序列(即同源片段)，且结构简单、稳定性高，能与免疫球蛋白进行可逆结合等。其中，最具有代表性的三种IBP是：蛋白A、蛋白G和蛋白L。
蛋白A，全称金黄色葡萄球菌蛋白A(Staphylococcal protein A,SPA)，是目前研究最透彻的免疫球蛋白结合蛋白。天然蛋白A分子量约42kDa，通过其羧端的细胞壁结合域被结合到细菌的细胞壁上，包括5个免疫球蛋白结合区，被称为E、D、A、B和C区，每个蛋白A分子可结合两个IgG分子。蛋白A与人IgG的IgG1、IgG2、IgG4三个亚型的反应性为100％，与IgG3的反应性较低，约35％。对IgM和IgA的反应性也相对较低，对IgE则几乎无反应性。
蛋白G，全称是链球菌蛋白G(Streptococcal protein G,SPG)，来源于另一种致病性革兰氏阳性菌-链球菌的细胞表面。天然蛋白G分子量约65kd，含3个同源性极高的结构域C1、C2、C3 3个IgG结合结构域。与蛋白A不同，蛋白G能结合人IgG的所有亚类，其反应性均是100％，但不结合IgA、IgM、IgD和IgE。
蛋白L，全称是食用链球菌蛋白L(protein L from peptostreptococcus magnus，PPL)。天然蛋白L来源于食用链球菌的细胞壁。蛋白A和蛋白G对人Ig的结合主要源于对Fc段，即Ig重链的结合，因此这两种IBP分子与人Ig的结合受Ig分类所限(不同类的Ig，即IgG、IgA、IgM、IgE和IgD因重链抗原性的不同而得以区分)。而蛋白L对人Ig的结合主要源于对Ig轻链的结合，因此这种IBP分子与人Ig的结合不受Ig分类所限，而受分型所限(根据轻链抗原性的不同，人Ig分为κ型和λ型)。蛋白L分子量76KD，包括5个Ig结合结构域：B1，B2，B3，B4，B5。蛋白L能结合κ型Ig中的κI、κIII和κIV三个亚型，而不结合κII亚型和λ型。它对IgG、IgM和IgA的亲和力应基本一致。依上所述，蛋白A、蛋白G和蛋白L的结合特性并不相同或具有一定的互补性，因此，如果能够对其进行综合利用、优势互补，有望开发出反应性更广、亲和力更高的多功能型IBP分子。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种免疫球蛋白结合蛋白及其制备方法和应用。如前所述，蛋白A、蛋白G、蛋白L三种免疫球蛋白结合蛋白对免疫球蛋白IgG、IgA、IgM、IgE的结合类型及结合力各不相同。且本发明的目的之一是选择3种蛋白免疫球蛋白结合蛋白中结合能力最强的结构域，如蛋白A的B结构域，蛋白G的C2结构域，蛋白L的B3结构域为模板，在此基础上通过密码子优化及突变氨基酸，使得蛋白在大肠杆菌中表达量更高，稳定性更高。
本发明的第一个目的在于提供一种免疫球蛋白结合蛋白所述结合蛋白为蛋白A的结构域串联体、蛋白G的结构域串联体、蛋白L的结构域串联体任意组合或两两组合；所述串联体为2个重复的蛋白结构域。
进一步地，所述蛋白A的结构域为蛋白A的B结构域变异体，与亲本分子的氨基酸序列相比其突变位点为N6G、N23T、G29A和N52K；所述蛋白G的结构域为蛋白G的C2结构域变异体，与亲本分子的氨基酸序列相比其突变位点为N7T、N34K、N36A和W42K；所述蛋白L的结构域为蛋白L的B3结构域变异体，与亲本分子的氨基酸序列相比其突变位点为N17K、Q26A、A35E、A57V、L59V、G62K、N67T和R69K。
蛋白A的B结构域亲本氨基酸序列如下：
VDNKFNKEQQNAFYEILHLPNLNEEQRNGFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK
蛋白G的C2结构域亲本氨基酸序列如下：
TYKLVINGKTLKGETTTEAVDAATAEKVFKQYANDNGVDGEWTYDDATKTFTVTE
蛋白L的B3结构域亲本氨基酸序列如下：
KEKTPEEPKEEVTIKANLIYADGKTQTAEFKGTFAEATAEAYRYADLLAKENGKYTADLEDGGYTINIRFAG
所述蛋白A、蛋白G、蛋白L均通过基因定点突变，提高了耐碱稳定性；通过基因定点突变，提高了蛋白A变异体对IgG3亚型的吸附能力，相应地其组合蛋白AG、AL、AGL对IgG3亚型的吸附能力也增强。
进一步地，所述蛋白A的B结构域变异体的氨基酸序列如SEQ NO:1～3所示；所述蛋白G的C2结构域变异体的氨基酸序列如SEQ NO:4～6所示；所述蛋白L的B3结构域变异体的氨基酸序列如SEQ NO:7～9所示。
进一步地，所述免疫球蛋白结合蛋白的氨基酸序列如SEQ NO:10～13所示。
本发明的第二个目的在于提供免疫球蛋白结合蛋白的制备方法，包括以下步骤：
(1)将蛋白A的B结构域串联体、蛋白G的C2结构域串联体和蛋白L的B3结构域串联体进行组合，构建基因重组质粒和表达菌株；
(2)重组免疫球蛋白结合蛋白的表达和纯化及吸附性能评价。
进一步地，所述蛋白A的B结构域的氨基酸序列如SEQ NO:1所示；所述蛋白G的C2结构域的氨基酸序列如SEQ NO:5所示；所述蛋白L的B3结构域的氨基酸序列如SEQ NO:9所示。
进一步地，所述重组质粒包含能编码如SEQ NO:10～13所示的氨基酸序列的基因。
进一步地，所述表达菌株为大肠杆菌BL21(DE3)，所述质粒为PET30a。
本发明直接合成含有限制性酶切位点的目的基因片段，将编码目的蛋白的基因被转入含有启动子和信号序列的载体中。利用酶切位点构建质粒，转入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中，利用载体的his标签方便后续纯化蛋白。将重组的大肠杆菌置于发酵培养基中，培养温度20～40℃，检测OD600值到达0.5～1.0时，加入诱导剂IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)进行诱导表达，继续培养温度20～40℃，时间5～24h，检测OD600值开始下降前离心，收集菌体。
本发明的第三个目的在于提供一种免疫球蛋白结合蛋白的纯化方法，所述纯化方法采用3步层析的方法纯化蛋白。所述3步层析方法的具体步骤为第一步层析选用亲和层析，第二步层析选用离子交换层析，第三步层析选用疏水层析；或者第一步层析选用疏水层析，第二步层析选用亲和层析，第三步层析选用离子交换层析。
优选地，所述方法还包括不同的层析步骤之间用超滤膜包置换5倍体积的缓冲液，将终蛋白溶液置换于生理盐水中，所述超滤膜包的孔径为5K。
优选地，所述亲和层析使用的平衡液为10-50mM bis-tris，洗脱液为180mM咪唑的bis-tris。
优选地，所述离子交换层析使用的平衡液为含有0.05-2wt％TritonX-100的10-50mM bis-tris，冲洗液为10-50mM bis-tris，洗脱液为含有150mM NaCl的bis-tris。本发明中离子交换层析选用bis-Tris代替tris-HCl主要是考虑后者含有氨基，对下游的合成填料有影响。
优选地，所述疏水交换层析使用的平衡液为含有1.5M(NH4)2SO4的PBS，洗脱液为PBS；所述平衡液、冲洗液、洗脱液的pH值均为7.2。疏水层析的主要目的是进一步纯化蛋白，去除内毒素。
优选地，所述疏水层析使用的填料为phenyl sepharose FF、Phenyl bestaroseFF、Phenyl bestarose HP或其它性质相同的填料；所述亲和层析使用的填料为TALONsuperflow、Ni sepharose 6FF、Ni Bestarose FF或其它性质相同的填料；所述离子交换层析使用的填料为DEAE sepharose FF、capto DEAE或其它性质相同的填料。
由于重金属离子的脱落问题，金属离子螯合层析的使用寿命一般不超过20次。所以工业生产不会考虑用这种亲和层析纯化蛋白。近年来，随着合成填料技术的不断改进，GE已经推出了可以耐碱(pH 2-14)且结合力高的纯化his标签蛋白的亲和层析填料，如TALONsuperflow。本发明采用金属离子螯合层析，离子交换层析，疏水层析这三步层析的方法进行纯化。通过实验发现，使用bis-tris溶液进行上样及清洗，同时用0.01M NaOH清洗层析柱，可以有效地提高填料的使用次数到50次以上。极大地提高了填料的使用寿命，能够用于工业生产蛋白。本发明利用3步层析的方法进行大规模蛋白的纯化，进一步稳定蛋白质量，保证蛋白纯度大于97％。内毒素水平低于1Eu/mg，符合临床用蛋白的要求。
进一步地，亲和层析包括以下步骤：用含5-50mM bis-tris，pH＝6.5-7.2的溶液平衡5倍柱体积，将蛋白溶液上样；继续用含5-50mM bis-tris，pH＝6.5-7.2的溶液平衡5倍柱体积；用0.01M NaOH冲洗1倍柱体积；再用含5-50mM bis-tris，pH＝6.5-7.2的溶液平衡5倍柱体积；最后用含有50-800mM咪唑的bis-tris缓冲液洗脱收集蛋白。
进一步地，离子交换层析包括以下步骤：用10-50mM bis-tris，0.05-2wt％TritonX-100，pH＝6.5-7.2的溶液平衡5倍柱体积，将蛋白溶液上样，继续用10-50mM bis-tris，0.05-2wt％TritonX-100溶液平衡5倍柱体积；再用10-50mM bis-tris的冲洗液冲洗5倍柱体积；最后用含有100-500mM的NaCl的10-50mM bis-tris缓冲液洗脱收集蛋白。
进一步地，疏水层析包括以下步骤：用含有1.0-1.5M(NH4)2SO4的PBS溶液平衡5倍柱体积，将含有1.5M(NH4)2SO4的蛋白溶液上样；继续用含有1.5M(NH4)2SO4的PBS溶液平衡5倍柱体积；最后用PBS溶液洗脱并收集蛋白溶液。
优选地，所述PBS溶液的由以下组分配置而成：磷酸氢二钠8.0mmol/L、磷酸二氢钾2.0mmol/L和NaCl 131mmol/L。
本发明的第四个目的在于提供免疫球蛋白结合蛋白在制备吸附填料中的应用。
进一步地，将本发明的免疫球蛋白结合蛋白偶联至固相载体上制备成免疫吸附剂，将所述免疫吸附剂用1M NaOH清洗6h以上或用0.5M NaOH清洗24h以上或用0.1M NaOH清洗72h以上，其吸附性能下降率不低于10％。
进一步地，将本发明的免疫球蛋白结合蛋白偶联至固相载体上制备成免疫吸附剂，用无菌氢氧化钠或饱和碳酸钠或饱和碳酸氢钠溶液清洗和消毒，延长吸附柱的使用寿命。
本发明的第五个目的在于提供了本发明的免疫球蛋白结合蛋白在制备用于治疗自身免疫性疾病试剂中的应用。
本发明的第六个目的在于提供了本发明的免疫球蛋白结合蛋白用于临床自身免疫性疾病或其它与人体内Ig相关的疾病的治疗。
本发明的本发明的有益效果：本发明的免疫球蛋白结合蛋白同时包括蛋白A的B结构域，蛋白G的C2结构域，蛋白L的B3结构域，通过蛋白A、蛋白G和蛋白L不同的结合特性具有一定的互补性，是反应性更广、亲和力更高的多功能型IBP分子。本发明的免疫球蛋白结合蛋白的3步层析方法能有效地提高填料的使用次数，延长了填料的使用寿命。本发明的3步层析法能稳定蛋白质量，保证蛋白纯度大于97％，内毒素水平低于1Eu/mg，符合临床用蛋白的要求。
附图说明
图1为实施例1构建的重组蛋白AG、AL、GL的质粒以及酶切后获得目的蛋白片段的SDS-PAGE图，其中1：蛋白AG质粒图(PET30a)；2：蛋白AG酶切后质粒图(708bp)；3：蛋白AL质粒图(PET30a)；4：蛋白AL酶切后质粒图(810bp)；5：蛋白GL质粒图(PET30a)；6：蛋白GL酶切后质粒图(804bp)；7：DNA Ladder 5000。
图2为实施例1构建的重组蛋白AGL的质粒以及酶切后获得目的蛋白片段的SDS-PAGE图，其中1：蛋白AGL质粒图(PET30a)；2：蛋白AGL酶切后质粒图(1152bp)；3：DNA Ladder5000。
图3为实施例2构建的重组菌具体破碎后上清SDS-PAGE图，其中1：蛋白Marker；2：蛋白AG菌体破碎上清电泳图(24KD)；3：蛋白AL菌体破碎上清电泳图(32KD)；4：蛋白GL菌体破碎上清电泳图(33KD)；5：蛋白AGL菌体破碎上清电泳图(38KD)。
图4为纯化后蛋白AGL的高效液相图
具体实施方式
为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细描述。
实施例1免疫球蛋白结合蛋白的载体构建及表达
人工合成如SEQ ID No：1～13的氨基酸序列，将能编码目的氨基酸序列的基因序列的重组质粒PET30a(Novagen)利用酶切位点NdeI和XhoI连接后，转入感受态的大肠杆菌菌株BL21(DE3)(merck millipore)中。在250mL三角瓶中装入50mL的LB培养基，卡那霉素终浓度50μg/mL，37℃，180rpm，培养4h后，加入终浓度为50μg/mL的IPTG进行诱导表达，再次培养5h后，收集菌体。
实施例2菌体的破碎处理
取l kg含有免疫球蛋白结合蛋白的菌体，按照质量:体积＝1kg:10L的比例将菌体加入到pH＝7.2的PBS缓冲液中，搅拌均匀后用高压均质机破碎，压力800bar破碎2次，4℃，8000rpm，离心15min收集上清液约9.5L。将所得到的溶液加入盐酸调节pH至3.0，4℃，8000rpm，离心15min，收集上清液用氢氧化钠调至pH＝7.0，8000rpm，离心15min得到菌体破碎上清。
实施例3免疫球蛋白结合蛋白的纯化
(1)亲和层析：将装填有TALON superflow金属离子螯合填料的层析柱用10mMbis-tris[二(2-羟乙基)三亚氨基(羟甲基)甲烷]，pH 7.2的溶液平衡5倍柱体积，然后将实施例2得到的破碎上清上样，上完样后用含10mM bis-tris，pH＝7.2的溶液平衡5倍柱体积，用0.01M NaOH冲洗1倍柱体积，再用含10mM bis-tris，pH＝7.2的溶液平衡5倍柱体积，最后用含有180mM咪唑的10mM bis-tris，pH 7.2的溶液洗脱收集蛋白。亲和层析的主要目的是捕获蛋白，利用金属离子螯合填料及需纯化的蛋白都耐碱的特性，在纯化时用低浓度的氢氧化钠清洗掉结合力不强的蛋白，一步法获得高纯度的蛋白，同时氢氧化钠冲洗也可以去除内毒素，降低洗脱峰中蛋白的内毒素含量。
(2)离子交换层析：用5K的超滤膜包置换缓冲液为10mM bis-tris，1.0wt％TritonX-100溶液。将装填有DEAE Bestarose层析填料的层析柱用含有10mM Bis-tris，1.0wt％TritonX-100，pH 7.2的溶液的平衡5倍柱体积，将蛋白溶液上样，上样后继续用10mM Bis-tris，1.0wt％TritonX-100，pH 7.2的溶液平衡5倍柱体积，用含有10mM Bis-tris，pH 7.2的冲洗液冲洗5倍柱体积，最后用含有150mM/L NaCl的10mM Bis-tris，pH 7.2的洗脱液洗脱，收集洗脱峰。离子交换层析用bis-Tris代替tris-HCl主要是考虑后者含有氨基，对下游的合成填料有影响。
(3)疏水层析：用5K的超滤膜包置换缓冲液为PBS缓冲液。将装填有Phenylbestarose FF的疏水层析填料的层析柱用含有1.5M(NH4)2SO4，pH 7.2的PBS溶液平衡5倍柱体积，将步骤(2)得到的蛋白溶液用含有1.5M(NH4)2SO4的PBS溶液稀释5倍后上样，上样后继续用含有1.5M(NH4)2SO4，pH 7.2的PBS溶液平衡5倍柱体积，最后用PBS溶液洗脱，收集洗脱峰。然后用超滤系统将缓冲液置换为生理盐水体系，即得目的蛋白溶液。疏水层析的主要目的是进一步纯化并浓缩蛋白，同时去除少量的内毒素。
用凝胶半定量法-鲎试剂测定所得终蛋白溶液的内毒素含量为0.4Eu/mg。蛋白纯度用反相HPLC法进行测定，纯度大于97％，如图4所示。
实施例4合成吸附填料的方法
合成吸附填料的方法参考专利CN201910353718.1。将100g琼脂糖凝胶(Sepharose6FF)用10倍体积左右的注射用水冲洗干净后，加入100mL的1M NaOH溶液、30mL环氧溴丙烷和70mL、1，4-丁二醇二缩水甘油醚和0.2g硼氢化钠，搅拌，30℃下反应1.5h，反应结束后用大量的注射用水冲洗干净，得到环氧活化的琼脂糖凝胶。在500mL的反应容器中加入上述合成的环氧活化琼脂糖凝胶100mL，0.1mol/L的硼酸盐缓冲液150mL，控制体系pH值为7.5到8.5，加入14g免疫球蛋白结合蛋白，在37℃恒温体系里反应20h，停止反应，用大约10倍体积的注射用水冲洗填料，冲洗干净后，加入200mL 0.2M的乙醇胺溶液封闭未反应的环氧基，20℃反应10h。反应完之后，用大量注射用水冲洗，最后将其保存在含有防腐剂的溶液中保存。
实施例5蛋白A及本发明中各组合蛋白合成填料对人IgG的吸附性能测试
取0.5mL的实施例4中合成的填料于10mL EP管中，加入5mL人血浆，置于摇床中，室温下缓慢摇匀1h。反应完成后，将上述反应液倒入一次性亲和层析柱中，先用约100mL平衡液(PBS)冲洗，然后用40mL洗脱液(柠檬酸2.1g/L，NaCl 8.0g/L)洗脱，收集洗脱峰，用紫外检测OD280的数值，吸附性能(mg/mL)＝[(OD280/1.38)×40]/0.5。同时用IgG3检测试剂盒测定洗脱液中IgG3的含量，计算各填料所吸附的IgG3的含量。结果如表1显示，除蛋白AG外，AL、GL、AGL与蛋白A对总IgG的吸附性能差别不大，但是组合蛋白对IgG3的吸附比例明显升高。
表1：蛋白A及本发明中各组合蛋白合成填料对人IgG的吸附性能结果
Figure GDA0003124408440000101
Figure GDA0003124408440000111
实施例6蛋白AGL合成填料的耐碱性能测试
取一定量的实施例5制备的填料，分别用0.5M NaOH浸泡处理1h，6h，12h，24h，36h后装入一次性亲和层析柱中，用10倍柱体积的纯化水冲洗。然后按照实施例5的方法测定吸附性能，结果如表2所示。
表2：蛋白A及本发明中各组合蛋白合成填料耐碱性能结果
Figure GDA0003124408440000112
结果显示，突变后的蛋白A填料耐碱性能比突变前有较大的提高，用0.5M NaOH处理36h后，吸附性能下降率由原来的53.7％提高至12.7％。其它几个蛋白的比较，蛋白AG及蛋白GL的耐碱性稍弱，处理36h后，吸附性能分别下降了15.2％和16.0％。蛋白A、蛋白AGL、蛋白AL的稳定性相当，处理36h后，吸附性能约下降12％。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州康盛生物科技有限公司
<120> 一种免疫球蛋白结合蛋白及其制备方法和应用
<130> 11.20
<160> 13
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 63
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 1
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<210> 2
<211> 63
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 2
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Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Ala Leu Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Ile Ala Pro Lys Val Asp Cys Leu Glu
50 55 60
<210> 3
<211> 63
<212> PRT
<213> 人工合成
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20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Ala Ala Leu Leu Ala Glu Ala
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Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Val Asp Cys Leu Glu
50 55 60
<210> 4
<211> 62
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 4
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Thr Thr Thr Glu Ala Val Asp Ala Ala Thr Ala Glu Lys Phe Phe Lys
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Gln Tyr Ala Asn Asp Ala Gly Val Asp Gly Glu Trp Thr Tyr Asp Asp
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<211> 62
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 5
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 11
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Lys Leu Ile Tyr Ala Asp Gly Lys Thr Ala Thr Ala Glu Phe Lys Gly
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<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 12
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Gln Tyr Ala Lys Asp Ala Gly Val Asp Gly Glu Lys Thr Tyr Asp Asp
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Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu Val Asp Thr Tyr Lys Leu Val
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Ile Thr Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr Thr Thr Glu Ala Val Asp
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100 105 110
Thr Glu Val Asp Lys Glu Lys Thr Pro Glu Glu Pro Lys Glu Glu Val
115 120 125
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Ala Asp Leu Leu Ala Lys Glu Asn Gly Lys Tyr Thr Val Asp Val Glu
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260 265
<210> 13
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<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 13
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Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
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Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala
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Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu
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Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Lys Asp Ala
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Gln Ala Pro Lys Val Asp Thr Tyr Lys Leu Val Ile Thr Gly Lys Thr
115 120 125
Leu Lys Gly Glu Thr Thr Thr Glu Ala Val Asp Ala Ala Thr Ala Glu
130 135 140
Lys Val Phe Lys Gln Tyr Ala Lys Asp Ala Gly Val Asp Gly Glu Lys
145 150 155 160
Thr Tyr Asp Asp Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu Val Asp Thr
165 170 175
Tyr Lys Leu Val Ile Thr Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr Thr Thr
180 185 190
Glu Ala Val Asp Ala Ala Thr Ala Glu Lys Val Phe Lys Gln Tyr Ala
195 200 205
Lys Asp Ala Gly Val Asp Gly Glu Lys Thr Tyr Asp Asp Ala Thr Lys
210 215 220
Thr Phe Thr Val Thr Glu Val Asp Lys Glu Lys Thr Pro Glu Glu Pro
225 230 235 240
Lys Glu Glu Val Thr Ile Lys Ala Lys Leu Ile Tyr Ala Asp Gly Lys
245 250 255
Thr Ala Thr Ala Glu Phe Lys Gly Thr Phe Glu Glu Ala Thr Ala Glu
260 265 270
Ala Tyr Arg Tyr Ala Asp Leu Leu Ala Lys Glu Asn Gly Lys Tyr Thr
275 280 285
Val Asp Val Glu Asp Lys Gly Tyr Thr Ile Thr Ile Lys Phe Ala Gly
290 295 300
Val Asp Lys Glu Lys Thr Pro Glu Glu Pro Lys Glu Glu Val Thr Ile
305 310 315 320
Lys Ala Lys Leu Ile Tyr Ala Asp Gly Lys Thr Ala Thr Ala Glu Phe
325 330 335
Lys Gly Thr Phe Glu Glu Ala Thr Ala Glu Ala Tyr Arg Tyr Ala Asp
340 345 350
Leu Leu Ala Lys Glu Asn Gly Lys Tyr Thr Val Asp Val Glu Asp Lys
355 360 365
Gly Tyr Thr Ile Thr Ile Lys Phe Ala Gly Val Asp Cys Leu Glu
370 375 380

Claims (17)

1.一种免疫球蛋白结合蛋白，其特征在于，所述结合蛋白为蛋白A的结构域串联体、蛋白G的结构域串联体、蛋白L的结构域串联体进行组合，所述组合为AG、AL、GL或AGL；所述串联体为2个重复的蛋白结构域；所述AG的序列如SEQ NO:10所示；所述AL的序列如SEQ NO:11所示；所述GL的序列如SEQ NO:12所示；所述AGL的序列如SEQ NO:13所示。
2.如权利要求1所述的免疫球蛋白结合蛋白，其特征在于，所述蛋白A的结构域为蛋白A的B结构域变异体，与亲本分子的氨基酸序列相比其突变位点为N6G、N23T、G29A和N52K；所述蛋白A的B结构域变异体的氨基酸序列如SEQ NO:1所示；
所述蛋白G的结构域为蛋白G的C2结构域变异体，与亲本分子的氨基酸序列相比其突变位点为N7T、N34K、N36A和W42K；所述蛋白G的C2结构域变异体的氨基酸序列如SEQ NO: 5所示；
所述蛋白L的结构域为蛋白L的B3结构域变异体，与亲本分子的氨基酸序列相比其突变位点为N17K、Q26A、A35E、A57V、L59V、G62K、N67T和R69K；所述蛋白L的B3结构域变异体的氨基酸序列如SEQ NO: 9所示。
3.如权利要求2所述的免疫球蛋白结合蛋白，其特征在于，所述蛋白A、蛋白G、蛋白L均通过基因定点突变，提高了耐碱稳定性；通过基因定点突变，提高了蛋白A变异体对IgG3亚型的吸附能力，相应地其组合蛋白AG、AL、AGL对IgG3亚型的吸附能力也增强。
4.一种如权利要求1~3任一项所述的免疫球蛋白结合蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将蛋白A的B结构域串联体、蛋白G的C2结构域串联体和蛋白L的B3结构域串联体进行组合，构建基因重组质粒和表达菌株；
（2）重组免疫球蛋白结合蛋白的表达和纯化及吸附性能评价；
所述蛋白A的B结构域的氨基酸序列如SEQ NO:1所示；所述蛋白G的C2结构域的氨基酸序列如SEQ NO:5所示；所述蛋白L的B3结构域的氨基酸序列如SEQ NO:9所示；所述重组质粒包含能编码如SEQ NO:10~13所示的氨基酸序列的基因。
5.一种如权利要求1~3任一项 所述的免疫球蛋白结合蛋白的纯化方法，其特征在于，具体步骤为第一步层析选用亲和层析，第二步层析选用离子交换层析，第三步层析选用疏水层析；或第一步层析选用疏水层析，第二步层析选用亲和交换层析，第三步层析选用离子交换层析。
6.如权利要求5所述的免疫球蛋白结合蛋白的纯化方法，其特征在于，所述方法还包括不同的层析步骤之间用超滤膜包置换5倍体积的缓冲液，将终蛋白溶液置换于生理盐水中，所述超滤膜包的孔径为5K。
7.如权利要求5所述的免疫球蛋白结合蛋白的纯化方法，其特征在于，所述亲和层析使用的平衡液为10-50mM bis-tris，洗脱液为180mM 咪唑的bis-tris；所述离子交换层析使用的平衡液为含有0.05-2wt% TritonX-100的10-50mM bis-tris ，冲洗液为10-50mM bis-tris，洗脱液为含有150mM NaCl的bis-tris；所述疏水交换层析使用的平衡液为含有1.5M（NH4）2SO4的PBS，洗脱液为PBS，所述平衡液、冲洗液、洗脱液的pH值均为7.2。
8.如权利要求5所述的免疫球蛋白结合蛋白的纯化方法，其特征在于，所述疏水层析使用的填料为phenyl sepharose FF、Phenyl bestarose FF、Phenyl bestarose HP或其它性质相同的填料；所述亲和层析使用的填料为TALON superflow、Ni sepharose 6FF、NiBestarose FF或其它性质相同的填料；所述离子交换层析使用的填料为DEAE sepharoseFF、capto DEAE或其它性质相同的填料。
9.如权利要求5所述的免疫球蛋白结合蛋白的纯化方法，其特征在于，亲和层析包括以下步骤：用含5-50mM bis-tris ，pH=6.5-7.2的溶液平衡5倍柱体积，将蛋白溶液上样；继续用含5-50mM bis-tris ，pH=6.5-7.2的溶液平衡5倍柱体积；用0.01M NaOH冲洗1倍柱体积；再用含5-50mM bis-tris ，pH=6.5-7.2的溶液平衡5倍柱体积；最后用含有50-800mM 咪唑的bis-tris缓冲液洗脱收集蛋白。
10.如权利要求5所述的免疫球蛋白结合蛋白的纯化方法，其特征在于，离子交换层析包括以下步骤：用10-50mM bis-tris，0.05-2wt% TritonX-100，pH=6.5-7.2的溶液平衡5倍柱体积，将蛋白溶液上样，继续用10-50mM bis-tris ，0.05-2wt% TritonX-100溶液平衡5倍柱体积；再用10-50mM bis-tris 的冲洗液冲洗5倍柱体积；最后用含有100-500mM的NaCl的10-50mM bis-tris缓冲液洗脱收集蛋白。
11.如权利要求5所述的免疫球蛋白结合蛋白的纯化方法，其特征在于，疏水层析包括以下步骤：用含有1.0-1.5M（NH4）2SO4的PBS溶液平衡5倍柱体积，将含有1.5M（NH4）2SO4的蛋白溶液上样；继续用含有1.5M （NH4）2SO4的PBS溶液平衡5倍柱体积；最后用PBS溶液洗脱并收集蛋白溶液。
12.如权利要求11所述的免疫球蛋白结合蛋白的纯化方法，其特征在于，所述PBS溶液的由以下组分配置而成：磷酸氢二钠8.0mmol/L、磷酸二氢钾2.0mmol/L和NaCl 131mmol/L。
13.如权利要求1~3任一项所述的免疫球蛋白结合蛋白在制备吸附填料中的应用。
14.如权利要求13所述的应用，其特征在于，将如权利要求1~3任一项所述的免疫球蛋白结合蛋白偶联至固相载体上制备成免疫吸附剂，将所述免疫吸附剂用1M NaOH清洗6h以上或用0.5M NaOH清洗24h以上或用0.1M NaOH清洗72h以上，其吸附性能下降率不低于10%。
15.如权利要求13所述的应用，其特征在于，将如权利要求1~3任一项所述的免疫球蛋白结合蛋白偶联至固相载体上制备成免疫吸附剂，可用无菌氢氧化钠或饱和碳酸钠或饱和碳酸氢钠溶液清洗和消毒，延长吸附柱的使用寿命。
16.如权利要求1~3任一项所述的免疫球蛋白结合蛋白在制备用于治疗自身免疫性疾病试剂中的应用。
17.如权利要求1~3任一项所述的免疫球蛋白结合蛋白在制备自身免疫性疾病或其它与人体内Ig相关疾病治疗产品的应用。
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