ES2210241T3 - Nuevas glicoformas del receptor de complemento soluble tipo 1. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A NUEVAS GLICOFORMAS Y PREPARACIONES DEL RECEPTOR DE COMPLEMENTO SOLUBLE DE TIPO 1 (SCR1) Y SUS USOS EN LA TERAPIA DE ENFERMEDADES ASOCIADAS DE COMPLEMENTO Y TRASTORNOS QUE COMPRENDEN LA INFLAMACION Y ACTIVACION DE COMPLEMENTO INAPROPIADA Y EN CONDICIONES DE ESTADO DE SHOCK O TROMBOTICAS.LA INVENCION SE REFIERE A NUEVAS GLICOFORMAS Y METODOS PARA PRODUCIR, DETECTAR, ENRIQUECER Y PURIFICAR TALES GLICOFORMAS. LA INVENCION SE REFIERE ADEMAS A METODOS DE PRODUCCION ESPECIFICA DE UNA GLICOFORMA POR MEDIOS RECOMBINANTES O QUIMICOS. REALIZACIONES PREFERIDAS DE LA INVENCION COMPRENDE GLICOFORMAS SIALIZADAS Y GLICOFORMAS CON UN PI INFERIOR O IGUAL A 5.1 DETERMINADO POR CROMATOENFOQUE O CON UN ACIDO SIALICO DE RELACION MOLAR DE MANOSA SUPERIOR A .25. LAS GLICOFORMAS PUEDEN FORMULARSE SOLAS EN COMPOSICIONES TERAPEUTICAS O EN COMBINACION CON AGENTES TROMBOTICOS.

Description

Nuevas glicoformas del receptor de complemento soluble tipo 1.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a glicoformas novedosas de receptor tipo 1 de complemento soluble (abreviadamente en inglés sCR1) y sus usos en la diagnosis y terapia de los trastornos que implican actividad del complemento y diversos trastornos inflamatorios e inmunes. La invención también proporciona procedimientos de producción, detección y purificación de dichas glicoformas.

Antecedentes de la invención El sistema de complemento

Constituyendo aproximadamente el 10% de las globulinas en el suero normal, el sistema de complemento se compone de muchas proteínas diferentes que son importantes en la respuesta del sistema inmune para antígenos extraños. El sistema de complemento se llega a activar cuando sus componentes principales se fragmentan y los fragmentos, solos o con otras proteínas, activan las proteínas de complemento adicionales dando como resultado una cascada proteolítica. La activación del sistema de complemento conduce a un incremento en la permeabilidad vascular, quimiotaxia de células fagocíticas, la activación de células inflamatorias, la opsonización de las partículas extrañas, la muerte directa de las células y daño tisular. La activación del sistema de complemento se puede accionar mediante complejos antígeno - anticuerpo (la ruta clásica) o por ejemplo, mediante los lipopolisacáridos presentes en las paredes celulares de las bacterias patogénicas (la ruta alternativa).

El receptor tipo 1 de complemento unido a membrana

El receptor tipo 1 de complemento (abreviadamente en inglés CR1) está presente en la superficie de la membrana de los eritrocitos, monocitos/macrófagos, granulocitos, células B, algunas células T, células dendriticas foliculares esplénicas y podocitos glomerulares. El CR1 se une a los componentes de complemento C3b y C4b y también se ha denominado receptor C3b/C4b. Se conoce la estructura tridimensional y la estructura primaria del CR1 (Klickstein y col., 1987, J. Exp. Med. 165: 1095 - 1112, Klickstein y col., 1988, J. Exp. Med. 168: 1699 - 1717; Hourcade y col., 1988, J. Exp. Med. 168: 1255 - 1270). Se compone de 30 repeticiones de consenso cortas (abreviadamente en inglés SCR), que contiene 60 - 70 aminoácidos. En cada SCR, se conservan 29 de la media de 65 aminoácidos. Cada SCR se ha propuesto que forma una estructura tridimensional de triple bucle mediante uniones disulfuro ente la tercera y primera y la cuarta y segunda mitad de la cistina en los puentes disulfuro. El CR1 se dispone además en forma de 4 repeticiones homólogas largas (abreviadamente en inglés LHR) de 7 SCR cada uno. Después de una secuencia guía, que se retira post-traduccionalmente, la molécula de CR1 constituida por la LHR-A más cercana al extremo N-terminal que comprende un dominio de unión de C4b, las dos siguientes repeticiones, LHR-B y LHR-C que comprenden dominios de unión C3b, y la LHR-D mas cercana al extremo C-terminal seguida por 2 SCR adicionales, una región teórica transmembranal de 25 residuos y una cola citoplásmica de 43 residuos.

El CR1 es un miembro de una superfamilia de proteínas caracterizado por esta homología de SCR. Alguno de los miembros de la superfamilia que tienen la función de unión a C3/C4 incluyen CR2, proteína de unión a C4, factor H, factor B, y C2, mientras que las proteínas que carecen de esta función incluyen el receptor de interleuquina 2, \beta2-glicoproteína I, C1r, haptoglobina de cadena a, y el factor XIIIb.

Se sabe que el CR1 es una glicoproteína y su secuencia de aminoácidos deducida tiene 25 sitios potenciales para la N-glicosilación (la secuencia de consenso de aminoácidos NXS o NXT) en la región extracelular. Solamente 6 - 8 de los sitios disponibles se indica que estén unidos a oligosacáridos (Sim, 1985, Biochem. J. 232: 883). Se produjo una forma no glicosilada de CR1 en presencia de tunicamicina y mostró unión reducida a iC3 (Lublin y col, 1986, J. Biol. Chem 261: 5736). El extremo N-terminal de la glicoproteína parece que esté bloqueado.

Hasta ahora, se han identificado cuatro formas alélicas diferentes de CR1 o alotipos, y difieren en tamaño en incrementos de 30 - 50 kDa. Las frecuencias génicas de estos alotipos difieren en la población humana (Holer y col., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 84: 2459 - 2463). El alotipo F (o A) se compone de 4 LHR y tiene un peso molecular de aproximadamente 250 kDa; el alotipo mayor S (o B), con un peso molecular de aproximadamente 290 kDa contiene un quinto LHR que es un híbrido de la mitad del extremo 5'terminal del LHR-B y la mitad del extremo 3!60!terminal de LHR-A y se predice que tiene un tercer sitio de unión a C3b (Wong y col., 1989, J. Exp. Med. 169: 847). El alotipo más pequeño F' (o C), que surge más probablemente de la supresión de LHR-B y un sitio de unión a C3b, presenta una frecuencia mas alta en pacientes con lupus eritematoso sistémico (abreviadamente en inglés SLE) (Van Dyne y col., 1987, Clin. Exp. Immunol. 68: 570, Dykman y col., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 80: 1698).

Receptor tipo 1 de complemento soluble

Una forma soluble de origen natural de CR1 se detectó en el plasma de individuos sanos y de ciertos individuos con SLE (Yoon y col., 1985, J. Immunol. 134: 3332 - 3338). Sus características son similares a las del CR1 (de la superficie celular) de los eritrocitos, tanto estructural como funcionalmente. Hourcade y col, 1988, J. Exp. Med. 168: 1255 - 1270) también se observó un sitio de poliadenilación alternativo en la unidad transcripcional de CR1 humana que se predijo que produce una forma secretada de CR1. El mRNA codificado por esta secuencia truncada comprende la primeras 8,5 SCR de CR1, y codifica una proteína de aproximadamente 80 kDa que incluye el dominio de unión a C4b. Cuando un cDNA que corresponde a esta secuencia truncada se transfectó a células COS y se expresó, demuestra la actividad de unión a C4b esperada pero no la unión a C3b (Krych y col., 1989, FASEB J. 3: A368). Krych y col., también observaron un mRNA similar al predicho en diversas estirpes de células humanas y postularon que dicha forma soluble truncada de CR1 con actividad de unión a C4b se puede sintetizar en humanos.

También se generaron varios fragmentos solubles de CR1 mediante procedimientos de DNA recombinante eliminando la región transmembranal de los DNA que se expresaron (Fearon y col., publicación de patente internacional WO 89/09220, 10/5/89; Fearon y col, publicación de patente internacional WO 91/05047, 18/4/91). Los fragmentos de CR1 solubles son funcionalmente activos, unen C3b y/o C4b y demuestran que la actividad del cofactor del factor I depende de las regiones que contengan. Dichas construcciones inhibían in vitro las consecuencias de la activación de complemento tal como el impulso oxidante neutrófilo, hemólisis mediada por el complemento y producción de C3a y C5a. Una construcción soluble, sCR1/pBSCR1c, también demostró actividad in vivo en una reacción inversa pasiva de Arthus (Fearon y col., 1989, 1991, referido anteriormente; Yeh y col., 1991, J. Immunol. 146: 250), inflamación miocárdica postisquémica suprimida y necrosis (Fearon y col., 1989, 1991, referido anteriormente; Weisman y col., Science, 1990, 249: 146 - 151) e índices de supervivencia mayores después del transplante (Pruitt y Bollinger, 1991, J. Surg. Res 50: 350; Pruitt y col., 1991 Transplantation 52; 868). Además, la coformulación del producto soluble del vector sCR1/pBSCR1 con el complejo activador plasminógeno - estreptoquinasa p-anisolado (abreviadamente en inglés APSAC) dio como resultado una actividad antihemolítica similar a la del el producto sCR1/pBSCR1c solo, indicando que era factible la combinación del inhibidor de complemento sCR1 con un agente trombolítico (Fearon y col, referido anteriormente).

Resumen de la invención

La presente invención se refiere a glicoformas novedosa de la proteína de receptor tipo 1 de complemento soluble (abreviadamente en inglés sCR1) y sus usos en la terapia de trastornos que implican la actividad de complemento y diversos trastornos inflamatorios e inmunes.

Los presentes inventores han descubierto que en ciertas condiciones de producción, se pueden obtener las glicoformas novedosas de sCR1 que presentan las propiedades deseables de aclaramiento prolongado de la sangre mientras retiene una actividad funcional significativa. Una larga semivida funcional permite la administración de la dosis del bolo simplificada y contribuye a la eficacia in vivo.

Los presentes inventores han aplicado diversos procedimientos de purificación para resolver y enriquecer glicoformas de sCR1 particulares. Así que, la presente invención proporciona una molécula de glicoproteína del receptor de complemento soluble 1 (abreviadamente en inglés sCR1) que contiene una o más estructuras de oligosacáridos complejas, cuyas una o más estructuras terminan con uno un promedio de uno o más residuos de ácido siálico.

En una realización, se proporciona en la que las moléculas contienen una o más estructuras de oligosacárido complejas, al menos 40% de cuyas estructuras de oligosacárido contienen una media de al menos un residuo de ácido siálico terminal. Preferiblemente, las moléculas contienen una o más estructuras de oligosacáridos complejas, al menos 70% de las cuales contienen un residuo de ácido siálico terminal.

En una realización, una preparación de sCR1 comprende moléculas de glicoprotéinas de sCR1, en las que las glicoformas predominantes muestran un punto isoeléctrico, pl, menor o igual que 5,1 como se determina mediante cromatofocalización, donde el pl aumenta después del tratamiento con la neuraminidasa.

En otra realización, los preparación de sCR1 comprende una glicoproteína de sCR1 en la que la relación molar de ácido siálico a manosa en la glicoproteína es mayor o igual que 0,25.

Preferiblemente una preparación de sCR1 según la presente invención tiene al menos 25% de la actividad inhibitoria de complemento de sCR1 desglicosilada.

En una realización preferida de la molécula o preparación de la presente invención, la estructura principal de la proteína de la glicoproteína de sCR1 contiene las regiones LHR-A, LHR-B, LHR-C, LHR-D, SCR29 y SCR30 hasta e incluyendo el primer residuo de alanina de la región transmembranal.

La presente invención también se refiere a una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de una molécula de glicoproteína de sCR1, como se ha descrito anteriormente, y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. En una realización, la composición farmacéutica comprendiendo además una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente trombolítico.

Preferiblemente, el agente trombolítico se selecciona del grupo constituido por:

(a)

un activador del plasminógeno o una muteína del mismo;

(b)

un complejo plasminógeno - estreptoquinasa - activador anisolado (abreviadamenete en inglés APSCA);

(c)

una uroquinasa de cadena sencilla;

(d)

una uroquinasa de dos cadenas,

(e)

una estreptoquinasa;

(f)

una proteína híbrida con actividad fibrinolítica que comprende una cadena de una primera proteasa de dos cadenas ligada a una cadena de una segunda proteasa de dos cadenas, teniendo al menos una de dichas primera o segunda proteasa actividad fibrinolítica; de manera que dicha proteína híbrida tiene un sitio catalítico esencial para la actividad fibronilítica que está opcionalmente bloqueada por un grupo bloqueante lábil; y

(g)

una enzima fibronilítica bloqueada de manera reversible in vivo en la que el sitio catalítico esencial para la actividad fibronilítica en dicha enzima está bloqueada por un grupo que se puede eliminar mediante hidrólisis a una velocidad tal que la constante cinética de pseudo - primer orden para la hidrólisis está en el intervalo entre 10^{-6} seg^{-1} y 10^{-3} seg^{-1} en una solución acuosa isotónica a pH 7,4 a 37ºC.

La presente invención también proporciona un procedimiento de tratamiento de una enfermedad o trastorno asociado a la inflamación o activación de complemento inapropiada que comprende la administración a un sujeto en necesidad de dicho tratamiento de una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica de sCR1 como se ha descrito anteriormente.

También se proporciona un procedimiento de tratamiento de una afección trombótica, que comprende la administración a un sujeto en necesidad de dicho tratamiento de una cantidad eficaz de una composición farmacéutica de sCR1 o preferiblemente, una composición farmacéutica como se ha descrito anteriormente que incluye un agente trombótico.

En los procedimientos citados anteriormente, el sujeto es preferiblemente un ser humano.

Además la presente invención se refiere a un procedimiento para preparar una glicoproteína de sCR1 o preparación de sCR1 como se ha descrito anteriormente, que comprende:

(a)

expresar una molécula de DNA que codifica el esqueleto proteico del sCR1 en una célula hospedadora de mamífero en cultivo en condiciones en las que el desarrollo celular no está limitada por el suministro de nutrientes, y en las que la célula hospedadora es capaz de sialización de las cadenas de oligosacárido; y

(b)

aislar la glicoproteína sCR1 del cultivo.

En una realización preferida, el procedimiento además comprende la etapa de:

(c)

aislar las moléculas que contienen ácido sialíco del material obtenido en la etapa (b).

En los procedimientos mencionados anteriormente, las condiciones de cultivo preferidas incluyen un biorreactor de lecho fluido, un birreactor de fibra hueca, cultivo en botella rotatoria o sistema de birreactor en tanque agitado, en los dos últimos sistemas, con o sin microvehículos celulares.

El producto de glicoproteína de sCR1 de cultivo celular anterior se puede purificar por afinidad, exclusión por tamaño, cromatografía de intercambio iónico y/o interacción hidrófoba. El enriquecimiento de las moléculas que contienen ácido siálico se logra preferiblemente mediante cromatografía sobre gel blando de intercambio iónico o HPLC usando resinas de intercambio catiónico o aniónico, con la recogida de la fracción más ácida. Las moléculas que contienen ácido siálico también se pueden aislar mediante cromatofocalización o cromatografía de afinidad de lecitina.

Preferiblemente, la célula hospedadora de mamífero es capaz de expresar las transferasas siálicas a un nivel suficiente para asegurar la sialización sustancial de oligosacáridos en la glicoproteína de sCR1 expresada. Las células hospedadoras adecuadas incluyen estirpes de CHO, preferiblemente la estirpe celular DUX B11.

Abreviaturas y definiciones

APSAC = complejo activador plasminógeno - estreptoquinasa anisolado

pl = punto isoeléctrico

HPLC = cromatografía líquida de alto rendimiento

IH50% = concentración que produce un 50% de inhibición de hemólisis

SRBC = glóbulos rojos de oveja

EIA = inmunoensayo de enzimas

p/v = relación peso a volumen

v/v = relación volumen a volumen

kDa = kilodalton

ELISA = ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas

gu = unidades de glucosa

SDS - PAGE = electroforésis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico

Glicoformas = especies de una glicoproteína, tal como la glicoproteína soluble CR1 de la presente invención, que se caracterizan por su contenido en carbohidratos, comportamiento cromatográfico y/o carga.

TP 10HD = una construcción particular soluble de CR1 que contiene regiones LHR- A, LHR-B, LHR-C, LHR-D, SCR29 y SCR30 hasta e incluyendo el primer residuo de alanina de la región transmembranal; TP 10HD corresponde a las secuencias que codifican para CR1 en el plásmido pBSCR1c (Fearon y col., publicación de patente internacional Nº WO 89/09220 (5 de octubre de 1989).

TP 10HD-CC = TP 10HD producido por células cultivadas en un birreactor de perfusión de lecho fluido y purificado mediante cromatografía de combinación como se describe en esta memoria descriptiva.

TP 10HD-CCW = la forma débilmente catiónica de TP 10HD-CC aislada mediante cromatografía preparativa de intercambio catiónico de HPLC.

TP 10HD-CCS = la forma fuertemente catiónica de TP 10HD-CC aislada mediante cromatografía preparativa de intercambio catiónico de HPLC.

TP 10HD-CX = TP 10HD producido mediante células cultivadas en un birreactor de fibra hueca y purificado mediante cromatografía de intercambio catiónico de HPLC (Fearon y col., indicado anteriormente).

TP 10HD-CXD = TP 10HD-CX desglicosilado enzimáticamente con la n-glicanasa.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 es una serie de trazos de absorbancia a 280 nm que muestran los resultados de una HPLC analítica o preparaciones de TP 10HD purificado de diferentes formas. Se usó una modificación del procedimiento de purificación de HPLC de Hydropore-SCX para demostrar la existencia de glicoformas de TP 10HD.

Panel A: material de TP 10HD purificado mediante cromatografía de afinidad que contenía múltiples glicoformas, las glicoformas predominantes eran fuertemente catiónicas (es decir, eluyendo a aproximadamente HCl 125 mM).

Panel B: material de TP110HD purificado mediante cromatografía de combinación que contenía múltiples glicoformas, las relaciones de concentración de las glicoformas débilmente catiónicas o fuertemente catiónicas variaban entre 70:30 y 80:20.

Panel C: TP 10HD purificado mediante cromatografía de HPLC de intercambio catiónico solamente contenía la glicoforma fuertemente catiónica.

La figura 2 muestra un perfil de elución de TP 10HD de una columna de S- Sefarosa con un gradiente de HCl 50 - 250 mM. Se indican los picos correspondientes a conjunto 1 y conjunto 2. El caudal era de 2 ml/min. La velocidad de la carta era 0,25 mm/min. La sensibilidad era 0,2 unidades de absorbancia a 280 nm de escala total.

La figura 3 muestra un patrón de gel de SDS-PAGE del material eluido de la columna de S-Sefarosa de la figura 2. Franja 1: patrones de alto peso molecular; franjas 5 y 8: conjunto 1 de S-Sefarosa (2,4 \mug cada uno); franjas 6 y 9: conjunto 2 de S-Sefarosa (5,0 y 6,7 \mug, respectivamente)

La figura 4 muestra cuatro radioelectroforetogramas de las cadenas de oligosacáridos de TP 10HD-CCW (paneles de la derecha) y TP 10HD-CCS (paneles de la izquierda). Los dos paneles inferiores muestran los patrones después de tratamiento con la neuraminidasa.

La figura 5 es dos cromatogramas que muestran tamaños y proporciones relativas de cadenas de oligosacáridos de TP 10HD-CCS (A) y TP 10HD-CCW (B).

La figura 6 muestra un trazo de una columna de cromatofocalización para TP 10HD-CC (parte superior) y TP 10HD-CX (parte inferior).

Descripción detallada de las realizaciones preferidas

La presente invención se refiere a las glicoformas novedosas de la proteína de receptor 1 de complemento soluble (abreviadamente en inglés sCR1) y sus usos en diagnosis o terapia de los trastornos que implican actividad del complemento y diversos trastornos inflamatorios e inmunes.

El receptor 1 de complemento soluble (abreviadamente en inglés sCR1) se define en esta memoria descriptiva como una forma soluble de CR1 humano que contiene los 30 dominios extracelulares de SCR.

La sCR1 y procedimientos mediante los que se puede preparar se describen en las publicaciones de patente internacional WO 89/09220 (5 de octubre de 1989) y WO 91/05047 (8 de abril de 1991). Preferiblemente el material de sCR1 se prepara mediante el cultivo de células DUX B11 recombinantes de ovario de hámster chino (abreviadamente en inglés CHO) en un biorreactor de perfusión de lecho fluido (véase el documento WO 91/05047 indicado anteriormente). En un aspecto preferido, se puede usar la estirpe celular DUX B11 de CHO que contiene el plásmido pBSCR1c/pTCSgpt, número de registro de ATCC CRL 10052.

Las glicoformas de sCR1 de la presente invención se caracterizan por su contenido en carbohidratos, comportamiento cromatográfico y/o carga. De acuerdo con lo anterior, la presente invención proporciona:

(1)

sCR1 que comprende un oligosacárido complejo terminado en uno o más residuos de ácido siálico;

(2)

sCR1 que tiene un punto isoeléctrico, pl \leq 5,1 medido mediante cromatofocalización, en el que el pl aumenta después del tratamiento con la neuraminidasa;

(3)

preparaciones de sCR1 en las que al menos el 40% de los oligosacáridos comprenden un complejo de oligosacárido terminado en uno o más residuos de ácido siálico;

(4)

preparaciones de sCR1 que comprenden estructuras de oligosacáridos en los que al menos el 70% de dichas estructuras son moléculas terminada en ácido siálico;

(5)

preparaciones de sCR1 en las que la relación molar de ácido siálico a manosa es \geq 0,25; y

(6)

las glicoformas y preparaciones de sCR1 preferidas que tienen al menos 25% de la actividad funcional del anticomplemento de sCR1 no glicosilada.

Las glicoproteínas preferidas son las que contienen oligosacáridos similares a, o idénticas a los oligosacáridos de origen natural en las glicoproteínas humanas. Las ventajas de una preparación de sCR1 que tienen dichos oligosacáridos incluyen un menor riesgo de ser inmunogénicas tras la administración a un ser humano.

Las glicofomas y preparaciones de sCR1 de la presente invención también se caracterizan por su actividad funcional. De este modo, muestran preferiblemente cualquiera de una o más de las actividades asociadas con las moléculas de sCR1, que incluyen pero no se limitan a:

(1)

unión a C3b y/o C4b o C4ma monoméricas y/o poliméricas;

(2)

prevención de producción de C3a o C5a en suero activado de complemento;

(3)

actividad del cofactor del factor I;

(4)

inhibición del impulso oxidante neutrófilo inducido por el complemento, y

(5)

inhibición de hemólisis mediada por el complemento.

Cultivo, purificación y enriquecimiento de las glicoformas de sCR1

Las glicoformas y preparaciones de sCR1 de la presente invención se pueden producir desarrollando las células que expresan DNA recombinante que codifica sCR1 en una diversidad de condiciones de cultivo de células, que incluyen pero no se limita a un sistema de biorreactor de lecho fluido, de un biorreactor de fibra hueca, de un cultivo en botella rotativa o de biorreactor de tanque agitado en los dos últimos sistemas, con o sin microvehículos celulares.

Las glicoformas de sCR1 de la presente invención se pueden obtener expresando el DNA que codifica sCR1, o que codifican fragmentos de sCR1, en una células hospedadora de mamíferos. Preferiblemente, la célula hospedadora de mamíferos es capaz de expresar una transferasa de sialilo funcional que da como resultado la producción de una glicoforma de sCR1 que contiene cadenas de oligosacáridos que preferiblemente tienen uno o más residuos terminales de ácido siálico. Las células hospedadoras adecuadas según la presente invención incluyen estirpes de CHO, preferiblemente la estirpe celular DUX B11.

Las condiciones de cultivo celular se seleccionan para lograr el nivel deseado de sialización. Los parámetros del proceso que influyen en el grado de sialización incluyen el nivel de oxígeno y el nivel de glucosa. La densidad celular, tiempo y condiciones de almacenamiento tales como temperatura también influyen en la sialización.

Las glicoformas de sCR1 que contienen 2 o más residuos de ácido siálico por estructura de oligosacárido compleja tienen velocidades de aclaramiento más largas in vivo. La velocidad de aclaramiento de la preparación se puede de esta manera manipular en límites amplios mediante el grado total de sialización de la preparación. El efecto del contenido en carbohidratos sobre el aclaramiento de suero (o plasma) se correlaciona débilmente con actividad funcional; la desglicosilación conduce a un rápido aclaramiento del plasma, pero incrementos mínimos de la actividad funcional in vitro.

Las glicoformas de sCR1 expresadas producidas en estos cultivos se pueden purificar convencionalmente, por ejemplo, mediante afinidad, exclusión por tamaño, cromatografía de intercambio iónico y/o interacción hidrófoba (abreviadamente en inglés HIC). Están disponibles diversos anticuerpos específicos de CR1 para uso en cromatografía de afinidad (Changelian y col., 1985, J. Immunol. 134: 1851).

Se pueden emplear numerosas matrices en la preparación de columna de HIC, la más ampliamente usada es agarosa. Se pueden usar las resinas de sílice y polímeros orgánicos. Los ligandos hidrófobos útiles incluyen, pero no se limitan, a grupos alquilo que tienen entre 2 y aproximadamente 10 átomos de carbono, tales como un butilo, propilo, u octilo, o grupos arilo tales como fenilo. Los productos convencionales de HIC para geles y columnas se pueden obtener comercialmente bajo los nombres de los productos butil-SEPHAROSE®, fenil-SEPHAROSE® CL-4B, octil-SEPHAROSE® FF y fenil-SEPHAROSE® FF (Pharmacia LKB AB, Uppsala, Suecia); TOYOPEARL butilo 650M (Fractogel TSK butil-650) o TSK-GEL fenil-5PW (Tosoh Corporation, Tokio, Japón); alquil-agarosa, en la que el grupo alquilo contiene entre 20 - 10 átomos de carbono (Miles - Yeda, Rehovot, Israel); y Bakerbond WP-HI-propilo (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ).

También es posible preparar la columna de HIC deseada usando química convencional. Véase, por ejemplo, Er-el, Z y col., Biochem. Biophys. Res. Comm. 49: 383 (1972); Ulbrich, V y col., Coll. Czech. Commum. 9: 1466 (1964)). La elección de un gel particular la puede determinar un experto en la técnica. En general la resistencia de la interacción de la proteína y el ligando de HIC se incrementa con la longitud de la cadena de los ligandos alquilo pero los ligandos que tienen entre aproximadamente 4 y aproximadamente 8 átomos de carbono son adecuados para la mayoría de las separaciones. La adsorción de las proteínas a una columna de HIC está favorecida por altas concentraciones de sal, pero las concentraciones reales pueden variar en un amplio intervalo dependiendo de la naturaleza de la proteína y el ligando de HIC particular elegido. En general, son útiles las concentraciones de sal de sulfato amónico de entre aproximadamente 0,75 y aproximadamente 2 M o de NaCl entre aproximadamente 1 y 4 M.

La elución, bien por etapas o en forma de un gradiente se puede lograr de diversidas de formas: (a) cambiando la concentración de sal, (b) cambiando la polaridad del disolvente o (c) añadiendo detergentes.

HIC es particularmente útil cuando se usa en combinación con otras técnicas de purificación de proteínas.

Como se conoce bien en la técnica, para cromatografía de intercambio iónico se puede unir diversos sustituyentes aniónicos o catiónicos a las matrices con el fin de formar soportes aniónicos o catiónicos. Los sustituyentes de intercambio aniónico incluyen grupos de dietilaminoetil (abreviadamente en inglés DEAE), aminoetil cuaternario (abreviadamente en inglés QAE), y amina cuaternaria (abreviadamente en inglés Q). Los sustituyentes de intercambio catiónico incluyen carboximetilo (abreviadamente en inglés CM), sulfoetilo (abreviadamente en inglés SE), sulfopropilo (abreviadamente en inglés SP), fosfato (abreviadamente en inglés P) y sulfonato (abreviadamente en inglés S). Los materiales de intercambio iónico comercialmente disponibles incluyen: resinas celulósicas de intercambio iónico tales como DE23, DE32, DE52, CM-23, CM-32 y CM-52 (Whatman Ltd. Maidstone, Kent, Reino Unido); intercambiadores iónicos a base de SEPHADEXr y reticulados, por ejemplo, DEAE-, QAE-, CM- y SP-SEPHADEX® y DEAE-, Q-, CM y S-SEPHAROSE® (Pharmacia AB); copolímero de etilenglicol - metacrilato derivatizado de DEAE- y CM- tal como TOYOPEARL DEAE - 650S y TOYOPEARL CM - 650S (Toso Haas Co., Filadelfia, PA).

La exclusión por tamaño o cromatografía por filtración de gel separa en base a tamaño molecular. Los materiales de matriz preferidos son químicamente inertes, rígidos y altamente porosos. Para los procedimientos a gran escala la rigidez es la más importante estableciendo el caudal global. Se prefieren los geles desarrollados más recientemente que han incrementado la rigidez, por ejemplo, las matrices de las series SEPHARCRYL®, ULTROGEL®; FRACTOGEL®, SUPEROSE® y TOYOPEARL HW (Toso Haas).

Las glicoformas de sCR1 deseadas de la presente invención se pueden enriquecer para las moléculas que contienen ácido siálico mediante cromatografía sobre gel blando de intercambio iónico o HPLC usando resinas de intercambio catiónico o aniónico, en las que se recoge la fracción más ácida. La matriz preferida para separar las glicoformas de sCR1 es S-Sefarosa. La etapa de cromatografía en S-Sefarosa se puede aplicar pronto en los procedimientos de purificación global de proteínas. En ese momento, una glicoforma deseada de sCR1 se puede separar de otras glicoformas y las etapas de purificación restantes llevarse a cabo sobre esa glicoforma. Alternativamente, una etapa de purificación adicional en S-Sefarosa, diseñada para resolver las glicoformas, se puede realizar al final de un procedimiento multietapa de purificación de proteínas, como se ejemplifica en el ejemplo V, más adelante.

Las glicoformas de sCR1 específicas también se pueden seleccionar mediante cromatografía de afinidad de lecitina o cromatofocalización.

La porción de carbohidratos complejos de la glicoforma de sCR1 se puede analizar fácilmente si se desea, mediante técnicas convencionales de análisis de carbohidratos. Así que, por ejemplo, las técnicas tales como transferencia de lecitina, bien conocidas en la técnica, revelan una baja proporción de manosa terminal u otros azúcares tal como galactosa. La terminación de oligosacáridos mono-, bi-, tri-, o tetra-antenarias mediante ácidos siálicos también se pueden confirmar mediante liberación de azúcares de la proteína usando hidracina anhidra o procedimientos enzimáticos y fraccionamiento de oligosacáridos mediante cromatografía de intercambio iónico o exclusión por tamaño u otros procedimientos bien conocidos en la técnica. En un ensayo posterior para identificar la glicoforma, el pl se mide, antes y después del tratamiento con la neuraminidasa para retirar los ácidos siálicos. Un incremento en pl después del tratamiento con la neuraminidasa indica la presencia de ácidos siálicos sobre la glicoforma.

Usos terapéuticos de las glicoformas de sCR1

Las glicoformas y preparaciones de sCR1 de esta invención son útiles en el tratamiento o diagnosis de muchas enfermedades y trastornos mediadas por complemento o relativas a complemento, que incluyen pero no se limitan a los indicados en la tabla 1.

TABLA 1 Enfermedad y trastornos que implican complemento

Trastornos neurológicos

Esclerosis múltiple

Accidente cerebrovascular

Síndrome de Guillain Barré

Lesión causada por traumatismo craneal

Enfermedad de Parkinson

Trastornos de activación del complemento inapropiada o indeseable

Complicaciones de hemodiálisis

Rechazo de transplante homólogo hiperagudo

Rechazo de transplante heterólogo

Toxicidad inducida por interleuquina 2 durante la terapia con IL-2

Trastornos inflamatorios

Inflamación de enfermedades autoinmunes

Enfermedad de Crohn

Síndrome de dificultad respiratoria del adulto

Lesión térmica incluyendo quemaduras y daño sufrido como consecuencia de una congelación

Afecciones de reperfusión posisquémica

Infarto de miocardio

Angioplastia de balón

Síndrome postbombeo en desviación cardiopulmonar o hemodiálisis renal

Hemodiálisis

Isquemia renal

Enfermedad infecciosas o septicemias

Trastornos complejos inmunes y enfermedades autoinmunes

Artritis reumatoide

Lupus eritematoso sistémico (abreviadamente en inglés SLE)

Nefritis del SLE

Nefritis proliferativa

Glomerulonefritis

Anemia hemolítica

Miastenia grave

En un procedimiento de tratamiento de una enfermedad o de un trastorno asociado a activación o inflamación del complemento inapropiada, una cantidad terapéuticamente activa de una glicoforma o preparación de sCR1 se administra a un sujeto en necesidad de dicho tratamiento. El sujeto preferido es un ser humano.

Una cantidad eficaz de una glicoforma de sCR1 para el tratamiento de una enfermedad o trastorno en el intervalo de dosis de 0,01 - 100 mg/kg; preferiblemente 0,1 mg - 10 mg/kg.

Para administración, la glicoforma o preparación de sCR1 se debe formular en una composición farmacéutica o terapéutica apropiada. Dicha composición típicamente contiene una cantidad terapéuticamente eficaz de la glicoforma o preparación de sCR1 y un excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable tal como solución salina, solución salina tamponada, dextrosa o agua. Las composiciones también pueden comprender agentes estabilizantes específicos tales como azúcares, incluyendo manosa y manitol, y anestésicos locales para composiciones inyectables, incluyendo, por ejemplo, lidocaína.

Con el fin de inhibir la activación del complemento y, al mismo tiempo, proporcionar terapia trombolítica, la presente invención proporciona composiciones que además comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente trombolítico. Una cantidad eficaz de un agente trombolítico se encuentra en el intervalo entre 0,01 y 10 mg/kg; preferiblemente entre 0,1 y 5 mg/kg. Los agentes tromolíticos preferidos incluyen, pero no se limitan a, estreptoquinasa, activador de plasminógeno de tipo de tejido humano y las moléculas de uroquinasa y derivados, los fragmentos o conjugados de los mismos. Los agentes trombolíticos pueden comprender una o más cadenas que se pueden condensar o unir reversiblemente a otros agentes para formar moléculas híbridas (documento EP-A-0297882 y documento EP 155387), tal como por ejemplo, uroquinasa ligado a plásmido (documento EP-A-0152736), una enzima fibriniolítica ligada a un polímero hidrosoluble (documento EP-A-0183503). Los agentes trombolíticos también pueden comprender muteínas de los activadores de plasminógeno (documento EP-A-0207589). En una realización preferida, el agente trombolítico puede comprender una enzima fibrinolítica bloqueada reversiblemente in vivo como se describe en la patente de Estados Unidos Nº 4.285.932. Una enzima más preferida es un complejo activador plasminógeno - estreptoquinasa p-anisolado como se describe en la patente de Estados Unidos Nº 4.808.405 y comercializado por SmithKline Beecham Pharmaceuticals con la marca registrada EMINASA (por ejemplo, nombre genérico anistreplasa, también denominada APSAC; Monk y col., 1987, drugs 34: 25 - 49).

Una composición terapéutica preferida para la inhibición de la actividad de complemento o para la terapia de combinación, como se ha descrito anteriormente, comprende una glicoforma o preparación de sCR1 novedosas de esta invención que muestra aclaramiento prolongado de la sangre mientras retiene actividad funcional significativa. Dicha semivida funcional prolongada permite la administración simplificada, de dosis del bolo y contribuye e la eficacia in vivo. Los inhibidores de activación del complemento preferidos en la composición terapéutica incluyen los glicoformas y preparaciones de sCR1 descritas anteriormente, por ejemplo:

(1)

las glicoformas de sCR1 que comprenden un oligosacárido complejo terminado en uno o más residuos de un ácido siálico;

(2)

las preparaciones que tienen un punto isoeléctrico, pl < 5,1 como se determina por cromatofocalización, en las que el pl es sensible a tratamiento con la neuraminidasa;

(3)

las preparaciones de sCR1 que comprenden oligosacáridos complejos, en las que al menos 40% de los oligosacáridos complejos terminan en uno o más residuos de ácido siálico, o

(4)

las preparaciones de sCR1 que tienen una relación molar de ácido siálico a manosa \geq 0,25.

Más preferiblemente las glicoformas y preparaciones de sCR1 terapéuticamente activas deben comprender al menos 70% de moléculas terminadas en ácido siálico y que tienen al menos 25% de la actividad de complemento de sCR1 no glicosilada. Además, los inhibidores de activación de complemento terapéuticamente activos de las composiciones terapéuticas deben comprender oligosacáridos similares o idénticos a los de origen natural en las glicoproteínas humanas.

Las vías de administración de las composiciones terapéuticas individuales o combinadas de la presente invención incluyen las vías habituales, tales como, por ejemplo, infusión intravenosa o inyección del bolo. Los bloqueantes de complementos activos y agentes trombolíticos se pueden administrar conjunta o secuencialmente, en cualquier orden.

La presente invención también proporciona un procedimiento para tratar una afección trombótica, en particular infarto de miocardio agudo, en un ser humano o animal no humano. Este procedimiento comprende la administración a un ser humano o animal en necesidad de este tratamiento de una cantidad eficaz de una glicoforma o preparación de sCR1 de acuerdo a esta invención y una cantidad eficaz de un agente trombolítico.

También se proporciona el uso de una glicoforma o preparación de sCR1 de esta invención y un agente trombolítico en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una afección trombótica en un ser humano o animal. Dichos procedimientos y usos se pueden llevar a cabo como se ha descrito anteriormente (publicación de patente internacional WO 91/05047).

Esta invención además proporciona un procedimiento para tratar síndrome de dificultad respiratoria del adulto (abreviadamente en inglés ARDS) en un ser humano o animal no humano. Este procedimiento comprende la administración al paciente de una cantidad eficaz de una glicoproteína o preparación de sCR1 según esta invención.

La invención también proporciona u procedimiento de retardar el rechazo de transplante homólogo hiperagudo o transplante heterólogo hiperagudo en un ser humano o animal no humano que recibe un transplante mediante la administración de una cantidad eficaz de una glicoforma o preparación de sCR1 según esta invención.

Habiendo ahora descrito la invención en general, la misma se entenderá más fácilmente mediante la referencia a los siguientes ejemplos que se proporcionan a modo de ilustración, y no tienen la intención de limitar la presente invención, salvo que se especifique.

Ejemplo I Producción y purificación de preparaciones de TP 10HD

TP 10HD preparada a partir de medio de cultivo de tejidos acondicionado se purifica mediante cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio catiónico de HPLC (o no HPLC) y una combinación de cromatografías de intercambio catiónico, de interacción hidrófoba y de exclusión por tamaño.

Fuentes de medio de cultivo celular acondicionado A. Biorreactor de fibra hueca

Células recombinantes DUX b11 de CHO que expresan el producto génico TP 10HD de sCR1 (Fearon y col., 1989, 1991, indicado anteriormente) se inocularon en un biorreactor de fibra hueca utilizando un modelo IV-L, cartucho de límite de exclusión de 30.000 dalton de peso molecular (Cell - Pharm Cell Cultura System I, CD Medical, Miami Lakes, FL) en un medio de crecimiento adecuado, por ejemplo, sistema de medio completo CHO-1 (Laboratorios Ventrex, Inc. Pórtland, ME) suplementado con glutamina (GIBCO, Grand Island, NY) y 1 - 10% de suero bovino fetal (Laboratorios HyClone, Inc. Logan, UT) y se actuó según las instrucciones del fabricante. La TP 10HD sintetizada se secretó en el medio de crecimiento y debido a su gran peso molecular, aproximadamente 200 kDa, se retuvo en el compartimiento celular del cartucho del reactor. A intervalos de 1 - 3 días, se retiró el medio acondicionado del interior del compartimiento celular, las células contaminantes y desechos celulares se retiraron mediante centrifugación y el medio acondicionado clarificado se dispensó en recipientes de laboratorio de plástico desechables y se mantuvieron a 2 - 8ºC hasta purificación. En estas condiciones, el medio acondicionado contenía hasta 500 \mug/ml de TP 10HD.

B. Cultivos celulares en botellas rotativas

Células recombinantes DUX B11 de CHO que expresan TP 10HD se inocularon en botellas rotativas en un medio de crecimiento adecuado, por ejemplo, una formulación exenta de suero hecha de una mezcla de Hams F 12 y DMEM (JHR Biosciences, Inc., Denver, PA) suplementado con glutamina (GIBCO, Grand Island, NY), albúmina sérica bovina, transferrina humana e insulina bovina (Pentex - Miles Inc., Kankakee, IL; Intergen, Purchase, NY). Después de que el cultivo se haya establecido, aproximadamente tres días, indicado por un cambio en el color del medio de rosa a amarillo, aproximadamente 10 ml de microvehículos de colágeno (Verox Corporation, Lebanon, NH) se añadieron junto al medio fresco. A intervalos de 3 días se sustituyó la mitad del medio (aproximadamente 150 ml). Se retiraron las células y desechos celulares del medio acondicionado mediante filtración y el medio condicionado clarificado se dispensó en recipientes de laboratorio de plástico desechables y se almacenó a o por debajo de -70ºC hasta la purificación. En estas condiciones, el medio acondicionado contenía aproximadamente 15 \mug/ml de TP 10HD.

C. Biorreactor de perfusión de lecho fluido

Las células recombinantes DUX B11 de CHO que expresan TP 10HD se inocularon en un biorreactor de perfusión de lecho fluido (Sistema S200 y Sistema S2000, Verax Corporation, Lebanon, NH) en un medio de crecimiento adecuado, por ejemplo, una formulación exenta de suero hecha a partir de una mezcla de Hams F12 y DMEM suplementado con glutamina (GIBCO, Grand Island, NY), albúmina sérica bovina, transferrina humana e insulina bovina (Pentex - Miles Inc, Kankakee, IL, Intergen, Purchase, NY) y el biorreactor se hizo funcionar según las instrucciones del fabricante. A intervalos de aproximadamente 2 días, el medio recogido acondicionado se retiró del tanque de almacenamiento de la recogida del biorreactor, las células y desechos celulares se retiraron mediante filtración y se concentraron 10 - 100 veces mediante ultrafiltración a través de una membrana de ultrafiltración de límite de exclusión de 50 kDa o 100 kDa de peso molecular (Millipore Corp, Bedford, MA). El medio acondicionado concentrado se dispensó en botellas de plástico y se almacenó a o por debajo de -70ºC hasta purificación. En estas condiciones, el medio concentrado acondicionado contenía > 900 \mug/ml de TP 10HD.

Esquemas de purificación A. Cromatografía de afinidad

El medio acondicionado derivado del biorreactor de fibra hueca se sometió a purificación usando una resina de afinidad de anticuerpo monoclonal (abreviadamente en inglés mAb). El anticuerpo monoclonal YZ1 identifica un epítopo en la porción extracelular de CR1 humano nativo (Changelian PS y col., 1985 J. Immunol 134: 1851, Wong, W y col., 1985, J. Immunol. Methods, 82: 303 - 313). La conjugación de este mAb a Affligel - 10 según las direcciones del fabricante (BioRad Corporation, Richmond, CA) produjo una matriz de afinidad capaz de aislar específicamente TP 10HD del medio acondicionado que contenía los contaminantes de suero bovino, como se ha descrito previamente (Yoon y col., indicado anteriormente). En resumen, el medio de cultivo de tejidos acondicionado se incubó con la matriz de afinidad a 4ºC, durante una noche con ligera agitación. Esta mezcla se vertió en una columna de cromatografía y se lavó extensivamente con Hepes 10 mM, NaCl 0,1 M, tampón pH 7 para retirar todo el material no específicamente unido de la matriz. La TP 10HD se desorbió de la matriz con fosfato sódico 20 mM, NaCl 0,7 M, tampón pH 12 y se examinaron las fracciones de la columna para la presencia de proteína usando un ensayo comercialmente disponible (Bio Rad Corporation, Richmond, CA). Las fracciones que contenían proteína se dializaron a 4ºC, frente a una solución salina tamponada con fosfato, pH 7,2 - 7,4. La presencia de TP 10HD en la preparación se confirmó con un inmunoensayo específico de TP 10HD. Este procedimiento produjo una preparación de TP 10HD que se estimó que era > 90% puro mediante gradiente lineal 4 - 20% de SDS - PAGE.

B. Cromatografía de combinación

Medio de cultivo de tejidos acondicionado de cultivos de botellas rotativas o los cultivos del biorreactor de lecho fluido se procesaron mediante una serie de etapas cromatográficas. El medio acondicionado se acidificó con HCl 1 N y se redujo el pH hasta 5,2 - 5,5. Durante la acidificación se volvió turbio el medio y se aclaró posteriormente por filtración a través de membranas de 0,45 y 0,2 \mum. El medio acondicionado acidificado y aclarado se aplicó a una columna de intercambio catiónico, S-Sefarosa (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ) equilibrada en fosfato sódico, 0,02 M, cloruro sódico, 0,06 M, tampón pH 5,5. Después de la aplicación de la muestra, se continuó el lavado de la columna en el tampón de partida hasta que la absorbancia volvió a su línea base. En estas condiciones todas las glicoformas de TP 10HD unidas a la resina mientras la mayoría de las proteínas contaminantes del medio de cultivo de tejidos quedan no unidas y se pasan a través de la columna. La TP 10HD se eluyó de la columna con fosfato sódico, 0,2 M, cloruro sódico, 0,50 M, tampón pH 8,0. La elución del conjunto que contenía TP 10Hd se controló mediante absorbancia a 280 nm.

El eluido de S-Sefarosa se mezcla con sulfato amónico hasta una concentración final de 0,8 - 0,9 M y se aplicó a una columna de interacción hidrófoba, butil-Sefarosa (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ) equilibrada con fosfato sódico, 0,1 M, sulfato amónico 0,9 M, tampón pH 7,0. Después de la aplicación de la muestra, se continuó el lavado de la columna con el tampón de partida hasta que la absorbancia regresó a la línea base. En estas condiciones se continuó la columna con el tampón de partida hasta que la absorbancia regresó a la línea base. En estas condiciones todas las glicoformas de TP 10HD se unieron a la resina mientras las proteínas contaminantes se quedaron sin unir y se pasaron a través de la columna. La TP 10HD se eluyó de la columna con fosfato sódico, 0,1 M, tampón pH 7,0; la separación del sulfato amónico del tampón de elución produce la deserción de la TP 10HD de la resina. La elución del conjunto que contenía la TP 10HD se controló mediante absorbancia a 280 nm.

El eluido de butilo-Sefarosa se aplicó a una columna de exclusión por tamaño, Sephacryl S-300 (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ) equlibrada con solución salina tamponada con fosfato (fosfato sódico 0,01 M, cloruro sódico 0,15 M), pH 7,2 - 7,4. Después de la aplicación de la elución de la muestra de la TP 10HD se controló mediante absorbancia. Se recogió el material eluyente justo después del volumen de exclusión de la columna y la cantidad de TP 10HD purificada se determinó con un inmunoensayo de enzimas específico para TP 10HD. Se almacenaron las alícuotas congeladas a o por debajo de -70ºC. Este protocolo produjo una preparación de TP 10HD que se estimó que tenía > 90% de pureza mediante SDS - PAGE de gradiente lineal 4 - 20%.

Conclusiones

Las células recombinantes DUX B11 de CHO que expresan un DNA modificado de sCR1 y producía una proteína de sCR1 denominada TP 10HD se puede cultivar en condiciones de laboratorio, por ejemplo, usando un biorreactor de fibra hueca o botellas rotativas, o en condiciones de cultivo a gran escala, por ejemplo, en un biorreactor de perfusión de lecho fluido, para producir un medio de cultivo de tejidos acondicionado que contenía TP 10HD secretada. La proteína recombinante secretada se puede aislar mediante diversos protocolos, específicamente cromatografía de afinidad, HPLC de intercambio catiónico, o una combinación de cromatografías de intercambio iónico, de interacción hidrófoba y de exclusión por tamaño, para producir una preparación purificada.

Ejemplo II Identificación de las diferencias moleculares características de las preparaciones de TP 10HD

Las preparaciones de TP 10HD producidas en condiciones diferentes y purificadas mediante procedimientos múltiples comprenden una estructura principal polipeptídica que se glicoliza hasta grados variables.

Procedimiento

Cuando se examinó mediante SDS - PAGE 4 - 20% las preparaciones de TP 10HD aisladas mediante cromatografía de HPLC de intercambio catiónico y de combinación como se describe en el ejemplo I se encontró que mostraban diferentes pesos moleculares aparentes. El material preparado mediante HPLC de intercambio catiónico tenía un peso molecular menor, aproximadamente 30 kDa, que el material preparado mediante la metodología cromatográfica. Cuando cada preparación se desglicolizó mediante digestión por la n-glicanasa como ha descrito el fabricante (Genzyme Corporation, Boston, MA; véase el ejemplo VI más adelante), los pesos moleculares se redujeron hasta un valor equivalente a la contribución del peso molecular teórico de la cadena polipéptidicaa la molécula de TP 10HD, aproximadamente 200 kDA.

Conclusiones

Estos resultados demuestraron que las moléculas de TP 10HD producidas en condiciones diferentes de cultivo y aisladas mediante múltiples estrategias de purificación se componen de cadenas polipeptídicas similares glicosiladas hasta niveles variables que dan como resultado diferencias observables en peso molecular. Esto sirvió como la primera indicación de que existían diferentes glicoformas de TP 10HD, que tienen diferentes composiciones de carbohidratos.

Ejemplo III Demostración adicional de la existencia de glicoformas de TP 10HD

Los análisis de HPLC mostraron que la TP 10HD se componía de una mezcla de glicoformas cuando se producían a partir de medio de cultivo celular acondicionado en uno de varios conjuntos diferentes de condiciones, incluyendo (a) en un biorreactor de fibra hueca, (b) en botellas rotativas que contienen microvehículos; o (c) en un biorreactor de perfusión de lecho fluido; y cuando se purifica bien mediante una combinación de cromatografías de intercambio catiónico, de interacción hidrófoba y de exclusión por tamaño, o mediante cromatografía de afinidad.

Procedimientos analíticos

Las muestras de TP 10HD purificadas mediante varios esquemas diferentes se dializaron frente a fosfato sódico, 20 mM, cloruro sódico, 30 mM, tampón pH 7,0 y se filtraron a través de una membrana de 0,2 \mum. Una columna de HPLC de Hydropore-SCX, 10 x 100 mm (Rainin instrument Company, Emeryville, CA), se equilibró con el mismo tampón, las muestras se aplicaron a 2 ml/min y el lavado de la columna se continuó con el tampón de partida hasta que la absorbancia regresó a la línea base. La concentración de NaCl en el tampón se aumentó hasta 50 mM, y la glicoforma de TP 10HD definida como débilmente catiónica se eluyó de la resina. Después de que la absorbancia regresó a la línea base, la glicoforma altamente catiónica se eluyó con un gradiente lineal de NaCl, 50 a 250 mM. Los resultados se muestran en la figura 1.

En estas condiciones de aplicación, todas las glicoformas de TP 10HD de unen a la resina. El material no absorbido que pasa directamente a través de al columna se mostró que era un contaminante no proteínico, no TP 10HD más probablemente DNA celular, basado en los siguientes criterios: (a) absorbía luz en el espectro ultravioleta; (b) no era reactiva en los ensayos químicos para la detección de proteína; (c) no era reactiva con tintes específicos de proteína usados para visualizar materiales en SDS - PAGE; y (d) no era reactiva en un inmunoensayo específico de TP 10HD.

Después de la aplicación, la concentración de NaCl en el tampón se incrementó hasta 50 mM, las moléculas de TP 10HD definidas como glicoformas débilmente catiónicas se eluyeron de la resina. Todo el material que eluía como glicoforma débilmente catiónica era identificable como TP 10HD en un inmunoensayo específico. Finalmente, las proteínas unidas más estrechamente se eluyeron de la resina incrementando la concentración de NaCl de una manera lineal. A una concentración de NaCl de \sim 125 mM, se eluyeron las moléculas de TP 10HD definidas como las glicoformas fuertemente catiónicas (Figura 1). Todo el material que eluía como glicoforma fuertemente catiónica era identificable como TP 10HD en un inmunoensayo específico.

TP 10HD purificada mediante cromatografía de afinidad

El material de TP 10HD purificado mediante cromatografía de afinidad contenía múltiples glicoformas cuando se analizó mediante el procedimiento de intercambio catiónico de HPLC. El trazo de absorbancia mostrado en la figura 1A demuestra que las glicoformas predominantes eran fuertemente catiónicas (es decir, eleuyendo a aproximadamente NaCl 125 mM).

TP 10HD purificada mediante cromatografía de combinación

Cuando se analizó mediante el procedimiento de intercambio catiónico de HPLC, se mostró que el material derivado del biorreactor de perfusión de lecho fluido contenía múltiples glicoformas de TP 10HD. Las relaciones de concentración de glicoformas débilmente catiónicas a glicoformas fuertemente catiónicas variaban entre 70:30 a 80:20 (figura 1B). El material derivado de los cultivos en botellas rotativas también se mostró que contenía múltiples glicoformas de TP 10HD, con la relación de glicoformas débilmente catiónicas a glicoformas fuertemente catiónicas siendo 76:24.

TP 10HD purificada mediante cromatografía de intercambio catiónica de HPLC

Este material se mostró que contenía solamente la glicoforma fuertemente catiónica de TP 10HD (figura 1C). Como se ha descrito previamente (publicación de patente internacional WO89/09220 y WO91/05047; Weisman HF y col., 1990. Science 249: 146; Yeh CG y col., 1991, J. Immunol 146: 250, el material aislado de esta forma demostró las características funcionales in vitro e in vivo de proteína sCR1 humana.

Conclusiones

Estos resultados demostraron que las múltiples glicoformas de TP 10HD, distinguibles mediante cromatografía de intercambio catiónico, existen en medio acondicionado derivado de biorreactores de perfusión de lecho fluido, cultivos en botellas rotativas y biorreactores de fibra hueca derivadas de medio acondicionado, aunque las proporciones de las diferentes glicoformas en los medios de suministro diferentes pueden variar significativamente.

Ejemplo IV Aislamiento de preparaciones purificadas de las glicoformas débilmente y fuertemente catiónicas

Las preparaciones de las glicoformas débilmente y fuertemente catiónicas se pueden preparar mediante HPLC.

Procedimientos

La HPLC preparativa se llevó a cabo en una columna de resina de intercambio iónico sustituida con sulfopropilo 21,4 mm x 100 mm (Hydropore - SCX, Rainin Instrument Company, Inc., Emeryville, CA). La columna se equilibró en fosfato sódico 20 mM, NaCl 30 mM, tampón pH 7,0. Una muestra de TP 10HD purificada mediante cromatografía de combinación como se ha descrito anteriormente se dializó frente al mismo tampón antes de usar. Después de la aplicación de la muestra, se continuó el desarrollo de la columna, típicamente durante 20 minutos, con el mismo tampón para lavar las proteínas no unidas específicamente de la resina. El tampón se cambió a tampón fosfato sódico 20 mM, NaCl 50 mM, pH 7,0 y se continuó el desarrollo, típicamente durante 20 minutos adicionales, hasta que toda la glicoforma débilmente catiónica había eluido de la columna. Finalmente el desarrollo de la columna se completó con un gradiente lineal de NaCl 50 - 250 mM (fosfato sódico 20 mM, tampón pH 7,0). La glicoforma fuertemente catiónica típicamente eluía de la columna con NaCl \sim 125 mM.

Resultados

En una preparación típica, una muestra de 125 ml, que contenía aproximadamente 100 mg de TP 100HD se aplicó a la columna. Las fracciones correspondientes a las glicoformas débilmente (TP 10HD-CCW) y fuertemente (TP 10HD-CCS) catiónicas se reunieron como se ha indicado y la cantidad de TP 10HD se determinaron con un inmunoensayo específico de TP 10HD.

Conclusiones

Las cantidades suficientes de múltiples glicoformas de TP 10HD se aislaron para permitir estudios funcionales y análisis bioquímicos detallados in vitro e in vivo.

Ejemplo V Resolución de glicoformas de TP 10HD mediante cromatografía de intercambio catiónico con S-Sefarosa después de purificación de TP 10HD

El protocolo de purificación de intercambio catiónico de HPLC descrito anteriormente resolvía las glicoformas de TP 10HD en dos fracciones (véase, por ejemplo, la figura 1B), un pico denominado "pico 2" (material más altamente glicosilado) que es el segundo pico de la izquierda, y "pico 3" (material menos altamente glicosilado) que es el pico más a la derecha. Se desarrolló el protocolo inicial usando una columna de intercambio catónico de HPLC, Hydropore-SCX, comprado en Rainin Instruments. Se observó que durante un período prolongado de tiempo, los resultados de esta etapa cromatográfica se convertían variables. Esta inconsistencia se atribuyó a la limitación en la vida utilizable de esta columna de HPLC en las condiciones de su uso y su almacenamiento.

Los presentes inventores buscaban por lo tanto un procedimiento de purificación alternativa para resolver las glicoformas de sCR1 que era reproducible más consistentemente con el tiempo. En lugar de evaluar las columnas de HPLC disponible de diversos otros proveedores, una resina de intercambio catiónico convencional, se seleccionó para ensayo la resina de flujo rápido de S-Sefarosa (Pharmacia). Esta resina se eligió principalmente debido al grupo funcional sobre S-Sefarosa es la misma que el grupo funcional de la columna Hydropore-SCX descrita anteriormente. La única diferencia entre estas resinas está en la matriz soporte: agarosa (S-Sefarosa) frente un envase a base de sílice cubierta con una capa de polímero hidrófila (SCX).

Una columna de 2,5 cm Kontes - Flex se preparó con S-Sefarosa que tenía dimensiones envasadas de 2,5 x 1,8 cm, y un monitor en línea UA-6 UV (Isco).

El material de TP 10HD ensayado en este estudio se produjo usando el biorreactor de perfusión de lecho fluido (Verax System S200; véase lo indicado anteriormente) y tenía una concentración de proteínas de 5,5 mg/ml. El material de TP 10HD obtenido del medio de cultivo celular acondicionado concentrado se había sometido primero a una serie de etapas de purificación antes del presente estudio (véase la patente de Estados Unidos Nº 5.252.216).

Primero, el medio crudo se sometió a cromatografía de intercambio catiónico sobre S-Sefarosa y se eluyó con fosfato sódico 20 mM, NaCl 500 mM, pH 7,0. La proteína eluida se precipitó con sulfato de amonio, se resolubilizó y se absorbió en un soporte cromatográfico de interacción hidrófoba, una columna de butil-TOYOPEARL, equilibrada con (NH_{4})_{2}SO_{4} 0,8 M en fosfato sódico 100 mM, pH 7,0. El material deseado se eluyó con (NH_{4})_{2}SO_{4} 0,7 M en fosfato sódico 100 mM, pH 7,0. El eluido se adsorbió en un soporte de intercambio aniónico, DE-AE-TOYOPEARL, se eluiyó y se sometió a una segunda etapa de cromatografía de intercambió de catiónico empleando como soporte TOYOPEARL CM 650S. Se eluyó la proteína con un gradiente lineal de 5 volúmenes de columna de NaCl 0 - 250 mM en MES/MES.Na 50 mM, pH 5,5 y se neutralizó con 1/10 de volumen de fosfato sódico dibásico 0,5 M. Después el producto TOYOPEARL CM se sometió a una cromatografía de exclusión por tamaño en una columna de TOYOPEARL HW65S, previamente equilibrada con fosfato sódico 10 mM, 0,9% p/v de NaCl, pH 7. El pico del producto entero se recogió y se concentró para almacenamiento. El material de TP 10HD estaba ahora listo para ensayo en el presente estudio.

Los siguientes tampones se usaron para el fraccionamiento de S-Sefarosa: el tampón de equilibrio y lavado fosfato sódico 20 mM, NaCl 30 mM, pH 5,2; tampón de lavado 2 y tampón A - fosfato sódico 20 mM, NaCl 50 mM, pH 7,0; tampón B - fosfato sódico 20 mM, NaCl 250 mM, pH 7,0.

Una muestra de 1,5 ml de TP 10HD purificado (8,25 mg de proteína) se aplicó a la columna de S-Sefarosa previamente equilibrado hasta pH 5,2. Después la columna se lavó hasta que el efluente dio lecturas de línea base (A_{280}). Después la columna se lavó con 2,5 volúmenes de lecho de tampón de lavado 2. Se aplicó un gradiente lineal (10 volúmenes de lecho) de tampón A y tampón B (NaCl 50 a 250 mM). La fracción eluida de TP 10HD se recogió en forma de un conjunto único en la base de absorbancia de UV. La concentración de proteína de cada fracción se determinó mediante A280 usando un coeficiente de extinción para una solución E al 1% (1%/280) igual a 10 cm^{-1}.

Resultados

Los resultados se muestran en las figuras 2 y 3. El pico menor mostrado en la figura 2, denominado conjunto 1, correspondiente al "pico 2" en la figura 1B, representaba el 2% de la muestra aplicada. El pico principal en la figura 2, denominado conjunto 2 (correspondiente a "pico 3" en la figura 1B) representaba aproximadamente 89% de la muestra aplicada.

SDS PAGE se realizó sobre los dos conjuntos anteriores. Los resultados se muestran en la figura 3. El material en el conjunto 1 tenía un peso molecular mayor tras SDS-PAGE que los del material en el conjunto 2.

Conclusión

Basándose en los resultados anteriores, se concluyó que un procedimiento cromatográfico de intercambio catiónico no HPLC, usando S-Sefarosa, era un medio útil para la separación reproducible de dos fracciones de glicoformas principales de TP 10HD y se prefería al procedimiento de la columna SCX de HPLC descrito anteriormente. La etapa de purificación se puede realizar como en esta memoria descriptiva, después de una purificación en múltiples etapas de TP 10HD del medio acondicionado. Alternativamente, la etapa inicial de S-Sefarosa en el procedimiento de purificación en múltiples etapas se puede usar para separar las diferentes glicoformas, y la purificación posterior de estas glicoformas realizarse independientemente.

Ejemplo VI Estudios farmacocinéticos de las glicoformas de sCR1

Se determinaron las semividas farmacocinéticas en plasma y/o velocidades de aclaramiento de las preparaciones de glicoformas diferentes. La glicoforma débilmente catiónica mostró semivida en plasma aumentada y/o velocidades de aclaramiento totales inferiores comparadas con la glicoforma fuertemente catiónica y ambas glicoformas mostraban semividas en plasma significativamente mayores y/o velocidades de aclaramiento total inferiores que las preparaciones de glicoformas desglicosiladas.

Materiales y procedimientos A. Fuentes de material de estudio

Véase la sección de definición, indicada anteriormente, para una definición de las diversas preparaciones de TP 10HD (TP 10HD-CX, TP 10HD-CC, TP 10HD-CCW, TP 10HD-CCS y TP 10HD-CXD). El material de ensayo se purificó como se ha descrito en el ejemplo I.

B. Estudios farmacocinéticas

En la tabla 2 más adelante se indican nueve estudios farmacocinéticos diferentes.

TABLA 2

Nº de estudio	Material	Especie animal
1	TP 10HD-CX	Ratas
2	TP 10HD-CX	Conejos
3	TP 10HD-CC	Cerdos
4	TP 10HD-CC	Ratas
5	TP 10HD-CCW	Ratas
6	TP 10HD-CCW	Conejos
7	TP 10HD-CCS	Ratas
8	TP 10HD-CCS	Conejos
9	TP 10HD-CXD	Ratas

C. Yodación del material de estudio

En los estudios 1, 2, 4, 5, 7 y 9, la yodación se llevó a cabo mediante el procedimiento de cloramina T. Tampón fosfato sódico, 0,5 M, pH 7,6, 50 \mul, se añadió a 1mCi de Na-^{125}I (New England Nuclear, Boston MA) como se suministró. Se añadió la muestra de TP 10HD, típicamente 100 \mug en 100 \mul (estudio 5 = 69 \mug; estudio 7 = 34 \mug; estudio 9 = 91 \mug), seguido de 50 \mul de una solución de 15 mg/ml de la cloramina T recientemente preparada. La mezcla de reacción se agitó vigorosamente durante 60 segundos. Se pipetearon sucesivamente metabisulfito sódico (50 \mul, 15 mg/ml) y yoduro sódico (100 \mul, 10 mg/ml) en el vial de reacción. La mezcla de reacción se pasó en a una columna PD10 (Pharmacia Fina Chemical, Piscataway, NJ), preequilibrada con solución salina tamponada con fosfato, PH 7,2 - 7,4, que contenía 0,1% de albúmina sérica bovina (Sigma Chemical Company, St, Louis, MO). Se recogieron fracciones de 0,5 ml y se contaron alícuotas de 2 \mul directamente después de combinar con 100 \mul de una solución de albúmina sérica bovina al 0,1% y 1 ml de ácido trifluoroacático al 20%. Después de la incubación a 0ºC durante 1 hora, la proteína precipitable con ácido asociada a radiactividad se recogió mediante centrifugación durante 10 minutos a 1000 x g y se cuantificó mediante conteo por centelleo. Las fracciones que contenían >90% de la radiactividad total en el precipitado ácido se reunieron para uso posterior.

En los estudios 6 y 8, la yodación se realizó mediante el procedimiento de yodogen (Fraker y col., 1978, Biochem Biophys Res Común 80: 849); el grado medio de sustitución de ^{125}I era 0,56 átomos/molécula de proteína dando como resultado una actividad específica de 22,7 kBq/mg para el estudio 6, y los grados medios de la sustitución de ^{125}I era 0,76 átomos/molécula de proteína que daba como resultado una actividad específica de 29,5 kBq/mg para el estudio 8.

D. Preparación de solución de dosificación

Estudio 1: TP 10HD - CX radioyodada se mezcló con TP 10HD-CX no marcada purificada para producir una solución de dosificación adecuada para la administración de 1 mg/kg de dosis de TP 10HD total que contenía 16 - 25 x 10^{6} cpm de TP 10HD-CX radiomarcada.

Estudio 2: TP 10HD - CX radioyodada, \sim 5% p/p, se mezcló con TP 10HD - CX purificada para producir una solución de dosificación que contenía 1 mg/ml de TP 10HD - CX en Hepes 0,1 M, NaCl 0,15 M, tampón pH 7,4.

Estudio 3: TP 10HD - CC se administró como se suministró hasta una dosis final de 1 mg/kg.

Estudio 4: TP 10HD - CC radioyodada se mezcló con TP 10HD - CC radioyodada para producir una solución de dosificación adecuada para administrar una dosis total de 1 mg/kg o 3 mg/kg de TP 10HD que contenía \sim 20 x 10^{6} cpm.

Estudio 5: TP 10HD - CCW radioyodada se mezcló con TP 10HD-CCW no marcada purificada para producir una solución de dosificación adecuada para la administración de una dosis total de 1 mg/kg de TP 10HD que contenía \sim 20 x 10^{6} cpm.

Estudios 6 y 8: como se ha descrito en el estudio 2 excepto que la TP 10HD - CCW radioyodada se añadió a \sim 1% p/p.

Estudio 7: TP 10HD - CCS radiomarcada se mezcló con TP 10HD-CCS no marcada purificada para producir una solución de dosificación adecuada para la administración de una dosis total de 1 mg/kg de TP 10HD que contenía \sim 20 x 10^{6} cpm.

Estudio 8: TP 10HD - CXD radioyodada se mezcló con TP 10HD-CXD no marcada purificada para producir una solución de dosificación adecuada para la administración de una dosis total de 1 mg/kg de TP 10HD que contenía \sim 20 x 10^{6} cpm.

E. Protocolos

En los estudios 1, 4, 5, 7 y 9, el material de ensayo de inyectó intravenosamente (abreviadamente en inglés iv) en cuatro ratas Sprague - Dawley (2 machos, 2 hembras). Se extrajeron las muestras de sangre del plexo retroorbital a 1, 3, 5, 10, 20, 30, 45 y 60 minutos después de la inyección y se determinó la radiactividad. Se tomaron muestras de sangre adicionales después de la infusión a 2, 3 y 4 horas después de la inyección (estudio 4) y a 120 minutos (estudio 5). La fracción de plasma de la muestra de sangre restante se retuvo para análisis posteriores.

Las muestras de plasma se analizaron para material de ensayo residual midiendo:

(1)

radiactividad residual total;

(2)

porcentaje de material radiomarcado precipitado con TCA;

(3)

radiactividad residual precipitable con ácido en presencia de SDS; y

(4)

material identificable inmunológicamente en un inmunoensayo enzimático como TP 10HD.

Los datos de radioisótopos se cuantificaron como cpm/ml totales de sangre o plasma como el porcentaje de un valor de tiempo cero teórico. La semivida farmacocinética se calculó a partir de los datos radiométricos.

En el estudio 2, el material de ensayo se inyectó iv en dos grupos de cinco machos de conejos Dutch (aproximadamente 1 kg) a una dosis de 1 mg/kg. Se tomaron muestras de sangre, 2 ml, de una arteria de la oreja inmediatamente antes de la dosificación y a 5, 10, 20, 45, 60, 120 y 180 minutos y se mezcló con heparina (concentración final 25 \mug/ml). La radiactividad se determinó en una alícuota mediante conteo por centelleo, y el plasma, obtenido mediante centrifugación a 2000 x g durante 5 minutos, se almacenó a -40ºC.

Se analizaron las muestras de plasma para material de ensayo residual mediante un ensayo funcional in vitro, inhibición de hemólisis de anticuerpos glóbulos rojos de oveja (abreviadamente en inglés SRBC) cubiertos con anticuerpo mediante complemento humano. La semivida farmacocinética se calculó a partir de la titulación de la actividad funcional residual.

En el estudio 3, el material de ensayo se inyectó iv a través de una cánula en la vena yugular en lechones que variaban en peso entre 4,5 y 6,1 kg. Se obtuvieron las muestras de sangre mediante una cánula en la vena yugular previamente implantada en jeringas que contenían litio heparina a una concentración final de 15 unidades/ml. Una muestra de preinfusión, 10 ml, se tomó a tiempo cero y se tomaron las muestras después de la infusión de 1 ml a 5, 10, 30, 45, 60, 120, 180, 240, 300, 360 minutos y 24 horas. Las muestras de sangre anticoaguladas se centrifugaron a \sim 3000 rpm, 4ºC, 5 minutos y el plasma pobre en plaquetas se alicuotó y se almacenó a o por debajo de -70ºC.

Las muestras de plasma se analizaron para material de ensayo residual mediante un ensayo funcional in vitro, como se ha descrito anteriormente, usando complemento de cerdo en lugar de humano. La semivida farmacocinética se calculó a partir de la titulación de la actividad funcional residual.

En los estudios 6 y 8, el material de ensayo se inyectó iv en un grupo de 5 conejos Dutch (aproximadamente 1 kg) a una dosis de 1 mg/kg. Las muestras de sangre, 1 ml, se tomaron de una arteria de la oreja inmediatamente antes de la dosificación a 5, 10, 20, 30, 60, 120 y 180 minutos, mezclada con heparina y la radiactividad se determinó en una alícuota mediante conteo por centelleo después de la precipitación con ácido tricloroacético.

Las muestras de plasma se analizaron para material de ensayo residual mediante un inmunoensayo enzimático (abreviadamente en inglés EIA) específico para TP 10HD. La semivida farmacocinética se calculó tanto de los datos radiométricos como del inmunoensayo.

F. Tratamiento con la N-glicanasa

En el estudio 9, la separación de las cadenas de oligosacáridos unidas por enlaces de N se realizó mediante digestión con la n-glicanasa, se realizó según las instrucciones del fabricante (Genzi¡yme Corporation, Boston, MA).Típicamente, 58 \mug de TP 10HD-CX se incubó con 10,5 unidades de la n-glicanasa durante 18 horas, 37ºC, en fosfato sódico 0,2 M, tampón pH 8,6.

G. Precipitación con ácido

La precipitación con ácido tricloroacético se realizó como sigue: plasma (20 \mul) se precipitó mediante adición secuencial de 450 \mul de Tris HCl 0,13 M, 4% de SDS, 10% de glicerol, tampón pH 6,8, seguido de 30 \mul de suero fetal bovino y 500 \mul de ácido trifluoroacético al 20%. Después de cada adición, los tubos se mezclaron vigorosamente y se incubaron durante 72 horas a 4ºC; los sedimentos de la proteína precipitable se recogieron mediante centrifugación a 1000 x g durante 10 minutos, los sobrenadantes se retiraron y se eliminaron y la radiactividad residual se midió mediante conteo por centelleo.

H. Inmunoensayo enzimático

Se utilizó un ensayo comercialmente disponible (Cellfree® CD35, T Cell Diagnostics, Inc. Cambridge, MA). En resumen, perlas de poliestireno recubiertas con anticuerpos anti-TP 10HD de conejo policlonal se incubaron simultáneamente con la muestra de ensayo diluida y una peroxidasa de rábano picante - anticuerpo anti-TP 10HD de conejo policlonal conjugado. Después de la incubación, se retiraron las perlas de la mezcla de reacción, se lavaron del material unido no específicamente y posteriormente se incubaron en presencia de una dilución apropiada de sustrato. El desarrollo de color se finalizó mediante la adición de ácido sulfúrico y se determinó la absorbancia (densidad óptica) como una medida de concentración de TP 10HD.

I. Ensayo de hemólisis

Las muestras de plasma de conejo se calentaron a 56ºC durante 1 hora en presencia de metilamina (12,5 mM) con el fin de amidar los grupos tioéster e inactivar los componentes de complemento endógeno C3 y C4. Este procedimiento eliminaba la actividad de conejo endógeno en las muestras de ensayo sin afectar significativamente la actividad de TP 10HD. Después las muestras de ensayo se diluyeron 1:50 con Hepes 0,1, NaCl 0,15 M, tampón pH 7,4 y se ensayaron.

SRBC presensibilizados con anticuerpo anti-srbc de conejo (Diamex, Miami, FL) se mezclaron en pocillos de microtitulación con fondo en v (Costar, Cambridge, MA) con una dilución apropiada del plasma de ensayo y una alícuota de suero humano diluido como fuente del complemento. Después de la incubación, 37ºC, 1 hora, los glóbulos rojos no lisados se sedimentaron mediante centrifugación, se transfirió el sobrenadante a los correspondientes pocillos de fondo plano (Costar, Cambridge, MA) y se midió la absorbancia a 415 nm. La inhibición de la lisis mediada por el complemento de los SRBC recubiertos con anticuerpo se midió como la reducción en la absorbancia en presencia de la muestra de ensayo. Las curvas patrones con cantidades conocidas de TP 10HD se pueden usar para calibrar el ensayo de manera que los resultados se pueden expresar en mg/ml de TP 10HD que permanece en el plasma frente al tiempo.

Estudio 3

Ensayo hemolítico

Antes de la infusión con TP 10HD-CC, se recogió plasma de cada cerdo a usar como un diluyente de muestra y fuente de complemento para el ensayo de hemólisis. Las muestras de ensayo se diluyeron un mínimo de 1:50 con Hepes 0,1 M, NaCl 0,15 M, tampón pH 7,4. Para una dilución mayor, las muestras de ensayo se diluyeron con plasma de preinfusión ya diluido 1:50 en el mismo tampón, manteniendo por lo tanto la concentración final del plasma a 1:50. A esta dilución, el grado de hemólisis era equivalente a la hemólisis con complemento humano, como se ha descrito anteriormente. Otras manipulaciones eran como se ha descrito anteriormente. Las curvas patrones con cantidades conocidas de TP 10HD se pueden usar para calibrar el ensayo de manera que los resultados se pueden expresar en \mug/ml de TP 10HD que permanece en el plasma frente al tiempo.

Resultados

Los resultados de los estudios farmacocinéticas se presentan en las tablas 3 - 7. Para los estudios 1, 4, 5, 7 y 9, en ratas, se determinaron los aclaramientos de la sangre de ^{125}I-TP 10HD-CX, ^{125}I-TP 10HD-CC,^{125}I-TP 10HD-CCW,^{125}I-TP 10HD-CCS y ^{125}I-TP 10HD-CXD, respectivamente. Se extrajo sangre completa (\sim 300 ml) del plexo retroorbital de cada rata. Se contaron muestras duplicadas de 100 \mul de cada momento, se promediaron por grupo y se normalizaron a cpm/ml. El aclaramiento de determinó mediante conteos de precipitable CON TCA de material marcado con ^{125}I y mediante EIA. Los resultados, mostrados en la tabla 3, indican un patrón de aclaramiento bifásico en cada estudio con una semivida de fase \alpha corta y una semivida de fase \beta más larga.

TABLA 3

1

TABLA 4

2

TABLA 5

3

Las muestras de plasma tomadas 24 horas después de la dosificación proporcionaron niveles de TP 10HD-CC que no eran distinguibles de los niveles de control. Los parámetros farmacocinéticas para la velocidad de aclaramiento, volumen de compartimiento, constantes de velocidad y semivida se obtuvieron ajustando los datos para cada cerdo a dos y tres modelos de compartimientos. Los análisis estadísticos mostraban que, para algunos cerdos, un modelo de tres compartimientos era un ajuste mejor, mientras, para otros cerdos, un modelo de dos compartimientos era mejor; para evitar los datos de complejidad para todas los cerdos, los datos se procesaron usando un modelo de dos compartimientos. La semivida media se encontró que era 8,3 minutos para la fase \alpha y 6 horas para la fase \beta. Estas fases representan 69% y 31% respectivamente de la dosis dada de manera que aproximadamente un tercio de la dosis se aclaró lentamente.

Este estudio demostró que la preparación de TPO 10HD-CC mostró un patrón de aclaramiento bifásico marcado en el que la fase \beta era mucho más lenta que la fase \alpha. Estos resultados son consistentes con aclaramiento diferencial de poblaciones de glicoformas, siendo algunas especies eliminadas muy lentamente.

Los resultados del estudio 6 se resumen en la tabla 6, más adelante

TABLA 6

4

La semivida farmacocinética de TP 10HD-CCW como se determinó mediante análisis radiométrico era aproximadamente 8 minutos para la fase \alpha y 216 minutos para la fase \beta. Aproximadamente el 30% de la dosis total se aclaró durante la fase \alpha rápida y el 70% de la dosis total se aclaró durante la fase \beta más larga. La velocidad de aclaramiento total para esta glicoforma era 0,26 ml/min/kg y el volumen del compartimiento para la fase \beta era \sim23 ml/kg.

Los resultados del estudio 8 se resumen en la tabla 7, más adelante.

TABLA 7

5

La semivida farmacocinética de TP 10HD-CCS determinada mediante análisis radiométrico era aproximadamente de 6 minutos para la fase \alpha y de 216 minutos para la fase \beta. Aproximadamente 75% de la dosis total se aclaró durante la fase \alpha rápida y el 25% de la dosis total se aclaró durante fase \beta más larga. La velocidad de aclaramiento total para esta glicoforma era 0,85 ml/min/kg y el volumen de compartimiento para la fase \beta era \sim 162 ml/kg.

En el estudio 9, la semivida farmacocinética de TP 10HD-CXD como se determina mediante análisis radiométrico era < 1 minuto para la fase \alpha y 6,1 minutos para la fase \beta.

Resumen

Los resultados presentados anteriormente demuestran que las preparaciones purificadas de TP 10HD contienen glicoformas que difieren en las velocidades de aclaramiento. La conclusión de que dichas diferencias se deben a variaciones en la glicosilación es consistente con los resultados:

(1)

la desglicosilación de las preparaciones de TP 10HD purificada produce moléculas con un peso molecular común, con tal que las cadenas polipeptídicas de todas las preparaciones de TP 10HD sean idénticas;

(2)

la TP 10HD desglicosilada se aclara rápidamente; y

(3)

las preparaciones de TP 10HD caracterizadas por pesos moleculares mayores debido a una glicosilación aumentada (por ejemplo, las preparaciones de TP 10HD CC y CCW), demuestran semividas en plasma mayores y/o velocidades de aclaramiento total menores que las preparaciones con pesos moleculares menores debido a menores grados de glicosilación (por ejemplo, las preparaciones CX y CCS).

La comparación de los resultados de los estudios 6 y 8 muestra que la diferencia principal entre las preparaciones TP 10HD-CCW y TP 10HD-CCS no está en las semividas que caracterizan el aclaramiento bifásico, pero en la proporción de material que se aclara lentamente (una proporción mayor en TP 10HD-CCW).

Como se indica más adelante, el análisis de carbohidratos detallado ilustra que las diferencias entre las glicoformas de TP 10HD se debe al grado de glicosilación, la composición de las cadenas de oligosacáridos y la identidad de identificación de los residuos de carbohidratos de oligosacáridos.

Ejemplo VII Determinación de los residuos de oligosacáridos terminales de las glicoformas múltiples de TP 10HD

La determinación de los residuos de oligosacáridos terminales de TP 10HD demostraron que la glicoforma débilmente catiónica muestra un nivel más alto de sialización.

Procedimientos

Se evaluó la estructura de carbohidrato terminal de las preparaciones de TP 10HD. Las muestras de cada preparación, 1 \mug, se inmovilizaron en membranas de nitrocelulosa usando un aparato de Dot - Blot comercialmente disponible (Bio-Rad, Richmond, CA). Un kit de diferenciación de glicanos comercialmente disponible que identifica los residuos de oligosacáridos terminales en glicoproteínas (Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianápolis, IN) se usó según las instrucciones del fabricante. El kit contiene cinco sondas de digoxigenina - lectina: aglutinina de Galanthus nivalis (abreviadamente en inglés GNA); aglutinina de Sambucus nigra (abreviadamente en inglés SNA); aglutinina de Maackia amurensis (abreviadamente en inglés MAA); aglutinina de cacahuete (abreviadamente en inglés PNA); y aglutinina de Datura stramonium (abreviadamente en inglés DSA).

En resumen, muestras replicadas de cada preparación de TP 10HD se sondaron con un complejo digoxigenina - lectina; cambiando la lectina se altera la especificidad de la sonda para permitir la detección de una diversidad de residuos de carbohidratos. Después de la unión las sondas se visualizaron mediante detección de epítopos de digoxigenina con una fosfatasa alcalina - reactivo Fab' de oveja anti-digoxigenina conjugado; el desarrollo de color se produjo en cinco minutos después de la adición del sustrato.

Los resultados se resumen en la tabla 8

TABLA 8

6

TP 10HD-CX era reactiva solamente con la lectina GNA, indicando que esta preparación muestra residuos de manosa terminales. TP 10HD-CXD era, como se esperaba, no reactiva con todas las sondas, indicando que el tratamiento con la N-glicanasa había separado las cadenas de oligosacáridos. La TP 10HD-CCW era fuertemente reactiva con MAA y débilmente reactiva con DSA, indicando las estructuras galactosa \alpha (2, 3) ácido siálico y galactosa \beta (1,4) N-acetilglucosamina. La TP 10HD-CCS era fuertemente reactiva con GNA, indicando una preponderancia de los residuos de manosa terminales, y débilmente reactiva con MAA y DSA, sugiriendo una contaminación cruzada con TP 10HD-CCW.

Conclusiones

Estos resultados demuestran que las glicoformas de TP 10HD presentan estructuras de oligosacáridos que difieren con la glicoforma débilmente catiónica, TP 10HD-CCW, caracterizada por los residuos de ácido siálico terminal y la glicoforma fuertemente catiónica, TP 10 HD-CX y TP 10HD-CCS, caracterizada por residuos de manosa terminales. Estos hallazgos sugieren que la presencia de residuos de ácidos siálicos terminales da como resultado una aclaramiento de plasma mas lento o residuos de manosa terminales dan como resultado un alto nivel de la TP 10HD a los receptores de carbohidratos celulares que conducen un aclaramiento de plasma más rápido.

Ejemplo VIII Derterminación de la composición de carbohidratos de oligosacáridos y estructura de TP 10HD

La determinación de la composición de carbohidratos de oligosacáridos y estructura de TP 10HD, preparado como se ha descrito en el ejemplo II mostró que el contenido en ácido siálico de la glicoforma de TP 10HD más fuertemente catiónica era menor que la glicoforma débilmente catiónica. El rápido aclaramiento de plasma se asoció con poco o nada de ácido siálico en las cadenas de oligosacáridos y (por inferencia) accesibilidad de la proteína a receptores de manosa o galactosa. El aclaramiento del plasma estaba asociado con uno o más residuos de ácidos siálicos terminales.

Composición de monosacáridos de las glicoformas de TP 10HD A. Fuentes del material de ensayo

La TP 10HD se aisló como se describe en los ejemplos I y V, como se ha escrito anteriormente, y se resolvió en la glicoforma débilmente catiónica, TP 10HD -CCW y la glicoforma fuertemente catiónica, T P 10HD-CCS.

B. Procedimientos

El análisis se realizó usando las siguientes etapas.

1.

Diálisis e la muestra (aproximadamente 270 - 280 mg) frente a agua desionizada, para eliminar todas las sales tampón, seguido de liofilización.

2.

liberación las cadenas de oligosacáridos intactos con hidracina anhidra.

3.

tratamiento de las cadenas de oligosacáridos intactas con HCI metabólico anhidro para liberar los monosacáridos individuales como derivados de O-metilo.

4.

N-acetilación de cualquier grupo amino primario.

5.

Derivatización para proporcionar glicósidos de per-O-trimetilsililmetilo.

6.

Separación de estos derivados de mediante GLC capilar (cromatografía de gas líquido) sobre una columna de CP-SIL8.

7.

identificación de derivados de glicósidos individuales por tiempo de retención de GLC y espectrometría de masas, comparado con los patrones conocidos.

8.

Cuantificación de los derivados individuales por FID con un patrón habitual (13-O.-metil-D-glucosa).

C. Resultados

El contenido molar relativo de cada monosacárido en las dos glicoformas de TP 10HD se muestran en las tabla 9, más adelante.

TABLA 9

7

D. Comparación con TP 10HD-CC

Con el fin de caracterizar cualquier diferencia en la composición de monosacáridos que pudiera existir entre TP 10HD producido en un biorreactor de fibra hueca como se ha descrito previamente (TP 10HD-CX), las glicoformas fraccionadas TP 10HD-CCXW y TP 10HD-CCS y el material no fraccionado producido en un biorreactor de lecho fluido (TP 10HD-CC), los lotes de estos materiales se pueden comparar usando otro planteamiento analítico.

Los azúcares neutros y amino se determinaron mediante cromatografía de intercambio aniónico de alta resolución combinado con detección amperométrica pulsada (Sistema de carbohidratos HPAE - PAD, Dionex Corp.). Los azúcares se liberaron mediante hidrólisis en 20% (v/v) ácido trifluoroacético a 100ºC durante 6 horas. Los hidrolizados se secaron mediante liofilización o con un Speed - Vac (Savant Instruments). El residuo se disolvió en una solución de acetato de sodio trihidrato al 1% y se analizó en una columna de HPLC-AS6 como se ha descrito en el documento de Anumula y col., (Anal. Biochem. 195: 269 - 280 (1991). Las muestras se analizaron por cuadriplicado.

El ácido siálico se determinó separadamente mediante el procedimiento colorimétrico directo de Yao y col., (Ana Biochem. 179: 332 - 335 (1989)) en muestras por triplicado.

Los resultados se muestran en la tabla 10, más adelante.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 10

8

El contenido en glucosamina en este en ensayo es equivalente al contenido en N-acetilglucosamina en el ensayo usado anteriormente.

Conclusión

La composición de monosacáridos de las glicoformas TP 10 HD-CCW y TP 10HD-CC son típicas de los oligosacáridos fucosilados complejos mono, bi, y triantenarios terminados en ácido siálico cerca del sitio de sustitución de la proteína N-ligada y conteniendo un núcleo de tri-manosa;. Se puede concluir que el material de la glicoforma TP 10HD-CCW contiene una alta proporción de ácido siálico y/o una proporción de manosa menor que la glicoforma TP 10HD-CCS. Las diferencias en contenido de galactosa y (N-acetil)galactosamina son probablemente no significativas. La relación ácido siálico/manosa de TP 10HD-CX indica que este material (descrito por Fearon y col., indicado anteriormente), se parece a la glicoforma TP 10HD-CCS y es distinto de TP 10HD-CCW y TP 10HD-CC. Lo último parece consistir principalmente en las glicoformas débilmente catiónicas de acuerdo con otros datos presentados anteriormente.

Los resultados indican un aclaramiento en plasma más lento (TP 10HD-CCW) se correlaciona con un mayor contenido en ácido siálico o relación ácido siálico/manosa (> 0,25). Un contenido relativamente bajo de manosa puede también reflejar un mayor grado de ramificación (es decir, estructuras más y bi- y triantenarias) en este material.

Ejemplo IX Análisis de carga y disrtibución de oligosacáridos liberados de glicoformas de TP 10HD

El oligosacárido complejo se liberó de cada muestra de glicoforma (0,6 mg) mediante hidrazinólisis. Las cadenas de oligosacáridos se radiomarcaron mediante tritación reductora. El oliogosacárido cargado se sometió a electroforesis de papel de alto voltaje en condiciones alcalinas y los picos se detectaron y se cuantificaron mediante radiografía de tritio. Las cadenas de oligosacáridos se trataron con la neuraminidasa de Athrobacter ureafaciens para retirar el ácido siálico y se repitió la electroforesis.

Las cadenas de oligosacáridos desializados radiomarcados (es decir, neutras) se sometieron a cromatografía de exclusión por tamaño sobre BioGel P4, malla 400, 2 m x 15 mm (BioRadCorporation, Richmond, CA) como sigue. La cromatografía se realizó en agua a 55ºC a un caudal de 0,2 ml/min. Las muestras se mezclaron con hidrolizado de ácido parcial no marcado de dextrano como un patrón interno. Las cadenas de oligosacáridos de glicoformas no marcadas se detectaron mediante un control de radioisótopos de flujo en línea y los patrones de oligoglucosa se detectaron mediante un refractómetro diferencial en línea. En los resultados que siguen, el volumen hidrodinámico de los oligosacáridos individuales se expresa en forma de unidades de glucosa aparentes (abreviadamente en inglés gu), los valores se determinan mediante interpolación spline cúbica entre los oligómeros de glucosa inmediatamente adyacentes al alditol del oligosacárido.

La figura 4 compara los radioelectrofoterogramas de TP 10HD-CCW y TP 10HD-CCS antes y después de tratamiento con la neuraminidasa. En ambos casos, el tratamiento con la neuraminidasa vuelve todas las cadenas de oligosacáridos marcadas neutras, indicando que la carga negativa se atribuye enteramente al ácido siálico.

En la glicoforma TP 10HD-CCS, aproximadamente el 64% de las cadenas de oligosacáridos eran inicialmente neutras y el resto tenía una movilidad correspondiente a una unidad de ácido siálico sola. Para las cadenas de oligosacáridos de la glicoforma TP 10HD-CCW, había una mayor proporción, 69%, de oligosacáridos ácidos de los cuales 40 - 50% tenían movilidades correspondientes a dos o más residuos de ácido siálico. Solamente aproximadamente el 31% de las cadenas de oligosacáridos de la glicoforma TP 10HD-CCW eran neutras antes del tratamiento con la neuraminidasa.

Los tamaños de las cadenas de oligosacáridos de las glicoformas detectadas mediante un análisis de perfil de tamaño se muestran en la tabla 11, más abajo.

TABLA 11

Análisis del tamaño de cadenas de oligosacáridos de glicoformas desializadas
TP 10HD-CCW	TP 10HD-CCS
\hskip1mm 20,1*	20,0
17,3	17,3
15,0	15,0
14,0	14,0
12,8	12,7
11,5	11,6
10,4	10,5
\hskip1mm 9,3	\hskip1mm 9,3
\hskip1mm 3,0	\hskip1mm 3,0
* Valores en unidades de glucosa (gu)

Así que, las cadenas de oligosacáridos derivadas de las glicoformas eran muy similares en tamaño. Sin embargo, como se muestra en la figura 5, las proporciones relativas de los diversos tamaños diferían. La TP 10HD-CCW contiene una mayor proporción de las cadenas de oligosacáridos de mayor tamaño, especialmente el oligosacárido predominante de 15 gu y una proporción menor de la especie de 14 gu, que TP 10HD-CCS.

Conclusiones

Además los datos de distribución de cargas confirman la correlación entre un alto contenido en ácido siálico y un bajo aclaramiento de plasma demostrado mediante la TP 10HD-CCW. Las proporciones relativas de las cadenas de las cadenas de oligosacáridos neutros son similares a las proporciones de material rápidamente y lentamente aclarado del plasma para las dos glicoformas (véase el ejemplo VI). Esto sugiere, que las moléculas de glicoproteínas en las que la cadena de oligosacáridas N-ligada tienen uno o más residuos de ácido siálico se deberían aclarar lentamente del plasma, mientras que las cadenas de oligosacáridos neutros se asocian con un aclaramiento rápido de plasma mediante un mecanismo todavía desconocido.

El perfil del tamaño de la cadena de los oligosacáridos solo no permite una identificación ambigua de las estructuras precisas de las cadenas de los oligosacáridos complejos. Sin embargo, los datos de la composición y tamaño juntos son consistentes con una estructura principal que contiene un núcleo de trimanosa (es decir, biantenario) con sialización variable de galactosa terminal y fucosilación variable. Las posibilidades adicionales incluyen además ramificación para proporcionar una estructura triantenaria con tres unidades Gal. Está claro que el perfil del tamaño no sugiere por sí cualquier tipo estructural principal asociado a un aclaramiento lento del plasma.

El aclaramiento lento del plasma solamente se correlaciona con el grado de sialización de numerosas estructuras del núcleo del tipo mencionado anteriormente.

Ejemplo X El pl de la glicoforma de TP 10HD débilmente catiónica es menor que la glicoforma fuertemente catiónica

El pl de la glicoforma altamente sializada es menor que el pl de la glicoforma ligeramente sializada.

Procedimientos

La cromatofocalización es un procedimiento de separación de isoformas de proteínas según su punto isoeléctrico, pl, usando una columna de intercambio iónico y un gradiente de pH creado con tampones anfóteros de pH diferentes. En este estudio, el análisis de las preparaciones de TP 10HD se realizó usando un gradiente se pH de 7,1 a 4,0. La resina cromatográfica era Mono P, Hr5/5 (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ); el tampón de partida era Bis/Tris 0,025 M titulado hasta pH 7,1 con ácido iminodiacético saturado; el eluyente era politampón 7 - 4 (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ) diluido 1:10 (v/v) con agua y ajustado hasta pH 4,0 con HCl; el tampón de limpieza era NaCl 2 M en agua. Las condiciones experimentales se eligieron para producir un gradiente de pH lineal de 7,1 a 4,0 unidades.

Resultados

La figura 6 resume los resultados de este experimento. Las isoformas predominantes en TP 10HD-CX tienen unos pl de aproximadamente 6,0 y 5,7, con cantidades menores de material a pl 5,0 e inferior. En la preparación de TP 10HD-CC, la isoforma de pl 5,7 era un componente menor; las formas predominantes tenían unos pl de 5,1 y 4,8. La integración de los picos sugiere que aproximadamente el 40% de la preparación de TP 10HD-CC tenía un pl < 4,9. Ya que la cantidad de material en la preparación de TP 10HD-CX con pl < 4,9 es tan pequeña, no era posible determinar exactamente la proporción de material de pl inferior en esta preparación.

Conclusión

La TP 10HD-CX se encontró que tenía un pl medio mayor que TP 10HD-CC, consistente con un menor contenido de grupos ácidos derivados post-traduccionalmente. Sin embargo, había alguna solapamiento en el perfil de isoformas entre las dos preparaciones de TP 10HD. El porcentaje de TP 10HD con un pl bajo (< 4,9) se correlacionó con el porcentaje material aclarado lentamente del plasma en cerdos (véase el ejemplo VI). Estos resultados están de acuerdo con los hallazgos descritos en el ejemplo VIII, esas glicoformas con los mayores niveles de residuos de ácido siálico terminal demuestran un pl bajo.

Ejemplo XI Actividad funcional de las glicoformas de TP 10HD: inhibición de hemólisis mediada por complemento in vitro

Las diversas glicoformas de TP 10HD tienen una actividad funcional antihemolítica in vitro comparable con el intervalo de confianza del ensayo, como se muestra en los resultados mostrados más adelante.

Procedimientos

El ensayo de inhibición de hemólisis se basa en la capacidad de las soluciones de TP 10HD de inhibir la lisis de SRBC sensibiliados con un anticuerpo policlonal de conejo en presencia de suero humano como fuente de complemento y se ha descrito en el ejemplo VI anteriormente.

La actividad se expresa como la concentración de TP 10HD que proporciona un 50% de inhibición de hemólisis, IH_{50}, en las condiciones de ensayo habituales. Cuanto menor es la concentración de TP 10HD, o glicoforma de TP 10HD, que produce 50% de inhibición, mayor es la eficacia de la preparación. Se examinó para cada muestra un intervalo de diluciones de TP 10HD o glicoforma de TP 10HD que variaba entre 7,8 y 1000 ng/ml.

Resultados

La TP 10HD-CX demostró un valor de IH_{50} típico de 20 \pm 7 ng/ml, mientras que el valor para TP 10HD-CC era mayor, aproximadamente 50 \pm 3 ng/ml, sugiriendo que la eficacia de la preparación que contenía una cantidad significativa de glicoforma débilmente cationica, altamente silizada era aproximadamente 2 veces más baja que la glicoforma fuertemente catiónica. La TP 10HD-CCW tenía un valor típico de IH_{50} de 44 ng/ml mientras la TP 10HD- CCS tenía valores de IH_{50} en el intervalo de 27 ng/ml. Estos resultados son consistentes con los valores para las preparaciones no fraccionadas de TP 10HD- CX y TP 10HD-CC. La desglicosilación reducía los valores de IH_{50} de 80 ng/ml para la TP 10HD-CX a 40 ng/ml para la TP 10HD-CXD.

Conclusión

La variabilidad intra ensayo de este ensayo está en el intervalo entre 15 y 20%, de manera que el significado de diferencias de 2 veces en los valores de IH_{50} es difícil de interpretar, mientras que cambios de cuatro veces o más se consideran significativos. Por lo tanto no hay base para concluir que TP 10HD- CC, TP 10HD-CCW y TP 10HD-CCS difieren en su eficacia en este ensayo. Un aumento de la glicosilación o sialización de estas glicoformas, que incrementa notablemente la semivida del plasma in vivo, claramente no tiene mayor impacto sobre la eficacia in vitro en la inhibición de hemólisis.

La estirpe celular DUX B11 de ovario de hámster chino (abreviadamente en inglés CHO) que lleva el plásmido pBSCR1c/pTCSgpt se depositó en la colección americana de cultivos tipo (abreviadamente en inglés ATCC), Rockville, Maryland, el 23 de marzo de 1989 y tenía el número de registro de cesión CRL 10052.

9

Claims (24)

1. Una preparación de moléculas de glicoproteína de receptor tipo 1 de complemento soluble y purificadas (abreviadamente en inglés sCR1), en la que

(1)

las isoformas predominantes de las moléculas de glicoproteína sCR1 en dicha composición presentan un punto isoeléctrico, pl, menor o igual que 5,1, como se determina mediante cromatofocalización, en las que el pl aumenta después del tratamiento con la neuraminidasa,

(2)

las moléculas de glicoproteína sCR1 en dicha preparación contienen una o más estructuras de oligosacárido complejas, en las que al menos 40% de dichas estructuras de oligosacárido contienen una media de al menos un residuo de ácido siálico terminal, y

(3)

las moléculas de glicoproteína sCR1 en dicha composición forman una población de moléculas de glicoproteína sCR1 teniendo una relación molar de ácido siálico a manosa mayor o igual que 0,25.

2. Una preparación según la reivindicación 1, en la que las moléculas de glicoproteína sCR1 en dicha preparación contiene una o más estructuras de oligosacárido complejas, en las que al menos 70% de dichas estructuras de oligosacáridos contienen una media de al menos un residuo de ácido siálico terminal.

3. La preparación según la reivindicación 1, en la que al menos 40% de las moléculas de glicoproteína sCR1 en dicha preparación muestra un punto isoeléctrico inferior o igual 4,9, como se determina mediante cromatofocalización.

4. La preparación según la reivindicación 1, en la que la población de las moléculas de glicoproteína sCR1 presenta una relación molar de ácido siálico a manosa mayor o igual que 0,38.

5. La preparación según la reivindicación 1, en la que la población de las moléculas de glicoproteína sCR1 presenta una relación molar de ácido siálico a manosa mayor o igual que 0,42.

6. La preparación según la reivindicación 1, en la que la población de las moléculas de glicoproteína sCR1 presenta una relación molar de ácido siálico a manosa mayor o igual que 0,53.

7. Una preparación según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, teniendo al menos 25% de la actividad inhibidora del complemento funcional de sCR1 desglicosilada, como se determina mediante ensayo de inhibición de hemólisis.

8. Una preparación según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que la estructura principal de proteína de dichas moléculas de glicoproteína sCR1 contiene las regiones LHR-A, LHR-B, LHR-C, LHR-D, SCR29 y SCR30 hasta e incluyendo el primer residuo de alanina de la región transmembranal.

9. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de una preparación según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

10. Una composición farmacéutica según la reivindicación 9, comprendiendo, además, una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente trombolítico.

11. Una composición farmacéutica según la reivindicación 10, en la que dicho agente trombolítico se selecciona del grupo constituido por:

(a)

un activador del plasminógeno;

(b)

un complejo plasminógeno - estreptocinasa - activador anisolado;

(c)

una uroquinasa de cadena sencilla;

(d)

una uroquinasa de dos cadenas,

(e)

una estreptoquinasa;

(f)

una proteína híbrida con actividad fibrinolítica que comprende una cadena de una primera proteasa de dos cadenas ligada a una cadena de una segunda proteasa de dos cadenas, teniendo al menos una de dichas primera o segunda proteasas actividad fibrinolítica; de manera que dicha proteína híbrida tiene un sitio catalítico esencial para la actividad fibrinolítica que está opcionalmente bloqueada por un grupo bloqueante lábil; y

(g)

una enzima fibrinolítica in vivo bloqueada de manera reversible en la que el sitio catalítico esencial para la actividad fibrinolítica en dicha enzima está bloqueada por un grupo que se puede eliminar mediante hidrólisis a una velocidad tal que la constante cinética de pseudo - primer orden para la hidrólisis está en el intervalo entre 10^{-6} seg^{-1} y 10^{-3} seg^{-1} en una solución acuosa isotónica a pH 7,4 a 37ºC.

12. Uso de una preparación según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para la fabricación de un medicamento en el tratamiento de un sujeto que padece una enfermedad o trastorno asociado a inflamación o a una activación del complemento inadecuada.

13. Uso de una preparación según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para la fabricación de un medicamento en el tratamiento de un sujeto que padece una enfermedad trombótica.

14. Uso de una preparación según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y de un agente trombótico para la fabricación de un medicamento en el tratamiento de un sujeto que padece una enfermedad trombótica en la que dicho agente trombótico se selecciona del grupo constituido por:

(a)

un activador del plasminógeno;

(b)

un complejo plasminógeno - estreptocinasa - activador anisolado;

(c)

una uroquinasa de cadena sencilla;

(d)

uroquinasa de dos cadenas,

(e)

una estreptoquinasa;

(f)

una proteína híbrida con actividad fibrinolítica que comprende una cadena de una primera proteasa de dos cadenas ligada a una cadena de una segunda proteasa de dos cadenas, teniendo al menos una de dichas primera o segunda proteasas actividad fibrinolítica; de manera que dicha proteína híbrida tiene un sitio catalítico esencial para la actividad fibronilítica que está opcionalmente bloqueada por un grupo bloqueante lábil; y

(g)

una enzima fibronilítica in vivo bloqueada de manera reversible en la que el sitio catalítico esencial para actividad fibrinolítica en dicha enzima está bloqueada por un grupo que se puede eliminar mediante hidrólisis a una velocidad tal que la constante cinética de pseudo - primer orden para la hidrólisis está en el intervalo entre 10^{-6} seg^{-1} y 10^{-3} seg^{-1} en una solución acuosa isotónica a pH 7,4 a 37ºC.

15. Uso de una preparación según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para la fabricación de un medicamento en el tratamiento de un sujeto que padece síndrome de dificultad respiratoria del adulto.

16. Uso de una preparación según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para la fabricación de un medicamento en el tratamiento o retraso del rechazo al trasplante en un sujeto que recibe un transplante.

17. El uso según la reivindicación 16 en el que el transplante es un transplante heterólogo o un transplante homólogo.

18. El uso según la reivindicación 12 en el que dicho sujeto es un ser humano.

19. El uso según la reivindicación 13 en el que dicho sujeto es un ser humano.

20. El uso según la reivindicación 14 en el que dicho sujeto es un ser humano.

21. El uso según la reivindicación 15 en el que dicho sujeto es un ser humano.

22. El uso según la reivindicación 16 en el que dicho sujeto es un ser humano.

23. El uso según la reivindicación 17 en el que dicho sujeto es un ser humano.

24. Un procedimiento para la preparación de moléculas de glicoproteína sCR1 teniendo un aclaramiento prolongado in vivo que comprende:

(a)

la expresión de una molécula de DNA que codifica la estructura primaria de dicha glicoproteína sCR1 en una célula hospedadora de mamífero en cultivo en condiciones en las que el crecimiento celular no está limitado por el suministro de nutrientes, y en las que la célula hospedadora es capaz de sializar las cadenas de oligosacárido de glicoproteínas; y

(b)

el aislamiento de las moléculas de glicoproteína sCR1 a partir de dicho cultivo, en el que:

(1)

las isoformas predominantes de las moléculas de glicoproteína sCR1 en dicha composición presentan un punto isoeléctrico, pl, menor o igual que 5,1, como se determina mediante cromatofocalización, donde el pl aumenta después del tratamiento con la neuraminidasa,

(2)

las moléculas de glicoproteína sCR1 en dicha preparación contienen una o más estructuras de oligosacárido complejas, en la que al menos el 40% de dichas estructuras de oligosacárido contienen de media al menos un residuo de ácido siálico terminal, y

(3)

las moléculas de glicoproteína sCR1 en dicha composición forman una población de moléculas de glicoproteína sCR1 teniendo una relación molar del ácido siálico a manosa mayor o igual que 0,25.