PT97389A - Processo para a preparacao de anticorpos monoclonais contra proteina da placenta 4 (pp4) - Google Patents

Description

Descrição referente à patente de invenção de BEHRINGWERKE AKTIENGESELLS-CHAFT, alemã, industrial e comercial, com sede em D-3550 Marburg, Republica Federal Alemã, (inventores: Hans Hock e Jurgen Romisch, residentes na República Federal Alemã), para PROCESSO PA RA A PREPARAÇÃO DE ANTICORPOS MONOCLO-NAIS CONTRA PROTEÍNA DA PLACENTA 4 (PP4)”.

DESCRICÃO A presente invenção refere-se a anticorpos monoclonais, especificamente dirigidos contra a proteína PP4, às linhas de células de hibridomas que produzem esses anticorpos assim como à sua utilização. n A proteína da placenta 4 (PP4) foi pela primeira vez isolada e caracterizada fisico-quimicamente por Bot (Patente de Invenção Europeia EP 0 123 307). Em seguida outros grupos de investigadores reconheceram esta proteína sem lhe conferirem essa identidade e designaram-na como anexina V, lipocor-tina V ou VAC-alfa. No sequenciamento do correspondente cADN Qrundmann e col. (1988), Proc. Natl. Acad. Sei. 85, 3708 - 3712) verificou-se que a PP4 pertence a uma família de proteínas que são designadas presentemente como lipocortinas ou anexinas.

As anexinas desempenham um papel decisivo de regulação na libertação de mediadores da inflamação. Por - 1

aplicação de anexinas, pode inibir-se a libertação de mediadores de inflamação.

As anexinas são agentes terapêuticos valiosos nas perturbações de coagulação, como a coagulação intravascular disseminada (DIC).

Para a obtenção de PP4, uma fonte apropriada é constituída pela placente humana que está à disposição em quantidades suficientes. 0 processo estabelecido de purificação de PP4 a partir de fontes naturais é no entanto dispendioso e origina perdas de PP4. 0 mesitP é válido para a PP4 preparada por tecnologia genética, que se pode obter a partir de culturas de células de E. coli ou de animais sob uma forma biologicamente activa. É necessário, por conseguinte, um processo de purificação rápido e que origine o mínimo de perdas possível,

A utilização de anticorpos monoclonais para finalidades de purificação foi já descrita e estabelecida para algumas outras proteínas. É decisiva para o rendimento e para a obtenção da proteína purificada o facto de se saber em que condições ou com que agentes a proteína ligada a anticorpos monoclonais imobilizados pode ser de novo eluída. Frequentemente, a ligação entre anticorpos monoclonais e antigenes pode conseguir-se apenas por meio de valores extremos de pH ou de agentes caotrópicos, o que origina frequentemente a desnaturação de proteína. Por este motivo, não é apropriada toda e qualquer purificação rápida e conveniente para cada anticorpo monoclonal. 0 objectivo da presente invenção é proporcionar anticorpos monoclonais contra PP4 que, ligados a suportes apropriados, permitam uma purificação cuidadosa e eficiente de PP4 a partir de diversos materiais de partida. são objecto da presente invenção anticorpos \ monoclonais contra PP4, um processo para a sua preparação e a 2 sua utilização, de preferencia, para a purificação ou o diagnóstico de PP4.

Surpreendentemente, Requerente descobriu anticorpos monoclonais que ligam a anexina PP4 apenas em presença de catiões bivalentes, de preferencia, cálcio. As soluções que não contêm cálcio nem reagentes que formem quelatos estão em posição de desadsorver PP4 sob uma forma biologicamente acti-va com grande rendimento e pureza a partir de anticorpos. Esses anticorpos monoclonais, ligados a materiais de suporte apropriados, são muito apropriados para a purificação de PP4 a partir de célulasou de orgãos humanos, assim como para a purificação de uma PP4 recombinante a partir de culturas de células de E. coli ou de animais. Esses anticorpos podem também ser utilizados com finalidades de diagnóstico.

Como se sabe, a PP4 pode considerar-se um marcador para determinadas doenças. Normalmente, a PP4 é de-tectável em liquidos corporais humanos, como plasma, por exemplo, apenas em concentrações muito pequenas (entre 0 e 10 nm/ ml). Em determinadas doenças, por exemplo, em alguns tumores, a concentração desta proteina é significativamente aumentada e pode ser utilizada como parâmetro de diagnóstico rápido. Isto abrange tanto as determinações quantitativas de PP4 com o auxilio de anticorpos monoclonais em líquidos corporais, por exemplo com o auxilio de ensaio de rádio-imunidade ou de enzimo-imuni-dade, como também a determinação qualitativa ou quantitativa em superfície de células, em extractos de tecidos ou em preparados histológicos como cortes de tecidos.

Para esta finalidade, podem preparar-se anticorpos procedendo da maneira que se descreve seguidamente.

Imunizam-se mamíferos de obtenção de células que produzem anticorpos, por exemplo, ratos Balb/c, por meio de injecçã subcutânea de uma emulsão de 50 microgramas de PP4 (obtida a partir de placenta humana como se descreve no - 3

Exemplo 1), em solução de Meio Adjuvante de Freund completa (dia 1). Nos dias 28 e 56, injectam-se em cada um deles 50 micrc gramas de PP4, emulsionada igualmente em Meio Adjuvante de Fre-unde incompleto, por via subcutânea. No dia 92, realiza-se uma injecçio intraperitonial de 100 microgramas de PP4 em 0,5 mililitro de solução fisiológica de cloreto de sódio. No dia 95, re-cuperam-se os linfócitos por desintegração mecânica, depois de se colher o baço ..

Realiza-se a fusão dos linfócitos com células de hibridoma de células de mieloma de acordo com o processo usual (Kohler e Milstein, 1975; Nature 256 : 495 - 497) : por exemplo, cultiva-se a linha de células de mieloma SP2/0-Agl4 em meio de Eagle modificado segundo Dulbecco (DMEM), com 10% de soro de feto de vitela (FKS). Para se conseguir a fusão das células de hibridoma, tipicamente, misturam-se as células de baço de rato (cerca de 10^) com 5 x 10^ células de mieloma, lava-se com DMEM isento de soro e centrifuga-se. Depois da completa separação do sobrenadante, adiciona-se gota a gota ao pelete de células 0,5 ml de uma solução a 50% de polietilenoglicol 4000 em DMEM, durante um minuto. Incuba-se a suspensão durante noventa segundos a 37s C e, em seguida, dilui-se mediante de 7,5 ml de DMEM durante o intervalo de tempo de cinco minutos. Depois de incubação durante dez minutos à temperatura ambiente, dilui--se com DMEM até perfazer 40 ml e centrifugam-se as células. De pois de se aspirar o sobrenadante, ressuspendem-se as células em DMEM com 20% de FKS e distribui-se por seis placas de micro-titulação (200 microlitros por cavidade). A escolha de células de hibridomas realiza-se por adição de 13,6 mg/ml de hipoxanti-na, 0,18 mg/ml de aminopterina, 3,9 mg/ml de timidina (meio de HAT). 0 meio consumido é substituído em intervalos de três a quatro dias por meio fresco e, depois de dez dias, o meio HAT é substituído por meio de HT.

Biotinizacao de PP4

Para o ensaio sobre anticorpos específi- 4 cos de PP4, é necessária PP4 biotinizada. Esta pode preparar--se procedendo da seguinte forma. Dialisa-se PP4 contra NaHC03 0,1 M, pH 8. À solução adiciona-se 0,1 miligrama de éster de N-hidroxi-succinimida de D-biotina (solução a 0,1% em sulfóxido de dimetilo) por miligrama. Incuba-se a mistura reaccional à temperatura ambiente durante quatro horas e, em seguida, dialisa-se contra Na2HP04 0,01 M, NaH2P04 0,01 M, pH 7,2, NaCl 0,15 M.

Ensaio sobre Anticorpos de PP4

Catorze dias depois da fusão, ensaiam--se os sobrenadantes da cultura de células das células de fusão por meio de ensaio de imunidade com enzimas relativamente a anticorposcontra PP4.

Incubam-se placas de microtitulação de poliestireno com 0,5 micrograma/mililitro de IgG de cabra anti--rato emTSIaHC03 0,1 M. pH 9,6 (vinte e quatro horas, 4S C). Em seguida, aplicam-se os sobrenadantes das células de cultura (duas horas, 372 c), seguida de incubação com PP4 biotiniliza-da (1 micrograma/ml). Em seguida, realiza-se a incubação durante trinta minutos a 37Q C com um complexo de avidina e peroxi-dase biotinilada (respectivamente, 1 micrograma/ml). Como substrato, utiliza-se uma solução de 0,1% (em peso/volume) de 2,2'--azino-di-(3-etil-benzotiazolino-sulfonato) e 0,012% (em volu-me/volume) de H2O2 em ácido cítrico 0,1 M, Na2HP04 0,1 M e pH 4,5. Depois de incubação durante trinta minutos a 37s c, mede--se a absorção a 405 nm. Entre as fases individuais da incubação lava-se com Na2HP04 0,01 M, NaH2P04 0,01 M de PH 7,2, NaCl 0,15 M, Tween 20 0,05% (PBS/Tween). Todos os reagentes são diluídos com Tris/HCl 0,02 M, pH 7,4 NaCl 0,15 M, CaCl2 0,02 M e 2% de albumina de soro de vitela (TBS/RSA). Paralelamente, reõ. liza-se o ensaio de imunidade com enzimas com os mesmos sobrenadantes da cultura de célula? era que, no entanto, se substitui . o cloreto de cálcio no tampão de diluição por EDTA 0,02 M. Se- . leccionam-se os anticorpos que se ligam a PP4 apenas em presençé 5 de CaCl2 mas não em presença de EDTA. Estes anticorpos são especialmente apropriados para a purificação de PP4 por meio de cromatografia de afinidade imune.

Clonacão de Linhas de células que produzem anticorpos

Clonam-se linhas de células que, no ensaio com anticorpos PP4 reagem em presença de EDTA, mas que não reagem positivamente na presença de cálcio, procedendo de acordo como método de diluição limitante, Para esse efeito, distribuem-se cerca de sessenta células em DMEM com 20% de FKS e 5% de sobrenadante de cultura endotelial (Costar) por noventa e seis cavidades de uma placa de cultura de células. Os cio nes individuais são identificados microscopicamente e ensaiados sobre a produção de anticorpos. Repete-se a clonação duas vezes.

Purificação de Anticorpos Monoclonais

Linhas de células clonais são transferidas para balões Roller para a produção de anticorpos e cultivadas em meio de Dulbecco modificado por Iscove. 0 sobredadan-te das células é obtido por centrifugação e concentrado com o auxílio de ultrafiltração cerca de dez vezes. AdiPiona-se o concentrado e uma coluna da proteína A-Sepharose ^ CL-4B (Phar macia) e elui-se a IgG ligada com glicina 0,2 M/HC1, pH 3. As fracções que contêm proteína são dialisadas com citrato 0,1 M, pH6,5 e concentradas por ultrafiltração e cerca de 5mg/ml. Nestas condições, obtém-se, por exemplo, um anticorpo de IgGl do subtino Kapa, que, por focagem iso-eléctrica, aparece em várias bandas, na gama de pH 6,2 a 6,5 e liga-se a PP4 em presença de iões de cálcio.

Os geles de afinidade por imunidade apropriados podem preparar-se procedendo de acordo com a seguinte maneira. Um dos anticorpos monoclonais, cuja preparação se des creveu anteriormente, é imobilizado num material de suporte 6

insolúvel apropriado (por exemplo» agarose» celulose» poliacri-lamida e os seus derivados)» por meio de um processo conhecido pelos peritos no assunto (por exemplo, activação com bromocia-no, epóxidos ou carbodiimidas). De acordo com uma maneira de proceder preferida, esses anticorpos monoclonais podem ser acoplados a Sepharose 4b(r) (Pharmacia) activada com bromociano de acordo com as indicações do fabricante. Por exemplo, podem ligar-se 5 mg de anticorpo por 1 ml de gel. Estes geles podem em seguida ser utilizados na cromatografia de afinidade com imunidade de PP4.

Os Exemplos seguintes esclarecem mais completamente a presente invenção.

EXEMPLOS

Exemplo 1

Purificação de PP4 de Placenta Humana e Determinação da Actividade Biológica.

Desfizeram-se 36 quilogramas de placenta humana, lavou-se várias vezes com NaCl 0,15 M e liofilizou-se em seguida. Extraiu-se o liofilizado (3 quilogramas) com 50 litros de Tris/HCl 0,02 M, pH 7,5, NaCl 0,15 M, citrato de tris-sódio 0,1 M, misturou-se com sulfato de amónio (33% de saturação) e incubou-se pelo processo descontínuo com 4 litros de fenil-Sepharose (R). Depois de se lavar a resina, eluiu-se a PP4 com água com sacudidelas, precipitou-se por adição de sulfato de amónio até 80% de saturação, separou-se o pelete por centrifugação, retomou-se em Tris/HCl 0,02 M de pH 8,0 (tampão A) e dialisou-se contra o mesmo tampão. Depois de se adicionar CaCl2 até se obter a concentração final de 0,005 M, misturou--se o dialisado pelo processo em cargas descontinuas com 1 litr° de uma heparina-RSepharose, agitou-se à temperatura ambiente durante sessenta minutos e separou-se a solução sobrenadante. Lavou-se em seguida o adsorvente com tampão A com adição de CaCl2 0,005 M. Realizou-se a eluição de PP4 com um gradiente - 7 - *

linear de NaCl 0 a 0,5 M em tampão A contendo cálcio. Depois da diálise das fracções que contêm PP4, adicionou-se EDTA até se obter a concentração final de 0,001 M e faz-se contactar o dialisado com 200 ml de uma heparina-RSepharose equilibrada em tampão A com EDTA 0,001 M, agitou-se durante sessenta minutos à temperatura ambiente e separou-se a solução sobrenadante que contém PP4. Eventualmente, fez-se ainda contactar a solução que contém PP4 com uma DEAE-RSepharose e eluiu-se a proteína por meio de um gradiente linear de NaCl. A PP4 purificada desta maneira apareceu na electroforese em gel de poliacrilamida contendo SDS (PAGE) como uma banda com uma massa molecular igual a 33 KDa. A PP4 não apresenta reacções cruzadas com anticorpos policlonais contra cinco outras anexinas.

A actividade anticoagulatoria de PP4 foi ensaiadapor intermédio de um ensaio de tempo de tromboplasti-na modificado: Misturaram-se 50 microlitros de plasma com citrato (plasma humana normal) com 150 microlitros de uma solução de Tris/HCl 0,05 M, pH 7,5, NaCl 0,15 M, assim como com 25 microlitros de tampão ou uma amostra e 25 microlitros de trombo plastina isenta de cálculo. Incubou-se esta mistura durante três minutos a 372 c. Iniciou-se a coagulação por adição de 25 microlitros de uma solução 0,02 molar de CaCl2· Determinou--se o tempo de coagulação por meio de um coagulómetro de acordo com o corte e o tamanho. Obteve-se uma recta de calibração, por meio da qualse determinou a PP4 purificada da placenta como se descreveu acima.

Exemplo 2

Purificação de PP4 de Placenta Humana por Meio de Cro-matoarafaia de Afinidade Imune.

Lavou-se placenta humana madura como se descreveu no Exemplo 1, liofilizou-se e extraiu-se com tampão de citrato. Dialisou-se este extracto contra Tris/HCl 0,02 M,pH * 7,5.Misturou-se com CaCl2 uma amostra do liquido dialisado que 8 continha 4,5 mg de PP4 (determinada com o ensaio de imunidade com enzimas descrito no Exemplo 4), misturou-se com CaCl2> (con centração final 0,02 M) e bombeou-se através de um gei de afinidade (20 mg de anticorpo monoclonal acoplado em 4 ml de CNBr-RSepharose 4B). Em seguida, lavou-se com 100 ml de TBS/cál--cio (Tris 0,02 M, NaCl 0,15 M, CaCl2 0,02 M, pH 7,4) de proteína não ligada pelo gel. Em seguida, enxaguou-se com 30 ml de TBS sem cálcio, condições em que se eluiu a PP4 de anticorpo. 0 rendimento em antigene e a actividade no ensaio de cromato-grafia de afinidade de imunidade foi igual a 92 Ou 90%. No ensaio de SDS-PAGE, a PP4 apareceu numa banda com uma massa molecular igual a 33 KDa.

Exemplo 3

Purificação de PP4 Recombinante Proveniente de E. coli por meio de Cromatoqrafia de Afinidade Imune.

Clonou-se o cADN que codifica PP4, isolado caracterizado a partir de um banco de genes de placenta humana, clonou-se e utilizou-se para a expressão em E. coli por meio do vector pTrc99A. A expressão de PP4 recombinante (r-PP4) realizou-se por fermentação da estirpe W31101acIQ de E. coli. A fermentação de E. coli realizou-se procedendo de acordo com a maneira de proceder conhecida pelos peritos. Depois de terminada a fermentação, recolheram-se as células por centrifuga-çãoj ressuspendeu-se o pelete em Tris/HCl 0,02 M, pH 7,5 e EDTA 0,01 M e lisaram-se as células por meio de uma "French Press". Eliminaram-se os fragmentos de ruptura das células por centrifugação e purificou-se o líquido sobrenadante por filtração através de um filtro de 0,45 micrômetro. Misturou-se a solução que continha r-PP4 com Triton(R) X-100 e dialisou-se contra um tampão de Tris/HCl 0,02 M, pH 7,5.. A uma amostra do dialisado que continha 3,8 mg de PP4 (determinada de acordo com o ensaio de imunidade de enzimas descrito no Exemplo 4), adicionou-se CaCl2 (concentração final 0,02 M), centrifugou--se o precipitado assim obtido e purificou-se o sobrenadante como se descreveu no Exemplo 3, por cromatografia de afinidade. 0 rendimento em antigen0 PP4 e a actividade (determinada - 9 -

de com o ensaio de imunidade com enzimas descrito no Exemplo 4 ou com o ensaio de actividade descrito no Exemplo 1) foram iguais a 94 e 93% respectivamente. A proteína em gel SDS demonstrou ser homogénea, com um peso molecular igual a 33 KDa.

Exemplo 4 ELISA em Sanduíche para a Quantificação de Antigenes de PP4

Para a quantificação de PP4 em líquidos biológicos, desenvolveu-se um ensaio ELISA em sanduíche.

Revestiram-se placas de microtitulação com anticorpos policlonais contra PP4 ( 1 a 20 microgramas/mi-lilitro). A amostra que contém PP4 (por exemplo, extracto de tecido da placenta, lisatos de E. coli ou plasma) foi incubada na placa revestida com anticorpos. Em seguida, incubou-se com um anticorpo monoclonal biotinizado (2 microgramas/milili-tro), seguido por um complexo de avidina e de peroxidase bio-tinizada. A realização do ensaio de imunidade com enzima e a detecção de actividade de peroxidase realizaram-se como se descreveu em "Ensaio sobre PP4-Anticorpos". Obteve-se uma rec-ta de calibração por meio da PP4 purificada de placenta de acordo com o Exemplo 1. Foi possível determinar PP4 numa gama de concentração entre 125 ng/ml e 2 ng/ml (Tabela 1). TABELA 1

Concentração de PP4 (ng/ml) Absorção a 125 1,601 62,5 1,393 31,25 1,067 15,63 0,812 7,82 0,597 3,91 0,298 1,96 0,076 10

Claims (1)

1. REIVINDICAÇÕES - 1» - Processo para a preparação de anticorpos monoclonais contra proteína da placenta 4 (PP4), caracterizado por se injectar proteína da placenta 4 (pp4) num animal mamífero, se recuperarem linfócitos de um orgão linfático deste animal, se fundirem estes com uma linha de células de mieloma, se cultivarem os hibridomas formados, se ensaiarem os sobrena-dantes das células relativamente à presença de anticorpos que reagem com PP4, se clonarem os hibridomas, se cultivarem os clones assim obtidos e se recuperarem das culturas anticorpos monoclonais contra PP4. - 2â - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se obter um anticorpo monoclonal que se liga a PP4 apenas em presença de iões de metais bivalentes. - 3» - Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por se obter um anticorpo monoclonal que se liga a PP4 apenas em presença de iões cálcio, - 4B - Processo para a purificação de PP4, carac terizado por se ligar um anticorpo monoclonal contra PP4 a um material insolúvel apropriado para um processo de purificação por cromatografia, se adsorver ao anticorpo assim ligado PP4 a partir de uma solução e se eluir a PP4. - 5â - 11 Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo facto de o anticorpo monoclonal ser um anticorpo a que a PP4 só se liga em presença de iões metálicos bivalentes e se eluir a PP4 com uma solução que não contém esses iões metálicos ou os contém sob a forma complexada. A requerente reivindica a prioridade do pedido alemãor apresentado em 18 de Abril de 1990, sob o ns P 4012 341.3.

   Lisboa, 17 de Abril de 1991

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