JPS60243027A - 抗体 - Google Patents
抗体Info
- Publication number
- JPS60243027A JPS60243027A JP9937484A JP9937484A JPS60243027A JP S60243027 A JPS60243027 A JP S60243027A JP 9937484 A JP9937484 A JP 9937484A JP 9937484 A JP9937484 A JP 9937484A JP S60243027 A JPS60243027 A JP S60243027A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- antibody
- protein
- erb
- peptide
- arg
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔発明の目的〕
産業上の利用分野
この発明は抗体に関し、更に詳しくは、発癌に関与して
いるといわれているｅｒｂ Ｂ遺伝子の産物に対する抗
体に関する。このような抗体は、癌の診断薬として使用
できる。
いるといわれているｅｒｂ Ｂ遺伝子の産物に対する抗
体に関する。このような抗体は、癌の診断薬として使用
できる。
従来の技術
ｅｒｂ Ｂ遺伝子は、ニワトリの急性白血病ウィルスの
一種トリ赤芽球症つィルスＨ株よ砂分離されたものであ
シ、（Ｔ、 Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ 、 Ｃｅ
１ｌ ＋ ３５ 、７１（１９８３）、その産物はトリ
赤芽球症細胞中に存在し、ｅｒｂ Ｂ遺伝子は、正常な
線維芽細胞を癌化させ肉腫をひきおこすことが最近間ら
かになった。
一種トリ赤芽球症つィルスＨ株よ砂分離されたものであ
シ、（Ｔ、 Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ 、 Ｃｅ
１ｌ ＋ ３５ 、７１（１９８３）、その産物はトリ
赤芽球症細胞中に存在し、ｅｒｂ Ｂ遺伝子は、正常な
線維芽細胞を癌化させ肉腫をひきおこすことが最近間ら
かになった。
又、この遺伝子産物である蛋白（以下ｒｅｒｂ Ｂ蛋白
」と記す）が、ヒトの上皮増殖因子リセプターの産物で
あシ細胞増殖を引き起こす蛋白と極めて類似しているこ
とが最近わかった（Ｊ、 Ｄｏｗｎｗａｒｄ ｅｔ ａ
ｌ ＋Ｎａｔｕｒｅ 、３０７．５２１（１９８４）ｏ
従ってｅｒｂ Ｂ遺伝子は、ヒトにおいても、発癌と密
接に関与していると考えられる。
」と記す）が、ヒトの上皮増殖因子リセプターの産物で
あシ細胞増殖を引き起こす蛋白と極めて類似しているこ
とが最近わかった（Ｊ、 Ｄｏｗｎｗａｒｄ ｅｔ ａ
ｌ ＋Ｎａｔｕｒｅ 、３０７．５２１（１９８４）ｏ
従ってｅｒｂ Ｂ遺伝子は、ヒトにおいても、発癌と密
接に関与していると考えられる。
このよりなｅｒｂ Ｂ蛋白に対する抗体は、従って、ヒ
トの癌の診断に使用できる。しかるに今迄、ｅｒｂＢ蛋
白に対する特異的な抗体のみならず、ｏｒｂ Ｂ蛋白自
体も分離されていない。
トの癌の診断に使用できる。しかるに今迄、ｅｒｂＢ蛋
白に対する特異的な抗体のみならず、ｏｒｂ Ｂ蛋白自
体も分離されていない。
発明が解決しようとする問題点
この発明の目的は従って、ｅｒｂＢ蛋白に対する抗体を
得ることにある、ｅｒｂ Ｂ蛋白に対する抗体は癌の診
断薬として使用できる。
得ることにある、ｅｒｂ Ｂ蛋白に対する抗体は癌の診
断薬として使用できる。
問題点を解決するだめの手段
このような状況下において、本発明者らは、下記のペプ
チド（以下「抗原〈プチド」と記す）を抗原としてｅｒ
ｂ Ｂ蛋白に対する抗体を得ることに成功した。
チド（以下「抗原〈プチド」と記す）を抗原としてｅｒ
ｂ Ｂ蛋白に対する抗体を得ることに成功した。
抗原ペプチドニ
Ａｓ ｐ−Ａｔａ−Ａ８ｐ−８ｓ ｒ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ
−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ａｒ ｇ−Ｇｔｕ−Ｌｅ ｕ抗原ペ
プチドを用いて抗血清を得るには、抗原ペプチドと適当
なキャリアー蛋白と結合せしめて後、抗原として用いる
＠ キャリヤー蛋白としては、キーホールリンペットヘモシ
アニン（ＫＩＬＨ） 、ウシ血清アルブミン等、従来知
られているもののいずれも使用できる。キャリヤー蛋白
と抗原ペプチドとを結合せしめる方法も、又、グルタル
アルデヒドを用いる方法（Ｇ。
−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ａｒ ｇ−Ｇｔｕ−Ｌｅ ｕ抗原ペ
プチドを用いて抗血清を得るには、抗原ペプチドと適当
なキャリアー蛋白と結合せしめて後、抗原として用いる
＠ キャリヤー蛋白としては、キーホールリンペットヘモシ
アニン（ＫＩＬＨ） 、ウシ血清アルブミン等、従来知
られているもののいずれも使用できる。キャリヤー蛋白
と抗原ペプチドとを結合せしめる方法も、又、グルタル
アルデヒドを用いる方法（Ｇ。
Ｗａｌｔｅｒ ｓｔ ａｌ、 Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＋ ７７＊５１９７（１９８
０））及び水溶性カルボジイミドを用いる方法（Ｗ、Ｇ
： Ｂｏｙｌｅ ａｔ ａｌ 、 Ｐｒｏｅ、 Ｎａｔ
ｌ 、Ａｃａｄ、 Ｓｅｉ、＋ ８０ ＋２８３４（１
９８３））サイシニイミドを用いる方法（Ｔ、 Ｋｉｔ
ａｇａｗａ ａｔ ａｌ 、 Ｊ、 Ｂｉｏｃｈａｍ、
７９ 、２３３（１９７６））等通常の方法を用いて
も特に支障はない。
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＋ ７７＊５１９７（１９８
０））及び水溶性カルボジイミドを用いる方法（Ｗ、Ｇ
： Ｂｏｙｌｅ ａｔ ａｌ 、 Ｐｒｏｅ、 Ｎａｔ
ｌ 、Ａｃａｄ、 Ｓｅｉ、＋ ８０ ＋２８３４（１
９８３））サイシニイミドを用いる方法（Ｔ、 Ｋｉｔ
ａｇａｗａ ａｔ ａｌ 、 Ｊ、 Ｂｉｏｃｈａｍ、
７９ 、２３３（１９７６））等通常の方法を用いて
も特に支障はない。
キャリヤー蛋白と抗原ペプチドとの結合物を用いて、マ
ウス、ウサギ、ラット、ヒツジ等の動物を免疫する。免
疫方法も又通常の方法でよい。
ウス、ウサギ、ラット、ヒツジ等の動物を免疫する。免
疫方法も又通常の方法でよい。
得られた抗血清よυ本発明の抗体を得る方法も従来知ら
れているいずれの方法も採用できる。具体的には、例え
ば、採血後、抗血清を作成する、ｅｒｂ Ｂ遺伝子が発
現している細胞例えば（ＡＥＶ−Ｋ トランスフオーム
３Ｙ１）を”” Ｓ−Ｍｅ ｔ、でラベルした後、細胞
を可溶化し、採取した抗血清で免疫沈降を行なう。沈降
した物質を５ＤＳ−電気泳動で解析し、分子量５７００
０のｅｒｂ Ｂ蛋白が検出できるか否で、ｅｒｂ Ｂに
対する抗体があるか否かが判定できる。
れているいずれの方法も採用できる。具体的には、例え
ば、採血後、抗血清を作成する、ｅｒｂ Ｂ遺伝子が発
現している細胞例えば（ＡＥＶ−Ｋ トランスフオーム
３Ｙ１）を”” Ｓ−Ｍｅ ｔ、でラベルした後、細胞
を可溶化し、採取した抗血清で免疫沈降を行なう。沈降
した物質を５ＤＳ−電気泳動で解析し、分子量５７００
０のｅｒｂ Ｂ蛋白が検出できるか否で、ｅｒｂ Ｂに
対する抗体があるか否かが判定できる。
あるいは上記のように免疫した動物のリンｉ４球とミエ
ローマとを融合させ、本発明の抗体を特異的に産生ずる
ハイブリドーマを得、これによってモノクローナル抗体
として、本発明の抗体を得ることもできる。
ローマとを融合させ、本発明の抗体を特異的に産生ずる
ハイブリドーマを得、これによってモノクローナル抗体
として、本発明の抗体を得ることもできる。
このようにして得られた免疫グロブリンは、以下のよう
な性質を有するものである。
な性質を有するものである。
１）免疫グロブリンの種類： ＩｇＧ
２）分子量 ： １５０Ｘ１０ ｄａｌｔｏｎ３）分子
吸光係数 ： Ｅ ” ’ ２８０ ｎｍ ＝ １４．
０ｃｒｎ ４）得られた抗体は、ｅｒｂ Ｂ蛋白及びＥＧＦレセグ
ター蛋白と特異的に反応する。
吸光係数 ： Ｅ ” ’ ２８０ ｎｍ ＝ １４．
０ｃｒｎ ４）得られた抗体は、ｅｒｂ Ｂ蛋白及びＥＧＦレセグ
ター蛋白と特異的に反応する。
作用
本発明の抗体は癌の診断薬として使用できるほか、癌の
治療薬として使用できる可能性がある。
治療薬として使用できる可能性がある。
実施例
（１）抗原蛋白の調製
抗原性が高いペプチドのは、ｅｒｂ Ｂ遺伝子構造から
、Ａｓ ｐ−ＡＬａ −Ａｓ ｐ−８ｏ ｒ −Ａｒ
ｇ−Ｐｒ ｏ−Ｌｙ ｓ −Ｐｈｅ −Ａｒｇ−Ｇｔｕ
−Ｌｅ ｕとした。本ペプチドの合成はベックマン社
９９０Ｂ自動ベゾチド合成装置を用い固相法で行なった
。
、Ａｓ ｐ−ＡＬａ −Ａｓ ｐ−８ｏ ｒ −Ａｒ
ｇ−Ｐｒ ｏ−Ｌｙ ｓ −Ｐｈｅ −Ａｒｇ−Ｇｔｕ
−Ｌｅ ｕとした。本ペプチドの合成はベックマン社
９９０Ｂ自動ベゾチド合成装置を用い固相法で行なった
。
合成されたペプチドを、７５％フッ化水素／ｓｐ−セフ
ァデックスカラム（２，５Ｘ５０ｍ） （０，０５Ｍ酢
酸アンモニウム、ｐＨ７，０及び１ｍＭジチオスライト
ールで平衡化）に吸着させた。５００ｒｎｌの同緩衝液
と、０．５Ｍ酢酸アンモニウム及び１ ｍＭジチオスラ
イトールｐＨ７，０，５００ｍＪのグラジェントで目的
のペプチドを分画精製した。各画分をフルオロレスカミ
ンでペプチドを検出し、ペプチド含有画分を集め、濃縮
した。３０％酢酸で平衡化したセファデックスＧ−１０
カラム（１０ＣｒｎＸ５０α）に上記濃縮液を加え蛋白
画分を集めた。得られたペプチド画分を濃縮乾固した。
ァデックスカラム（２，５Ｘ５０ｍ） （０，０５Ｍ酢
酸アンモニウム、ｐＨ７，０及び１ｍＭジチオスライト
ールで平衡化）に吸着させた。５００ｒｎｌの同緩衝液
と、０．５Ｍ酢酸アンモニウム及び１ ｍＭジチオスラ
イトールｐＨ７，０，５００ｍＪのグラジェントで目的
のペプチドを分画精製した。各画分をフルオロレスカミ
ンでペプチドを検出し、ペプチド含有画分を集め、濃縮
した。３０％酢酸で平衡化したセファデックスＧ−１０
カラム（１０ＣｒｎＸ５０α）に上記濃縮液を加え蛋白
画分を集めた。得られたペプチド画分を濃縮乾固した。
ペプチドの構成アミノ酸組成は、ペプチドをＩＮ塩酸で
１２０℃１晩の加水分解によシ調べた。加水分解物はア
ミノ酸アナライザーを用いて測定した。
１２０℃１晩の加水分解によシ調べた。加水分解物はア
ミノ酸アナライザーを用いて測定した。
ペプチドのアミノ酸組成は以下の通シであった。
Ａｓｐ １．９ ； Ａｒｇ １．９ ： Ａム１．０
； ＧＬｕ １．０ ； Ｌｅｕ １．０ ：ＬｙＢ
ｌ、１ ：Ｐｈｅ Ｏ，９；Ｐｒｏ １．０ ：Ｓｅｒ
Ｏ，９：Ｃｙｓ １．０゜このペプチドにキャリヤー
蛋白を以下のように付加させた。１０ ｎ＆Ａｌｌ （
１０ｍＭ ＩＪン酸バッファーｐＨ７，０）にとかした
キーホールリンペットヘモシアニンと６３μｌの１５４
傳ｍ−マレイミドーＮ−ハイドロキシサクシミドエステ
ルとを混合し、３０分間室温に保持反応した。反応液を
４℃で、０．１Ｍ燐酸バッファー（ｐＩ′１６．０）で
平衡化した［セファデックスＧ−２５Ｊを用いて、カラ
ムクロマトグラフィを行った。２．３−の活性化したキ
ーホールリンペットヘモシアニンと０．１ｄの合成した
当該ペグチド（１０ｒｖＡｒＬｌにリン酸ハｙ ７７
＋ ｐ’ ７．３ ＋ ５ ｍＭ ＥＤＴＡ）を混合し
、−を６．５にあわせ混合した。４時間室温で混合し、
キーホールリンＪ 、 トヘモシアニンと合成した当該
ペプチドを結合させた。結合したかいなかを５ＤＳ−電
気泳動によシ確認した。
； ＧＬｕ １．０ ； Ｌｅｕ １．０ ：ＬｙＢ
ｌ、１ ：Ｐｈｅ Ｏ，９；Ｐｒｏ １．０ ：Ｓｅｒ
Ｏ，９：Ｃｙｓ １．０゜このペプチドにキャリヤー
蛋白を以下のように付加させた。１０ ｎ＆Ａｌｌ （
１０ｍＭ ＩＪン酸バッファーｐＨ７，０）にとかした
キーホールリンペットヘモシアニンと６３μｌの１５４
傳ｍ−マレイミドーＮ−ハイドロキシサクシミドエステ
ルとを混合し、３０分間室温に保持反応した。反応液を
４℃で、０．１Ｍ燐酸バッファー（ｐＩ′１６．０）で
平衡化した［セファデックスＧ−２５Ｊを用いて、カラ
ムクロマトグラフィを行った。２．３−の活性化したキ
ーホールリンペットヘモシアニンと０．１ｄの合成した
当該ペグチド（１０ｒｖＡｒＬｌにリン酸ハｙ ７７
＋ ｐ’ ７．３ ＋ ５ ｍＭ ＥＤＴＡ）を混合し
、−を６．５にあわせ混合した。４時間室温で混合し、
キーホールリンＪ 、 トヘモシアニンと合成した当該
ペプチドを結合させた。結合したかいなかを５ＤＳ−電
気泳動によシ確認した。
（２）抗体の調製
得られたキャリアーとペプチド結合物２００μｇをフロ
イントの完全アジュバントと共にウサギの指掌部に注射
した。以後７〜１０日間隔で２００μｇづつ４回つサギ
背皮下に免疫した。最終免疫の後１０日目上採血し血清
を得た。血清を遠心（１００００Ｘｇ、５分）した上清
に飽和硫安溶液（ＰＨ７，４）を加えて４０％飽和とし
た。−晩水冷下で攪拌した後、１ｏｏｏｏｘ、ｙにて５
分間遠心し、沈殿物を得た。沈殿物を蒸留水に溶かし、
２００倍量の０．１５Ｍ ＮａＣ６に対し、３６時間透
析した。得られた抗血清２１ｎｌを１０ ｍＭリリン緩
衝液（ｐＨ７，２）で平衡化し７’ｃ ＤＥＡＥ−セル
ロース（ワットマンＤＥ３２）カラム（ＩＸ１５ｃｍ）
に添加した。免疫グロブリンＩｇＧ画分は素通シして溶
出されるので、この両分を回収した。２Ｔｎｌの抗血清
から２４ｍｇのＩｇＧが得られた。集めたＩｇＧを０．
１Ｍ炭酸す） ＩＪウム緩衝液（ｐｉ−１９，０）に透
析した。
イントの完全アジュバントと共にウサギの指掌部に注射
した。以後７〜１０日間隔で２００μｇづつ４回つサギ
背皮下に免疫した。最終免疫の後１０日目上採血し血清
を得た。血清を遠心（１００００Ｘｇ、５分）した上清
に飽和硫安溶液（ＰＨ７，４）を加えて４０％飽和とし
た。−晩水冷下で攪拌した後、１ｏｏｏｏｘ、ｙにて５
分間遠心し、沈殿物を得た。沈殿物を蒸留水に溶かし、
２００倍量の０．１５Ｍ ＮａＣ６に対し、３６時間透
析した。得られた抗血清２１ｎｌを１０ ｍＭリリン緩
衝液（ｐＨ７，２）で平衡化し７’ｃ ＤＥＡＥ−セル
ロース（ワットマンＤＥ３２）カラム（ＩＸ１５ｃｍ）
に添加した。免疫グロブリンＩｇＧ画分は素通シして溶
出されるので、この両分を回収した。２Ｔｎｌの抗血清
から２４ｍｇのＩｇＧが得られた。集めたＩｇＧを０．
１Ｍ炭酸す） ＩＪウム緩衝液（ｐｉ−１９，０）に透
析した。
次にキャリヤー蛋白に用いたキーホールランベットヘモ
シアニンに対する抗体を除去するため、キャリヤー蛋白
−結合セファロース４Ｂカラムを用いてキャリヤー蛋白
抗体を結合させた。すなわチ、ＣＮＢｒ −活性化セフ
ァロース４Ｂ（ファルマシア製１７−０４３１−０１）
０．５＆を０．１Ｍ炭酸緩衝液（ＰＨ９，０）５ｍｌに
投入し、ただちに、キーホールラン４ツトヘモシアニン
２５■を加え、氷冷しながら２４時間攪拌した。このよ
うにしてできたキャリヤー蛋白結合セファロース４Ｂを
０．５ｍ×２０ｍのカラムにつめ、このカラムにＩｇＧ
画分２ｄをのせた。洗浄用緩衝液（０，１５Ｍ ＮａＣ
ｔ７０．０２Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液、 ＰＨｓ、ｏ
）で洗浄し、未結合のまま溶出した蛋白をすべて集めた
、得られたＩｇＧはさらにペプチドを結合させたセファ
ロース４Ｂカラムで精製した。ペグチド結合七ファロー
ス４Ｂカラムの作成方法は前述の通り、このペグチド結
合セファロース４Ｂカラム（０，５の×２０ｃｒｎ）に
上記で得られたＩｇＧ画分をのせ、洗浄用緩衝液（０，
１５Ｍ ＮａＣｔｌｏ、０２Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液、
ｐＨ８，０）で十分洗浄し、０．１７Ｍグリシン−塩
酸緩衝液（ｐＨ２，３）でカラムに吸着した抗ペプチド
抗体を溶出させた。集めた溶出液を０．１５ＭＮａＣｔ
に対して透析し、限外濾過で濃縮した。このようにして
２．５ｍｙＡｒＬｌのＩｇＧ’溶液０、５１ｒＬｌを得
た。
シアニンに対する抗体を除去するため、キャリヤー蛋白
−結合セファロース４Ｂカラムを用いてキャリヤー蛋白
抗体を結合させた。すなわチ、ＣＮＢｒ −活性化セフ
ァロース４Ｂ（ファルマシア製１７−０４３１−０１）
０．５＆を０．１Ｍ炭酸緩衝液（ＰＨ９，０）５ｍｌに
投入し、ただちに、キーホールラン４ツトヘモシアニン
２５■を加え、氷冷しながら２４時間攪拌した。このよ
うにしてできたキャリヤー蛋白結合セファロース４Ｂを
０．５ｍ×２０ｍのカラムにつめ、このカラムにＩｇＧ
画分２ｄをのせた。洗浄用緩衝液（０，１５Ｍ ＮａＣ
ｔ７０．０２Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液、 ＰＨｓ、ｏ
）で洗浄し、未結合のまま溶出した蛋白をすべて集めた
、得られたＩｇＧはさらにペプチドを結合させたセファ
ロース４Ｂカラムで精製した。ペグチド結合七ファロー
ス４Ｂカラムの作成方法は前述の通り、このペグチド結
合セファロース４Ｂカラム（０，５の×２０ｃｒｎ）に
上記で得られたＩｇＧ画分をのせ、洗浄用緩衝液（０，
１５Ｍ ＮａＣｔｌｏ、０２Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液、
ｐＨ８，０）で十分洗浄し、０．１７Ｍグリシン−塩
酸緩衝液（ｐＨ２，３）でカラムに吸着した抗ペプチド
抗体を溶出させた。集めた溶出液を０．１５ＭＮａＣｔ
に対して透析し、限外濾過で濃縮した。このようにして
２．５ｍｙＡｒＬｌのＩｇＧ’溶液０、５１ｒＬｌを得
た。
（３） ｅｒｂ Ｂ蛋白抗体の性質
（３）−１ＩｇＧであることの証明
精製しだｅｒｂ Ｂ蛋白抗体がＩｇＧクラスであること
は、抗体のクラス別に作成された抗Ｉｇ抗体で免疫沈降
するかどうかで判定できる、すなわち抗つサギＩｇＧ抗
体（カッペル社製ＡＯ２１２０１２４）、抗’＞？＝１
’ＩｇＭ抗体（カッペル社製Ａ０２１２−０２１０）、
抗つｆ キＩｇＡ＋ＩｇＭ＋ＩｇＧ抗体（カッペル社製
ＡＯ２１２−０２３４）を用いて免疫沈降した。方法は
オフタロニー法を用いた。すなわち、１チの寒天中にあ
けた穴の中心に抗つサギＩｇ抗体３種を入れ、まわシの
穴には抗体に対して１／２０量から２倍づつ希釈した精
製ｅｒｂ Ｂ蛋白抗体を入れる。０℃で１晩放置後形成
された沈降線を観察した所、精製ｅｒｂ Ｂ蛋白抗体は
抗つサギＩｇＧ抗体及び抗ウサギＩｇＡ＋Ｉ ｇＭ＋
Ｉ ｇＱ抗体とのみ沈降したことからＩｇＧであると確
認できた。
は、抗体のクラス別に作成された抗Ｉｇ抗体で免疫沈降
するかどうかで判定できる、すなわち抗つサギＩｇＧ抗
体（カッペル社製ＡＯ２１２０１２４）、抗’＞？＝１
’ＩｇＭ抗体（カッペル社製Ａ０２１２−０２１０）、
抗つｆ キＩｇＡ＋ＩｇＭ＋ＩｇＧ抗体（カッペル社製
ＡＯ２１２−０２３４）を用いて免疫沈降した。方法は
オフタロニー法を用いた。すなわち、１チの寒天中にあ
けた穴の中心に抗つサギＩｇ抗体３種を入れ、まわシの
穴には抗体に対して１／２０量から２倍づつ希釈した精
製ｅｒｂ Ｂ蛋白抗体を入れる。０℃で１晩放置後形成
された沈降線を観察した所、精製ｅｒｂ Ｂ蛋白抗体は
抗つサギＩｇＧ抗体及び抗ウサギＩｇＡ＋Ｉ ｇＭ＋
Ｉ ｇＱ抗体とのみ沈降したことからＩｇＧであると確
認できた。
（３）−２分子量
精製したｅｒｂ Ｂ蛋白抗体の分子量はセファデックス
Ｇ−１００を用いるゲル濾過法によ請求めた。
Ｇ−１００を用いるゲル濾過法によ請求めた。
すなわち０．０２Ｍ炭酸す） ＩＪウム緩衝液で平衡化
させたセファデックスＧ−１００（１ｃｍＸ１００ｃｒ
ｎ）カラムに１■の精製ｅｒｂ Ｂ蛋白抗体をのせ、同
緩衝液で展開した。２８０ｎｍの吸光度で溶出蛋白を検
出し、分子量測定スタンダード（バイオラッド社製屋１
５１−１９０１ 、チログロブリン分子量６７００００
。
させたセファデックスＧ−１００（１ｃｍＸ１００ｃｒ
ｎ）カラムに１■の精製ｅｒｂ Ｂ蛋白抗体をのせ、同
緩衝液で展開した。２８０ｎｍの吸光度で溶出蛋白を検
出し、分子量測定スタンダード（バイオラッド社製屋１
５１−１９０１ 、チログロブリン分子量６７００００
。
γ−グロブリン１５８０００ 、卵白アルブミン４４０
００ 、 ′ミオグロビン１７０００．ビタミｙＢ−１
２１３５０） の溶出パターンと比較した成分子ｉ １
５００００の所にｅｒｂ Ｂ蛋白抗体が溶出した。
００ 、 ′ミオグロビン１７０００．ビタミｙＢ−１
２１３５０） の溶出パターンと比較した成分子ｉ １
５００００の所にｅｒｂ Ｂ蛋白抗体が溶出した。
（３）−３分子吸光係数
１■の精製ｅｒｂ Ｂ蛋白抗体を炭酸ナトリウム緩漬液
（ｐＨ９，０） １ ｄに溶解し、２８０ ｎｍの吸光
度を測定した所、１．４０を示したので、本蛋白の分子
吸光係数Ｅ１％−１４，０である。
（ｐＨ９，０） １ ｄに溶解し、２８０ ｎｍの吸光
度を測定した所、１．４０を示したので、本蛋白の分子
吸光係数Ｅ１％−１４，０である。
ｃｒｎ
（３）−４抗体の免疫特異性
ｅｒｂ Ｂの発現しているニワ） ＩＪ胎児線維芽細胞
（ＡＥＶ −ＣＥＦ細胞）及びその親である正常細胞（
ｏｒｂ Ｂは発現していない）（ＣＥＦ）を１００μｃ
ｉＳの５５Ｓ−メチオニンでラベルするラベルされた細
胞を洗浄した後、ＲＩＰＡ緩衝液（１％ＮＰ−４０、０
，１チデオキシコール酸−Ｎａ塩、 ０．１５Ｍ Ｎａ
Ｃｔ、 １ ｍＭフェニルエチルスルフォニールフルオ
ライｌ’ 、 ５０ｍＭＴｒｉｓ −ＨＣｔｐＨ７，４
）に懸濁し、０℃にて２０分溶解させた。溶出液をｉ
ｏ ｏ、ｏ ｏ ｏ ｘ 、ｙにて３０分間遠心後、上
澄液を得た。この上澄液１５０μノと前に得られた抗体
１０μノを１時間Ｏ℃反応させた、抗原−抗体複合体ハ
フロティンＡセファロースＣＬ−４Ｂ（ファルヌシア製
１７−０７８０−０１）であつめた。抗原−抗体複合体
沈殿物をＬａｅｒｒｉｍｌｉの方法に従がい１０チＳＤ
Ｓ −ｇｅｌにて電気泳動した。得られたゲルを常法に
従ってラジオオートグラフィーによシ分析した。
（ＡＥＶ −ＣＥＦ細胞）及びその親である正常細胞（
ｏｒｂ Ｂは発現していない）（ＣＥＦ）を１００μｃ
ｉＳの５５Ｓ−メチオニンでラベルするラベルされた細
胞を洗浄した後、ＲＩＰＡ緩衝液（１％ＮＰ−４０、０
，１チデオキシコール酸−Ｎａ塩、 ０．１５Ｍ Ｎａ
Ｃｔ、 １ ｍＭフェニルエチルスルフォニールフルオ
ライｌ’ 、 ５０ｍＭＴｒｉｓ −ＨＣｔｐＨ７，４
）に懸濁し、０℃にて２０分溶解させた。溶出液をｉ
ｏ ｏ、ｏ ｏ ｏ ｘ 、ｙにて３０分間遠心後、上
澄液を得た。この上澄液１５０μノと前に得られた抗体
１０μノを１時間Ｏ℃反応させた、抗原−抗体複合体ハ
フロティンＡセファロースＣＬ−４Ｂ（ファルヌシア製
１７−０７８０−０１）であつめた。抗原−抗体複合体
沈殿物をＬａｅｒｒｉｍｌｉの方法に従がい１０チＳＤ
Ｓ −ｇｅｌにて電気泳動した。得られたゲルを常法に
従ってラジオオートグラフィーによシ分析した。
表１よシ明かなよう、に、抗ｅｒｈ Ｂ蛋白血清はｅｒ
ｂＢの発現している細胞から分子量６８０００及び６６
０００の蛋白を沈降した。ｅｒｂ Ｂの発現していない
正常細胞ではこの蛋白は沈降しない。またｅｒｂ Ｂ発
現細胞に抗ｅｒｂＢ蛋白抗体とｅｒｂ Ｂ蛋白を共存さ
せると６８０００と６６０００の蛋白が沈降しないこと
がわかった。したがってｅｒｂ Ｂ蛋白抗体はｅｒｂ
Ｂの産物を認識していることが明らかである。
ｂＢの発現している細胞から分子量６８０００及び６６
０００の蛋白を沈降した。ｅｒｂ Ｂの発現していない
正常細胞ではこの蛋白は沈降しない。またｅｒｂ Ｂ発
現細胞に抗ｅｒｂＢ蛋白抗体とｅｒｂ Ｂ蛋白を共存さ
せると６８０００と６６０００の蛋白が沈降しないこと
がわかった。したがってｅｒｂ Ｂ蛋白抗体はｅｒｂ
Ｂの産物を認識していることが明らかである。
表１． ＡＥＶ−ＣＥＦ及びその正常細胞の抗ｅｒｂ
Ｂ抗体による免疫沈降 抗ｅｒｂＢ蛋白抗体 ４，５万蛋白 ４５万蛋白６．８
万蛋白（３）−５ヒト癌細胞増殖因子レセプターとの反
応ｅｒｂ Ｂ蛋白抗体は、ｅｒｂ Ｂ遺伝子産物を沈降
させることがわかったが、この抗体は、ｅｒｂ Ｂ遺伝
子産物のみならずヒト癌細胞の細胞増殖因子のリセゾタ
ーに対しても反応し、免疫沈降することをみい出した。
Ｂ抗体による免疫沈降 抗ｅｒｂＢ蛋白抗体 ４，５万蛋白 ４５万蛋白６．８
万蛋白（３）−５ヒト癌細胞増殖因子レセプターとの反
応ｅｒｂ Ｂ蛋白抗体は、ｅｒｂ Ｂ遺伝子産物を沈降
させることがわかったが、この抗体は、ｅｒｂ Ｂ遺伝
子産物のみならずヒト癌細胞の細胞増殖因子のリセゾタ
ーに対しても反応し、免疫沈降することをみい出した。
すなわち細胞増殖因子である上皮細胞増殖因子のりセプ
ターと反応した。この上皮細胞増殖因子は、ヒト癌細胞
に広く分布していることが知られている。したがって本
抗体は上皮細胞増殖因子を持つ癌細胞を広く検出するこ
とが可能であることのみならず癌細胞増殖因子の作用を
抑制することによシ癌細胞増殖を阻害し、したがって制
癌剤として有効である。次に上皮細胞増殖因子のりセゾ
ターを免疫沈降する実験例を示す。
ターと反応した。この上皮細胞増殖因子は、ヒト癌細胞
に広く分布していることが知られている。したがって本
抗体は上皮細胞増殖因子を持つ癌細胞を広く検出するこ
とが可能であることのみならず癌細胞増殖因子の作用を
抑制することによシ癌細胞増殖を阻害し、したがって制
癌剤として有効である。次に上皮細胞増殖因子のりセゾ
ターを免疫沈降する実験例を示す。
ヒト上皮性癌細胞Ａ４３１細胞から定法によシ細胞膜両
分を単離した。そして膜画分を０℃にて２０分間１％Ｎ
Ｐ−４０で可溶化した。１０００００ Ｘ 、９にて３
０分間遠心した後、上澄液を１μＥｌ／ｍｌの上皮細胞
増殖因子の存在下に、２０ ｍＭピにスピペラジンジエ
タンスルホン酸−ＮａＯＨ（ｐＨ７，２） 、 ４ ｍ
Ｍ ＭｎＣｌ２゜２ ｍＭ ＭｇＣ２２，及び〔γ−”
Ｐ ′３ＡＴＰ （１５μＭ。
分を単離した。そして膜画分を０℃にて２０分間１％Ｎ
Ｐ−４０で可溶化した。１０００００ Ｘ 、９にて３
０分間遠心した後、上澄液を１μＥｌ／ｍｌの上皮細胞
増殖因子の存在下に、２０ ｍＭピにスピペラジンジエ
タンスルホン酸−ＮａＯＨ（ｐＨ７，２） 、 ４ ｍ
Ｍ ＭｎＣｌ２゜２ ｍＭ ＭｇＣ２２，及び〔γ−”
Ｐ ′３ＡＴＰ （１５μＭ。
４ｍＣ１／μｍｏｌ）の条件で８分間０℃で反応した。
プロティンキナーゼ反応は１０ ｍＭ ＥＤＴＡ添加で
停止した後、抗ｅｒｂ Ｂ蛋白抗体で免疫沈降した後、
ＳＤＳ −ｓｑリアクリルアミド電気泳動及びラジオオ
ートグラフィーを行なった。ラジオオートゲ２フは表２
にしめした。この表から明らかなように、分子量１７万
の蛋白を免疫沈降する。この蛋白はリン酸化蛋白であシ
そのリン酸化はＥＧＦの添加によシ増加する、またこの
免疫沈降する蛋白は Ｉ−でラベルした上皮細胞増殖因
子と結合する。以上の結果から、この抗ｅｒｂ Ｂ抗体
で沈降するのは上皮細胞増殖因子のりセゾターであると
確認できる。
停止した後、抗ｅｒｂ Ｂ蛋白抗体で免疫沈降した後、
ＳＤＳ −ｓｑリアクリルアミド電気泳動及びラジオオ
ートグラフィーを行なった。ラジオオートゲ２フは表２
にしめした。この表から明らかなように、分子量１７万
の蛋白を免疫沈降する。この蛋白はリン酸化蛋白であシ
そのリン酸化はＥＧＦの添加によシ増加する、またこの
免疫沈降する蛋白は Ｉ−でラベルした上皮細胞増殖因
子と結合する。以上の結果から、この抗ｅｒｂ Ｂ抗体
で沈降するのは上皮細胞増殖因子のりセゾターであると
確認できる。
表２．抗ｅｒｂ Ｂ抗体によるヒト上皮性癌細胞Ａ４３
１の膜蛋白の免疫沈降 十−一 抗ｅｒｂ Ｂ蛋白抗体 −１７０ ＋ １７０ 抗ｅｒｂ Ｂ蛋白抗体 −十 − 十十一 特許出願人 味の素株式会社
１の膜蛋白の免疫沈降 十−一 抗ｅｒｂ Ｂ蛋白抗体 −１７０ ＋ １７０ 抗ｅｒｂ Ｂ蛋白抗体 −十 − 十十一 特許出願人 味の素株式会社
Claims (1)
- 下記のペプチドを抗原として得られる抗体Ａｎ ｐ −
Ａｈａ−Ａｓ ｐ−８ｅ ｒ−Ａｒｇ −Ｐｒ ｏ−Ｌ
ｙｓ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｇｔｕ−Ｌｅ ｕ
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9937484A JPS60243027A (ja) | 1984-05-17 | 1984-05-17 | 抗体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9937484A JPS60243027A (ja) | 1984-05-17 | 1984-05-17 | 抗体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60243027A true JPS60243027A (ja) | 1985-12-03 |
Family
ID=14245755
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9937484A Pending JPS60243027A (ja) | 1984-05-17 | 1984-05-17 | 抗体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS60243027A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5770195A (en) * | 1988-01-12 | 1998-06-23 | Genentech, Inc. | Monoclonal antibodies directed to the her2 receptor |
-
1984
- 1984-05-17 JP JP9937484A patent/JPS60243027A/ja active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5770195A (en) * | 1988-01-12 | 1998-06-23 | Genentech, Inc. | Monoclonal antibodies directed to the her2 receptor |
| US5772997A (en) * | 1988-01-12 | 1998-06-30 | Genentech, Inc. | Monoclonal antibodies directed to the HER2 receptor |
| US6165464A (en) * | 1988-01-12 | 2000-12-26 | Genetech, Inc. | Monoclonal antibodies directed to the HER2 receptor |
| US6387371B1 (en) | 1988-01-12 | 2002-05-14 | Genentech, Inc. | Monoclonal antibodies directed to the HER2 receptor |
| US6399063B1 (en) | 1988-01-12 | 2002-06-04 | Genentech, Inc. | Monoclonal antibodies directed to the HER2 receptor |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU600439B2 (en) | Ras oncogene peptides and antibodies | |
| JPH03500005A (ja) | 組換えｄｎａタンパクの製造方法 | |
| JPH0669390B2 (ja) | ヒト−レニンに対するモノクロ−ナル抗体及びその使用 | |
| US4957859A (en) | Antibodies for transforming ras protein | |
| JPH076982B2 (ja) | 抗 体 | |
| JPH04504664A (ja) | 化学反応速度を増進する自己抗体 | |
| EP0245520A1 (en) | Monoclonal antibody against glutathione s-transferase and its use in the diagnosis of cancer | |
| EP0418590A1 (en) | Antibodies, production thereof and use | |
| EP0042428A1 (en) | Purified human prostate antigen | |
| JPS60243027A (ja) | 抗体 | |
| Reiss et al. | Monoclonal antibodies to renal brush border membrane maltase: age-associated antigenic alterations. | |
| JP2955082B2 (ja) | ヒトカルシトニンのｎ末端部分を特異的に認識するモノクローナル抗体 | |
| JP2735986B2 (ja) | 癌抑制遺伝子ｗｔの産物に対する抗体 | |
| PT97389A (pt) | Processo para a preparacao de anticorpos monoclonais contra proteina da placenta 4 (pp4) | |
| Stiehm et al. | Some immunologic properties of papain digest fragments of multiple myeloma proteins | |
| JPS61254530A (ja) | 抗体 | |
| CA2017933A1 (en) | Hanp antibody and method for immunological determination of hanp | |
| JP2873586B2 (ja) | 抗体およびこれを用いる免疫化学的測定方法 | |
| Kenigsberg et al. | Production of a bi-specific monoclonal antibody recognizing mouse kappa light chains and horseradish peroxidase: Applications in immunoassays | |
| JP3268147B2 (ja) | モノクローナル抗体 | |
| JPH0977799A (ja) | ヒト−マクロファージ遊走阻止因子（ヒト−ｍｉｆ）に対するモノクローナル抗体および該抗体を産生するハイブリドーマ | |
| JPH0794475B2 (ja) | 純粋なエリスロポエチンの製造法 | |
| JP2706667B2 (ja) | 抗 体 | |
| JP2608012B2 (ja) | 癌抑制遺伝子ｍｃｃの産物に対する抗体 | |
| JP2639684B2 (ja) | 抗ｃｐｂ▲ｉｉ▼モノクローナル抗体 |