JPH02238892A - ウイルスの感染性を阻止するヒトライノウイルス受容体タンパク質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ヒトライノウイルス（Ｈ　Ｒ　Ｖ）へ結合す
る動物細胞、とくに補乳動物細胞からのタンパク質の分
離に関する。さらに詳しくは、本発明はＨＲＶに結合す
ることができ、これにより前記ウイルスの感染性を遮断
することができる、ＨＲＶ受容体夕冫バク質の分離に関
する。この性質は、普通のかぜとして知られているより
もよく、ＨＲＶの感染の開始または広がりを阻止するた
めの基準として働くことができる。

宿主細胞を感染するためには、ウイルスは細胞に結合し
、次いで細胞に侵入して感染を開始しなくてはならない
。■９５９年以来、宿主細胞上の特異的結合部位部位（
受容体）の存在がある種のウイルスの組織向性の主要な
決定因子でありうることを示す証拠が文献に蓄積された
。［ホランド（Ｈｏｌｌａｎｄ）、Ｊ．Ｊ．およびマク
ラレン（ＭａｃＬａ　ｒｅｎ）　、Ｌ．Ｃ．　、補乳動
物細胞一ウイルスの関係（Ｔｈｅ　　ｍａｍｍａｌｉａ
ｎｃｅｌｌ−ｖｉｒｕｓ　　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉ　
ｐ）．Ｉ　Ｉ．ＨｅＬａ細胞によるポリオウイルスの吸
収、受容、および衰微（Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ，ｒｅｃ
ｅｐｔｉｏｎ．ａｎｄ　　ｅｃｌｉｐｓｅ　　ｏｆ　　
ｐｏＬｉｏｖｉｒｕｓ　　ｂｙ　　ＨｅＬａ　　ｃｅｌ
ｌｓ）、ジャーナノレ壷オブ●イクスペリメンタル・メ
ディシン（　Ｊ　．　Ｅ　ｘ　ｐ　．　Ｍ　ｅ　ｄ　．
）、１０９、４８７−５０４　（１９５９）。ホランド
（Ｈｏ　ｌ　ｌ　ａｎｄ）　、Ｊ．Ｊ．　、ヒトにおけ
るエンテロウイルスの組織向性の主要な決定因子として
の受容体の親和性（Ｒｅｃｐｔｏｒ　　ａｆｆｉｎｉｔ
ｉｅｓ　　ａｓ　　ｍａｊｏｒ　　ｄｅｔｅｒｍｉｎａ
ｎｔｓ　　ｏｆ　　ｅｎヒｅｒｏｖｉｒｕｓ　　ｔｉｓ
ｓｕｅ　　ｔｒｏｐｉｓｍｓ　　ｉｎ　　ｈｕｍａｎ　
ｓ）　、ウイルス学（Ｖｉｒｏｌ．）、１５，３　１２
−３２６　（１　９６　１）］。ピコルナウイルス、例
えば、ポリオウイルス、コクサッキーウイルス、および
ライノウイルスのうちで、宿主細胞への特異的結合性が
実証された。競合実験により、これらの受容体のあるも
のは、１つのウイルスの受容体の飽和が第２のウイルス
の結合に影響をもたないことにおいて、他のものと区別
されることが実証された。［ロンバーグーホルム（Ｌｏ
ｎｂｅ　ｒｇ−Ｈｏ　ｌｍ），Ｋ，クロウエル（Ｃｒｏ
ｗｅｌ１）、Ｒ．Ｌ．およびフィルプソン（Ｐｈｉｌｉ
ｐｓｏｎ）、Ｌ．、無関係の動物ウイルスは受容体を共
有する（Ｕｎｒｅｌａｔｅｄ　　ａｎｉｍａｌ　　ｖｉ
ｒｕｓｅｓ　　ｓｈａｒｅ　　ｒｅ（６ｐｔｏｒｓ）、
ネイチャ−（Ｎａｔｕｒｅ）、２５９、６．７９−６８
　１　（１　９７６）］。

ライノウイルスは、ピコルナウイルスの最大の族を形成
し、１１５の明確な血清型が今日までに同定されている
。ラインウイルスの大きい分画（８０％であると推定さ
れる）はヒト細胞上で共通の受容体に結合するようにお
もわれる。［エイブラハム（Ａｂｒａｈａｍ）、Ｇ．お
よびコロンノ（Ｃｏ１ｏｎｎｏ），Ｒ．Ｊ．、多くのラ
イノウイルスの血清型は同一の細胞受容体を共有する（
Ｍａｎｙ　　ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ　　ｓｅｒｏｔｙｐ
ｅｓ　　ｓｈａｒｅ　　ｔｈｅ　　ｓａｍｅ　　ｃｅｌ
ｌｕｊａｒ　　ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ウイルス学誌（Ｊ
．Ｖｉｒｏ１ｏｇＦ）、５２、３４０−３４５　（１９
８４）］。１　９　８　５年において、主要なライノウ
イルス受容体に対して向けられていると思われるモノク
ローナル抗体の分離が記載された。［コロンノ（Ｃｏｌ
ｏｎｎｏ）、Ｒ．Ｊ．カラハ（Ｃａｌｌａｈａｎ）、Ｐ
．Ｌ．およびロング（Ｌｏｎｇ）、Ｗ．Ｊ．、ヒトライ
ノウイルスの主要な群の取り付けを遮断するモノクロー
ナル抗体の分離（Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　　ｏｆ　　ａ　
　ｍｏｎｏｃ１ｏｎａｌ　　ａｎｔｉｂｏｄｙ　　ｔｈ
ａｔ　　ｂｌｏａｋｓ　　ａｔｔｃｈｍｅｎヒ　ｏｆ　
　ｔｈｅｍａｊｏｒ　　ｇｒｏｕｐ　　ｏｆ　　ｈｕｍ
ａｎ　　ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓｅ）、ウイルス学誌（Ｊ
．　Ｖｉ　ｒｏ　ｌ　ｏｇｙ）　、５７，７−１２　（
１９８６）］。それはライノウイルスの適当な血清型を
阻害し、そして放射線標識したライノウイルスの細胞へ
の結合を阻止した。このグループは引き続いて、モノク
ローナル抗体が９０．０００ダルトンの見掛けの分子量
をもつタンパク質に結合することを報告した。［トマシ
ニ（Ｔｏｍａｓｓｉｎｉ）、Ｊ．Ｅ．およびコロンノ（
Ｃｏｌｏｎｎｏ）、Ｒ−　　Ｊ．ヒトライノウイルスの
取り付けにおいて参加する受容体タンパク質の分離（Ｉ
ｓｏｌａｔｉｏｎｏｆ　　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　　ｐｒｏ
ｔａｉｎ　　ｉｎ　　　ａｔｔｃｈｍｅｎｔ　　　　ｏ
ｆ　　　　ｈｕｍａｎ　　　　ｒｈｉｎｏｖｉ　ｒｕｓ
ｅ）、ウイルス学誌（Ｊ．　Ｖｉｒｏ１ｏｇｙ）、５８
、２９０−２９５　（１９８６）］。このモノクローナ
ル抗体は霊長類を使用する臨床的実験において利用され
てきており、そしてライノウイルスの感染に対して多少
の保護を提供すると理解されている。

ライノウイルスの感染における仲介において、他のいく
つかの試みの報告が存在する。ヒトにおけるインターフ
ェロンの鼻内適用が試みられた。

［ダグラス（Ｄｕｇｌａｓ）、Ｒ．Ｍ．ら、統の設定に
おけるラインウイルスの感染に対する鼻内アルファ２−
インターフェロンの予防的効能（Ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔ
ｉｃ　　ｅｆｆｉｃａｃｙ　　ｏｆ　　ｉｎｔｒａｎａ
ｓａｌ　　ａｌｐｈ２−ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　　ａｇ
ａｉｎｓｔ　　ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ　　ｉｎｆｅｃｔ
ｉｏｎｓ　　ｉｎ　　ｔｈｅｆａｍｉｌｙ　　ｓｅｔｔ
ｉｎｇ）、Ｔｈｅ　　Ｎｅｗ　　Ｅｎｇｌａｎｄ　　Ｊ
．ｏｆ　　Ｍｅｄｄｉｃｉｎｅ）、３１４、６５−７５
　（１　９８６）］。

この場合において、感染のひどさにおける有意な減少が
見いだされたが、副作用として鼻出血が観察された。ま
た、ある数のビコルナウイルスの感染性を減少する（有
効性は血清型に依存して広く変化する）ジスオキサリル
（ｒＷＩＮＪ化合物）のいくつかの類似体が組織培養物
および動物のモデルにおいて試験された。［フ才クス（
Ｆ　ａ　ｘ）、Ｍ．Ｐ．、オット（Ｏｔ　ｔｏ）、Ｍ．
Ｊ．およびマクキンレイ（Ｍｃｋｉｎ　ｌａｙ）、Ｍ．
Ａ．、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇ．ａｎｄ　　Ｃｈｅ
ｍｏｔｈｅｒａｐｙ）、３０、１１０−１１６（１９８
６）］。これらの化合物は、多分ウイルスの脱外被のい
くつかの段階において、受容体への結合に引き統いて複
製を阻害するように思われる。

血清型ＨＲＶ１４のウイルスのカプシド内のこれらの化
合物の結合部位の原子の配位は、Ｘ線の結晶学により実
証され、そしてカプシドのプロトマー単位の各々に存在
する疎水性ポケット内に位置する。［スミス（Ｓｍｉ　
ｔ　ｈ）　、Ｔ．Ｊ．ら、脱外被を阻害する抗ウイルス
剤についてのヒトライノウイルスｌ４の取り付け部位（
Ｔｈｅ　　ｓｉｔｅ　　ｏｆ　　ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ
　　ｉｎ　　ｈｕｍａｎ　　ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ　　
１４　　ｆｏｒ　　ａｎｔｉｖｉｒａｌ　　ａｇｅｎｔ
ｓ　　ｔｈａｔ　　ｉｎｈｉｂｉｔ　　ｕｎｃｏａｔｉ
ｎｇ），サイエンス（ＳＣｉｅｎｃｅ），２３３、１２
８６−１２９３　（１　９８６）］。結合ポケットの特
定の機能は、存在するとしても、知られていないが、こ
の領域における単一のアミノ酸の交換をもつ薬物抵抗性
突然変異は高い頻度で生じ、そして生存しうる。［バジ
ャー（Ｂａｄｇｅｒ）、Ｊ．ら、ヒトライノウイルス１
４と複合したｌ系列の抗ウイルス剤の構造分析（Ｓｔｒ
ｕｃｔｕｒａｌ　　ａｎａｌｙｓｉｓ　　ｏｆ　　ａ　
　ｓｅｔｉｅｓ　　ｏｆ　　ａｎｔｉｖｉｒａｌ　　ａ
ｇｅｎｔｓ　　ｃｏｍｌｅｘｅｄ　　ｗｉｔｈ　　ｈｕ
ｍａｎ　　ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ　　１４）、ＰＮＡＳ
，３５、３３０４−３３０８　（１９８８）］。この結
果はこのような化合物が薬物として効能をもつことを疑
わしいものとする。ウサギにおける抗ペプチド抗体の産
土は、「受容体力ニオン（ｃａｎｙｏｎ）Ｊを並べる（
ｌｉｎｅ）ウイルスカプシドタンパク質のアミノ酸配列
から誘導したペプチドを使用して、報告された。［マク
クレイ（ＭｃＣｒａｙ）、Ｊ．およびウエルナ−（Ｗｅ
ｒｎｅｒ）、Ｇ．、抗ペプチド抗体により中和された異
なるライノウイルス血清型（Ｄｉｆｆｅｒｎｔ　　ｒｈ
ｉｎｏｖｉｒｕｓｓｅｒｏｔｙｐｅｓ　　ｎｅｕｔｒａ
ｌｉｚｅｄｂｙ　　ａｎｔｉｐｅｐｔｉｄｅ　　ａｎｔ
ｉｂｏｄｉｅｓ）、ネイチャ−　（Ｎａ　ｔ　ｕ．ｒ　
ｅ）、３２９、７３６−７３８　（１９８７）］。これ
らの血清型の力価は非常に低いが、ライノウイルスの感
染からの組織培養物の交差血清型の保護は実証され、ワ
クチンの可能性を発生させた。

本発明の目的は、ＨＲＶ感染を遮断する性質を有する細
胞から、ＨＲＶ受容体タンパク質を分離することである
。ウイルスのその受容体についての高い親和性が与えら
れると、ＨＲＶ感染に対して有効な治療剤は受容体それ
自体であるか、あるいはより特定的には受容体のウイル
ス結合部位であることが仮定された。ウイルス結合部位
を構成するタンパク質、タンパク質断片またはペプチド
は、ウイルス上の受容体結合クレフト（ｃｌｅｆｔ）を
満たす（遮断する）ことによって、宿主細胞へ結合する
ウイルスの能力を遮断することができるであろう。さら
に、このような分子は受容体がする接触を分子のあるも
のまたはすべてにウイルスカプシドに行わせるので、分
子の結合に悪影響を及ぼすウイルスの突然変異は受容体
の結合に悪影響を及ぼし、こうしてウイ“ルスに悪影響
を及ぼし、そして致死的となるであろう。したがって、
薬物抵抗性突然変異の可能性は非常に低いであるう。さ
らに、このような分子はヒト分子であり、ヒトにおいて
抗原性である可能性を低下するであろう。

ヒトライノウイルス（ＨＲＶ）の主要な受容体は、ＨＲ
Ｖカプシドへ結合しかつウイルスの感染性を実質的に減
少させる所望の性質を示す、水溶性調製物として分離す
ることができることが発見された。調製物は、ＨＲＶの
主要な受容体を発現する動物細胞、好ましくは補乳動物
細胞から分離された洗浄剤複合糖タンパク質の形態であ
る。精製された受容体タンパク質は、次のように特徴づ
けられる。それは９５．０００ダルトンの見掛けの分子
量を有する糖タンパク質であり、そしてＨＲＶのための
結合部位を含む。糖タンパク質は６〜７のアスパラギン
結合オリゴサッカリド鎖を含有し、そして洗浄剤ミセル
結合夕冫パク質の形態の調製物で存在する。

一般に、本発明のＨＲＶの主要な受容体の調製物は、Ｈ
ＲＶの主要な受容体を発現することが知られている適当
な動物細胞を非イオン性洗浄剤で抽出し、次いで免疫沈
澱することによって得ることができる。多くのヒト細胞
系、例えば、ＨｅＬａおよびＷＩ３８は受容体を発現す
る。ＨＲＶ受容体のこれらのヒト源のいずれも抽出する
ことができる。さらに、ＨＲＶ受容体を発現する、ヒト
以外の噛乳動物のトランスフェクション体細胞は既知で
あるか、あるいは調製することができ、これらは受容体
の他の有用な源を提供する。とくに、欧州特許出願公開
第０　　３１９　　８１５号に記載されているようなト
ランス７エクション体細胞系は、受容体の入手容易な源
を提供し、とくに受容体の過剰発現に二次トランスフェ
クシコン体を選択した。この分野において知られている
か、あるいは以後開発された他の動物細胞、例えば、遺
伝子でトランスフェクションし、そして受容体を発現す
る昆虫の組織培養細胞を、また、使用することができる
。

本質的に、任意の非イオン性洗浄剤を抽出に使用するこ
とができるが、ただしタンパク質受容体の自然のコン７
才メーションが破壊されないことを条件とする。受容体
の変性は、ウイルスの感染性を阻害する抽出したタンパ
ク質の能力を監視することによるか、あるいはタンパク
質加水分解に対する感受性により決定することができる
。受容体は６０°Ｃにおいて３０分間加熱するか、ある
いは１％のＳＤＳで処理することによって変性できるこ
とが決定され、｝ＩＲＶ結合部位の自然のコン７才メー
ションを維持するように注意を払うことが必要であるこ
とが示される。有用な非イオン性洗浄剤の例は、次のと
おりである：アルキルボリオキシエチレンエーテル（例
，ｔｌｆ、Ｂｒｉｊ）、アルキル７エニルポリオキシエ
チレンエーテル（例えば、トリトンＸ−１００およびＮ
ｏｎｉｄｅｔＰ−４０）、アシルポリオキシエチレンソ
ルビタンエステノレ（ツイーン）、およびベーターＤー
アルキルグリコシド、トリトンＸ−１００はとくに好ま
しいと考えられる。

受容体の精製における重要な工程は、高度に選択的な杭
受容体抗体を使用して分画することである。最も容易な
手段は、モノクローナル技術によりこのような抗体を得
ることである。ネズミ骨髄腫細胞およびＨＲＶ受容体を
発現するマウストランスフエクション体細胞の融合から
、ハイブリドーマ細胞系を発生することによって、マウ
スモノクローナル抗体を産生ことはとくに好ましい。そ
れ以上の詳細は、欧州特許出願公開第０　３１９８１５
号に記載されている。細胞の抽出から得られた洗浄剤一
糖タンパク質複合体を選択したモノクローナル抗体に結
合した後、抗体に結合した複合体を混合物の残部から分
離する。その後、抗体に結合した洗浄剤一受容体複合体
を解離し、再び変性を防止する工程を取り、そして得ら
れる水溶性受容体の調製物を分離する。抗体から洗浄剤
一受容体複合体を解離するために適当な条件は、実験的
に決定することができ、そして多少抗体毎に変化するこ
とが期待される。ｐＨを上昇させることによる解離はあ
る場合において最も有効であることが発見されたが、低
いｐＨまたは高い塩の条件は使用可能であるが、より低
いタンパク買の収率を生成する。

したがって、抗体を使用する精製の前に、中間の精製を
実施することは好ましい。このような中間の工程は、洗
浄剤抽出したタンパク質複合体をＨＲＶ受容体と結合す
ることができるレクチンに吸着させ、吸収した複合体を
混合物の残部から分離し、そしてこのような複合体を引
き続く抗体を使用する処置のために解離することからな
る。レクチンの選択および解離の条件は、通常実験的で
ある。ＨＲＶ受容体は麦芽のアグルチンのレクチンに適
当に結合し、そしてＮ−アセチルグルコサミドの溶液で
洗浄することによって効果的に解離されることが発見さ
れた。受容体タンパク買上のオリゴサッカリドは完全に
特徴づけられず、そして受容体タンパク質は異なる細胞
のタイプ（例えば、マウス細胞のトランスフエクシ町ン
体）上で異なるようにグリコシル化されうるので、他の
レクチンは、また、適当であることが期待される。

麦芽のアグルチンおよび／または溶離剤の代替物の選択
は当業者によりなされることができる。

得られる調製物は、タンパク質加水分解剤、例えば、グ
ロテアーゼ、例えば、トリプシンで処置して、ＨＲＶと
結合しかつその感染性を減少する能力を保持する、小さ
い糖タンパク質断片を生成することができる。例えば、
ペプチド断片は糖タンパク質の末端領域、例えば、カル
ポキシ末端から切断して、ＨＲＶ結合性を保持する糖タ
ンパク質断片を生成することができる。このような糖タ
ンパク質断片は、例えば、約ａｏ．ｏｏｏダルトン〜約
９５，０００ダルトンの見掛けの分子量を有することが
できる。受容体のＨＲＶ結合ドメインを保持する、より
小さい断片は、また、本発明の範囲内であることが考え
られる。

本発明の受容体調製物は、多分ＨＲＶカズシドに結合し
て、次いでヒト細胞と結合しかつそれを感染する能力を
遮断することによって、ウイルスの感染性を阻止するこ
とが示された。このような観察は、受容体調製物が、ウ
イルスを調製物とウイルスへの結合に好適な条件下に接
触させることによって、生体内の宿主ヒト細胞の感染を
減少することにおいて有用であることを示す。治療の形
態は、受容体を溶液中に保持しかつその自然のコン７オ
メーションに維持する非イオン性洗浄剤の存在下におけ
る、受容体の水溶液の形態であろう。

より低い臨界ミセル濃度をもつ洗浄剤、例えば、アルキ
ルポリオキシエチレンエーテル、例えば、Ｂｒｉｊ　　
５８は、治療溶液中の洗浄剤の濃度を減少するｔ；めに
好ましいであろう。受容体調製物は、生体内で、ＨＲＶ
により感染されやすい体の区域との適当な接触により、
例えば、鼻内噴霧により投与することができる。

次の実施例によって、本発明をさらに説明するが、本発
明はこれらの実施例により限定されない。

精製したヒトライノウィルス受容体（Ｈ　Ｒ　Ｒ）タン
パク質の調製 （１）ヒト細胞（例えば、ＨｅＬａ）またはマウスＬ一
細胞トランス７エクション体（例えば、欧州特許出願公
開第０　　３１９　　８１５号に記載されている細胞系
、「主要なヒトライノウイルス受容体を発現するトラン
スフヱクシコン体細胞系」）を、大きい数で、細胞単層
として、標準の培地（１０％の胎児子ウシ血清を含有す
るダルベツコ変性必須培地；トランス７エクション体細
胞はＨＡＴ（ハイポキサンチン／アミノプレリン／チミ
ジン）を含有する同一の培地で維持した）中で増殖させ
て、選択可能なマーカー（ＨｅｒｐｅｓＴＫ）のために
選択的圧力を維持した。細胞を１時間４℃において非イ
オン性洗浄剤（例えば、トリトンｘ−１００）および受
容体の分解を防止するためのプロテアーゼ阻害剤のカク
テル（アブロチニン、レウペリン、ｌ　Ｏ　／Ｊ　ｇ／
ｍＱ　，　Ｅ　ＤＴＡ，１ミリモル）を含有する生理学
的緩衝液（リン酸塩緩衝液）中で可溶化した。不溶性物
質を０．２２μのフィルターを使用する濾過により除去
した。

（２）抽出物は、親和性園脂（セ７アローズに１８時間
４℃においておだやかに混合しながら架橋した麦芽のア
グルチン（ＷＧＡ）（Ｓ　ｉ　ｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ
　　Ｇｏ．、米国ミゾリー州セントルイス）を含有する
、５ｍｇのＷＧ　Ａ／ｍｌ２樹脂／ｌ　Ｏ’細胞を含有
する）上へ吸収させた。

次いで、親和性樹脂を緩衝液でよく洗浄して、結合しな
い糖タンパク質を除去し、そして単糖Ｎーアセチルグル
コサミド（Ｔ緩衝液中の０．３モルのＮ−アセチルグル
コサミド）で１時間室温において溶離した。

（３）次いで、ＷＧＡ−セファローズＳ離液を親和性樹
脂（ＨＲＲに対する精製しｊ；モノクローナル抗体（例
えば、ＡＴＣＣ　　ＨＢ　　９ａ５９４、欧州特許出願
公開第０　　３１９　　８１５号中で言及されている）
が結合されている）へ吸収させた。

モノクローナル抗体１ｇＧを硫酸アンモニウム沈澱によ
り精製し（Ｐａｔｈａｍ，Ｐ．．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ
ｏｌ．９２、１１０−１３８　（１９８３）］、次いで
プロテインＡ−セファロース［Ｅｙ，Ｐ．Ｌ．　　ら、
Ｉ　ｍ　ｍ　ｕ　ｎ　ｏ　ｃ　ｈ　ｅ　ｍ　．土擾，４
２９−４３６　（１９７８）］　またはＡｂｘ力ラム［
Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅ　ｒ　　Ｃｏ．　、米国ニュージャー
ジイ州フィリプスバーグ］の親和クロマトグラフィーに
製造業者により記載される手順に従いかけた。モノクロ
ーナルＩｇＧ親和性樹脂を、■ｇＧを臭化シアン活性化
セファローズ［Ｐａｔｈａｍ，Ｐ．，ｓｕｐｒａ］にカ
ップリングすることによって調製する。

ＩＯμｇ　／　ｍ　Ｑのヒトトランスフエリンを添加し
て樹脂へのトランスフエリン受容体への吸ｉを遮断した
後、溶離液を４゜Ｃにおいて１８時間樹脂とともに混合
しながらインキユベーションし（４０〜２００μ（２の
樹脂、５ｍｇのＩｇＧ／ｍｌ２の樹脂／ｌ　Ｏ’細胞を
含有する）、Ｔ緩衝液でよく洗浄して結合しないタンパ
ク質を除去し、次いで非変性条件下に高いｐＨの緩衝液
（０．０５モルのジエタノールアミン（ｐＨ１１．５）
および０．１％のトリトンＸ−　１　０　０）で１時間
室温において溶離する。溶離液を取り出し、０．２体積
の１モルのＨＥＰＥＳ　（ｐＨ７．２）の添加により中
和し、そして受容体の可溶性を維持するために少量の非
イオン性洗浄剤を含有する生理学的緩衝液（０．０１モ
ルのＨＥＰＥＳ，０．１５０モルのＮａＣ　Ｉ、０．０
０１モルのＣａＣＩ．、０．　　１％のトリトンｘ−１
００、ｐＨ７．５）の３回の交換に対して透析する。

受容体は、さらに、スクロースの勾配による速度沈降に
より精製して、少量の高分子量（〉２０ｏ．ｏｏｏダル
トン）の群を除去することができる。受容体の調製物を
１５〜３５％のスクロース勾配（合計の体積約４．５ｍ
（１）の上部に層状に配置し、そして４℃において１８
時間３００．０００において遠心する。分画を勾配から
集め、ライノウイルス受容体を含有する分画（これは勾
配の約１／３の経過で沈降する）をプールし、濃縮し（
必要に応じて）、そして透析する。

（４）ＨｅＬａ細胞から得られる調製物は、９５．００
０ダルトンの見掛けの分子量をもつ糖タンパク質を含有
することが発見された。マウストランスフエクション体
細胞から、同一の分子量であるが、不均質性がより大き
い（ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析する）タンパク質が分
離された。分離したタンパク質は、次にによりライノウ
イルス受容体からなることが示された： （ａ）ｌ！Ｊ一表面標識したＨｅＬａ細胞およびヒトラ
イノウイルス受容体を発現するマウストランス７エクシ
ョン体からの、細胞へのラインウイルスの結合を阻止す
るモノクローナル抗体を使用する免疫沈澱。

（ｂ）精製した１″！一標識した受容体の、ＡＴＣＣ　
　ＨＢ　　９５９４モノクローナル抗体を使用する免疫
沈澱。

（５）トリプシン断片は、受容体を１％（重量Ｅ／重量
受容体夕冫パク質）のトリプシンで１時間３７°Ｃにお
いて消化することによって調製した。

反応混合物をＩＮ緩衝液と平衡化したＧＦ−ゲル濾過力
ラム（デュポン）に適用し、そして夕冫パク質加水分解
断片を酵素から分離した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析
は、受容体の９０．０００ダルトンおよび８３．０００
ダルトンの混合物を示した。これらの断片は、同一位置
において、ゲル濾過力ラム上で完全な受容体として溶離
し、それが洗浄剤ミセルヘ結合していることを示唆した
。

断片のアミノ酸の配列決定は、配列を生成せず、それら
が、完全な受容体に似て、遮断されたＮ末端を有するこ
とを意飯、そしてさらに、９０．０００および８３．０
００ダルトンの断片から損失したペプチドがタンパク質
のＣ末端からであることを示した。

調製物の特性づけ （１）受容体調製物の純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび
引き続いて銀の染色により評価した。タンパク質の定量
は、銀染色したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上の１系
列の標準の既知量と比較することによって決定し、そし
てアミノ酸分析により確証し、タンパク質の分子量が５
０．０００ダルトンであることを仮定した（脱グリコシ
ク化した受容体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ上のタンパク質の分
子量の決定により決定した）。

（２）タンパク質は、コアグリコシク化受容体をエンド
グリコシダーゼＨで消化することによって、６〜７のア
スパラギン結合オリゴサッカリド鎖を含有する糖タンパ
ク質であることが示された。

ゲル濾過すると、受容体は一定体積で２５０，０００ダ
ルトンのタンパク質分子量をもって溶離された。このデ
ータは、受容体が七ノマーであることをしめす化学的架
橋実験からの証拠と一緒に、洗浄剤のミセルに結合した
タンパク質に似た受容体の挙動と一致する。

（３）精製した受容体タンパク質は、生体外でライノウ
イルスに結合することが示された。３０分間３４℃にお
いてｌμｇ／ｍＱのＨＲＶ　ｌ　４またはＨＲＶ３とと
もにインキユベーションすると、非標識　ｌ．ｓ　１標
識した、および３ＳｓＱシステインで代謝的に標識しあ
ＨＲＲは、スクロース勾配における沈降によるか、ある
いは高速度の遠心により、ウイルスと会合（ａｓｓｏｃ
ｉａｔｅ）ことを示すことができた。この結合は、非標
識受容体と放射線標識した受容体の結合を競合させるこ
とによって、特異的であることが示すことができた。生
体外の反応は、生体内と同一の温度依存性を有した：受
容体はウイルスに３７℃において結合したが、４℃にお
いて結合しなかった。

（４）ＨＲＲをウイルスとともに（結合を実証できる、
前述と同一の条件下に）インキュベーシコンし、次いで
得られる混合物を標準の制限希釈感染性アッセイにより
感染性について試験することによって、受容体はライノ
ウイルスの感染性を阻止することが示された．，ＨｅＬ
ａ細胞の懸濁液を０．０３％のＥＤＴＡ／ＰＢＳでｌＯ
分間分離することによって調製物し、細胞を２％のＦＢ
Ｓ／ＤＭＥＭ（Ｉ培地）および１０ミリモルのＨＥＰＥ
Ｓ中で洗浄し、そしてｌ．ＩＸＩＯ’細胞／ｍＱの濃度
に調節した。ウイルスまたはウイルスー受容体混合物を
Ｉ培地で系統的に希釈し、そして２０ｐρのウイルスを
１８０μ０の細胞と混合し、そして６０分間室温におい
てインキユベーションした。次いで、この混合物を９体
積の１培地で希釈し、８〜ｌＯウエルの９６ウェルの組
織培養平板中にプレイティングし（ほぼ２００μＱ／ウ
ェル）、そして３４℃において５日間培養した。

次いで、培養物にＣＰＥ　（細胞変性作用）でスコアを
つけ、そしてもとの原液の力価を次の式により決定した
： ＃死亡ウエル／　ｌ　Ｏ　ｘ　５　０　ｘ希釈係数一Ｐ
ＦＵ／ｍＱ 結果を下表に示す。

青 ウイルス ＨＲＶｌ４ ０　　　　　　　　　　２　　ＸＩＯ’６．６ＸＩＯ−
’　　　　　　　　３．５ＸＩＯ＠２　　ＸＩＯ−’　
　　　　　　　４．５ＸＩＱ’６．６ＸｌＯ−″　　　
　　　　２　　ＸＩＯ’２　　ＸＩＯ−’　　　　　　
　　３　　Ｘｌ０４０　　　　　　　　　　　２．５Ｘ
ｌＯ’６．６ＸｌＯ−’　　　　　　　　３　　ＸＩＯ
’２　　ＸＩＯ−”　　　　　　　３．５ＸｌＯ’６．
６ＸＩＯ−’　　　　　　　３．５ＸｌＯ’２　　ＸＩ
Ｏ−’　　　　　　　　５　　ＸＩＯ”追加のＨＲＶ血
清型を試験した。ＨＲＶ　　４、ＩＩ、１７ｉｉよび８
９血清型（主要なクラス）はウイルスにより阻害された
が、ＨＲＶ　　ｌａおよび２（小さいクラス）は阻害さ
れなかった。

上の結果が示すように、精製したＨＲＲはライノウイル
スの主要な受容体のクラスに属するライノウイルスの感
染性を遮断することができる。受容体タンパク質の感染
性阻害性質は、ウイルスに結合するその能力と相関関係
をもち、そしてウイルス上の受容体結合部位を遮断する
ことによって作用すると思われる。受容体のこの性質は
受容体タンパク質の低い濃度において現れ、そしてウイ
ルスについての受容体の高い親和性を示す。これらの結
果の意味は、精製した、可溶性の受容体を使用して、生
体内のライノウイルスの感染の開始または広がりを阻止
できることにある。精製したタンパク質は、また、完全
な受容体と同一の活性を有する、より小さいタンパク質
断片およびペプチドを誘導することができる、材料の源
を提供する。

次いで、精製したタンパク質を制限したまたは完全なタ
ンパク質加水分解にかけ、ペプチドを逆相クロマトグラ
フィー、ゲル濾過、またはＳＤＳ−ＰＡＧＥにより精製
し、次いで自動化タンパク質配列決定にかけた。これら
の配列を使用して、タンパク質の配列（ＮＲＦＢおよび
ＭＩＰＳＸ）およびＤＮＡ配列（Ｇｅｎｂｎｋ）データ
ベースをサーチした。ＨＲＲタンパク質から決定したす
べての既知ペプチドの配列の合致を行った。（細胞間付
着分子−１％Ｓｉｍｍｏｎｓ　　ｅｔ　　ａｔ，ｒｌｃ
ＡＭ，ＬＦＡ−１の付着配位子、ＮＣＡＭの神経細胞付
着分子と相同性であるか」、ネイチャ−（Ｎａｔｕｒｅ
）、３３１，６２４−６２７（１９８８））。ＩＣＡＭ
は、Ｔリンパ球を種々の異なる細胞タイプに付着する役
割をもつため、他の研究者らにより研究された。ＩＣＡ
Ｍ（線維芽、上皮細胞、白血球、および内皮細胞上に存
在する）は、Ｔリンパ球の表面上に存在するＬＦＡ−ｌ
（ＩＪンパ球一機能関連抗原−１）と呼ばれる構造体と
相互作用し、これによりこれらの細胞のタイプへの付着
の原因となることが仮定される。

われわれはライノウイルス受容体の１０６アミノ酸の配
列を決定し、そしてすべての１０６は■ＣＡＭの配列と
精確に合致した（ＩＣＡＭについて予測される合計５０
７アミノ酸のうちから）。

他の生物化学的情報はＨＲＲとＩＣＡＭとの同一性を支
持する。第１に、生体外翻訳系において合成された一次
ｍＲＮＡ翻訳産生物は、ＩＣＡＭと同一である、５５，
０００ダルトンの見掛けの分子量を有する。第２に、ツ
ニカマイシンで被毒した細胞中に見いだされるＨＲＲタ
ンパク質種、アスパラギン結合グリコシク化の特異的阻
害因子は、タンパク質のＮ末端からのシグナル配列の除
去と一致する、５４．０００ダルトンの見掛けの分子量
を有する。第３に、コアグリコシク化ＨＲＲタンパク質
の部分的消化は、７つのアスパラギン結合炭水化物の気
相の存在を示し、ＩＣＡＭのアミノ酸配列における８つ
の潜在的炭水化物受容体配列（Ｎ−Ｓ／Ｔ）の存在と一
致する。最後に、ＨＲＲの染色体地図の位置は、ＩＣＡ
Ｍについて決定したそれと一致する、ヒト染色体ｌ９で
あることが決定された。

ＩＣＡＭの完全なヌクレオチドおよびアミノ酸配列は決
定され、そしてＩＣＡＭおよびＨＲＲが同一であるか、
あるいは非常に類似する分子であるという圧倒的なでな
いにしても、実質的な証拠存在するので、ライノウイル
ス受容体の完全なアミノ酸配列は現在知られた。このア
ミノ酸配列の決定は、この分子の部分的な化学的構造で
あり、大量の受容体タンパク質、断片、機能的ドメイン
、および切頭変異型、および受容体夕冫パク質の類似体
、およびライノウイルスおよびコクサッキーＡウイルス
の感染に対して阻止活性を有するペプチド、を設計およ
び産生ずる能力を提供する。完全なアミノ酸配列は、ま
た、きわめて重要な分子の接触の同定に導き、新規な阻
害分子の設計に使用できる、ライノウイルスー受容体の
相互作用の生理学的および生物化学的研究に要求される
情報を提供する。

ＩＣＡＭ分子は染色体ｌ９にマッピングされる免疫グロ
ブリン超遺伝子の族のｌ員であり（ヨーロピアン・ジャ
ーナノレ・オブ・イムノロジー（Ｅｕ　ｒ．Ｊ．Ｉｍｍ
ｕｎｏ　１．）、ｌ５、１０３−１０６　（１９８４）
そして他のピコルナウイルス、例えば、ポリオウイルス
およびコクサツキーウイルスは染色体ｌ９上に位置する
遺伝子をもつ受容体に結合するので、ＩＣＡＭをそれら
の他のビコルナウイルスにより同様によく感染に対して
反作用するだめの治療の開発のための基準として使用す
ることができる。ＩＣＡＭまたはその断片は他のウィル
スおよび炎症の病気のための治療剤として直接有用であ
ろう。あるいは、ＩＣＡＭの構造の知識はそれらのウイ
ルスの受容体の同定において有用であろう。さらに、Ｉ
ＣＡＭ−１は大人の神経系、神経細胞の付着分子（ＮＣ
ＡＭ）およびミエリン関連糖夕冫パク質（ＭＡＧ）およ
びある族の上皮細胞分子、例えば、ＣＥＡ，ＮＣＡ１Ｔ
Ｍ−ＣＥＡ，および妊娠特異的Ｂｌ一糖タンパク質の２
つの付着（ａｄｈｅｓｉｏｎ）タンパク質に密接に関係
する。ＮＧＡＭ，ＭＡＧおよびＩＣＡＭ−　１の各々は
、５つの免疫グロプリン様ドメインを有する、参照、ダ
スチン（Ｄｕｓｔｉｎ）ら、「免疫系に存在する超遺伝
子の族（Ｓｕｐｅｒｇｅｎｅ　　　Ｆａｍｉｌｉｅｓ　
　　Ｍｅｅｔ　　　ＩｎＴｈｅ　　　Ｉｍｍｕｅ　　　
Ｓｙｓｔｅｍ）Ｊ　　、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　　Ｐｕｂｌ
ｉｃａｔｉｏｎｓ，ケンブリッジ、ｌ９８８。ビコルナ
ウイルスとＩＣＡＭ，ＮＧＡＭおよびＭＡＧの超遺伝子
の族との関係は、ウイルスのこのクラスの感染性を阻止
するタンパク質、夕冫パク質断片、機能的ドメイン、類
似体およびそれらの混合物を開発するための基準を提供
する。

アミノ酸配列の知識、およびＩＣＡＭタンパク質につい
ての感染は、ＨＨＲおよびライノウイルスの知識と組み
合わせて、ライノウイルスの感染を処置しそして炎症を
処置するためのタンパク質断片および類似体を設計する
ための、次のアプローチのための基準を提供する。

生物学的に活性な宿主細胞の可溶性の形態を使用して、
常態で感染を促進する細胞膜の結合受容体と対照的に、
ウイルスの感染を阻止することができる。生物学的に活
性な受容体タンパク質、タンパク質断片、機能的ドメイ
ンまたは類似体の可溶性の形態は、前述の洗浄剤の使用
を包含する。

あるいは、Ｃ末端の排除はタンパク質を可溶性とする。

生物学的に活性なトリプシン断片は、２つのカプシドの
混合物であり、１つは８３．０００の見掛けの分子量を
もち、そして１つは９０，０００の見掛けの分子量をも
つ（９５ｋＤのＨＲＲに関して）。両者の種のＮ末端は
遮断されており、それらが無傷のＨＲＲ分子の残基ｌか
ら出発し、そしてペプチドはＣ末端からなはれているこ
とを示す：最大の可能な断片は残基１から残基４８８で
あろう。無傷のＨＲＲに関して見掛けの分子量の下方の
シ７トは＞５．０００ダルトン、または４５アミノ酸残
基の損失を示しこれは断片の新しいＣ末端をトランスメ
ンブレンセグメントに近接する（Ｎ末端）の位置に配置
するであろう。

可溶性断片の例は、全体の細胞外ドメイン（アミノ酸４
８８まで）を包含するか、あるいは受容体タンパク質の
アミノ酸配列の細胞外ドメイン（アミノ酸１〜２００　
．２００〜４６０）びいずれかおよび／または両者の明
確な部分を包含することができるであろう。さらに、予
測されるように、最小のペプチド断片はウイルスの感染
を阻止するための生物学的に活性な類似体を提供するこ
とができる。

ＨＲＲの全長のｃＤＮＡは、ＩＣＡＭ−１の発表された
配列から作られたオリゴヌクレオチドでスクリーニング
することによって、受容体を発現するＨｅｌまたは他の
細胞のｃＤＮＡライブラリーから分離されるであろう。

ＨＲＲのドメイン断片の構成および発現は、確立された
組み換え体ＤＮＡの方法を使用して達成されるであろう
（Ｆｉｓｈｅｒら、ネイチャ−（Ｎａｔｕｒｅ）、３３
七、７６−７８　（１９８８）；Ｈｕｓｓｅｙら、ネイ
チャ−（Ｎａｔｕｒｅ）、３３１ｘ　　７８−８１　（
１９８８））。可溶性細胞外ドメインは、ＨＲＲ解読配
列のｃＤＮＡクローンをＴｈａｉで切断してつくられ、
このＴｈａｌはトランスメンブレンドメインの開始前に
シグナルペプチド領域における位置３７でおよび位置１
４１５、１２アミノ酸において切断する。合成オリゴヌ
クレオチドリンカーを、分子の５′および３″末端に段
階的方法で付加して、シグナルペプチドおよびイニシエ
イタ−ＡＴＧをＮ末端において修復し、そしてフレーム
翻訳停止コドンをＣ末端に導入する。停止コドンの位置
を変更して、別の切頭形態の分子を生成することができ
る。同様に、異なる頻繁ではない切断制限酵素を使用し
て、分子の他の領域に停止コドン挿入する。制限酵素部
位は、リンカーの末端に含めて、種々の発現ベクター中
に方向的にクローニングする。普通の方法を使用する、
オリゴヌクレオチド部位特異的突然変異誘発を使用して
、便利な自然に発生する部位が存在しない、制限酵素部
位を導入する。さらに、ポリメラーゼ鎖の反応（ＰＣＡ
）技術を使用゜して、分子のドメインおよび他の下位領
域をエンコードする特異的ＤＮＡ断片を生成する。

前述のアプローチを、また、使用して、受容体の追加の
下位断片、例えば、５免疫グロブリン様ドメインを生成
する（残基ｌ〜８８、８９〜ｌ８５、１８６〜２８４、
２８５〜３８５、３８６〜４５３、Ｓｔａｕｎｔｏｎら
、細胞（Ｃｅｌｌ）、５２１９２５〜９３３　（１９８
８））。この場合において、使用する発現合成のための
タンパク質の分泌を指令する適当なシグナル配列を含め
る。

種々の発現系、例えば、補乳動物細胞（Ｓｍｉｔｈら、
プロシーデインダス・オブ・ナショナル・アカデミー・
オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ．Ｎａ　ｔ　ｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃ　ｉ．）ＵＳＡ％　８２、８４０４−８４０８
　（１９８５）；およびＥ．ｃｏ１ｉ（Ｓｋｅｒｒａお
よびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ）、２４０、１０３８−１０４　１　（１９８８））
におけるウイルスのプロモーターを使用する。受容体の
下位断片または上の方法において生成される下位断片を
、主要なライノウイルスの血清型と結合しかつウイルス
の感染性を減少する能力について試験する。前述の細胞
外ドメインの発現を、また、使用して、構造の研究、例
えば、Ｘ線結晶学のための可溶性細胞ドメインの十分な
量を誘導する。

非還元のＩ　ＣＡＭ−　１の酵素的または化学的断片化
を使用する構造の研究は、合計７つの潜在的対のうちか
ら３つのジサルファイド結合をマッピングし、そして仮
説的に２つのジサルファイド結合をマッピングした。こ
れらの結果はＣｌ０８およびＣ１５９の間、Ｃ２１０お
よびＣ２６３の間、およびＣ３０５およびＣ３４４の間
のジサル７アイド結合を示し；ＣＮＢｒを使用するＭ６
４における切断はＣ２１およびＣ２５の対およびＣ６５
およびＣ６９を示し、そしてＩｇ様の折り畳みに基づく
モデルの構成は対Ｃ２１対Ｃ６５およびＣ２５対Ｃ６９
を示す。これらのデータは、３つのＮ末端のＩｇ様ドメ
インをもつＩ　ＣＡＭ−　１の構造のモデルを支持する
証拠を提供する（第２図参照）。

ｌ系列のｃＤＮＡ　（ｔ　ＩＣＡＭ，または切頭■ＣＡ
Ｍ）をＩＣＡＭ−１　　ｃＤＮＡから構成して、成熟タ
ンパク質のアミノ酸位置４５４、２８４または１８５に
早熟停止コドンを含有させて、Ｃ末端から漸進的に切頭
される分泌されたタンパク質を産生じた。切頭の位置は
、トランスメンブレインドメイン（ｔ　ＩＣＡＭ　（１
−４５３））　、免疫グロブリン様ドメイン１＋２＋３
　（ｔ　ＩＣＡＭ　（１−２８３））および免疫グロブ
リン様ドメインｌ＋２　（ｔ　ＩＣＡＭ（１−１８３）
）および免疫グロブリンドメインｌ　（ｔ　ＩＣＡＭ　
（１−８８））の予測した境界にに基づいて選択した。

これらの遺伝子のタンパク質生成物は第２図に線図で示
されている。そえあはポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）に
より５′および３゛オリゴヌクレオチドプライマーを使
用して構成し、前記プライマーはＩＣＡＭ−２解読配列
と重複し、そして制限酵素部位を含有する；５′プライ
マーは追加のＥｃｏＲ１部位を含有し、そして３′　プ
ライマーは追加の翻訳停止コドンおよびＢａｍｒ部位を
含有した。これらのＤＮＡはブルースクリプト（Ｂｌｕ
ｅｓｃｒｉｐｔ）−ＳＫベクター（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎ
ｅ）中に方向をもたせてクローニングし、ＨｉｎｄＩＩ
Ｉ／Ｘｂａ消化で切断した。次いで、これらの遺伝子お
よび対照の全長のＩＣＡＭ−１　　ｃＤＮＡを遺伝子の
５′末端においてＨｉｎｄｌＩＩおよび３′末端におい
てＸｂａを使用して、発現ベクターＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ
ら）中に方向をもたせてクローニングした。これらのプ
ラスミドはＣｏＳ細胞中にＤＥＡＥ−デキストラン技術
を使用してトランスフエクションし、そして細胞をアッ
セイの前に７２時間培養しｔ；。表面の発現は、ＦＡＣ
Ｓにより間接免疫蛍光およびＩ　ＣＡＭ−　１に対して
特異的なモノクローナル抗体を使用して監視した。培地
中のＩＣＡＭ−１の分泌は、細胞の代謝的標識つけによ
り７時間３ＳＳシステインを使用して、次いでモノクロ
ーナル抗Ｉ　ＣＡＭ−　１−七７７ローズ樹脂を使用す
る培養物の免疫吸収により監視した。ＦＡＣＳ分析は、
全長のＩＣＡＭ−１でトランスフェクシコンした細胞に
おいてＩＣＡＭ−　１の表面の発現を明瞭に示した，　
ＣＭＳ　８またはｔ　ＩＣＡＭ（１−４５３）ででトラ
ンスフエクションした細胞は表面の発現を示さなかった
。

代謝的に標識した培養物の上澄み液から分離した物質を
、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、次いでフル才ログラ７イー
により分析したとき、ＩＣＡＭ−１は対照または全長の
Ｉ　ＣＡＭ−　１　トランスフエクション体において観
察されなかったが、８０．０００ダルトンの種はｔ　Ｉ
ＣＡＭ　（１−４５３）　トランスフェクション体より
分泌され、６５．０００ダノレトンのタンパク質はｔ　
ＩＣＡＭ　（１−２８３）トランスフエクション体によ
り分泌された。

同一物質を銀染色により染色すると、ｔｌｃＡＭ（１−
４５３）は実質的に純粋であることが明らかにされた。

安定なトランスフエクシ２ン体は、選択可能なマーカー
のための遺伝子と混合した同一のｃＤＮＡ　（マウスＬ
細胞についてチミジンキナーゼ、ＣＨＯ細胞についてジ
ヒドロフォレートリダクターゼ）をマウスＬｔｋ一細胞
まｔ；はハムスターＣＨＯ　（ｄ　ｈ　ｆ　ｒ−）細胞
中にトランスフエクションし、そして薬物選択にかけた
（Ｌ　ｔ　ｋ−細胞についてＨＡＴ選択およびＣＨＯ（
ｄｈｆｒ−）についてメタトレキセート）。生存する細
胞をクローニングし、そしてこれらの細胞からの培養物
上澄み液をラジオイムノアッセイによりスクリーニング
し、ここでＭＡｂ　　ｃ７８．５をマイクロタイター皿
に吸着させ、精製したＩＣＡＭ−１または培養物上澄み
液をＭＡｂ被覆した皿とともにインキユベーションし、
次いで結合したＩＣＡＭ−　１を１２８　■標識ＭＡｂ
　　ｃ７８．５とともにインキユベーションすることに
よって検出した。いくつかのＬ細胞トランスフェクショ
ン体およびｔ　ＩＣＡＭ　（１−４５３）を分泌する１
つのＣＨＯ細胞のトランスフェクシ５ン体およびｔＩＣ
ＡＭ（１−１８３）を発現するＬ細胞を得た。

発現は前述の細胞の代謝的標識つけおよび引き続く培養
物上澄み液の免疫吸収により確証された。

ｔ　ＩＣＡＭ　（１−８８）はＥ．ｃｏｌｉにおいてイ
ノウエのＯｍｐＡ分泌ベクターを使用して発現された。

この系において、ＯｍｐＡシグナルペプチドを成熟ＩＣ
ＡＭ−１タンパク質のＮ末端に融合する。ｔ　ＩＣＡＭ
　（１−８８）およびｔｌｃＡＭ（１−１８３）はＯ　
ｍ　ｐ　Ａベクター中に配置された；これらのベクター
で形質転換したＥ．ｃｏ１ｉはタンパク質生成物を発現
し、この生成物はＩ　ＣＡＭ−　１のドメインｌ内の配
列に対する抗ペプチド抗体を使用する細胞の抽出物のＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥゲルのウェスタン・プロットにより検出
する。

ＩＣＡＭ−１に対する６　　ＭＡｂのパネル（それらの
すべてのはＩＣＡＭ−１へのウイルスの結合を阻止する
）を使用する遮断の研究は、これらの抗体により定めら
れる２つの明確なエピトープの存在を示し、１つはｃ７
８．４により定められる（ｃ７８−　ＩＳｃ７Ｂ−　２
、ｃ９２．ｌおよびｃ９２．５を含有する）。Ｉ　ＣＡ
Ｍ−　１のタンパク質加水分解断片および切頭ＩＣＡＭ
−１　　ｃＤＮＡの生体外翻訳を使用する免疫沈澱の研
究は、これらのエピトープの両者が第１１ｇ様ドメイン
内にを含有されることを示す。

放射線標識ｔ　ＩＣＡＭ　（１−４５３）および精製し
たライノウイルスを利用する生体外ウイルス結合研究は
、それが溶液中でライノウイルスに結合できることを示
した。

追加の生物学的に活性な断片は、ＨＲＲタンパク質の一
部または全部に対応するｌＯ〜２０残基の合成ペプチド
の重複する組みを利用して評価する。ペプチドをつくり
、そして受容体へのウイルスの結合を阻止する能力にっ
てい個々に試験する。

これらのペプチド断片は、ライノウイルス受容体の一部
のコピーを指令することができるか、あるいは受容体の
非隣接領域からの配列を含有することができるであろう
。

ＩＣＡＭは、ＮＣＡＭに対する相同性に基づいて、免疫
グロブリン遺伝子の超科のｌ員であることが予測された
。予測されるように、ＩＣＡＭにおける免疫グロブリン
様ドメインは、この族の２つの他の員、ベータ−２−ミ
クログロプリンおよびＨＬＡ−Ａ２アルファ−３ドメイ
ンについて示されたように、基本的な「免疫グロブリン
の折り畳み」を有するであろう。この折り畳みは、２つ
の逆平行のベータープリーテッド（ｂｅｔａ−ｐｌｅａ
ｔｅｄ）シートから成る「ベーターバレル（ｂａｒｒｅ
ｌ）Ｊから成り、１つは３および１つは４つのベータス
トランドから構成されている；２つのシステイン残基の
間のジサルファイド結合（鎖に沿ってほぼ６０アミノ酸
により分離されている）は２つのシートを接続する（Ｗ
ｉｌｌｉａｍｓ％Ａ．Ｆ．，Ｉｍｍｕｎ．Ｔｏｄａｙ，
８、２９８−３０３　（１９８７））。ジサルファイド
結合の２つは、ドメイン２　（ＣＩＩＯ−Ｃｌ６１）お
よび３　（Ｃ２１２−Ｃ２６５）に対応し、われわれに
より実験的に決定され、このモデルの支持を提供する。

構造についてのこのモデルは、ウイルスの結合部位をま
ねることができ、かつ受容体の遮断体硫酸アンモニウム
有用であろうる独特の類似体を設計するための基準を提
供する。ベーターバレルにおいて逆平行のベータストラ
ンドの各対は可変の大きさのヘヤピンの回転により結合
されている；第２構造から突起するこのような回転また
はループは、しばしば、配位子の認識において役割を演
ずることが発見された（ＬｅｚｃｚｙｎｓｋｉおよびＲ
ｏｓｅ，サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２２４、８４
９−８５５　（１９８６）。

このような突起する構造はライノウイルス受容体におい
てとくに興味がある。なぜなら、ウイルスカプシド上の
受容体結合部位はくみぼのある空洞であることが提案さ
れているからである。ＨＲＲの配列を使用して、このよ
うな回転およびループは、ベーターバレルの構造に基づ
いて予測し、そしてペプチドのＮ末端およびＣ末端にお
ける新規なシステイン残基の付加をもつ合成ペプチドと
して産生されることができるであろう；次いで、ジサル
ファイド結合は同一ペプチド上のこのような残基の間に
形成されて、ループを共有結合的に閉じるであろう（自
然タンパク質と対照的、ここでループは隣接するベータ
ー鎖の間の非共有結合的相互作用により閉じられるであ
ろう）．このようなペプチドはコンフォメーションが筒
単な直線のペプチドより自然タンパク質におけるコン７
才メ−ションに類似し、そしてウイルスの結合活性につ
いて試験する。

ウイルス結合活性の原因となる分子の領域またはドメイ
ンを探す方法。ＨＲＲの特定の部分に対して向けられた
部位特異的抗体（免疫グロブリンの折り畳みに基づく使
用モデルから予測される）は、タンパク質の選択した領
域に対応する合成ペブチドをつくり、このようなペプチ
ドをより大きいタンパク質にカップリングし、そして標
準の方法によりこのような接合体でウサギまたは他の動
物を免疫化することによって産生ずることができるであ
ろう。このような抗体は、ウイルスの結合を阻止する能
力について試験することができるであろう：このような
抗体のサブセットを使用する阻止は特定のドメインまた
はドメインの部分に注意を向けるであろう。

受容体タンパク買上のいくつかのアミノ酸残基上の特定
の反応性基は、非変性条件下に化学的修飾することがで
きる。いくつかの残基の修飾の結果、ウイルス結合能力
は損失されうる。修飾剤中の放射性トレーサーの使用に
より、いくつかのアミノ酸残基の修飾は結合活性の損失
と相関関係づけることができ。認識においてそれらの基
を暗示する。これは、ウイルスの結合において特定の役
割を演ずるとして、分子の特定の部分または特定のアミ
ノ酸残基に注意を向けるであろう。次いで、このような
残基は生体外突然変異誘発実験において実験的に修飾す
ることができる。一例として、放射性ポルトン／ハンタ
ー（Ｂｏ　ｌ　ｔ　ｏ　ｎ）　／Ｈｕｎｔｅｒ）試薬（
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、これはＮ末端
おびリジン残基を特異的に修飾する）を使用するＨＲＲ
の標識つけは、ライノウイルスへ結合するその活性を実
質的に減少する。

Ｘ線結晶学および／またはＮＭＲによりＨＲＲのウイル
ス結合ドメインの三次元構造の決定。ＨＲＶｌ４の三次
元の座標（ブルックヘブンのデータバンク（Ｂｒｏｏｋ
ｈａｖｅｎ　　Ｄａｔａ　　Ｂａｎｋから）は、コンピ
ューターグラフィック法により２つの分子の最適な「ド
ッキング」を発見する。次いで、「ドッキングされた」
複合体を使用して、受容体のタンパク質またはペプチド
断片の性質を精練しかつ改良することができる。このよ
うな改良の例は、次のとおりである：　（ｌ）ウイルス
結合反応の親和性の増加；（２）より小さい分子の生成
；および（３）分子の他の領域、例えば、ＬＦＡ−１へ
の結合に要求されるものの欠失または損傷。ＬＦＡ−　
１のための結合部位が異なるドメイン上に存在する場合
、このドメインは欠失することができる。あるいは、Ｌ
ＦＡ−１の結合部位がウイルス結合ドメイン上に存在す
る場合、特異的アミノ酸の部位特異的突然変異を使用し
て、結合する能力を阻止することができる。

ウイルスの結合に参加する受容体の重要な残基は、オリ
ゴヌクレオチド部位特異的突然変異ｍ発により決定され
る。例えば、飽和突然変異誘発により産生した突然変異
体のプールをペターソン（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ）およびシ
ード（Ｓ　ｅ　ｅ　ｄ）の方法（細胞（Ｃｅｌｌ）、５
４、６５−７２　（１９８８））により、陰性の選択と
してＨＲＶ　ｌ　４またはモノクローナル抗体／補体の
殺し、および陽性の選択としてウサギポリクローナル抗
体を使用してスクリーニングする。この方法において同
定される分子の領域に対応する合成ペプチドをつくり、
そしてウイルスの結合および感染性を減少する能力につ
いて試験する。

タンパク貿、夕冫パク質断片、機能的ドメインおよび類
似体の製剤学的組成物は、複数の病気において用途を有
する。ＨＲＶおよびＬＦＡ−１の両者がＩＣＡＭに結合
するという知識を用いて、ライノウイルスに結合し、こ
うしてライノウイルスの感染を阻止するが、ＩＣＡＭお
よびＬＦＡ−１の相互作用を混乱させない、ＩＣＡＭの
類似体を設計することができることが予測される。ある
いは、選択した残基（アミノ酸）は構造の予測および生
物化学的構造に基づいた作られるであろう。

再び、ＩＣＡＭおよびＨＲＲが同一の分子であるという
知識を用いて、それはＬＦＡ−　１の断片、機能的ドメ
インまたは類似体における用途を有し、ＨＲＲおよびラ
イノウイルスの間の相互作用を混乱し、これによりライ
ノウイルスの感染を処置することができることが予測さ
れる。

ＨＲＲまたはその断片は、ＩＣＡＭ，！：ＬＦＡ−１と
の間の相互作用の混乱において使用することができ、こ
れは炎症の処置のために有用である。

ライノウイルスの既知のカプシドタンパク質から誘導さ
れるペプチドは、ＨＲＲおよびＬＦＡ−１の間の相互作
用を混乱し、これによりライノウイルスの感染の処置に
有用である。生物学的活性を妨害しない炭水化物の基は
除去して、バクテリアにおけるベプチドの産土を増大す
ることができる。

カプシドの部位特異的突然変異誘発は、生物学的に活ｔ
ｔなコンフォメーシ膳ンへの再折り畳みを制限するため
に有用である。

本発明の主な特徴および態様は、次の通りである。

ｌ１ヒトライノウイルス（Ｈ　Ｒ　Ｖ）の主要な受容体
を発現し、そしてＨＲＶカプシドへ結合する能力を阻害
しかつ前記ウイルスの感染性を実質的に減少する動物細
胞から分離された洗浄剤複合糖タンパク質からなること
を特徴とする、水溶性ヒトライノウイルス（Ｈ　Ｒ　Ｖ
）の主要な受容体調製物。

２、ＨＲＶの主要な受容体を発現する噛乳動物細胞から
分離された上記第１項記載の調製物。

３、糖タンパク質は約９５，０００ダルトン以下の見掛
けの分子量を有する、上記第１または２項記載の調製物
。

４、ＨｅＬａ細胞の洗浄剤抽出により得られた、上記第
ｌ〜３項のいずれかに記載の調製物。

５、ＨＲＶの主要な受容体を発現するヒト以外のトラン
ス７エクション体細胞の洗浄剤抽出により得られた上記
第１〜４項のいずれかに記載の調製物。

６、主要な受容体のクラスのヒトライノウイルスのカプ
シドへ結合する能力を示しかつ前記ウイルスの感染性を
阻止する、生物学的に活性な受容体タンパク質の断片、
機能的ドメインおよびそれらの類似体から成る群より選
択されたことを特徴とする、ヒトライノウイルス受容体
タンパク質。

７、工程： ａ）ＨＲＶの主要な受容体を発現する動物細胞を非イオ
ン性洗浄剤で抽出し、 ｂ）得られる洗浄剤一糖タンパク質複合体を、ＨＲＶ受
容体タンパク質への結合について選択的である抗体と結
合し、 Ｃ）洗浄剤一ＨＲＶ糖タンパク質複合体を抗体から解離
し、そして ｅ）得られるＨＲＶの主要な受容体の水溶性調製物を分
離する、 からなることを特徴とする、上記第１〜６項のいずれか
に記載の水溶性ヒトライノウイルス（ＨＲＶ）主要な受
容体調製物を得る方法。

８、工程ａ）における補乳動物細胞から可溶化した洗浄
剤一糖タンパク質複合体を、ＨＲＶの主要な受容体のタ
ンパク質と結合することができるレクチンに吸着させ、
前記レクチンに吸着した複合体を混合物から分離し、そ
してレクチンから解離した洗浄剤−ＨＲＶ糖タンパク質
複合体を工程ｂ）の抗体に適用する、上記第７項記載の
方法。

９、有効量の上記第６項記載のタンパク質および製剤学
的に許容されうる賦形剤からなることを特徴とする、ヒ
トライノウィルスの処置において第１図は、ＩＣＡＭ（
マイナスシグナル配列）のアミノ酸配列である。ＨＲＲ
のペプチド断片から得られた配列は（　ＩＣＡＭの対応
する配列の下の点線または破線として示す。破線は確信
をもって帰属されるペプチドの配列を意味し、点線は不
明瞭な帰属を意味し、そしてｘｘは不明瞭な帰属の正し
くない決定を意味する。ペプチドの配列の下の数字は、
タンパク質配列決定実験のコード名である。

￥，２母＋１ｉイス各のタシＩ＼゜２笈性ｆｆｉ’Ｍｔ
實・１匁５ハであう。

特許出願人　モレキュラー・セラビューティクス・イン
コーポーレテッド

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ヒトライノウイルス（ＨＲＶ）の主要な受容体を発
   現し、そしてＨＲＶカプシドへ結合する能力を阻害しか
   つ前記ウィルスの感染性を実質的に減少する動物細胞か
   ら分離された洗浄剤複合糖タンパク質からなることを特
   徴とする、水溶性ヒトライノウイルス（ＨＲＶ）の主要
   な受容体調製物。 ２、工程： ａ）ＨＲＶの主要な受容体を発現する動物細胞を非イオ
   ン性洗浄剤で抽出し、 ｂ）得られる洗浄剤−糖タンパク質複合体を、ＨＲＶ受
   容体タンパク質への結合について選択的である抗体と結
   合し、 ｃ）洗浄剤−ＨＲＶ糖タンパク質複合体を抗体から解離
   し、そして ｅ）得られるＨＲＶの主要な受容体の水溶性調製物を分
   離する、 からなることを特徴とする、特許請求の範囲第１項記載
   の水溶性ヒトライノウイルス（ＨＲＶ）主要な受容体調
   製物を得る方法。