DK174095B1 - Anvendelse af et humant rhinovirus (HRV)-hovedreceptorpræparat til fremstilling af et lægemiddel til inhibering af initieringen eller spredningen af rhino-virusinfektion - Google Patents

Description

DK 174095 B1 i

Den foreliggende opfindelse angår anvendelsen af et humant rhinovirus (HRV) -hovedreceptorpræparat til fremstilling af et lægemiddel til inhibering af initieringen eller spredningen af rhinovirusinfektion.

5 Det har vist sig, at man kan isolere af HRV-recep- torproteiner, som kan bindes til HRV og derved blokere virussens smittevne. Denne egenskab kan fungere som basis for at inhibere initieringen eller spredningen af HRV-infektion, bedre kendt som almindelig forkølelse.

10 For at inficere værtsceller skal vira nødvendigvis bindes til og derpå trænge ind i celler for at påbegynde en infektion. Siden 1959 har der i litteraturen Samlet sig beviser på, at tilstedeværelsen af specifikke bindingssteder (receptorer) på værtsceller kunne være en overvejende deter-15 minant for visse viras vævstropisme [J.J. Holland og L.C. McLaren, The Mammalian Cell-Virus Relationsship. II. Absorption, Reception, and Eclipse of Poliovirus by HeLa-Cells, J. Exp. Med. 109, 487-504 (1959) ; J.J. Holland, Receptor

Affinities as Major Determinants of Enterovirus Tissue Tro-20 pisms in Humans, Virology 15, 321-326 (1961)]. Blandt picor-navira, såsom poliovirus, coxsacchie-virus og rhinovira er specifik binding til værtsceller blevet påvist. Ved konkurrenceforsøg er det blevet påvist, at nogle af disse receptorer kan skelnes fra hinanden derved, at mætningen af én 25 virus' receptor ikke havde nogen virkning på bindingen af en anden virus. [K. Lonberg-Holm, R.L. Crowell og L. Philip-son, Unrelated Animal viruses Share Receptors, Nature 259, 679-681 (1976)].

Rhinovira udgør den største familie af picornavira 30 med 115 særskilte serotyper identificeret til dato. En stor fraktion af rhinovira (skønnes at være 80%) synes at bindes til en fælles receptor på humane celler. (G. Abraham og R.J. Colonno, Many Rhinovirus Serotypes Share the Same Cellular Receptor, J. of Virology 51, 340-345 (1984)]. I 35 1985 er isoleringen af et monoklont antistof beskrevet, som synes at være rettet mod den overvejende rhinovirus-receptor.

DK 174095 B1 2 [W.J. Colonno, P.L. Callahan og W.J. Long, Isolation of a Monoclonal Antibody that Blocks Attachment of the Major Group of Human Rhinoviruses, J. of Virology 57, 7-12 (1986)].

Det inhiberer infektion af celler med de pågældende serotyper 5 af rhinovirus, og det inhiberer binding af radiomærket rhi-novirus til celler. Denne gruppe rapporterer derefter, at det monoklone antistof bindes til et protein med en tilsyneladende molekylvægt på 90.000 dalton. (J.E. Tomassini og R.J, Colonno, Isolation of a Receptor Protein Involved in 10 Attachment of Human Rhinoviruses, J. of Virology 58, 290-295 (1986)]. Dette monoklone antistof er blevet anvendt til kliniske prøver med primater og mennesker og menes at tilvejebringe en vis beskyttelse mod rhinovirus-infektion.

Der findes adskillige andre rapporter om forsøg med 15 terapeutisk indgriben i rhinovirus-infektioner. Intranasal indgift af interferon hos mennesker har været forsøgt. [R.M. Douglas m.fl., Prophylactic Efficacy of Intranasal «-2-Interferon against Rhinovirus Infections in the Family Setting,

The New England J. of Medicine, 314, 65-75 (1986)]. I dette 20 tilfælde fandt man signifikant reduktion af infektionens sværhedsgrad, selv om der blev observeret næseblod som en bivirkning. Der er ligeledes blevet afprøvet flere disoxaril-analoge ("Win"-forbindelser), som reducerer smitteevnen hos en række picornavira (med stærkt varierende effektivitet, 25 afhængig af serotypen) , i vævskultur og i nogle dyremodeller.

[M.P. Fox, M.J. Otto og M.A. McKinlay, Antimicrob. Ag. and Chemotherapy 30, 110-116 (1986)]. Disse forbindelser synes at inhibere replikation på et trin efter receptorbinding, sandsynligvis i et eller andet trin i virusafdækning. Atom-30 coordinaterne for disse forbindelsers bindesteder inden for serotype HRV14's virale capsid er blevet konstateret ved hjælp af røntgen-krystallografi og er placeret i en hydro-fobisk lomme, der forekommer i hver protomer enhed i cap-sidet. [T.J. Smith m.fl., The Site of Attachment in Human 35 Rhinovirus 14 for Antiviral Agents that Inhibit Uncoating, Science 233, 1286-1293 (1986)]. Bindingslommens særlige 3 DK 174095 B1 funktion, hvis der er nogen, kendes ikke, men præparat-resistente mutanter med ombytninger af en enkelt aminosyre i denne region forekommer med stor frekvens og er levedygtige.

[J. Badger τη.f 1., Structural Analyses of a Series of An-5 tiviral Agents Complexed with Human Rhinovirus 14, PNAS 85, 3304-3308 (1988)]. Dette resultat sætter spørgsmålstegn ved sådanne forbindelsers effektivitet som lægemiddel. Der findes rapporter om produktion af anti-peptid-antistoffer i kaniner ved brug af peptider afledt fra aminosyresekvensen 10 i det virale capsids proteiner, som ordner "receptor canyon"-en i HRV14. (J. McCary og G. Werner, Different Rhinovirus

Serotypes Neutralized by Antipeptide Antibodies", Nature 329, 736-738 (1987)]. Selvom disse seras titre er ret lave, på-: vises kryds-serotype-beskyttelse af celler i vævskultur 15 fra rhinovirus-infektion, hvilket stiller muligheden for en vaccine i udsigt.

Det har vist sig, at man kan isolere et HRV-receptorprotein fra celler med den egenskab, at de blokerer HRV-infektion. I betragtning af den høje affinitet, som virusset 20 har for receptoren, er den hypotese blevet fremsat, at et terapeutisk middel, der er effektivt mod HRV-infektion, kunne være selve receptoren, eller især receptorens virus-bindende domæne. Et protein, proteinfragment eller peptid, . som omfatter det virus-bindende domæne, kunne blokere virus' 25 evne til at bindes til værtsceller ved at besætte (blokere) den receptor-bindende spalte på virusset. Eftersom endvidere et sådant molekyle ville udgøre nogle eller alle de molekylekontakter med viruscapsidet, som receptoren har, ville virusmutationer, som negativt påvirker molekylets binding af 30 receptoren, negativt påvirke receptorens binding og ville således være skadelige eller dødelige for virusset; derfor ville sandsynligheden for præparat-resistente mutanter være meget ringe. Endvidere ville et sådant molekyle være humant, hvilket reducerer sandsynligheden for, at det er antigent 35 hos mennesker.

Det har nu vist sig, at den overvejende humane rhi- DK 174095 B1 4 novirus-(HRV)-receptor kan isoleres som en vandopløselig tilberedning, der udviser den ønskede egenskab, at den bindes til HRV-capsider og i væsentlig grad reducerer virussets smitteevne. Tilberedningen foreligger i form af detergent-5 kompleksbundet glycoprotein isoleret fra dyreceller, fortrinsvis pattedyreceller, som udtrykker hoved-HRV-receptoren. Det rensede receptorprotein kan karakteriseres på følgende måde. Det er et glycoprotein med en tilsyneladende molekylvægt på 95.000 dalton og omfatter bindingsstedet for 10 HRV. Glycoproteinet indeholder 6-7 asparaginforbundne oligo-saccharid-kæder og foreligger i tilberedningen i form af et detergent-micelle-bundet protein.

Opfindelsen angår således anvendelsen af et humant rhinovirus (HRV)-hovedreceptorpræparat indeholdende ICAM-1-15 monomer af funktionelle domæner, fragmenter eller analoger omfattende det test-Ig-lignende domæne af ICAM-1, som udviser evne til binding til HRV-capsider, til fremstilling af et lægemiddel til inhibering af initieringen eller spredningen af rhinovirusinfektion, og opfindelsen angår tillige anven-20 delsen af et humant rhinovirus (HRV)-hovedreceptorpræparat indeholdende en forbindelse fra gruppen: det hele ekstracel-lulære domæne af ICAM-1, aminosyrerne 1-200, tlCAM (1-453), tlCAM (1-283), tlCAM (1-184) eller tlCAM (1-88), som udviser . evne til binding til HRV-capsider, til fremstilling af et 25 lægemiddel til behandling af rhinovirusinfektion.

Generelt kan hoved-HRV-receptor-tilberedningen fås ved ekstraktion af passende dyreceller, som man véd udtrykker hoved-HRV-receptoren, med et ikke-ionisk detergent, efterfulgt af immunrensning. Mange humane cellelinier udtrykker 30 receptoren, såsom HeLa og WI38. En hvilken som helst af disse humane HRV-receptor-kilder kan ekstraheres. Særlig anvendelige er HeLa-celler. Desuden kendes transficerende ikke-humane pattedyrecellelinier, som udtrykker HRV-recep-toren, eller de kan fremstilles, hvilket udgør en anden 35 anvendelig receptorkilde. Især udgør transficerende cellelinier, der er beskrevet i offentliggjort Europa-patent- 5 DK 174095 B1 “ ansøgning nr. 0.319.815, en nærliggende receptorkilde, især sådanne sekundære transfektanter, som er blevet udvalgt for receptoroverekspression. Andre dyreceller, som er kendt på området eller senere er blevet udviklet, såsom insektvævs-5 kulturceller, som er blevet transficeret med genet og udtrykker receptoren, kan også anvendes.

Hovedsagelig et hvilket som helst ikke-ionisk detergent kan anvendes til ekstraktion, forudsat at proteinreceptorens oprindelige konformation ikke ødelægges. Denaturering 10 af receptoren kan bestemmes ved at overvåge det ekstraherede proteins evne til at inhibere virussmitteevne eller følsomhed over for proteolyse. Det er blevet konstateret, at receptoren kan denatureres ved opvarmning ved 60°C i 30 min. eller ved behandling med 1% SDS, hvilket viser, at man må sørge for 15 at bibeholde HRV-bindingsstedets oprindelige konformation. Eksempler på anvendelige ikke-ioniske detergenter er alkyl-polyoxyethylenethere (såsom Brij), alkylphenylpolyoxyethyl-enethere (såsom Triton X-100 og Nonidet P-4 0), acylpolyoxy-ethylensorbitanestere (såsom Tween) , og β-D-alkylglucosider, 20 idet Triton X-100 anses for særlig foretrukket.

Nøgl'etrinnet i rensningen af receptoren er fraktionering med stærkt selektivt anti-receptor-antistof. Den nemmeste måde til opnåelse af et sådant antistof er monoklone metoder. Det foretrækkes især at fremstille monoklone 25 muse-antistoffer ved dannelse af hybridomcellelinier ud fra fusionering af muse-myelomceller og muse-transficerende celler, der udtrykker HRV-receptoren. Yderligere enkeltheder findes i offentliggjort Europa-patentansøgning nr. 0.319.815.

Efter at detergent/glycoprotein-komplekserne, der fås fra 30 celleekstrakten, er bundet til det valgte monoklone antistof, adskilles komplekser, der er bundet til antistof, fra det øvrige af blandingen. Derefter dissocieres detergent/recep-tor-komplekser bundet til antistof, idet man atter sørger for at forhindre denaturering, og den opnåede vandopløselige 35 receptortilberedning isoleres. Passende betingelser til dissociering af detergent/receptor-komplekser fra antistoffet DK 174095 B1 6 * kan konstateres empirisk og kan forventes at variere noget fra antistof til antistof. Dissociering ved at hæve pH har i nogle tilfælde vist sig at være mest effektiv ved lavt pH eller højt saltindhold, betingelser, der fungerer, men 5 som giver lavere proteinudbytter.

Det foretrækkes at udføre en mellemliggende rensning før rensning med antistof. Sådanne mellemliggende trin omfatter adsorbering af de detergent-ekstraherede proteinkomplekser på en lectin, der kan binde HRV-receptor, fraskil-10 lelse af absorberede komplekser fra resten af blandingen og dissociering af sådanne komplekser til efterfølgende behandling med antistof. Valget af lectin og dissocieringsbetin-gelser er i reglen empirisk. Det har vist sig, at HRV-recep-toren bindes på passende måde til hvedekimagglutininlectin 15 og dissocieres effektivt ved vask med en opløsning af N-acetylglucosamin. Da oligosacchariderne på receptorproteinet ikke er fuldstændig karakteriserede, og fordi receptorproteinet kan glycosyleres forskelligt på forskellige celletyper (f.eks. musecelletransfektanter), kan det forventes, at også 20 andre lectiner er egnede. Valg af et passende alternativ til hvedekimagglutinin og/eller elueringsmiddel kan overlades til fagfolk på området.

Den opnåede tilberedning kan behandles med proteoly-tiske midler, såsom proteaser, f.eks. trypsin, til fremstil-25 ling af mindre glycoproteinfragmenter, som bibeholder evnen til at binde og reducere HRV's smitteevne. Således kan peptidfragmenter spaltes fra den endestillede region i glyco-proteinet, f.eks. C-endestillingen, hvilket giver glycoprotein- fragmenter, som bibeholder HRV-binding. Sådanne glyco-30 protein-fragmenter kan f.eks. have en tilsyneladende molekylvægt mellem ca. 80.000 og ca. 95.000 dalton. Mindre fragmenter, som bibeholder receptorens HRV-bindingsdomæne, anses også for at være omfattet af den foreliggende opfindelses omfang.

35 Receptor-tilberedningen har vist sig at inhibere virussets smitteevne, formodentlig ved at bindes til HRV- 7 DK 174095 B1 capsidet, så at dets evne til at binde og inficere humane celler blokeres. En sådan iagttagelse viser, at receptortilberedningen vil være anvendelig til at reducere infektionen af humane værtsceller in vivo ved at bringe virusset i kon-5 takt med tilberedningen under betingelser, der er egnede til binding med virusset. En terapeutisk form vil være en vandig opløsning af receptoren i nærvær af ikke-ionisk detergent for at bibeholde receptoren i opløsning og i dens oprindelige konformation. Detergenter med lavere kritiske 10 micelle-koncentrationer, såsom alkylpolyoxyethylenetheren Brij 58, vil være at foretrække for at reducere koncentrationen af detergent i den terapeutiske opløsning. Receptortilberedningen kan indgives in vivo ved passende kontakt* med de områder af kroppen, der kan inficeres med HRV, f.eks.

15 ved hjælp af intranasal spray.

Opfindelsen vil i det følgende blive belyst ved hjælp af nedenstående eksempler, som dog ikke skal fortolkes begrænsende .

20 Fremstilling af renset human rhinovirus-receptor-(HRR)-protein (1) Humane celler (f.eks. HeLa) eller muse-L-celle-transfektanter (f.eks. cellelinierne, der er beskrevet i offentliggjort Europa-patentansøgning nr. 0.319.815), dyrkes 25 op i store antal som cellulære monolag i standard-vævskul-turmedium (Dulbecco's modificerede essentielle medium indeholdende 10% kalvefosterserum,· transficerende celler holdes i samme medium indeholdende HAT (hypoxanthanin/aminoptherin/-thymidin) for at opretholde selektive tryk for udvælgelses-30 markøren (Herpes TK). Celler opløses i én time ved 4°C i en fysiologisk puffer (phosphatpufret saltopløsning) indeholdende en ikke-ionisk detergent f.eks. Triton X-100) (T-puf-fer) og en blanding af protease-inhibitorer (aprotinin, leupeprin ved 10/zg/ml, EDTA ved 1 mM) for at forhindre pro-35 teolytisk nedbrydning af receptoren. Uopløseligt materiale fjernes ved filtrering gennem et 0,22 μ filter.

DK 174095 B1 8 (2) Ekstrakten absorberes på en affinitietsharpiks, der indeholder hvedekimagglutinin (WGA), (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA), tværbindes til Sepharose i 18 timer ved 4°C under forsigtig blanding (2 ml pakket harpiks 5 indeholdende 5 mg WGA/ml harpiks, pr. 109 celler). Affinitet sharpiksen vaskes derpå omhyggeligt med puffer for at fjerne ubundne glycoproteiner og elueres med det konkurrerende monosaccharid N-acetylglucosamin (0,3 M N-acetylglu-cosamin i T-puffer) i én time ved stuetemperatur.

10 (3) WGA-Sepharose-elueringsmidlet absorberes derpå til en affinitetsharpiks, hvortil der er koblet renset monoklont antistof mod HRR (f.eks. ATCC HB 9a594, der omtales i offentliggjort Europa-patentansøgning nr. 0.319.815. Det monoklone antistof IgG renses ved ammoniumsulfat-fældning [P.

15 Parham, Meth. Enzymol. 92, 110-138 (1983)] efterfulgt af affinitetschromatografi på enten protein A-Sepharose [P.L.

Ey m.fl., Immunochern. 15, 429-436 (1978)] eller en Abx-ko-lonne (J.T, Baker Co., Phillipsburg, NJ, USA) ved at følge fabrikantens anvisninger. Monoklont IgG-affinitetsharpiks 20 fremstilles ved at koble IgG til cyanogenbromid-aktiveret Sepharose (P. Parham, supra).

Efter at der er tilsat 10 rø/ml humant transferrin for at blokere adsorption af transferrin-receptor til harpiksen, inkuberes elueringsmidlet ved 4°C i 18 timer med har-25 piksen under blanding (40-200 μΐ harpiks indeholdende 5 mg IgG/ml harpiks, pr. 109 celler) , vaskes udtømmende med Τ'-puffer for at fjerne ubundne proteiner og elueres derpå under ikke-denaturerende betingelser med en høj-pH-puffer [0,05 M diethanolamin (pH 11,5) med 0,1% Triton X-100] i én 30 time ved stuetemperatur. Elueringsmidlet fjernes, neutraliseres ved tilsætning af 0,2 volumendele 1 M HEPES (pH 7,2) og dialyseres mod tre skift af en fysiologisk puffer indeholdende en smule ikke-ionisk detergent for at opretholde receptorens opløselighed (0,01 HEPES, 0,150 M NaCl, 0,001 35 M CaCl2, 0,1% Triton X-100, pH 7,5).

Receptoren kan renses yderligere ved hastighedssedi- 9 DK 174095 B1 mentation ved hjælp af saccharose-gradienter for at fjerne en gruppe mindre forureninger med høj molekylvægt (>200.000 dalton). Receptortilberedningen lejres foroven på en 15-35% saccharose-gradient (samlet volumen ca 4,5 ml) og centrifu-5 geres ved 300.000 x G i 18 timer ved 4°C. Fraktioner opsamles fra gradienten, og fraktioner, der indeholder rhinovirus-receptor, der sedimenterer ca. 1/3 ned ad gradienten, slås sammen, inddampes (om nødvendigt) og dialyseres.

(4) Den opnåede tilberedning ud fra HeLa-celler viser 10 sig at indeholde et glycoprotein med en tilsyneladende molekylvægt på 95.000 dalton. Ud fra muse-transfektant-celler isoleres et protein med samme molekylvægt, men med større heterogeneitet (efter analyse ved SDS-PAGE). Det isolerede protein har vist sig at omfatte rhinovirus-receptoren ved: 15 (a) Immunfældning ud fra med 125l overflademærkede HeLa- celler og musetranfektanter, der udtrykker den humane rhinovirus -receptor med et monoklont antistof, som inhiberer rhinovirus' binding til celler.

(b) Immunfældning af renset med 125j mærket receptor med 20 monoklont ATCC HB 9594 antistof.

(5) Der fremstilles et tryptisk fragment ved at fordøje receptoren med 1% (vægt E/vægt receptorprotein) trypsin i én time ved 37°C. Reaktionsblandingen påføres på en GF-450 gelfiltreringskolonne (Dupont), der er bragt i ligevægt 25 i N-puffer, og det proteolytiske fragment adskilles fra enzymet. Analyse af de opnåede fragmenter ved hjælp af SDS-PAGE viser en blanding af et receptorfragment på 90.000 dalton og et receptorfragment på 83.000 dalton. Disse fragmenter elueres i samme position på en gelfiltreringskolonne 30 som intakt receptor, hvilket tyder på, at de er bundet til en detergent-micelle. Aminosyre-sekvensbestemmelse af fragmenterne giver ingen sekvens, hvilket viser, at de ligesom den intakte receptor har en blokeret N-endestilling, og endvidere, at peptider, der mistes fra 90.000- og 83.000 35 dalton-fragmenterne, er fra proteinets C-endestilling.

DK 174095 B1 10

Karakterisering af tilberedningen (1) Receptortilberedningens renhed bedømmes ved hjælp af SDS-PAGE ved sølvfarvning. Mængdebestemmelse af protein foretages ved at sammenligne sølvfarvet protein med en række 5 standard-proteiner med kendt mængde på SDS-PAGE og bekræftes ved hjælp af aminosyre-analyse, idet man går ud fra en protein-molekylvægt på 50.000 dalton (sker ved at bestemme den tilsyneladende molekylvægt på SDS-PAGE for deglycosyleret receptor).

10 (2) Proteinet viser sig ved fordøjelse af kerne-gly- cosyleret receptor med endoglycosidase H at være et glycoprotein, der indeholder 6-7 asparagin-bundne oligosaccharidkæder. Efter gelfiltrering elueres receptoren med et volumen, der svarer til en protein-molekylvægt på 250.000 dalton.

15 Denne oplysning sammen med bevis fra kemiske tværbindings-forsøg, der viser, at receptoren er en monomer, stemmer overens med receptoren, der opfører sig som et protein bundet til en detergentmicelle.

(3) Det rensede receptor-protein viser sig at bindes 20 til rhinovirus in vitro. Når med 125I mærket og med 35S-cystein metabolisk mærket HRR inkuberes i 30 min. ved 34°C med 1 ^g/ml HRV14 eller HRV3, viser det sig at associere med virus ved sedimentering i saccharose-gradienter eller ved pelletering i en centrifuge med høj hastighed. Det kan på-2 5 vises, at denne binding er specifik ved at lade bindingen med radiomærket receptor konkurrere med umærket receptor. Reaktionen in vitro har samme temperaturafhængighed som in vivo: receptor bindes til virusset ved ved 37°C, men ikke ved 4°C.

30 (4) Receptoren viser sig at inhibere rhinovirus' smitteevne, når man inkuberer HRR med virus (under de samme betingelser som beskrevet ovenfor, hvor binding kan påvises) og derpå afprøver de opnåede blandinger med hensyn til smitteevne ved en begrænsende standard-fortyndingssmitteevneprø-35 ve. Der fremstilles en HeLa-celle-suspension ved frigørelse med 0,03% EDTA/PBS i 10 min., og cellerne vaskes i 2% FBS/- DK 174095 B1 11 DMEM (I medium) med 10 mM HEPES og justeres til en koncentration på 1,1 x 107 celler/ml. Virus eller virus/receptor-blandinger fortyndes serievis i I medium, og 20 μΐ virus blandes med 180 μΐ celler og inkuberes i 60 min. ved stue-5 temperatur. Blandingen fortyndes derpå med 9 volumendele I medium og udstryges i 8-10 fordybninger på en vævskulturplade med 96 fordybninger (ca. 200 μΐ/fordybning) og dyrkes ved 34°C i 5 dage. Kulturerne får derpå point efter CPE (cyto-patisk virkning), og titeren af den oprindelige beholdning 10 bestemmes ved hjælp af følgende formel: antal døde fordybninger/10 x 50 x fortyndingsfaktor = PFU/ml

Resultaterne ses i nedenstående tabel.

15

TABEL

Virus HRR (M/L) Virustiter (PFV/ml HRV14 0 2 X 107 20 " 6,6 x 10~9 3,5 x 106 " 2 x 10‘8 4,5 x 106 " 6,6 x 10'8 2 x 106 " 2 x 10“7 3 x 104 HRV3 0 2,5 X 106 25 " 6,6 x 10'9 3 x 105 " 2 x 10~8 3,5 x 105 " 6,6 x 10-8 3,5 x 104 " 2 x 10-7 5 x 103 30 Der afprøves yderligere HRV-serotyper. HRV4, -11-, -17- og -89-serotyper (hovedklasse) inhiberes af virusset, hvorimod HRV la og 2 (mindre klasse) ikke inhiberes.

De ovenfor beskrevne resultater viser, at det rensede HRR kan blokere smitteevnen hos rhinovira, der hører til 35 hovedreceptorklassen af rhinovira. Receptorproteinets in-hiberende egenskab på smitteevnen har forbindelse med dets DK 174095 B1 12 evne til at bindes til virusset og formodes at virke blokerende på receptorbindingsstedet på virusset. Denne egenskab hos receptoren kommer til udtryk ved lave koncentrationer af receptorproteinet og viser en høj affinitet hos receptoren 5 for virusset. Betydningen af disse resultater er, at den rensede opløselige receptor kan anvendes til at inhibere igangsætningen af spredningen af rhinovirus-infektioner in vivo. Det rensede protein udgør også en kilde til materiale, hvorfra mindre proteinfragmenter og peptider kan derivati-10 seres, der har samme aktivitet som den intakte receptor.

På tegningens fig. 1 ses ICAM's aminosyresekvens (minus signalsekvens). Sekvenser, der fås fra peptidfragmenter i HRR, vises med punkterede eller stiplede linier under ICAM's tilsvarende sekvens; stiplet betyder sikkert 15 angivne peptidsekvenser, punkteret betynder tvivlsomme angivelser, og xx betyder ukorrekte bestemmelser af tvivlsomme angivelser. Tallene under peptidsekvenser viser kodenanvnet på proteinsekvensbestemmelsesforsøget.

Derpå underkastes renset protein begrænset eller 20 komplet proteolytisk nedbrydning, peptider renses enten ved omvendt-fase-chromatografi, gelfiltrering eller SDS-PAGE og underkastes derpå automatiseret proteinsekvensbestemmeIse.

Disse sekvenser anvendes til at søge i proteinsekvens- (NRFB og MIPSX) og DNA-sekvensdatabaser (genbank). Der foretages 25 en matchning af alle kendte peptidsekvenser bestemt ud fra HRR-protein.

[Intercellulær Adhesion Molecule-1, Simmons m.fl., "ICAM,

An Adhesion Ligand of LFA-1, Is homologous To The Neural Cell Adhesion Molecule of NCAM", Nature 331, 624-627 30 (1988)]. ICAM undersøges af andre forskere på grund af sin rolle med hensyn til T-lymphocytters adhæsion til en række forskellige celletyper. Man har fremsat den hypotese, at ICAM (der forekommer på fibroblaster, epithelceller, leu-kocytter og endothelceller) samvirker med en struktur kaldet 35 LFA-1 (med lymphocyt-funktion associeret antigen-1), der forekommer på T-lymphocytters overflade, og derved er an- DK 174095 B1 13 svarlig for adhæsionen til disse celletyper.

Man har nu bestemt sekvensen i 106 aminosyrer i rhi-novirusreceptoren, og alle 106 passer nøjagtig til sekvensen i I CAM (ud af ialt 507 aminosyrer, der er forudsagt for 5 ICAM-sekvensen). Andre biokemiske informationer understøtter HRR's identitet med ICAM. For det første har det primære mRNA-translationsprodukt, der er syntetiseret i et in vitro-translationssystem, en tilsyneladende molekylvægt på 55.000 dalton, hvilket er den samme som ICAM1s. For det andet har 10 den HRR-proteintype, der findes i celler forgiftet med tu-nicamycin, der er en specifik inhibitor af asparagin-bundet glycosylering, en tilsyneladende molekylvægt på 54.000 dalton, hvilket passer med fjernelsen af en signalsekvens fra proteinets N-endestilling. For det tredie viser delvis for-15 døj else af kerne-glycosyleret HRR-protein tilstedeværelse af 7 aspargin-bundne carbonhydrat-grupper, hvilket stemmer med tilstedeværelsen af 8 mulige carbonhydrat-acceptorse-kvenser (N-S/T) i ICAM's aminosyresekvens. Endelig bestemmes HRR's chromosomkortposition til at være humant chromosom 20 19, identisk med, hvad der er konstateret for ICAM.

Eftersom det komplette nucleotid og aminosyresekvensen i ICAM er blevet bestemt, og der er væsentlige, om ikke: overvældende tegn på, at ICAM og HRR er de samme eller . meget lignende molekyler, kendes nu rhinovirusreceptorens 25 komplette aminosyresekvens. Bestemmelsen af denne aminosyre-sekvens, som er dette molekyles partielle kemiske struktur, giver mulighed for at udforme og producere en stor mængde receptorprotein, fragmenter, funktionelle domæner og afkortede versioner samt receptorproteinanaloge og peptider, som 30 har inhiberende aktivitet over for rhinovirus- og coxsackie A-virusinfektion. Den komplette aminosyresekvens giver også oplysninger, der er nødvendige for biofysiske og biokemiske undersøgelser af rhinovirus/receptor-samspil, som vil føre til identifikationen af afgørende molekylære kontakter, som 35 kan anvendes til udformningen af hidtil ukendte inhiberende molekyler.

DK 174095 B1 14

Eftersom ICAM-molekylet er et medlem af immunglobulin-supergen-familien [Eur. J. Immunol. 15, 103-106 (1984)], og eftersom andre picornavira, såsom poliovirus og coxsackievirus, bindes til receptorer, hvis gener er anbragt på chro-5 mosom 19, er det muligt, at ICAM kan anvendes som basis for udviklingen af terapeutica til modvirkning af infektioner også af andre picornavira. Det er muligt, at ICAM eller fragmenter deraf er anvendelige direkte som terapeutica til andre virus- og inflammationssygdomme. Alternativt vil kend-10 skabet til ICAM-struktur være anvendeligt til identifikation af sådanne viras receptorer. Endvidere er ICAM-1 nært be-slæget med to adhæsionsproteiner i det voksne nervesystem, neuralt celleadhæsionsmolekyle (NCAM) og myelin-associeret glycoprotein (MAG) og en familie af epithelcellemolekyler, 15 herunder CEA, NCA, TM-CEA og de graviditets-specifikke Bl-glycoproteiner. NCAM, MAG og ICAM-1 har hver 5 immunglobulin-lignende domæner, jfr. Dustin m.fl., "Supergene Families Meet In The Immunesystem", Commentary, Elsevier Publications, Cambridge (1988). Slægtskabet mellem picornavira og super-20 genfamilien bestående af ICAM, NCAM og MAG danner basis for udviklingen af proteiner, proteinfragmenter, funktionelle domæner, analoge og blandinger deraf til inhibering af smitteevnen hos denne virusklasse.

Kendskab til aminosyresekvensen og oplysninger om 25 ICAM-proteinet sammen med kendskabet til HHR og rhinovirus danner basis for de følgende forslag til udformning af proteinfragmenter og analoge til behandling af rhinovirus-infektion og til behandling af inflammation.

Opløselige former af biologisk aktivt værtscellepro-3 0 tein kan anvendes til at inhibere virusinfektion i modsætning til det cellemembran-bundne receptorprotein, som i reglen letter infektionen. Opløselige former af biologisk aktivt receptorprotein, proteinfragmenter, funktionelle domæner eller analoge kan omfatte anvendelsen af detergenter som 35 beskrevet ovenfor. Alternativt kan eliminering af C-ende-stillingen gøre proteinet(rne) opløseligt(e). Et biologisk DK 174095 B1 15 aktivt tryptisk fragment er en blanding af to arter, én med en tilsyneladende molekylvægt på 83.000 dalton og én på 90.000 dalton (i forhold til HRR på 95 Kd) . N-endestillingen i begge arter blokeres, hvilket viser, at de begynder fra 5 rest 1 i det intakte HRR-molekyle, og peptider fjernes fra C-endestillingen: Det størst mulige fragment vil gå fra rest 1 til rest 488. En nedadgående ændring i tilsyneladende molekylvægt i forhold til intakt HRR viser et tab på >5.000 dalton eller 45 aminosyrerester, hvilket vil anbringe de 10 nye fragment-C-endestillinger i stillinger proximalt (N-endestillet) til transmembransegmentet.

Eksempler på opløselige fragmenter kan omfatte hele det ekstracellulære domæne (op til a.a. 480) eller kan omfatte én eller begge adskilte dele i det ekstracellulære 15 domæne (a.a. 1-200; 200-460) i receptorproteinets aminosyre-sekvens. Det forventes endvidere, at mindre peptidfragmenter kan udgøre biologisk aktive analoge til inhibering af virusinfektion.

En cDNA-klon med fuld længde af HRR isoleres fra et 20 cDNA-bibliotek over Hel- eller andre celler, der udtrykker receptoren, ved at screene med oligonucleotider fremstillet ud fra den offentliggjorte ICAM-1-sekvens. Konstruktion og ekspression af domænefragmenter af HRR opnås ved anvendelse . af etablerede rekombinant-DNA-metoder [Fisher m.fl., Nature 25 331, 76-78 (1988); Husseym.fi., Nature 331, 78-81 (1988); og Deen m.fl., Nature 331, 82-86 (1988)]. Et opløseligt ekstracellulært domæne fremstilles ved i HRR at spalte en cDNA-klon, der koder sekvensen, med Thai, som skærer i position 37 i signalpeptidregionen og i position 1415, 12 30 aminosyrer før begyndelsen af det transmembrane domæne. Syntetiske oligonucleotid-forbindelsesstykker tilføjes trinvis på molekylets 5'- og 3'-ender for at genoprette signal-peptidet og initiator ATG ved N-endestillingen og for at indføre et ramme-translationsstopcodon ved C-endestillingen.

35 Stopcodonets position kan varieres, så at der fremstilles alternative afkortede former af molekylet. På lignende måde DK 174095 B1 16 anvendes forskellige sjældne skærerestriktionsenzymer til at indsætte stopcodoner i andre regioner af molekylet. Restriktionsenzymsteder medtages i enderne af forbindelsesstykkeme for at tillade styret kloning til en række forskellige eks-5 pressionsvektorer. Oligonucleotidsteds-dirigeret mutagenese ved hjælp af gængse metoder anvendes til at indføre restriktionsenzymsteder, når der ikke findes passende naturligt forekommende steder. Yderligere anvendes polymerase-kædereaktions- (PCA)-metoden til at fremstille særlige DNA-frag-10 menter, der koder domæner og andre underregioner i molekylet .

De ovennævnte løsninger anvendes også til fremstilling af yderligere underfragmenter af receptoren, såsom de 5 immunglobulin-lignende domæner (resterne 1-88, 89-185, 186-15 284, 285-385 og 386-453), Staunton m.fl., Cell 52, 925-933 (1988). I dette tilfælde medtages der passende signalsekvenser til styring af proteinudskillelse til det ekspressionssystem, der anvendes. Der anvendes forskellige ekspressionssystemer, herunder virale promotorer i pattedyre-20 celler [Cate m.fl., Cell 45, 685-698 (1986)]; insektceller [Smith m.fl., Proc. Acad. Sci. USA 82, 8404-84-8 (1985)]; og E.coli [Skerra og Pluckthun, Science 240, 1038-1041 (1988)]. Underfragmenter af receptoren, der fremstilles på ovennævnte måde, afprøves for deres evne til at binde over-25 vejende rhinovirus-serotyper og til at reducere virus' smitteevne. Ekspression af det ekstracellulære domæne som beskrevet ovenfor anvendes ligeledes til at aflede tilstrækkelig mængder af den opløselige receptor til strukturundersøgelser, såsom røntgenkrystallografi.

30 Strukturundersøgelser ved hjælp af enzymatisk og kemisk fragmentering af ureduceret ICAM-1 har kortlagt tre disulfidbindinger af ialt 7 potentielle par og har forsøgvis kortlagt yderligere to disulfidbindinger. Disse resultater viser disulfidbindinger mellem C108 og C159, mellem C210 og 35 C263 og mellemn C305 og C344; spaltning ved M64 med CNBr viser, at C21 og C25 danner par med C65 og C69, og modelop- DK 174095 B1 17 bygning baseret på den Iq-lignende foldning viser pardannelse af C21 til C65 og C25 til C69. Disse data bidrager til at støtte en strukturmodel af ICAM-1 med tre N-endestillede Ig-lignende domæner (jfr. tegningens fig. 2).

5 Ud fra ICAM-1 cDNA konstrueres en række cDNA'er (tICAM'er eller forkortede ICAM'er), så at de indeholder præmature stopcodoner ved aminosyrepositionerne 454, 284 og 185 i det modne protein til fremstilling udskilte proteiner, der progressivt afkortes fra C-endestillingen. Afkortninger-10 nes positioner udvælges på basis af de forudsagte grænser for transmembrandomænet [tICAM(1-453}], immunglobulin-lignende domæner 1+2+3 (tICAM)1-283) og immunglobulin-lignende domæner 1+2 (tICAMl-183)) og immunglobulinlignende domæne 1 (tICAM(1-88). Proteinprodukterne af disse gener findes i 15 diagram i fig. 2 på tegningen. De konstrueres ved hjælp af polymerasekædereaktioner (PCR) ved hjælp af 5'- og 3'-oligo-nucleotid-igangsættere, som overlapper I CAM-2-kodningssekvensen og indeholder restriktionsenzymsteder/ 5'-igangsætteren indeholder et yderligere EcoRl-sted, og 3'-igangsætterne 20 indeholder et yderligere translationsstopcodon og et Baml-sted. Disse’DNA'er klones i korrekt retning ind i Bluescript-SK-vektoren (Strategene) , der er udskåret ved en HindIII/Xba-fordøjelse. Disse gener og en kontrol-ICAM-1 cDNA med fuld . længde klones derpå i korrekt retning ind i ekspressionsvek-25 toren CDM8 (Seed m.fl.) ved hjælp af Hindlll-stedet i genets 5'-ende og Xba-stedet i 3'enden. Disse plasmider transficeres ind i COS-celler ved hjælp af DEAE-dekstran-metoden, og cellerne dyrkes i 72 timer før afprøvning. Overfladeekspression overvåges ved hjælp af FACS ved brug af indirekte im-30 munfluorescens og et monoklont antistof, der er specifikt for ICAM-1. Udskillelse af ICAM-1 i mediet overvåges ved metabolisk mærkning af celler i 7 timer med 35 S-cystein efterfulgt af immunabsorption af kulturoverfaserne med en monoklon anti-ICAM-l-sepharosepharpiks. Facs-analysen viser 35 tydeligt overfladeekspression af ICAM-1 i celler transficeret med IBAM-1 i fuld længde; celler transficeret med CMS8-vek- DK 174095 B1 18 toren alene eller med tiCAM (1-453) udviser ingen overfladeekspression. Når materialet, der er isoleret fra de metabolisk mærkede kulturoverfaser, bliver analyseret ved hjælp af SDS-PAGE efterfulgt af fluorgrafi, iagttages ingen ICAM-1 i 5 kontrol- eller fuld-længde-ICAM-l-transfektanter, og der udskilles et protein på 80.000 dalton af tiCAM (1-453)-trans-fektanter, et protein på 65.000 dalton af tICAM (1-283(-transfektanter og et protein på 43.000 dalton af tICAM )1-184)-transfektanter. Når det samme materiale farves for 10 protein ved sølvfarvning, er det klart, at tICAM(l-453) i det væsentlige er rent. Stabile transfektanter dannes ved at transficere de samme cDNA'er blandet med genet for en markør, der kan udvælges (thymidin-kinase til muse-L-celler, dihydrofolatreductase til CHO-celler), ind i muse-Ltk-celler 15 eller hamster-CHO(dhfr-)-celler og underkastes præparatudvælgelse (HAT-udvælgelse til Ltk-celler og methatrexat til CHO(dhfr-)-celler). Overlevende celler klones, og kulturoverfaser fra disse celler screenes ved hjælp af en radioim-munprøve, hvor MAb c78,5 absorberes på mikrotiterskåle, 20 renset ICAM-1 eller kulturoverfaser inkuberet med de MAb-overtrukne skåle, og derefter påvises bundet ICAM-1 ved inkubation med 125-mærket MAb c78.4. Der fås adskillige L-celletransfektanter og én CHO-celletransfektant, der udskiller tICAM(l-453) og L-celler, som udtrykker tICAM(l-183).

25 Ekspression bekræftes ved hjælp af metabolisk mærkning af celler efterfulgt af immunabsorption af kulturoverfaser som beskrevet ovenfor.

tICAM(l-88) er blevet udtrykt i E.coli ved hjælp af OmpA-sekretionsvektor fra Inoue. I dette system fusioneres 30 OmpA-signalpeptidet med modent ICAM-1-proteins N-endestil-ling. tICAM(l-88) og tICAM(1-183) anbringes i OmpA-vektoren; E.coli, der er transformeret med disse vektorer, udtrykker proteinprodukter af den forventede størrelse som påvist ved Western-aftryk af SDS-PAGE-geler af celleekstrakter med 35 anti-peptid-antistoffer mod en sekvens inden for domæne 1 i ICAM-1.

DK 174095 B1 19

Blokeringsundersøgelser med et panel af 6 MAb'er mod ICAM-1 (som alle inhiberer virusbinding til ICAM-1) viser, at der findes to adskilte epitoper, der defineres af disse antistoffer, én defineret af c78.4 (indeholdende c78.1, 5 c78.2, c92.1 og c92.5). Immunfældningsundersøgelser med proteolytiske fragmenter af ICAM-1 og med in vitro-translat ioner af afkortede ICAM-l-cDNA'er viser, at begge disse epitoper indeholdes i det første Ig-lignende domæne.

In vitro-virusbindings-undersøgelser, ved hvilke der 10 anvendes radiomærket tICAM(1-453) og renset rhinovirus har vist, at det kan bindes til rhinovirus i opløsning.

Yderligere biologisk aktive fragmenter bedømmes ved hjælp af overlappende sæt af syntetiske peptider på 10-20: rester svarende til en del af eller alt HRR-proteinet. Pep-15 tiderne fremstilles og afprøves individuelt for deres evne til at inhibere virusbinding til receptoren.

Disse peptidfragmenter kan være direkte kopier af en del af rhinovirus-receptoren eller kan indeholde sekvenser fra ikke-tilgrænsende regioner i receptoren.

2 0 Man har på basis af homologi med NCAM forudsagt, at I CAM er et medlem af immunglobulin-gen-superfamilien. Man skulle forvente, at immunglobulin-lignende domæner i ICAM ville have den grundlæggende "immunglobulin-fold", som den er blevet påvist for to andre medlemmer af familien, β-2-25 mikroglobulin og HLA-A2-a-3-domænet. Denne fold består af en "β-barrel" udformning bestående af to antiparallele β-foldede plader, én sammensat af tre og én sammensat af fire β-strenge; en disulfidbinding mellem to cystein-rester (adskilt af ca. 60 aminosyrer langs kæden) forbinder de to 30 plader [A.F, Williams, Immun. Today 8, 298-303 (1987)]. To af disulfidbindingerne, dem, der svarer til domæne 2 (C110-C161) og 3 (C212-C265), er blevet bestemt forsøgsmæssigt af ansøgerne og støtter modellen. Denne strukturmodel danner basis for udformning af unike analoge, som kan efterligne 35 virusbindingsstedet og være anvendelige som receptorblokeringsmidler. Hvert par antiparallele β-strenge i "β-barrel" DK 174095 B1 20 forbindes ved hjælp af et hårnålesving med variabel størrelse; et sådant sving eller løkke, som rager ud fra sekundære strukturer, viser sig ofte af spille en rolle ved genkendelsen af ligander [Lezczynski og Rose, Science 224, 849-855 5 (1986)]. Sådanne udadragende strukturer kan være af en særlig interesse i rhinovirus-receptoren, eftersom det foreslås, at receptorbindingsstedet på viruscapsidet ligger i en tilbagetrukket hulhed. Ved hjælp af HRR-sekvensen kan sådanne sving og løkker forudsiges på basis af en "β-barrel"-struktur 10 og fremstilles som syntetiske peptider med tilføjelse af nye cysteinrester i peptidernes N- og C-endestilling; en disulfidbinding dannes derpå mellem sådanne rester på det samme peptid for at lukke løkken covalent (i modsætning til det oprindelige protein, hvor løkken lukkes ved ikke-covalent 15 samspil mellem tilstødende β-strenge). Sådanne peptider har en konformation, der er mere analog med konformationen i det oprindelige protein end et enkelt lineært peptids og afprøves for virus-bindende aktivitet.

Fremgangsmåde til lokalisering af den region eller det 20 domæne i molekylet, der er ansvarligt for virusbindende aktivitet . Stedsdirigerede antistoffer rettet mod en særlig del af HRR (forudsagt ud fra en arbejdsmodel baseret på en immunglobulinfold) kan fremstilles ved at fremstille syntetiske peptider svarende til udvalgte regioner i proteinet, 25 koble sådanne peptider til større bærerproteiner og immunisere kaniner eller andre dyr med sådanne konjugater ved standardmetoder. Sådanne antistoffer kan afprøves for deres evne til at inhibere virusbinding; inhibering med en delmængde af sådanne antistoffer vil rette opmærksomheden mod 30 særlige domæner eller dele af domæner.

Specifikke reaktive grupper på nogle aminosyrerester på receptorproteinet kan modificeres kemisk under ikke-de-naturerende betingelser. Som følge af modifikationen af visse rester kan den virus-bindende evne gå tabt. Ved hjælp af 35 radioaktive sporstoffer i modificeringsreagenset kan modifikationen af nogle aminosyrerester koordineres med tab af DK 174095 B1 21 bindingsaktivitet, hvilket implicerer disse grupper i genkendelsen. Herved henledes opmærksomheden på en særlig del af molekylet eller en særlig aminosyrerest for at spille en bestemt rolle ved virusbinding. Sådanne rester kan derpå 5 forsøgsvis modificeres ved mutageneseforsøg in vitro. Det har eksempelvis vist sig, at når man mærker HRR med radioaktivt Bolton/Hunter-reagens (en N-hydroxysuccinimid-ester, som specifikt modificerer N-endestillinger og lysinrester), reduceres dets evne til at bindes til rhinovirus væsentligt.

10 Bestemmelse af den tredimensionale struktur af det vi rus-bindende domæne i HRR ved hiælo af røntgen-krystallografi οα/eller kernemagnetisk resonans. Ved hjælp af tredimensionale HRV14-koordinater (fra Brookhaven Data Bank) findes de to molekylers optimale "docking" ved hjælp af 15 grafisk computermetodologi. Det "dockede" kompleks' struktur kan derpå anvendes til at raffinere og forbedre egenskaberne hos proteinet eller receptorens peptidfragment. Eksempler på sådanne forbedringer kan være: (1) forøgelse af en virusbindende reaktions affinitet; (2) fremstilling af et mindre 20 molekyle; og (3) udeladelse eller beskadigelse af andre regioner i molekylet, såsom det, der er nødvendigt for binding til LFA-1. Hvis bindingsstedet for LFA-1 sidder på et andet domæne, kan domænet udelades. Alternativt, dersom bindingsstedet for LFA-1 sidder på det virus-bindende domæne, 25 kan der benyttes stedsdirigeret mutagenese af særlige aminosyrer for at inhibere bindingsevnen.

Receptorens nøglerester, der er involveret i virusbinding, bestemmes af oligonucleotidsteds-dirigeret mutagenese. Således screenes mutantpuljer fremstillet ved mæt-30 ningsmutagenese ved hjælp af den af Peterson og Seed i Cell 54 beskrevne metode, 65-67 (1988), ved anvendelse af enten HRV14 eller monoklont antistof/komplementaflivning som negativ udvælgelse og et kanin-polyklont antistof som den positive udvælgelse. Syntetiske peptider svarende til regi-35 oner på molekylet, der er identificeret på denne måde, fremstilles og afprøves med hensyn til virusbinding og evnen DK 174095 B1 22 til at reducere smitteevne.

Farmaceutiske tilberedninger af proteiner, proteinfragmenter, funktionelle domæner og analoge finder anvendelse ved mange sygdomme. Med den viden, at HRV og LFA-1 begge 5 bindes til ICAM, forventes det, at der kan udformes ICAM-analoge, som bindes til rhinovirus og derved inhiberer rhi-novirusinfektion, men som ikke afbryder samspillet mellem ICAM og LFA-1. Alternativt foretages mutagenese af udvalgte rester (aminosyrer) på basis af strukturelle forudsigelser 10 og biokemisk struktur.

Det forventes endvidere ud fra den viden, at ICAM og HRR er det samme molekyle, at det kan anvendes i fragmenter, funktionelle domæner eller LFA-l-analoge til at afbryde samspillet mellem HRR og rhinovirus og derved til 15 behandling af rhinovirusinfektioner.

HRR eller fragmenter deraf kan finde anvendelse ved afbrydelsen af samspil mellem ICAM og LFA-1, hvilket kan anvendes til behandling af inflammation.

Peptider afledt fra de kendte capsid-proteiner i 20 rhinovirus kan anvendes til afbrydelse af samspil mellem ICAM og LFA-1, hvilket kan anvendes til behandling af inflammation. Carbonhydratgrupper, som ikke er "nec" med hensyn til biologisk aktivitet, kan fjernes for at forøge produktionen af peptider i bakterier.

25 Stedsdirigeret mutagenese af cystiner kan anvendes til at begrænse genfoldning til biologisk aktive konformat ioner .

Claims (2)

1. Anvendelse af humant rhinovirus (HRV)-hovedrecep-torpræparat indeholdende ICAM-1-monomer af funktionelle domæner, fragmenter eller analoger omfattende det test-Ig- 5 lignende domæne af ICAM-1, som udviser evne til binding til HRV-capsider, til fremstilling af et lægemiddel til inhibe-ring af initieringen eller spredningen af rhinovirusinfek-tion.

2. Avendelse af et humant rhinovirus (HRV)-hovedre-10 ceptorpræparat indeholdende en forbindelse fra gruppen: det hele ekstracellulære domæne af ICAM-1, aminosyrerne 1-200, tlCAM (1-453), tlCAM (1-283), tlCAM (1-184) eller tlCAM (1-88), som udviser evne til binding til HRV-capsider, til fremstilling af et lægemiddel til behandling af rhinovirus-15 infektion.