PT88783B - Processo de purificacao de proteina t4 soluvel e de producao da mesma - Google Patents

Description

MEMÓRIA DESCRITIVA

Campo do Invento

Este invento refere-se à produção de uma proteína F4 Sjo luvel (sT4). Em particular refere-se à construção de vectores para a expressão de sT'4 em células de mamífero.' e à purificação do produto resultante.

Antecedentes do Invento

A molécula de T4 é uma de entre várias proteínas de superfície de linfócitos T não polrmorficas que têm sido implica, das na mediação de interacções eficientes célula T - célula al. vo. A análise destas proteínas de superfície índica que os líri fócitos T maduros se dividem em duas classes com base na sua expressão predominante quer de glicoproteína de superfície Γ4 quer T8 (Re inherz , et a 1. , Ce 11 19:821(1980)) «, A molécula de T4 é predominantemente expressa em linfócitos F ^,rhelper enquanto que a T8 é expressa em células F citotóxicas e supress£ ras (Reinherz, et al», supra(1980)). Esta distinção funcional não é absoluta uma vez que os linfócitos TT'^⁺ podem produzir citotoxicidade e supressão (Thomas, et al., cr.. Exp». Med..

154 ;45 9 (1981),* Meuer, et al», Proc. OTatl. Acad. Sei. USA 79: :4395(1982)). Existe uma relação mais forte entre subconjuntos de células T e os produtos genéticos do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) expressos pelas células alvo. Os linfócitos T4 T interagem com células alvo expressando produtos genéticos de MHC da classe ΓΙ enquanto que as células T8⁺ T interagem com alvos expressando moléculas de MHC, da classe I (Engleman, et al«, J. Immunol. 127:2124Ç1981)r Krens — ky, et al», Proc. Hatl. Acad, Sei» XISA 79^2365(1982); Biddison, et al,, J. Exp. Med. 156 :1065 (1982)’y Swain, et al., Immunol.

Res. 74:129Ç1983)) . Além disso, os anticorpos monoclonais díri gidos contra T4 e T8 inibem in vitro a função da célulaT(Engle. man, et a 1., J. Exp. Med. 154:193(1981); Wilde, et al., J. Immunol. 131:2178(1983)). Estas. observações sugerem que a especi

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—3ficidade da interacção de subpopulaçoes de linfócltos T com diferentes células alvo resulta da associação de T4 e T8 com proteínas da classe II do MHC e da classe I do MHC’#· respecti vamente# e que este reconhecimento pode ser essencial para a função da célula T^:.

A sequência.de ADNc do receptor dê T'4 humano é conhecú da (Maddon, et al.#. Ce 11 £2,:93(1985)). A sequência completa da pré-proteína T4 tem um comprimento de 458 aminoácidos compreendendo os domínios putativos de comando de secreção,, çom 23 atninóacidos, de superfície (v^-v^) com 372 aminoácidos# de transmembrana com 23 aminoácidos e citoplasmático com 40 ami— noá eidos.

C domínio de superfície apresenta quatro regiões de ho mologia limitada#, 20-30% em relação às regiões variável (V) e de ligação «I da imunoglobulina. Quatro das cinco fronteiras intrão-exão no domínio da superfície ocorrem perto das junções destas regiões V-J. Com base na Informação parcial da se, quência da proteína para as proteínas T4 de ratinho e de carneiro (classon# et al.# Immunogen, 23 :12 9(1986))# as 6 clsteí— nas no domínio da superfície são emparelhadas sequencialmente para dar três pontes de dlssulfureto. Existem dois sítios pos, síveis para esta glicosilação ligada a.N# com base na sequência de aminoácidos. Esta homologia V-CT# o emparelhamento da cisteína e estrutura intrão-exão sugerem que a T'4 partilha al, gumas similaridades estruturais com as imunoglobulinas.

O vírus da imunodeficiência humana (HI7)# o agente etio lógico do síndroma da ImunodefIciênçla adquirida (SIDA)# apresenta uma afinidade marcada com linfocitos T'4 . A caracterização molecular do genoma de HIV tem demonstrado que o vírus exl be a mesma organização global gag-pol-env que outros retrovírus . Ratner# et al,#. Nature 313 ?277(1985)γ Waín-HObson#. et al.# Ce11 40:9(1985). 0 carácter linfotrópico T4⁺ do vírus pode ser explicado pela sua ligação específica ao receptor de Γ4 Cs anticorpos monoclonais dirigidos contra T'4 bloqueiam a Infecção por ΗΓ7 de células T4⁺# in vitro (Dalglelsh#. et al.#. Na ture 312:763(1984)? McDougal# et al.#. J. Tmmunol. 135:3151

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(1985)). As linhas de células humanas, tanto não linfóides co mo linfóides, que tem falta do receptor de T4 não podem ser infectadas por HIV, mas estas células tornam-se susceptíveis â infecção após introdução e expressão do gene de Γ4 clonado (Maddon, et al._r Cell 47:333(1986)). A ligação do vírus a T^r4 é mediada pela glicoproteina gpl20 do envelope virai. A proteína Γ4 pode ser co-precipitada a .partir de células Infectadas com HIV e lisadas, com anticorpo antl-env e, reciprocamen te, a gp!20 pode ser co-precipitada com anticorpo monoclonal anti-T4, demonstrando assim que a ligação do vírus a T'4 é mediada pela glicoproteína gpl20 do envelope virai (McDougal,. et al., Science 231:3 82 (1986) ).

A sida resulta na diminuição e em última análise na de pleção dos linfocitos T4 com consequente disfunção da respos ta imunitária celular. Xn vitro, o HIV mata especificamente células T4⁺.(Gálio, et al,, Science 224:497(1984); Sarngadharan, et al., Science 224:506 (1984); Barre—Sinoussi, et al>, Science 220:868 (1983);· contudo, algumas células linfóides e mieióides podem ser infectadas produtivamente sem efeito cito pático notável (DeRossi, et al», Proc. Natl. Acad» Sei, USA 83:4297(1986); Gartner, et al., Science 233:215(1986). Γη vltro, a citotoxicidade depende do nível de expressão das proteínas do envelope de HIV (Sodroski, et al., Nature 322í47O de (1986) e do receptor/T4 (Hoxie, et al., Science 234:1123 (1986). Um relatório recente descreve uma correlação dírecta entre citolise e a formação de sincício (Yoffe, et al., Proc, Natl. Acad. Sei. USA 84:1429(1987). Contudo, a causa da citóli se não é clara; pode ser uma consequência Imediata da fusão da célula ou o resultado da co-expressão das proteínas env de HIV e T4 na mesma célula.

vírus da SIDA pode ser tanto neurotrópico como linf_o trópico. A SIDA é frequentemente acompanhada de disfunção do sistema nervoso central (SNCj , mais .frequentemente: a consequência de uma encefalite sub-aguda, 0 ARN e o ADN do vírus da SIDA têm sido identificados em cérebros afectados- (Shaw, et a 1., Science 2 27:177(1985)); têm-se localizado vírus nos macro fagos e astrócitos e tem-se isolado o vírus tanto do cérebro

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—5 — neurologicas como do fluído cerebroespinal de pacientes com desordens/ (Levy, et al,, Lancet IIi586(1985)). Estas observações sugerem . que o vírus da SIDA infecta células no cérebro e é directamen te responsável pelas lesões do SNC observadas em pacientes com SIDA.

Estudos recentes identificaram a expressão de ARNm de T4 em alguns tecidos cerebrais (Maddon, et al./ supra, 1986). Cbse.rvam-se duas espécies de ARH, uma comparável em tamanho à encontrada em Iinfócitos e um segundo ARNm mais curto. A natureza da proteína T4 codificada por este ARNm encurtado não é ainda clara. Actualmente, a relevância da expressão de T4 em tecido cerebral na infiltração de HIV no SNC é apenas especulativa .

Sumário do Invento

Este invento refere-se a um processo para purificar T4 solúvel (sT4) a partir de meio condicionado clarificado, a partir de uma cultura de células que produz sT4. 0 processo compreende fazer contactar o meio condicionado com um suporte de permuta catiónica ficando assim a sT4 adsorvida .ao suporte; eluir a sT4 do suporte; fazer contactar o eluído com um suporte de permuta aniónica; e recolher a sT4 no efluente do suporte de permuta aniónica.

Noutra concretização do invento descreve-se um processo para a produção de sT4 que compreende os seguintes passos;

1) cultivar células de mamífero que expressem sT4; 2) clarificar o meio condicionado das células cultivadas por centrifugação e filtração; 3) fazer contactar o meio clarificado com uma coluna sulpítopropyl-Sepharose M; 4) eluir sT4 da coluna usando um gradiente linear de 0-0,5M de NaCl; 5) dialisar o eluído pa, ra remover o sal; 6) fazer contactar o eluído dialisado com uma coluna QAE-Sepharose χ<· 7) passar o efluente através de uma coluna de Superose© 12 ; e 8) recolher a sT4 purificada.

Estas e outras concretizações são consideradas aspectos do mesmo invento que é aqui completamente desenvolvido»

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-6Breve Descrição da Figura 1

Sequência de T4 solúvel: a sequência de ADNc de T4 solúvel é derivada da sequência do ADNc de T^;4 publicada· (Maddon, et al., Ce 11 42 i93(1985)) e um ligante sintético adicionado ao sítio HpalT no pbl252. 0 ligante sintético introduziu um codão de terminação de tradução no pbl258. A sequência predita da proteína é apresentada por baixo da sequência de nucleótidos. Postulou-se que o sítio de processamento de comando residia en tre o Lys (pbl52) e o gin (pbl55). os 20 resíduos iniciais da proteína ST4, determinados pela sequenciação de aminoácidos, são apresentados por baixo da sequência predita da proteína, a identidade com a sequência predita é indicada por um ae.

Descrição Detalhada do Invento presente invento descreve um meio para produzir uma molécula T4 reçomfoínante, designada por T4 solúvel (sT'4), consistindo no domínio extracelular predito do receptor de T4 (Ver Figura 1). Usando a porção do ADNc de T4 que codifica os , ' t domínios de comando e extracelular do receptor de T4, i.e. pre -sT4, constroem-se vectores capazes de sobreexpressão de sT4 em células de mamífero.

A sequência de codificação para sT4 pode ser obtida, por exemplo, por síntese do gene usando a sequência de ADN conhecida, por técnicas de clonação padrão baseadas na sequência e por re-isolamento por detecção de proteína, i.e., transfecção de clones de ADNc de linhas de células que expressam T4 e identificação por anticorpos dirigidos contra a proteína (Ver Maddon, et al,, supra).os clones de ADNc transportando a sequência de codificação de sT4 podem ser identificados pelo uso de sondas de hibridação de oligonucleótido. As sondas- podem ser concebidas com base na sequência conhecida da proteína T4. Tendo-se identificado um clone transportando a sequência de codifi cação de sT4, a sequência de codificação pode ser excisada pela utilização de endonucleases de restrição e inserida em vectores de clonação e/ou de expressão. Num vector de expressão, a sequêr

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-7cia de codificação de sT4 é operativamente ligada a funções reguladoras necessárias ou desejáveis para a transcrição,· tra. dução e processamento da sequência de codificação,,

As funções reguladoras incluem, por exemplo,, funções necessárias para a ligação da ARN polimerase e transcrição, bem como outras funções tais como poliadenilação e melhoria das sequências transcricionais. 0 promotor pode ser regulável de modo que, por exemplo, a expressão não seja induzida a não ser após a transfecção e selecção dos clones transformados. Pro motores úteis na prática do invento incluem por exemplo, o pro motor precose fearly) SV40 e as repetições terminais compridas (LTR) do vírus do sarcoma de Rous ou do vírus do Sarcoma de Moloney.

Antes da transfecção, o mini-gene de. sT'4, i.e,, o gene que codifica os domínios de comando e extracelular do receptor de T4, é, preferivelmente·incorporado numa molécula de ADN maior que compreende um sistema genético marcador de selecção, sistema marcador de selecção pode consistir em qualquer gene ou genes que provoquem uma alteração fenotípica facilmente detectável numa célula hospedeira transfectada. Esta alteração fenotípica pode ser, por exemplo, formação de foci, resistên cia a drogas, tal como genes para resistência a G418 ou à higromicina B; ou outros marcadores seleccionáveis tal como xantina guanina fosforribosil transferase fxgprt), timidina quin£ se (TI<) e galactoquinase (galk) . Pode-se usar um marcador de selecção que permita uma amplificação de gene para aumentar o número de cópias quer por maior eficiência de transfecção que por melhoramento/replicação intracelular do gene de Interesse e do marcador de selecção. Estes marcadores que também servem para amplificar o número de cópias de gene incluem genes para di-hidrofolato redutase (resistência a metotrexato)_f CAD fresistência a N-fosfonacetil-L—aspartato) e adenosina desaminase (resistência a 2-desoxicoformicina)»

A seguir à transcrição e tradução em células de mamífero, a sequência de comando parece ser clivada e a sT4 madura é

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-8segregada no meio condicionado.

Na prática preferida do invento, o mini-gene de sT4 é ligado com um mini-gene de H-ras. humano ou de di-hidrofolato redutase (DHFR) para criar os vectores de expressão.

mini-gene· de sT4 é ligado, por exemplo, com o H-ras humano ou com DHFR de ratinho de modo a proporcionar um marcador de selecçao e meios para amplificar selectivamente a ex pressão do gene através da eo-transfecção com esses genes. Mar cadores de selecção comuns incluem por exemplo, DHFR, G418 ou higromicina que seleccionam para integraçãç de tão poucas quan tas uma única cópia do gene de interesse. A amplificação com, por exemplo, metotrexato (mtx)' no sistema de DHFR resulta na sobreexpressão do gene.

Um meio alternativo de expressão aumentada do gene inclui o uso de proto-oncogene ras. A família de genes ras inclui os genes, H-ras, K-ras e N-ras. Numa aplicação preferida do invento, usa-se o gene H-ras.

Podem ligar-se- directa ou indirectamente ao mini-gene sT4 outras funções de ADN ou estas funções podem estar não li^ gadas. Ver por exemplo, Axel, Patente E.TJ.A» 4 339 216.

A sobreexpressão dos produtos de gene em células de mamí fero pode ser conseguida por meios transientes ou estáveis·. A sobreexpressão transiente pode ser conseguida por métodos virais tais como o uso de vectores de vírus vaccinia ou por métodos de amplificação do gene tais como com os vectores com base em SV-40 em células que suportam a replicação de SV-40, Estes métodos conduzem finalmente à morte da célula. A sobreexpressão estável pode ser conseguida por geração de cópias múltiplas de gene tal como através da selecção para amplifica^ ção do gene ou através do uso dos proto-oncogenes ras.

A sobreexpressão da proteína sT4 por co-transfecção usando o sistema de gene H-ras pode ser conseguida usando vá — rias linhas de células diferentes, sendo a linha de células preferida a linha de células NIH-3T3 que é uma linha de células de tibroblasto de ratinho inibida por contacto.- Outras li

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-9nhas de células incluem a linha de células de rim normal de ra tazana (NRK) (ATCC 1571) e a linha de células de .fibroblasto de embrião de ratazana 52 (REF-52) CMcClure,. et al,., Cold Spring Harbor Conferences on Ce 11 Prollferatlon _9:345fI982)) .,

Quando se usa um sistema marcador de selecção, por exem pio, DHFR com metotrexato (técnica DHFR/MTX), na qual a amplificação do numero de cópias de gene é conseguida por amplifica^ ção selectiva, prefere-se a linha de células de ovário de cri— ceto chinês (CHO). Em particular usam-se as células de CHO deficientes em DHFR (Urlaub, et al., Cell 33:4θ5 (1983)). Outros tipos de células que podem ser usados incluem, por exemplo, qualquer célula de mamífero que tenha sido modificada de modo a ser DHFR^-.

Alguns tipos de células DHFR⁺ podem ser usadas em combi nação com genes DHFR mutantes que são menos sensíveis ao meto— trexato do que as DHFR normais (Axel, Patente dos E.U.A.

399 216), Em principio, as células DHFR podem ser usadas em combinação com genes DHFR normais e um gene dominante seleccio nável adicional tal como o gene para resistência a G418 fKim et al,, Cell 42:129 (1987)). A transfecção é realizada usando técnicas padrão. Ver, por exemplo, Wigler, et al., Proc, Natl. Acad. Sei, USA 76:1373(1979) e Copeland, et,al., Cell 17:993 (1979)» Estas técnicas incluem, por exemplo, precipitação por fosfato de cálcio pinocitose induzida por DEAE-dextrano-, electroporação e transfecção virai.

A seguir ã transfecção, as células albergando e expressando o gene de resistência ou marcador são obtidas por cultura em meios de cultura.padrão de mamífero, contendo uma droga selectiva. Por exemplo, a selecção para resistência a DHFR em células deficientes em DHFR pode ser realizada em meio ΙΊ2 deHsm sem hipoxantina e timidina (Gibco, Grand Island, New York) contendo 5-15% de soro de bovino fetal dialisado, a selecção para resistência a DHFR em células DHFR pode ser realizada em meio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) (Gibco) contendo 515% de soro de vitela e metotrexato,- a selecção para transformação morfológica com gene H -ras pode ser realizada em DMEM

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-10em 5-10% de soro de vitela» As células com um gene de resistên cia que pode amplificar em resposta à concentração da droga po dem ainda ser cultivadas em meio contendo quantidades crescentes de droga. As culturas de células são mantidas à pressão am biente a 3O-452C. As células seleccionadas que expressam níveis elevados da proteína sT4 são identificadas por técnicas imunológicas padrão tal como ELISA.e immunoblotting^M, Estas células são cultivadas e o produto,. a proteína sT4, é reconhído e purificado.

Pode recolher-se meio condicionado CcM) de células que estão aderentes a suportes sólidos ou em suspensão. Por exemplo o CM é preparado a partir de células aderentes que se fizeram crescer em frascos móveis (roler) ou que se fizeram crescer em suportes sólidos, e cultivado em suspensão ou em leitos flui dizàdos OU . compacotados. 0 CM é preparado a partir de células em suspensão em vasos tanque agitados.,

A sT4 do invento inclui derivados do domínio extracelular de T4. Estes derivados compreendem adição, delecções ou.su bstituições, alterações que não afectam significativa e adversamente a secreção da proteína no meio condicionado e a afíni dade da proteína por proteína env de HIV, i.e. gpl20. Por exem pio, pode adicionar-se ou deleccionar-se um ou alguns aminoáci. dos dos terminais N- ou C—. Alternativamente,, um ou alguns ami noácidos, preferivelmente não mais de.quatro aminoácidos podem ser inseridos, em deleccionados. ou substituir aminoácidos internos. Alternativamente pode construir-se uma proteína híbrida, i.e., uma fusão de tradução, entre sT4 e um transportador de proteína, outro antigénio ou outras moléculas sT4 para preparar uma molécula poli-sT4. Ainda noutra alternativa pode con jugar-se sinteticamente sT4 a uma molécula veículo., í

Nos Exemplos abaixo ilustra-se uma concretização de um derivado de sT'4. Ver Exemplo 4. À afinidade da sT4 para env de HIV pode ser demonstrada por um ensaio de ligação competitiva usando uma molécula de sT4 possuindo uma afinidade conhecida ou usando anticorpos que reconhecem o receptor de T4, tal como

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-110ΚΓ4 e 0KT4A. Moléculas de sT4 derivadas úteis do invento, são selectivamente precipitadas do meio condicionado por 0KT4A como se mostra nos Exemplos 4B e 4C. Os derivados podem ser preparados quimicamente, após expressão, ou geneticamente, antes da expressão, por manipulação da sequência de codificação para o domínio de comando e/ou extracelular.

A sT4 do invento pode ser purificada a partir dos meios de cultura esgotados usando várias técnicas de purificação de proteínas, por exemplo, cromatografia, de afinidade/ cromatograf ia de permuta iónica? cromatografia de exclusão por tamanho;· cromatografia hidrofóbica ou cromatografia de fase inversa .

A sT4 pode ser purificada por cromatografia.de afinidade, usando adsorventes gerais específicos de grupo, por exemplo ligandos de ligação a hidratos de carbono ou de afinidade por corantes; ou usando ligandos que se ligam especlficamente a sT4₍ por exemplo, anticorpo monoclonal ou proteína de ΗΓ7, gpl20, ou suas porções.

Um esquema de purificação exemplificativo compreende:

1) fazer crescer as células em meios de crescimento de selecção isentos de soro, 2) clarificar os meios condicionados e 3) separar a sT4 do invento de outras proteínas presentes nos meios condicionados.

Num método preferido a sT4 é purificada do meio de cultura isento de soro usando uma série de passos de cromatografia que são baseados nas propriedades físicas da molécula de sT4. A sT4 também pode ser purificada do meio de cultura contendo soro usando métodos de cromatografIa similares.

No método preferido de purificação de sT4, o meio de cultura é primeiro clarificado,, tal como por centrifugação e/ /ou filtração e é em seguida passado através de um suporte de permuta catiónica, p.e. uma coluna de carboximetilo ou de sulfopropilo, preferivelmente uma coluna S-Sepharose (Sulfopropil Sepharose) (Pharmacia, Piscataway, New Jersey)' que liga a a sT4 enquanto que a maioria das· proteínas contaminantes atra68 281

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—12 — vessa a coluna. A amostra de proteína é então eluida usando um gradiente linear de sal, p.e. NaCl 0-0,5 M. Preferivelmente usa-se uma segunda coluna de permuta iónica a seguir à diá, lise para remover o sal. Esta coluna, é uma coluna de permuta aniónica, p.e. uma coluna de dietilaminoetilo ou amínoetilo quaternário, preferivelmente uma coluna,Q-Sepharose (amlnoetil quaternário Sepharose) (Pharmacia), tem propriedades tais que as proteínas contaminantes presentes na amostra se ligam à coluna enquanto que a sT4não se liga e é recolhida no tampão em circulação da coluna. Finalmente> usa—se uma coluna de filtração de gel, tal como, uma coluna de dextrano reticulado ou uma coluna de agarose, que actua de modo a remover material contaminante remanescente.

passo de exclusão por tamanho é realizado, preferivel. mente, usando um enchimento de partículas pequenas, p.e. com menos do que cerca de 50/Um possuindo uma gama de separação de pesos moleculares de 1000 a 300 000. Verificou—se que usando este gel podem ser removidos vestígios residuais de contaminan tes de elevado peso molecular. Um exemplo ê a agarose reticula_ da Superose © 12 (Pharmacia) que tem um tamanho médio de partículas de 20-40e uma gama de separação de pesos moleculares de 1000 a 300 000.

Um processo alternativo de purificação de sT4 envolve o uso de anticorpos monoclonais dirigidos contra sT4. A proteína sT4 pode ser purificada num passo por passagem de meios de cul tura clarificados através de um suporte de gel de afinidade ao qual o anticorpo monoclonal dirigido contra sT4 está ligado. A sT4 ligar-se-ão à coluna no sítio de ligação do anticorpo enquanto que todas as proteínas contaminantes são arrastadas através da coluna. A sT4 é então eluida da coluna sob condições que impedem a proteína sT'4 de ser inactivada.

A caracterização in vltro das propriedades biológicas e imunológicas da proteína sT4 índica que a proteína tem valor na prevenção e tratamento de SIDA. Estudos indicam ,que a proteína sT4 actua como inibidor da disseminação extracelular e de célula a célula do vírus. Em virtude de se ter mostrado que a sT4

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-13bloqueia a ligaçao do vírus a células alvo T'4 em cultura, crê -se que a administração de sT4 a pessoas infectadas actúaria de modo a inibir a disseminação extracelular do vírus. Consequentemente, a sT4 tem valor tanto como agente profilático como, como agente terapêutico no tratamento de SIDA.

Como agente profilático, a sT4 é administrada a indiví- duos em alto risco de doença ou a indivíduos que mostram exposição a HIV pela presença de anticorpos para o vírus. A administração de uma quantidade eficaz de sT4 num estádio precose da doença ou antes do seu início actua de modo a inibir a infecção de linfócitos T4⁺ por HIV, Como agente terapêutico, a administração de sT4 a pessoas infectadas com HIV actua de modo a inibir a disseminação extracelular do vírus.

A fusão entre as células infectadas por HIV e outros lin fócitos T4 parece ser também uma via de.disseminação do vírus.

Além disso, a fusão pode ser responsável, em parte, pelo enfraquecimento da função de linfocito T4 e em última análise pela depleção de linfocitos T4 nos indivíduos infectados. A fusão de de células depende tanto dos produtos/gene do envelope virai como do receptor de T4 e pode ser inibida pelo 0ΚΓ4Α ou por anticorpos monoclonais similares (Malc) (Sattentau,. et al. , Science 234:1120(1986)) . A sT4 interfere com a fusão das células e consequentemente espera-se que diminua a disseminação célula a célula do vírus e a perda de função dos linfócitos T4⁺.

O receptor de T4 é monomórfico e deste modo crê-se que a sT4 é um inibidor universal de vírus que reconheçam o domínio de superfície do receptor de T4, incluindo todos os HIV.

A sT4 pode ser usada em combinação com outros agentes, por exemplo, em associação com agentes dirigidos contra outras proteínas de HIV, tais como transcrrptase inversa? protease ou tat. Um agente terapêutico eficaz contra HIV deverá evitar a transmissão da infecção, mediada tanto por vírus como célula a célula. A sT4 também pode ser usada em combinação com outros agentes anti-virais, por exemplo, azIdotimldina (AZT).

A proteína sT4 deste invento tem também utilidade como

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-14z 4* inibidor da função da célula T4 . Numerosos estudos sugerem um papel crítico para o receptor CD4 (CD4 é a terminologia ge^ ral para o receptor de T4 humano e os seus correspondentes em células de outros mamíferos) na tolerância imunitária particu larmente na patogenese e progressão de doenças auto-imunes e na rejeição de enxertos específica pelo hospedeiro. São de re levância particular para sT4 as observações com Mab anti-CD4„ Através da sua associação com o receptor CD4, alguns destes Mab melhoram as respostas auto-imunes e a rejeição de enxertos. Exemplos desta acção incluem a inibição da função de células T in vitro, por exemplo, proliferação induzida por anti génio, secreção de linfocina e da função de células helper por determinados Mab anti-CD4r o tratamento de lupus eritematoso disseminado por administração de Mab anti-CD4 para retar dar o início de lupus murino,- e estudos sobre enxertos em ratinhos nos quais uma dose única de Mab de murino.dirigido con tra o receptor CD'4 de murino resultou na aceitação do homoenxerto.

A consequência molecular da ligação de Mab a CD4 não é clara. Os Mab podem bloquear a associação de CD4 com o seu.H gando, ligando que, a evidência sugere-o, é um epítopo conser vado nos antigénios. MHC da classe ΓΙ (Ver Oreenstein et al,, Ann. Inst. Pasteur 138:134(1987) e Gay, et al,, Ann. Inst. Pas teur 138:127(1987)). Contudo, pelo menos alguns destes mesmos Mab inibem a activação das células CD4 por um aparente caminho independente da classe II.

Crê-se também que a sT4 inibe as interacçoes das células T como competidor de T4 celular, talvez por ligação a moléculas alvo extracelulares que interagem normalmente com o domínio de superfície do receptor de T4 . Esta distinção entre Mab e sT4 pode ter consequências funcionais importantes. Por exemplo, enquanto que alguns Mab dirigidos contra T4 eliciam uma resposta na célula Γ4, a sT4 pode eliciar uma resposta em células que expressam antigénios MHC da classe II. Também a afinidade de T4 pelo seu suposto ligando da classe TI parece ser bastante baixa comparada com as elevadas afinidades de Mab dirigido contra T4, Assim,, embora Mab e sT4 possam inter —

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-15 — ferir com os mesmos processos, eles afectariam moléculas alvo diferentes e células alvo diferentes.

Como agente profilático ou terapêutico, a sT'4 é administrada parenteralmente, preferivelmente intravenosamente. 0 agente pode ser administrado por infusão ou por injecção, p..e. diariamente, semenalmente ou mensalmente. A quantidade e frequência de administração são seleccionadas de modo a manter uma quantidade eficaz de sT4 em circulação. Um modo de adminis^ tração alternativo seria extracorporal, usando a sT4 como agen te de diálise.

A proteína sT4 deste invento também pode ser usada como reagente para identificar moléculas naturais, sintéticas ou re combinantes que actuatn como agentes terapêuticos ou inibidores 4“ de interacções de células T'4 .

Por exemplo, a proteína sT4 pode ser usada em ensaios de triagem, tal como ensaios relativos à interação de proteínas medida por metodologias baseadas em ELjSA, para proporcionar um reagente solúvel em água, bioquimicamente puro que pode ser usado em combinação com outros reagentes para ensaiar rel£ tivamente aos competidores das interacções do domínio de super fície do receptor de T4. Por exemplo, como a sT4 se liga à pro teína env de HIV ou às misturas contendo proteínas env de HIV, ela pode ser usada para triar inibidores da ligação do vírus. Com base em dados in vitro mostrando que a sT4 se liga a células expressando proteínas env de HIV, a sT4 pode também servir como uma molécula de alvejamento selectivo de células infectadas por HIV, in vivo, como proteína transportadora específica do alvo, a sT4 pode servir, por exemplo, como a proteína tran£ portadora para distribuição de agentes citotóxicos às células infectadas.

Em adição, com bade em dados mostrando que o receptor de T4 se associa especificamente com antigénios HHC da classe II em células que apresentam antigénios como é sugerido pela restrição de classe de células T4⁺, a sT4 pode ser usada em com binação com antigénios da classe II para testar em relação a inibidores de interacções linfocito T4 - célula alvo. Em adição

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a estes exemplos que são baseados em ensaios de ligação directa entre sT4 e suas moléculas alvo podem conceber-se ensaios mais complexos que assentam nas respostas bioquímicas ao rec^o nhecimerto de sT4.

A sT4 pode ser usada em ensaios de disgnóstico para a detecção de proteínas T4 ou das moléculas com as quais elas interagem. Por exemplo, a quantificação de células T4 e T4⁺ e de anticorpos para T'4 teria valor para o diagnóstico da SIDA.

Em adição, a sT4 pode ser usada para gerar reagentes de diagnóstico novos, por exemplo, Mab ou outros tipos de moléculas para uso nos ensaios imunológicos padrão, i.e., ELZSA, imu noensaios de captura, radio-imunoensaios, Em virtude de sT4 exibir ο 0KT4, o 0ΚΓ4Α e a maioria se não todos os outros epí— topos de superfície de receptor de T'4, a sT4 é especialmente útil em ensaios de imunodiagnóstico visto que pode ser usada para quantificação absoluta de níveis de T4 num sistema, Presentemente não há padrões para quantificação do receptor de T4, receptor de T'4 reside em três ambientes químicos diversos: a superfície da célula, hidrofílica, oxidante;· a membrana hidrofóbica; e o citoplasma hidrofílico, redutor. Estes ambientes diversos iriam muito provavelmente impedir o isolamento do receptor no seu estado totalmente nativo. A sT4, que consiste somente no domínio extracelular,. é segregada eomo uma proteína solúvel para o sobrenadante de célula e a sua conformação parece mimetizar a superfície do domínio de superfície do receptor. Assim, a sT4 é adequada para análise estrutural detalhada, em particular para cristalografia por raios X. A de^ terminação da estrutura tridimensional de sT'4 sozinha ou· numa forma complexa com outras moléculas interactivas poderia propor cionar uma base para a concepção racional de antagonistas e ago nistas selectivos para sT4.

Exemplos

Os exemplos que se seguem são ilustrativos e não limita

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-17 — tivos do invento. As enzimas usadas nas manipulações genéticas foram obtidas a partir de fontes comerciais e foram usadas substancia lmente de acorde com as instruções dos vendedores., Ex cepto onde se indicar em contrário os procedimentos foram realizados como descrito por Maniatis, et al., Molecular Clonlng_r Cold Spring Harbor Laboratory,. 1982.

Exemplo 1; construção de vectores

Usando manipulações de ADN recombinante os pares de bases (pb) 1-1257 da sequência de ADNc de T4 humano (Maddon, et al,_r supra) foram colocados entre um promotor precose de SV-40 e um codao de terminação TAA seguidos pela região de poliadeni lação do gene da hormona de crescimento bovina. Esta sequência do ADNc de T4 codifica o domínio de comando e extracelular pre_ dito do receptor/T'4. Este minigene st4 foi unido com um minigene H-ras, humano, ou com uma di-hidrofolato redutase de rati nho, para criar os vectores pST4CHras e pST4DHPR respectivamen te. A construção destes vectores foi feita como se segue:

Construção de pST4sal: 0 plasmídeo pST4sal foi construí do a partir de dois outros plasmídeos, JKT4 e pUCsT'4. A construção destes plasmídeos é detalhada abaixo.

Construção do plasmídeo JRT4: Para criar o plasmídeo JRT4, o plasmídeo DSP1 (Pfarr, et al., DNA 4^:461(1985)) foi cortado com Xhol, a região precose polyA de SV40 foi deleccionada e os sítios Xhol foram introduzidos usando fragmento Klenow de ADN polimerase. A região de poliadenilação da hormona de crescimento bovina (BGH) (Pfarr, et al._r DNA 5^:115(1986) foi cortada com Pvuir e Kpnr e o sítio Kpnl foi tornado rombo por tratamento com ADN polimerase de T4. Este fragmento de 230 pb foi ligado a DSPl para criar DSP1BGH.

DSP1BGH. foi cortado com SmaX e Sair e a “cassette galk (consistindo no promotor precose de SV40, na região de codificação galk e na região polyA de BGH) foi ligada ao pUC19 (Yanisch-Perron,'et al., Gene 33 :103(1985)) no sítio Sair usando um ligante sintético consistindo numa extremidade Sair,

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-18num sítio BglII e numa extremidade Smal. Esta ligação das três partes resultou no plasmídeo DSP1BZBGH.JT.

DSP1BZBGH.JT,, que foi cortado com StuI e Bell para de leccionar a região de codificação de galk,,foi ligado a um fra_ gmento EcoRl (introduzido)-BamHI de 1,7 Kb, contendo ADNc de T4 do plasmídeo pl4B (Maddon, et al,_f Ce11 42:93(1985)) para criar o plasmídeo JR14.

Construção do plasmídeo pUCsT4: Para criar o plasmídeo pUCsl4, um fragmento HaelI e Hpall C1125 pb) do ADNc de 14 do plasmídeo pT4b foi ligado, através da utilização de ligantes sintéticos, ao vector pUC18 que tinha sido cortado com Kpnl e Xbal. A extremidade HaelI do ADNc de 14 foi ligada ao sítio Kpnl de pUC18 usando um ligante sintético com uma extremidade Kpnl e uma extremidade HaelI. A extremidade Hpall do ADNc de 14 foi ligada ao sítio Xbal de pUCIS usando um ligante sintético com uma extremidade Hpall e uma extremidade Xbal. Este ligante também in seriu um codão de paragem 1AA depois do nucleótido 1257 da região de codificação de 14. 0 plasmídeo resultante foi o ptJCsl4»

Para criar o plasmídeo pS14Sal, o plasmídeo JRT4 foi cortado com BglII e Saci e isolou-se um fragmento de 959 pb (consis_ tindo no promotor precose de SV40 e nos primeiros 602 nucleótidos do ADNc de 14). O plasmídeo pUCsT'4 foi cortado com Saci e Xbal e isolou-se um fragmento de 660 pb (consistindo no ADNc de 14 dos nucleótidos 603-1257 seguido do codão IAA do ligante sintético) . Estes dois fragmentos foram ligados em DSP1BZBGH.JT que tinha sido cortado com BglII e Xbal para deleccionar o promotor precose de SV40 e a região de codificação de 14 a todo o comprimento. 0 plasmídeo resultante foi o pSl4sal.

Construção de pSI'4DHFRr Para criar o plasmídeo pST'4DHPR, um fragmento Bglll-BamHI contendo uma cassette de expressão Φ-globina DHFR foi ligada no sítio BamHI de pST4sal. A cassette de expressão $~globina DHFR consiste: no promotor Q-globina de ratinho (fragmento HincII de 550 pb do plasmídeo pPK288 (Berg, et al», Mol» Ce 11.· Biol, 3j 1246C1983)) modificado na sua extremidade 5* com um ligante sintético para conter um sítio BglII;

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-19na região de codificação DHER de ratinho ('fragmento Hindri introduzido) de 735 pb de plasmídeo pSV2-DHFR fSubramani, et al,, Mol. Ce 11. Biol. 1:854(1981)) na região precose· polyA de SV40? Nhel (introduzido)-BamHI (introduzido) de DSP1 (Pfarr, et al,_A DNA £:461(1985)); e na região terminadora DHPR cie ratinho (fra gmento HindIII de 907 pb (introduzido) de plasmídeo mDH9 fFra^ ne, et al., Mol. Cell, Biol, 4:2921(1984)), modificada na sua extremidade 3* com um ligante sintético para criar um sítio BamHI.

Construção de pST4cHras: o plasmídeo pMERcHras foi cria, do cortando o plasmídeo pMER com EcoRV e HindIII (introduzido), para remover a região galK,, e ligando num fragmento Ndel (intro duzidt^-SalI (tornado rombo por mung bean” nuclease) de 870 pb, contendo a região de codificação para cHras, do plasmídeo pSKcHras (Gross, et al., Mol. Cell. Biol, 5:1015(1985). O plasmídeo pMER difere do pSVK (Schumperli, et al., Proc» Natl., Acad. Sei. USA 79:257(1982)) em quatro posições: (1) delecção do sítio HindIII no pb 340 por inserção de um ligante contendo um s£ tio Smal; (2) inserção de um fragmento de EcoRI de 34 pb num HindIII de pUC' (Vieira, et al., Gene 19:259 (1982)) no sítio PvuII no pb 1; (3) delecção de um fragmento Hpai de 722 pb nos pb 1573-2295? e (4) delecção do sítio Apal no pb 2701 por inserção de um ligante contendo um sítio Sall.

A cassette de transcrição de T4 solúvel foi removida de pST4sal por meio de um fragmento Bglir-BamHT e ligada no sítio BamHI (’3' em relação a polyA precose de SV4o) de pMERcHras para criar pST4cHras.

Exemplo 2: Expressão de minigenes de T4 solúvel (sT4) em células de mamífero

A. Expressão de psT4cHras em células NIH-3T3 plasmídeo pST4cHras (lo Mg) foi co-precipitado, pelo m£ todo de precipitação com fosfato de cálcio, com lO>U.g de plasmídeo pTKneo, um vector conferindo resistência a G418, na presença de 10 Ug de ADN transportador (ADN genómico de NIH—3T3), em célu

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-205 las NIH-3T3 semeadas a 5x10 células por 60 mm de prato de cultura no dia anterior. As células foram Incubadas com o ADN pre cipitado durante 6 horas a 372C, 0 ADN precipitado foi removido e adicionaram-se meios frescos (DMEM, 5% de Nu-Serum® CCollabo rative Research, Xnc., Lexington, Massachusetts)) aos pratos.

As células foram trlpslnizadas 16 horas mais tarde e semeadas em três pratos de 100 mm e mantidas nos meios anteriores. Apare^ ceram foci^r‘ (a próxima da mente 50 por prato) em 12-14 dias. Onze dos foci transformados foram seleccionados, expandidos e em seguida semeados a 5x105 células por prato de 100 mm para selec çao nos meios anteriores mais 500 y«g/ml GENETICXtí^ G418 fSibco Laboratories, Grand Lsland,· New York)’. Todos os 11 clones sobre viveram à selecção a G418 (500 ^«.g/ml) e foram triados relativamente aos níveis de H-ras (p21) por análise ímmunoblot padrão de proteína.

0s clones que expressaram os níveis mais elevados de p21 (aproximadamente 2 ng de p21/Ug de proteína solúvel em Triton) foram ensaiados relativamente à expressão de sT4. Culturas confluentes foram incubadas durante 18 horas com metionína e cisteína marcadas com S. 0s sobrenadantes da cultura e os lisados de células foram imunoprecipitados com anticorpos monoclonais es_ pecíficos para os receptores de T4 (ΌΚΤ4, 0KT4A) e T8 (ΌΚΤ8), com anticorpos policlonal específico para proteínas ras ou com TgG de ratinho, não específica. Uma proteína de cerca de 45 Kd, o tamanho previsto de sT’4, foi especificamente precipitada do meio de cultura por ambos os anticorpos monoclonais dirigidos contra o receptor de T4. A banda de sT4 não foi observada em lisados de células. Como se esperava, a p21 foi precipitada das c£ lulas mas não dos sobrenadantes da cultura. A quantificação subsequente mostra que, quando comparadas com sT'4 purificada, estas células produzem níveis relativamente baixos de sT4, I.e. aproximadamente 100 vezes mais baixos do que com células CHO c_o mo se descreve no Exemplo 2B.

B. Expressão de pST4DHFR em células de ovário de Crlceto

Chinês (CHO)

Células DXB-11, uma linha de células CHO deficiente em

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DHFR (Urlaub, et ai,, supra) foram transfectadas por precipita* ção com fosfato de cálcio, com 10 a 30/U.g de pST4DHFR na presença de lOyLlg de ADN transportador (ADN genómico de NIH-3T3), um dia depois de se semearem pratos de 60 mm com 5xl0^células. As células foram incubadas com o ADN precipitado, durante 6 hjo ras a 372C, os meios foram removidos e adicionaram-se aos pratos meios frescos ( F12, 10% de FBS, 100 unidades/ml de penici* lina e estreptomicina), Os meios foram mudados de novo após 16 horas e as células foram incubadas por mais 24 horas. As.células foram então tripsinizadas, semeadas em três pratos de 100 mm e seleccionadas em meios isentos de nucleósidos (F-12 sem hipoxantina e timidina, FBS 10% dialisado e 100 unidades/ml de penicilina e estreptomicina). Apareceram colónias (aproximadamente 100 por prato) em 7-10 dias. As colónias de cada prato 3 foram reunidas, expandidas e em seguida semeadas a 5x10 e a ,

5x10 células por cavidade em placas de cultura de 24 cavidades 5 ou a 5xlo células por prato de 100 mm. As células foram deixadas recuperar durante 3 dias antes de se iniciar a selecção em meios Isentos de nucleósidos contendo 80 nM de metotrexato (mtx) . As cavidades ou clones Individuais foram ensaiados- em confluência relativamente à expressão de sT4 e os que foram se leccionados para amplificação adicional foram semeados em placas de cultura de 24 cavidades às densidades descritas anteriormente. A selecção a 800 nM de mtx em meios isentos de nuclecj sidos foi iniciada 3 dias depois da sementeira. Este procedimento de selecção foi repetido para selecçoes a 8yLÍM e 80/àm de mtx.

várias linhas de células foram derivadas usando este método que expressa T4 solúvel num mínimo de 3 pg/céluIa/24 horas.

ixemplo 3: Purificação de sT'4

Preparou-se tir de culturas de veis (roller) de Na confluência, as meio condicionado (CM) isento de soro, a par* células aderentes expandidas em frascos mó2

850 cm sob condiçoes selectivas para mtx. células foram lavadas duas vezes com solução

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-222+ 2+ salina tamponada com fosfato (PBS) sem Mg eCa e o meio de crescimento (F12 de Ham sem hipoxantinae timidina, 10% de soro de bovino fetal, 100 unidades/ml de penicilina e estrepfcomicína e mtx à concentração selectiva) foi substituído com o mesmo meio sem soro e mtx e com IxITS (insulina, transferina e selénio (Collaborative Research Inc.)). Após 24-48 h o meio foi re movido e substituído por meio de crescimento selectivo. O meio isento de soro foi re-aplicado em 3—5 dias e este ciclo foi. repetido indefinidamente, i.e., por mais de dois meses. 0 CM foi clarificado por centrifugação a 8000 xg. Adicionou-se um inibi dor de protease PMSF (fenilmetilsulfonilfluoreto) a 0,5 M e o CM foi concentrado cerca de 10 vezes por filtração por pressão de membrana. Este CM concentrado foi clarificado por centrifugação a 2000 xg e adicionou-se Aprotinín, inibidor de protease, (Sigma Chemical, St. Louis, Missouri) até uma concentração final de 5 g/ml. A amostra foi processada directamente ou após armazenagem a -70²C.

A amostra de CM concentrada foi diluída 2 vezes com MES 50 mM ^Cácido 2-(N-morf olino)-etanossulfónicoJZZ, pH 6,0 e filtrada através de um filtro de 0,45 micron. A amostra foi então tratada com 10 ^M de pAPMSF (p-amidinofenil-metilsulfonilfluoreto) (CalBiochem-Behring, San Diego, Califórnia) e aplicada a uma coluna de S-Sepharose (Sulf o—propil)' (Pharmacia P—L Biochemicals, Piscataway, New Jersey) equilibrada em MES 50 mM, pH 6,0 a uma concentração de proteína de 1,5-2,0 mg/ml de gel.

A amostra foi eluida usando um gradiente linear de 0-0,5 M de NaCl em MES 50 mM, pH 6,0. As fracções de pico foram eluídas a NaCl aproximadamente 0,2 M, foram reunidas e tratadas com pAPMSF a 100>UM. As fracções contendo sT4 foram confirmadas por ensaios SDS-PAGE e immunoblot. Após assentar a 4^c durante 1 hora a amostra foi dialisada contra Bis -tris ~propanoZ7l#-3-bis Z7tris-(hidroximetil)metiIamino_í7propano.Z7 50 mM, pH 6,0.

A amostra tratada com pAPMSF 100^.M e 0,1% de tiodiglicol, pH 9,0 foi então aplicada a uma coluna de Q-Sepharose® (aminoetilo quaternário) (Pharmacia) (5 ml de amostra/ml de gel) equilibrada em Bis-T'ris propano (BTP), 50 mM, pH 9,0, A amostra

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-23 — de sT4 não se ligou à Q-Sepharose e foi recuperada na fracção não ligada e da lavagem da coluna. A amostra não ligada foi imediatamente ajustada a pH 6,0.

passo final foi a cromatografia numa coluna Superose® 12 de 30 micra (2,5x46 cm) (Pharmacia) equilibrada em fosfato 50 mM, NaCl 0,15 M, pH 7,0. A coluna foi passada a um caudal de 3,0 ml/mn. Fizeram-se injecções de dez ml e recolheu-se o pico dos 42 minutos descontinuamente. 0 processo rendeu aproximada— mente 1,0 mg de produto por 20,0 mg de proteína total para uma linha de células produzindo aproximadamente 3 pg/célula/dia.

Exemplo

Caracterização da T4s

A. Propriedades Físicas;

A concentração total da proteína foi determinada usando o ensaio de proteína BCA colorimétrico (Bícinchoninic Acid, Pierce Chemical Co., foram determinadas dição da composição

Rockford, ΓΙ1), As concentrações absolutas por análise quantitativa de aminoácidos. Ame ém amino ác ido s da sT4 purificada foi realiza-

da usando técnicas de análise de aminoácidos padrão e verificou -se que concordava com a sequência prevista para a molécula den_ tro do erro experimental (+/— 15%). Ao longo dos primeiros 20 resíduos a sequência era como a prevista com a excepção de come çar por lys-lys-val-val----. Assim, o terminal amino maduro começa na posição +3 relativamente ao sítio clip^!í de comando pre visto (Maddon, et al», supra., (1985)) e difere da sequência prevista nessa posição numa alteração de asn para lys, A posição do terminal amino maduro concorda bem com os teripínals determinados das proteínas CD4 de ratinho e de carneiro. Especula -se que a alteração de asn para lys, pode representar um erro de sequenciação (simples alteração da base) ou uma mutação que surgiu durante os procedimentos de recombinação.

B. Imuno-epitopos:

Os anticorpos monoclonais 0KT4 e 0ΚΓ4Α reconhecem epito pos de superfície não interferentes do receptor de T'4 (Rao, et

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—24 —

a 1., Ce 11 Immunol·. 80:3 lo(1983)) . Estes anticorpos são específicos para a conformação nativa por não se ligarem, em ensaios de ’·immuno-blot'*, à proteína desnaturada por SDS, reduzida. Verificou-se que ambos os anticorpos precipitam especificamente

5 sT4 a partir de sobrenadantes de cultura marcados com S usan do o seguinte procedimento de Imunoprecipitação:

marcaram-se culturas de células produtoras de sT4 contendo IxlO^células por prato de cultura de 60, mm, durante 16 horas a 37sc, em 1,5 ml de meio F12 isento de metionina e cis3 5 teína, contendo ITS, e 170/ÍCi/ml de /7 Sj7metionina e 30/JLCi/

5 /ml /~ S cisteína_/ (ICN Biomedicals, Inc. Costa Mesa, GA). 0 meio clarificado (100 ytl) foi diluído com um volume igual de tampão de precipitação (fosfato de sódio 100 mM pH 7,5, NaCl 100 mM, 0,1% de NP-4<j^, 0,5% de leite magro evaporado) e incubou-se com 3/Xg de IgG de coelho durante 15 min* a 42C seguido por 30ju.1 (volume de enchimento) de pérolas de protein A Sepha_ rose (Pharmacia P-L Biochemicals) durante 30 min. a 42c, 0 sobrenadante pré-c lar if içado foi incubado com 5^g de 0ΚΓ4,

CKT4A e 0KT8 (oferta de P. Ra o, Ortho Pharmaceuticals Corp., Raritan, New Jersey), IgG de ratinho (Cooper Biomedical, Mal— vern, PA) ou IgG «^-ratinho de coelho (Cooper Biomedical) duran te 30 min. a 42c. Os 0ΚΓ4, 0KT4A, 0KT8, IgG de ratinho, e IgG oí-ratinho de coelho foram precipitados por incubação com.20/.-Ll (volume de enchimento) de pérolas protein A Sepharose durante 30 min. a 42c. A seguir à precipitação, as pérolas foram lavadas duas vezes com 200/il de tampão de precipitação e uma vez com 200 /Ai de tampão de precipitação sem NP-40 e leite magro evaporado. As pérolas foram fervidas durante 5 min. em 20/Λ1 de tampão de amostra (Tris-HCl 125 mM pH 6,8, 20% de glicerol,

0-mercaptoetanol 1,4 M) e os sobrenadantes foram analisados por eiectroforese num SDS-gel de poliacrilamida a 12,5%. Obtiveram-se resultados semelhantes com 0KT4B, 0KT4C 0KT4D, 0KT4E', 0KT4F e outros Mab específicos para T'4. Estes resultados sugerem que a conformação de sT4 mimetiza rigorosamente o domínio de superfície do receptor de T 4.,

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-25C· Propriedades Bioquímicas e Biológicas

1. Reconhecimento de gp!20 - a ligação de sT4 a gpl20 foi determinada essencialmente como se descreve para a medição da interação entre gpl20 e o receptor de T4 de comprimento total fMcDougal, et al., supra.(1986) ). Neste ensaio, um lisado de HIV extracelular (estirpe LAVI) de células infectadas mar cado com S-metionina e S-cisteína é incubado com uma amostra de proteína T4. 0 complexo T'4-gpl2O é imunoprecipitado com anticorpo 0KT4 que não interfere com a ligação de gpl20 a T'4.

Em ensaios iniciais, ó CM das células produtoras de sT4 foi com parado com CM, preparado sImilarmente, das células DXB-11 de controlo. A gp!20 de HIV foi precipitada quando incubada com CM das células produtoras de sT4 mas não com CM das células DXB-11 Nos ensaios subsequentes, a sT4 purificada co-precipitou especi ficamente gpl20.

2. Competição da ligação de HIV - a ligação de gpl2C a sT4 sugeriu que a sT4 inibiria a ligação do vírus da SIDA a células susceptíveis. 0 CM com ou sem sT4, como descrito em C.l acima, foi usado nos ensaios iniciais. 0 HIV foi incubado com CM e quantificou-se a ligação do vírus à linha de células CEM T4 por incubação com anticorpo anti-HIV conjugado com FITC e análise FACS (sequenciador (sorter) celular activado com fluoresceína como descrito por McDougal, et al.,. supra., (1985).

CM da linha de células produtoras de sT4 inibiu a ligação de HIV de uma maneira dependente da diluição, enquanto que não se observou resposta com CM de células (DXB-11) não produtoras· com binadas. Em ensaios subsequentes, a pré-incubação de vírus com sT4 purificada a 8,2 /Xg/ml bloqueou completamente a ligação do vírus.

3. Competição da infecção por HIV - a inibição da ínfecção por HIV foi avaliada de acordo com métodos descritos por McDougal, et al., supra,, (1985). Em ensaios iniciais, realizaram-se titulações para a infecciosidade de HIV, na presença de CM concentrado das células que expressam sT4 a aproximadamente 0,15 pg/célula/dia. Incubaram-se diluições seriadas de vírus em

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-26 —

CM concentrado 6x e em seguida adicionaram-se a línfócitos nor mais estimulados por fito-hemaglutinina. Após uma incubação de uma noite as células foram lavadas e em seguida mantidas em meio contendo 2xCM. A presença de vírus foi analisada nos dias 4, 8 e 12 por um ensaio de captura de antigénlo. O CM das célu las produtoras de sT'4 Inibiu 90% a infecc ios idade do vírus em relação ao CM de controlo ou à não adição. Usando sT4 purifica da a uma concentração de 8,6/Lig/ml, observou-se uma Inibição

4-log da infecção no 8^dia após a injecção com uma dose infec4 t ciosa de 10 de vírus.

A descrição anterior e os exemplos revelam completamente o invento incluindo as suas concretizações preferidas. Pretende-se que as modificações aos métodos descritos que são óbvias para os peritos em genética molecular- e ciências afins estejam no âmbito das reivindicações seguintes.

Claims (5)

1 - Processo para purificar sT4 (Proteína T'4 solúvel)' a partir de meio clarificado condicionado de uma cultura de célii las que produz sT4, caracterizado por compreender (!) fazer contactar o meio condicionado com um suporte· de permuta catiónica, ficando assim o sT4 adsorvido ao suporte, (ii) eluir o sT4 do suporte, (iii) fazer contactar o eluído com um suporte de permuta aniónico e (iv) recolher sT4 no efluente do suporte de permuta aniónica.

2 — Processo de acordo com a reivindicação I, caracteri zado por o suporte de permuta catiónica ser um suporte de carboximetilo ou de sulfopropilo; a sT4 ser eluida com um gradien te crescente de sal;· e por o suporte de permuta aniónica ser DEAE ou QAE.

3 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracteri zado por compreender ainda passar o efluente do suporte de permuta aniónica através de um gel calibrador.

4 - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracteri zado por o gel calibrador, ser agarose reticulada possuindo uma dimensão de partículas inferior a 50/Am e possuindo uma gama de separação de pesos moleculares de 1000 a 300 000 daltons,

5 — Processo de produção de sT4 caracterizado por compreender (i) cultivar células de mamífero que expressem sT4;

(ii) clarificar o meio condicionado por centrifugação e filtração; (iii) contactar o meio clarificado com uma coluna sulfopro pyl-Sepharose(iv) eluir sT4 da coluna com um gradiente de NaCl de 0-0,5 M; (v) dialisar o eluído para remover o sal;

(vi) contactar o eluído dialisado com uma coluna QAE-Sepharose®; (vii) passar o efluente através de uma coluna de Superos^ 12 e (viii) recolher a sT'4 purificada..