JPH02503744A - 第ＶＩＩＩ：ｃ因子型タンパク質の改良生産方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 第■：Ｃ因子型タンパク質の改良生産方法［発明の背景］ 第■　因子複合体は２つの異なった生物学的Ｉ！能、即ち凝血活性および初期止 血に関与した役割をもつ、第■囚子欠乏疾患である古典的血友病およびフォノ・ ビルプラント病の分析は、第１因子が二つの構成要素の複合体であることを理解 するのに貢献した。第■：Ｃ因子凝血促進性タンパク質（抗血友病因子）および 第１因子関連抗原（フォノ・ビルブラ〉′ト因子、ＶＷＦ）は別々の遺伝制御に 支配され、それぞれ異なった生化学的および免疫学的性質を有し、特異的で不可 欠な生理学的機能を有する。

第■：Ｃ因子分子は血液凝固カスケードにおける重要な調節タンパク質である。

この分子はトロンビンによって活性化された後、第■ａ因子による第Ｘ因子の活 性化速度を促進し、結局フィブリン凝血の生成に導く、第■：Ｃ因子の欠乏（古 典的な血友病）は発病した男性の出血性Ｎ患率および死亡率の主な原因となるＸ 一連鎖染色体性疾患である。処１Ｆは通常血液製剤で頻回に輸血することからな る。この処置は血友病患者間に感染性合併症（種々の形の肝炎および後天性免疫 不全疾患等）の高い発生率を招く。

＼７　ＷＦ分子は血小板凝集で中心的役割と果たす粘着性のある糖タンパク質で ある。この分子は血漿内で第■：Ｃ因子の担体として働き、血小板−血管壁間の 相互作用を促進する。糖タンパク質１ｂおよび糖タンパク質Ｉｌ　ｂ−１ａ複合 体にある血小板受容体部位、およびコラーゲン結合部位へ結合するＶＷＦの別々 のドメインが注目された。ＶＷＦは恐らくは同一のそれぞれ約２３００００ダル トンの多皺のサブユニットから構成されている。ＶＷＦは内皮細胞および巨核球 で合成される。血漿内でＶＷＦは５Ｘ１０’〜１．０７ダルトンの範囲の高分子 量多量体として存在する。フォノ・ビルプラント因子は５〜６２６の炭水化物複 合体を含んでおり、それは血小板へ結合する分子の結合能に重要であるらしい、 ＶＷＦ活性のさまざまな異常がフォノ・ビルプラント病を生じ得る。障害は一般 に常染色体優勢の形で遺伝され、２０００人に１人程度の割で発病する。この疾 患の軽症の形は診断されずに済むことが多いが、型理発病患者ではたびたび血液 製剤でそれに伴う危険を支える必要がある、最近第■：Ｃ因子およびフォノ・ビ ルプラント因子の双方に対する遺伝子が単離され、本質的にウィルスが混入して いない組換え第■：Ｃ因子およびＶＷＦ因子の生産がそれぞれ可能となった［ツ ールら、１９８４年、ネーチャー、３１２巻、３４２頁；ウッドら、１９８４年 、ネーチャー、３１２巻、３３０頁：リンチら、１９８５年、セル、４１巻、４ ９〜５６頁：ギンスバーグら、１９８５年、サイエンス、２２８巻、１４０１〜 １４０６頁］、Ｍ換えＤＮＡ技術による第■：Ｃ因子またはその類似体の生産は 、第■：Ｃ因子またはその類似体を暗号化しているＤＮＡを含んだ好適な発現ベ クターでトランスフェクトまたは形質転換された哺乳動物細胞を利用して達成さ れた０組換え第■：Ｃ型囚子夕〉゛バク質の合成における主な問題点は、（ｉ） 培地から入手し得る組換え体タンパク質の収量、（ｉ）生産された組換え体タン パク質の安定性、（ｉ）タンパク質精製効率およびその費用、（ｉｖ）精製され た組換え体タンパク質生産全体に要する全費用等である。

最良の結果を得るため、これまで代表的には哺乳動物の血清、例えば通例ウシ胎 児血清調製品を培地の全容量に対して約１０容量％含有する培地でＦ■：Ｃ型タ ンパク質を生産する細胞を培養してきた（以下簡単にするため、血清濃度はすべ て全培地に対する容量％で表す）９血清の添加なしでは組換えＦ■：Ｃの収量お よび安定性はともに著しく低下する。然し血清の費用および血清添加によって生 じる精製の際の追加的な不都合さおよび出費のため、血清の使用は好ましくない 要件とみなされ、血漿から精製した天然Ｆ■：Ｃに換えて組換えＦ■：Ｃを広範 囲に使用することは商業的にも魅力がなかった。興味深いことに医学および薇学 社会では、組換えＦ■：Ｃの臨床的可能性は大きい関心事であったにもかかわら ず発明者らは上記の血清に依存する問題、その生化学的根拠およびそれに閏わる 方法に間してこれまで報告がないことに気付いた。

Ｆ■：Ｃ生産細胞に使用する培地の膨大な修飾実験の後、驚くべきことに発明者 らは、たとえ減量した血清を含有した培地（例えば半特定培地、〜１％血清を含 有する）もしくは本質的に無血清培地（特定培地）を使用しても安定なＦ■：Ｃ 型タンパク質を高収量で生産し得る方法を発見した。Ｆ■：Ｃ型タンパク質を生 産する宿主細胞は半特定培地または特定培地がＶＷＦまたはある種のリン脂質の ような疎水性物質の適量を含有していると、半特定培地または特定培地で少なく とも１０％血清の存在で得られる収量に匹敵し得る収量で、ある場合にはそれよ り優れた収量で回収可能な安定したＦ■：Ｃ型タンパク質を生産することが判明 しな、またさらにそのような添加物を欠いた半特定培地または特定培地で生産さ れたＦ■：Ｃ型タンパク質は典型的に劇的な不安定性を示し、たとえ回収された としても極めて低収量でしか回収し得ないことが判明した。

現在までの証拠からＶＷＦは生体内で血漿中の第■：Ｃ因子に対して安定化効果 を有するのか、あるいはＶＷＦが第■：Ｃ因子の貯蔵場所からの生体内放出を誘 発するのか、または第■：Ｃ因子の生体内合成および／または分泌を刺激するの かの何れかであろうことを示唆している（ワイス、Ｈ，Ｊ、ら、１９７７年、ジ ャーナル・オブ・クリニカル・インベステイゲーション、６０巻、３９０〜４０ ４頁）、またトロンビンで活性化された第■因子（天然ヒトＦ■由来）はトロン ビンが関与する分解に関して恐らくリン脂質によって安定化されることが示唆さ れた（アンダーソンおよびブラウン、１９８１年、バイオケミカル・ジャーナル 、２００巻、１６１〜１６７頁参照）、然りながら発明者らの知るところ、先行 技術では第■二Ｃ型因子タンパク質の試験管内生産（例えばトロンビンが実質上 存在しない場合）に対するＶＷＦまたはリン脂質の何らか可能な効果について示 唆を得られず、あるいはＷＷＦまたはＶＷＦ型タンパク質および／まなはリン脂 質を含有する第■：Ｃ因子生産のための培地補足物に関して、哺乳動物血清に存 在している成分の複合混合物を実質上含有しないのか、それともこの発明に示し たように１０％血清補足物によってもたらされるよりさらに高濃度を補足すべき かについて何らの示唆も得られない、ＩＩ乳動物の血清がＶＷＦを含有している ことに注目すべきである。９考までに約１０％血清を含有している哺乳動物細胞 用の通常の培地は培地１ｍｌ当りｖＷＦ約１μｇを含有している。

［発明の要約コ この発明は第■：Ｃ型因子タンパク質の改良生産方法に間するものである。

本明細書で用いるｒ第■：Ｃ型囚子」タンパク質の語は第■：Ｃ型因子凝血促進 活性を示すタンパク質を意味する。この発明の範囲に含まれる第■：Ｃ型因子タ ンパク質は非第■：Ｃ因子遺伝子へはハイブリッド形成を起こさない条件下で、 例えば５ｘＳＳＣ（１ｘＳＳＣは１５０ｍＭ　ＮａＣｌ１０．１５Ｍクエン酸ナ トリウム）中で６５Ｃと同等の条件下で、第■：Ｃ因子を暗号化しているＤＮＡ へハイブリッド形成し得るＤＮＡ配列によって暗号化されている。天然哺乳動物 （例えばヒト）の第■：Ｃ因子に追加して、第一：Ｃ型因子タンパク質には、例 えば国際特許出願番号ＰＣＴ／１Ｊｓ８６１００７７４号（１９８６年１０月２ ３日公閏）に詳細に報告されているように１例えば天然第■：Ｃ因子に対して９ ０Ｋｄおよび６９Ｋｄ切断部位間の１またはそれ以上のアミノ酸欠失を含んでい るタンパク質等が挙げられる。また第■：Ｃ囚子型タンパク質にはＰ　ＣＴ／Ｕ 　５８６１００７４号に報告された方法と類似の方法によって生産される５０／ ４０切断部位および６９Ｋｄ切断部位間の１またはそれ以上のアミノ酸欠失を含 んでいる第■：Ｃ因子類似体が挙げられる。

さらに第■：Ｃ因子型タンパク質には、例えば発現すべきｃ　ＤＮＡの通常の部 位特異的突然変異によって１またはそれ以上のアミノ酸を異なったアミノ酸で置 換することによって、２２６．３３６．５６２．７４０．７７６．１３１３．１ ６４８または１７２１の位置の１ｔたはそれ以上の切断部位をまたがるアルギニ ン残基がタンパク質分解酵素切断に対して抵抗性となった類似体（上記のような 欠失を含み、または含まない）が挙げられる。したがって第■：Ｃ因子型タンパ ク質にはそのタンパク質を生産する細胞に由来する細胞系によって生産された天 然の第■：Ｃ因子、「組換え」第■：Ｃ因子および凝血促進活性を有するその類 似体および弁組換え第■：Ｃ因子またはその類似体等が挙げられる。

したがってこの発明の方法は、第■：Ｃ型因子タンパク質を暗号化したＤＮＡを 含み、そのタンパク質を発現し得る哺乳動物細胞を利用する。この発明の方法は 第■：Ｃ型因子タンパク質を安定化させる物質の有効量を含有する培地で細胞を 培養する。そのような物質は、（ｉ）ＶＷＦ型タンパク質、（ｉ）安定化リン脂 質またはリン脂質混合物および（ｉ）ＶＷＦ型タンパク質とリン脂質の混合物等 である。「安定化物質」と名付けたが、ＶＷＦ型タンパク質は第■：Ｃ型因子タ ンパク質に対する安定化効果の他にもさらに第■：Ｃ型因子タンパク質を生産細 胞から高濃度で合成および／または放出させる別の効果をも有し得るものと理解 すべきである。ＶＷＦ型タンパク質には、上記のようにハイブリッド形成条件下 で哺乳動物のＶＷＦを暗号化しているｃＤＮＡヘハイブリッド形成が可能なｃＤ ＮＡによって暗号化され、第■：Ｃ型因子タンパク質を安定化し、あるいは培地 内で第■：Ｃ型因子タンパク質の生産および／または蓄積を増大させ得る能力を 保有している、先端を切り取った、あるいはその他の修飾を加えた７オン・ビル プラント因子を含んでいる。

例えばこの発明の実施に使用し得る先端を切り取った形のヒトＶＷＦには、（ｉ ）ＶＷＦの「プロ」配列を欠いている△プロＶＷＦ、（１１）成熟配列をもたな い「プロ」配列を含んでいる△成熟ＶＷＦ、（ｉ）プロＶＷＦ配列をそのＮ−末 端から５’５ａｃｌ制限酵素部位まで含み、ＶＷＦの「１０３部分および成熟配 列の最初の「Ｄｊドメインを含んでいるＶＷＦ−５’−３ａｃ等が挙げられる。

ＶＷＦの完全鎖長のペプチド配列、ヌクレオチド配列および制限酵素地図は公開 されている［例えば国際特許出願公開番号ＷＯ３６１０６０９６号（出願番号Ｐ ＣＴ／ＵＳ８６１００７６０）参照］、その配列を説明すると「プロ」部分はア ミノ酸位置２３からＡｒｇ−７６３にまたがり、「成熟」タンパク質はアミノ酸 位置７６４から２８１３にまたがっている。△プロＶＷＦを暗号化したｃＤＮＡ は、例えば以下に説明するベクターに含まれる完全Ｍ長のＶＷＦｃＤＮＡおよび ＶＷＦｒプレ」配列および成熟配列の一部または全部と相補的なくただし「プロ 」配列と相補的なコドンを欠いた）合成ループアウト・オリゴヌクレオチドを用 いる通常のループアウト突然変異により作成し得る。△成熟ＶＷＦを暗号化して いるｃＤＮＡはこれと類似の方法によって作成するか、あるいは完全鎖長のＶＷ ＦｃＤＮＡに含まれる都合よい制限酵素部位を利用することにより成熟配列の一 部または全部を除去することによって作成し得る。このように成熟配列の一部だ けを除去する場合は、成熟ペプチド配列を暗号化している残りのｃＤＮＡ領域を 通常のループアウト突然変異によって切り出してもよい、別法としてΔ成熟ＶＷ ＦおよびＶＷＦ−５’−５ａｃは、生産しようと望むペプチド配列の３′へ直ち に翻訳停止コドンを挿入する通常のオリゴヌクレオチド指向性突然変異により突 然変異させたＶＷＦｃＤＮＡの通常の哺乳動物への発現によって生産し得る。ま たその他、先端を切り取りもしくはそれ以外の修飾を加えたＷＷＦの形もこれと 類似の方法によって作成でき、以下に説明する方法によって容易に測定し得るよ うにこの発明の実施に有用である（例えば実施例参照）、特にｌまたはそれ以上 のｒ　ｐ　Ｊドメインを含んだ（そのうちの２つは「プロ」部分に存在している ）ＶＷＦの先端を切り取ったその他の形もこの発明の実施に有用であろうと予想 される。これまでのところ、この発明に使用するには先端を切り取ったＶＷＦ変 異種のうちで△プロＶＷＦが好ましい。

これらおよびこれらと類似の先端を切り取り、あるいはそれ以外の修飾を加えた 形のＶＷＦを使用することによって可能な利点は、（１）著しく小さい方のタン パク質の合成、翻訳後修飾および放出を意図することによって生産細胞のストレ ス負担を軽減し、（ｉ）小さい方のＶＷＦ型のタンパク質が存在し高分子量のＶ ＷＦ型多量、体が存在しないことにより馴化培地の粘度を減少させ、（ｉ）完全 鎖長のＶＷＦタンパク質より、むしろ先端を切り取ったＶＷＦ型タンパク質から の方がＦ■：Ｃ型タンパク質の精製を一層容易にすること等である。

ＶＷＦ型タンパク質は、好ましくは哺乳動物細胞で、例えばＶＷＦ型タンパク質 を暗号化しているｃＤＮＡの通常の発現により容易に生産され、その性質を明ら かにし得る。ついでそのようなＶＷＦ型タンパク質を、例えば実施例に記載した ような方法によってＦ■：Ｃ型タンパク質の生産に対する効果について試験し得 る。このＣＤＮＡは任意的または部位特異的な態様で突然変異により生産され得 る１本明細書では哺乳動物ＶＷＦおよびＶＷＦ型タンパク質な以下、単にＴＶＷ ＦＪと呼ぶ。

この発明の態様は第■：Ｃ型因子タンパク質を生産し得る哺乳動ｆ＃細胞を外来 性ＶＷＦ型タンパク質を添加した培地で培養することからなる第■：Ｃ型因子タ ンパク質の改良生産方法を包含する。以下さらに詳細に説明するように１例えば ＶＷＦ型タンパク質を生産する細胞により、あるいはＶＷＦ型タンパク質を生産 する細胞を第■：Ｃ型因子タンパク質を生産する細胞とともに培灸することによ り、あるいは遺伝子技術によってＶＷＦ型タンパク質および第■：Ｃ型因子タン パク質の双方を生産し得るようにした細胞を使用することにより、または例えば 馴化培地から得られた外来性ＶＷＦ型タンパク質を添加することによってあらか じめ培地を条件付けすることにより外来性ＶＷＦ型タンパク質を培地に添加し得 る。

ＶＷＦ型タンパク質の好ましい有効量は、一般にＶＷＦ約０．１〜１０μｇ／ｍ ＋（培地）、一層好ましくは〜１〜〜３μｇ／ｍ１．特に好ましくは〜２−〜３ μｇ／ｍｌである。然しながら遺伝子技術によりｖＷＦ型タンパク質と第■：Ｃ 型因子タンパク質の双方を生産し得るようにした細胞を使用することによって培 地へ外来性ＶｗＦ型夕〉バク質を添加する場合は、−ｉ的な範囲の最低量が好ま しいであろうことな銘記すべきである。低培地濃度であればあるほどそれにもか かわらず、第■：Ｃ型因子タンパク質が培地へ生産および分泌される部位で外来 性ＶＷＦ型タンパク質の一層有効量を入手し得るのであるから、ＶＷＦ型タンパ ク質が低培地濃度であるほどそのような方法では有用であり得る。そのうえ双方 のタンパク質を生産する細胞を使用することは、個々に１つまたはそれ以外のタ ンパク質な生産する異なった細胞を同時培養するよりも好ましい、後者の方法で は異なった細胞の一定しない増殖速度のように細胞培養過程の混乱を招くことが あり得るし、本来第■：Ｃ型因子タンパク質を生産するＨＩ胞の密度低下を生じ るからである（ＶＷＦ型タンパク質を生産する細胞が存在するため）。

好適なリン脂質の容易に入手し得る供給源の一つは乾燥脱脂粉乳および低脂肪脱 脂粉乳のような商業的に入手可能な乾燥粉乳製剤である。そのような乾燥粉乳製 剤は約０，０１〜１０％（乾燥粉乳量ｌ／培地容量）の範囲の量を培地へ添加し 得る０ＭＥ胞に対する毒性効果を最低にし第■：Ｃ因子生産に対する効果を最適 にするためには約１％〜４％の乾燥粉乳が好ましい、乾燥粉乳製剤はまず粉乳の １０％水性懸濁液を調製し、オートクレーブ加圧によって都合よく滅菌され得る 。もう一つの好適なリン脂質の入手可能な供給源は、この発明の培地に添加し得 る商業的に入手可能な大豆レシチンであり、好ましくはリポソームの形で添加す る。

本明細書で用いる「リン脂質」の語は、Ｎ肪酸１または２分子、アルコールおよ び窒素性塩基を含んだリン酸エステルを表す。そのようなリン脂質を例示すれば 、セファリン、ホスファチジルセリン：ホスファチジルコリンの混合物、ホスフ ァチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、大豆レシチンおよび それらの混合物等が挙げられ、とりわけ大豆レシチンが好ましい、この方法に有 用なその他のリン脂質および有効濃度および／または最適濃度および／またはそ れらの混合物については、当業者であれば以下さらに詳細に説明する方法を用い て容易に確かめ得るであろう、リン脂質またはリン脂質混合物の好ましい有効量 は培地１ｍｌ当りリン脂質またはリン脂質混合物的１〜１０００μｇで、約１０ ０μｇ／ｍｌより高濃度が一層好ましく、約２００〜３００μｇ／ｍｌが特に好 ましい、そのような組成物のＣＨＯ細胞のような哺乳動物細胞に対する観察され た毒性の点でそのようなリン脂質添加物の有用性は全く予想外であった。実際こ の発明でリン脂質添加物を使用する際、培地にウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を 追加的に含有させると細胞をそのような毒性から防御するのに好ましい、好適な りＳＡの濃度は使用したリン脂質の量、細胞の強度、ＢＳＡ無添加の際に観察さ れた毒性の程度により、１培地当りＢＳＡ約１〜約１０ｇの範囲である。またリ ン脂質混合物は好ましくは約５００ｎｍまでの直径を有するリポソームの形で培 地へ添加するのが好ましい、多重層リポソームも使用し得るが、リポソームは好 ましくは一枚膜である。最も好ましくはリポソームの直径は約１１００ｎよりも 小さい、またリポソームは、上記のリン脂質を第′″＠二〇型因子タンパク質と 混和し、あるいはそのタンパク質を患者に投与する基剤または担体として含有し 使用し得るリン脂質から通常の方法によって製造する。粉乳をリン脂質の供給源 として使用する場合は（リポソームの形よりもむしろ）粉乳を直接培地へ添加し てもよい。

−実ｍｗ様として、ＶＷＦ型タンパク質を生産するよう好適に操作した細胞のよ うなＶＷＦ型タンパク質生産細胞を、ＶＷＦ型タンパク質で条件付けした培地で 第■：Ｃ型因子タンパク質を生産する細胞の培養に先立ってまたは同時に培養す る。別法として組換えｖＷＦ型タンパク質を別途生産し、第■：Ｃ型因子タンパ ク質を生産する細胞を培養するために使用する培地へ外来性補足物として添加し てもよい、この発明のもう一つのＢｔｌは、第■：Ｃ型因子タンパク質を生産す る細胞を好適に操作し、即ちＶＷＦ型タンパク質生産の指令が可能な翻訳単位で ＶＷＦ型タンパク質と第■：Ｃ型因子タンパク質が同一細胞によって同時発現す るよう効果的に形質転換する。さらにこの発明のもう一つの態様では上記プロセ スの一つにより第■：Ｃ因子型タンパク質を生産する細胞培養のために使用する 培地にＶＷＦ型タンパク質と安定化リン脂質をともに含有する。その場合は単独 に使用する量に比べて各成分を減量して使用することが望ましい、好適に補足し たこの発明の特定培地を使用することにより回収可能な安定した第■：Ｃ因子型 タンパク質活性が高水準で生産され、ついでこれを回収し、血清を分離する必要 なく精製し得る。この発明で使用する培養培地は本質的に無血清培地が好ましい が、哺乳動物由来の血清、例えばウシ胎児血清を好ましくは約１０％の量を超え ず、一層好ましくは約５％の量を超えず、さらに好ましくは０〜１％の量を追加 的に含有し得る。またそれ以外に通常の哺乳動物細胞培養培地の補足物もまた使 用し得る。

この発明の実施に当ってはこのようにして生産された第■：Ｃ因子型タンパク質 が分泌された培地から都合よくこれを回収し、所望により、例えば通常のクロマ トグラフィー的な方法および免疫親和性に基づく方法等多くの任意の通常の方法 によって精製する。

以下に実施例を示して、特にリン脂質および／またはＶＷＦ型タンパク質と培地 補足物として使用することによって１回収可能な安定した活性筒■：Ｃ型因子タ ンパク質を生産する「血清」依存性を克服できる代表的な方法を挙げてこの発明 を説明する。実施例はこの発明の理解を深めるためのものであって、これによっ てこの発明の範囲を限定するものではない。

実施例Ｉ ヒト第■：Ｃ因子を発現するチャイニーズハムスター卵巣８１１１系の樹立 この発明で使用する第■：Ｃ因子発現プラスミドは、ポリオーマウィルスエンハ ンサ−、アデノウィルス３分節系先導配列の第一先導配列、ＤＨＰＲ遺伝子およ びＳＶ４０ポリアデニル化信号が後続する第■：Ｃ因子転写単位、およびテトラ サイクリン耐性暗号化遺伝子を時計方向順に含んでいるＲｘＰｙ■−１である。

このプラスミドを同時形質転換によってジヒドロ葉酸還元酵素（Ｄ　ＨＦ　Ｒ） 発現１ラスミドとともにＤＨＦＲ欠乏チャイニーズハムスター卵巣細胞へ導入し 、ついでヌクレオチド添加をしないで発育する細胞を選択した。続いてＤＨＰＲ 遺伝子および第■：Ｃ因子遺伝子を増幅するためｌ　ｉｇｌと命名した形質転換 体の１特定プールをメｌ−）レキセード（ＭＴＸ＞濃度を増加させた培地で発育 させた。得られた細胞系は第■因子欠乏血漿の凝固能（クロチック（ＡＰＰＴ） 検定）または第１Ｘａ因子、リン脂質、カルシウムおよび第Ｘ因子の存在下に第 Ｘａ因子を生成する生成能（カビ・コテスト検定）の何れかで測定する高濃度の 第■因子活性を発現した。これらのＣＨＯ細胞の第■：Ｃ因子産生能を第１表に 示す、第■因子活性は、第■因子遺伝子コピー数と相関するＭＴＸ耐性水準の増 大により１００００倍増加した。またその他の発現ベクターでも、第■：Ｃ因子 またはその類似体の発現指令が可能なものである限りＲｘＰｙ■−１の代わりに 使用し得る。そのようなベクターとして例えばｐＣＶＳＶＬ２−■（ＡＴＣＣ番 号３９８１３、ヨーロッパ特許出願第８５２０２１２１．１号参照）およびｐＤ ＧＲ−２（ＡＴＣＣ番号５３１００、ＰＣＴ／ＵＳ８６１００７７４号、欠失類 似体参照）等が挙げられる０例えｊｆｐｓＰ６４−Ｖｌ　（ＡＴＣＣ番号３９８ １２）またはｐＣＶＳＶＬ２−■由来の５ａｌｌ断片を含有するその他の第■： Ｃ因子発現ベクターは通常の発現ベクターおよび手法を用いて作成し得る。何れ のベクター由来の５ａｌｌ断片とも完全鎖長の第■：Ｃ因子を暗号化したＤＮＡ 配列を含んでいる。

［第１表コ トランスフェクトし増幅したｃＨｏｓ胞における第■因子発現７−ル　　　ＭＴ Ｘ、（μＭ）　　　　　■：Ｃのｍｕ／ｍｌ／日Ｌｊｇ　　１　　　　０．０　 　　　　　　　　　０．１０．０２１１．．５ ０．１　　　　　　　　　８８．０ １．０　　　　　　　２８８．５４５”５．０　　　　　　　６４４．８７５５ ２０．０　　　　　　　　　１０７５ ＊２つの独立した検定からの試料を表すプラスミドｐＡｄＤ２６ＳＶｐＡ（３） （カウフマンおよびシャープ、１９８２年、モレキュラー・セル・バイオロジー ）およびプラスミドｐＲＸＰ３／−■−１をＣ１ａ　１で消化して得られた直鎖 状のＤＮＡを試験管内でライゲーションしてＣａＰＯ４と共沈させ、ＣＨＯＤ） ＩＦＲ欠乏ＤＬＩＫＸ−Ｂｌ細胞のトランスフェクトに使用した。

Ｄ）ＩＦＲを効果的に発現した細胞はｐ　Ａ　ｄ　Ｄ　２６　Ｓ　Ｖ　Ｐ　Ａ　 （３）に由来するＤＨＦＲ遺伝子を伴ったＰＲＸＰ、ｙＷ−１由来のエンハンサ −要素を含むことが期待される。結果はこの仮説と一致した。ついで濃度を増加 したＭＴＸで増殖する細胞によるＤＨＦＲ発現の増加について選別し、第■因子 遺伝子およびＤ）ＩＦＲ遺伝子を増幅した細胞を得た。０．０５ｍＬｌ／ｍｌよ り高い感度が得られるように修飾したカビ・コテスト法で測定した第■：Ｃ因子 活性検定によって。

ＭＴＸ選別の各濃度毎に馴化培地試料（ウシ胎児血清１０％補足アルファ培地中 、約１０’細胞／ｍｌ）を採取した。また第■：Ｃ因子欠乏血漿を使用する１段 階活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）血液凝固検定でもそれに匹敵 し得る結果が得られた。すべての試料は３０〜５０倍のトロンビン活性化を示し た。トロンビン活性化のため、試料をトロンビン０．２単位／ｍｌで室温で１〜 １０分関前に処理した。

実施例■ 第■：Ｃ因子合成の血清依存性 実施例■のＬｉｇｌ　ＣＨＯ細胞のサブクローン（Ｌｉｇｌ　　２Ａサブクロー ンＢＩＯ２０，１μＭ　ＭＴＸ中、８０％墓密〉をすすぎ、１０％ＦＣＳ含有培 地または特定培地（無血清、５ｍｇ／ｍｌ　ＢＳＡ、インスリン、トランスフェ リン、セレン、ヒドロコーチシンおよび１トレツシン含有）で流加培養すると第 ■因子活性が蓄積する。特定培地中の出現率は血清含有培地中より約４倍低い、 血清の存在なしで細胞を増殖させると４倍の差はさらに増大する。これは細胞の すすぎが不十分であることに起因している。第■：Ｃ因その出現率は２４時間ま でやや直線的に増加し、これは第■因子が培地内で安定であることを示唆してい る。この結果はｃｏｓｓ胞で得られた低水準の第■因子発現結果（約１０’細胞 ｍ！／日）と類似している。

リン脂質混合物であるセファリンは少なくとも血清欠乏を部分的に中和できる。

実施例１のＣＨＯ細胞のサブクローン（Ｌｉｇ２Ａプール、２０μＭ　ＭＴＸ） を血清添加および無添加で別々に培養し、４時間後にすすいだ、２つのＣＨＯ培 養を再分割し、血清“および血清−ｃＨｏｓ胞の一部にセファリン５μＭを補足 してさらに２時間培養した。血清１および血清−ＣＨ０細胞の他の部分はセファ リンを補足しなかった。培地を６時間口および２５時時間化検定した。その結果 を下表に示す。

条件　　　　　　　　　　第■：Ｃ因子活性會血清　　　　セファリン　　　６ 時間口　　　２５時間目十ＦＣＳ　　　　十Ｃｅｐｈ　　　　　５９４　　　　 １０４４−Ｆ’ＣＳ　　　　十Ｃｅｐｈ　　　　　４０８　　　　　５１４十Ｆ Ｃ３−Ｃｅｐｈ　　　　　５６３　　　　１４９２−Ｆｅ２　　　−Ｃｅｐｈ　 　　　　１４０　　　　　３７２’ｍ　Ｌｌ　７ｍ　１ この結果から、セファリンは無血清単独で第■活性を増加させることができるが その効果は単時間性であることが示唆される（即ち２時間後では観察されるが２ ５時時間化は消失する）、−実験で、セファリン濃度牙増加したがそれ以上の第 ■活性増加は認められなかった。このことはセファリン中のある成分が律速的で はないことを示している。

セファリン効果は簡単な混合物または単一のリン脂質によって部分的に誘発でき る。細胞（実施例ＩのＣＨＯ細胞のサブクローン、Ｌｉｇｌ　　２Ａ　、０２プ ール、２０μＭ　ＭＴＸ）を１０％ウシ胎児血清培地または無血清培地で２４時 間流加培養し、ついでセファリン（５μＭ）またはホスファチジルセリンおよび ホスファチジルコリン（ＰＣＰＳ）の混合物（１：４）を無血清培養へ添加した 。２時間後検定した培地の成績を下表に示す。

条件　　　　　　　　　　　　　Ｆ■：Ｃ活性無血清　　　　　　　　　　　　 　　　１１０無血清＋セフアリン　　　　　　　　　４８９無血清十ＰＣＰＳ　 　　　　　　　　　　　２３０１０％ＦＣ３６１３ この結果からリン脂質は単独で馴化培地の第■活性を増加し得ることが判る。

さまざまな条件下で発育させたＣＨＯ細胞で発現した第■活性のトロンビン活性 化分析から血清の存在がトロンビン活性化程度Ｅ　ｉｔ少させることか示唆され る。ＣＨＯ細胞（Ｌｉｇｌ　　２Ａプール、２０μＭ　ＭＴＸ）をすすぎ、１０ ％ウシ胎児血清含有培地または特定培地（５ｍｇ／ｍｌ　ＢＳＡ、）ランスフェ リン、セレン、インスリン、ヒドロコーチシン、１トレツシン）で流加培養した 。２４時間後、セファリンまたは１０％ＦＣ３を添加し、さらに２時間後、検定 のため試料を採取してトロンビン活性化能を測定した。

検定（２６時間目） 凝固検定 添加物　　　　　Ｃｏｂａｓ　　　（活性化の試料培地　　　　（２４時間目） 　　　ｍＬｌ／ｍｌ　　　ｍＬｌ／ｍｌ　　　倍数）特定培地　　　　　　　　 　　　　　３１５　　　３００　　　２０×特定培地　　　　５μＭセファリン 　７５２　　１０４０　　　３４Ｘ特定培地　　　　１０％ＦＣ３６８４４４０ ８，４Ｘ十１０％Ｆ　ＣＳ　　　　　　　　　１０７８　　１２００　　　１０ ｘ−１１０％ＦＣ３５μＭセフｙリン　１１５４　　１１２０　　　１４Ｘ（表 つづき） 特定培地　　　　１０％煮沸ＦＣ３５４３−−これらの結果から、無血清培地と 比較して血清の存在は生産される活性を増大するがトロンビン活性を低下するこ とが示唆される。

これに反してセファリンは生産される第■活性化能を増大する血清効果を代償し 得るがトロンビン活性化能を低下しない、このようにＣ）Ｉ　ＯＩ！！１Ｎ２１ は第■活性を１単位／ｍｌの濃度で生産し、この物質は３４倍のトロンビン活性 化を示す、またこの実験では検定の２時間前に無血清培地へ１０％ＦＣ８を添加 すると第■活性量が増加することを示している。この能力は添加の１０分前に血 清を煮沸してもそれによって消失されない、このように第■活性に必要な血清因 子は熱に安定である０発明者らは第■活性の増加に必要な血清因子はリン脂質と リン脂質を安定化させるのに必要な熱に安定なもう１つの因子の２つの成分から なっていると結論した。

著しく増幅されたＣＨＯ細胞系で１０％血清が第■：Ｃ因子発現を限定するのか どうかを測定するため、１０Ａ１細胞系で第■：Ｃ因子活性を誘発する能力に対 する血清量増加の効果を調べた。１０Ａ１はＬｉｇｌブールを１ｍＭ　ＭＴＸで の発育について選択することによって誘導されたクローンである。この実験では １０Ａ１細胞系へ添加するウシ胎児血清量の増加の第■因子活性に対する２４時 間の効果が証明された。２４時間馴化培地で５０％血清は１０％血清と比較して ３倍強力な活性を生じた。また細胞を５０％血清中で増殖させた他の実験結果か らも活性第■因子抗原の量がそれに対応して増加することが判明した。やや低い 第■：Ｃ因子濃度を発現する他の細胞系をもっと高い血清濃度で発育させること により、それほど劇的ではないが第■：Ｃ因子活性の増加を示した。このように 第■因子の商業規模的生産に望ましい高生産細胞系では、第■因子発現のため何 らかの制限必要量があるように思われる。

実施例層 ＣＨＯの浮遊培養におけるｒ第■：Ｃ因子合成の血清依存性下表は培養中の血清 濃度に対する組換え第■：Ｃ因子（ｒＦ■）活性の依存性を示したものである。

比較的低いｒＦ■生産体であるクローンＩＥ６Ｔｈ各種濃度のウシ胎児血清（Ｆ ＢＳ＞を含有する培地で浮遊培養により３〜４日間発育させた。

１０％ＦＢＳ　　　　　　３１８　　　　　　　　　０．１９５％ＦＢＳ　　　 　　　　１００　　　　　　　　　０．０３特定培地”　　　　　　　　４　　 　　　　　　１／４〜０．０１−上記はすべてＲＰＭＩ　１６４０を基本培地と して使用した。特定培地はインスリ〉・５μｇ／Ｉ、トランスフェリン５μｇ／ ｍｌ、セレン５ｒ＋ｇ／ｍｌ、ヒドロコーチシン１０−”Ｍ、プトレッシン１０ ０ｒ＋ｇ／ｍｌ　ＢＳＡ　　５ｍｇ／ｍｌからなる。

これと同じ血清依存性が他のｒＦ■分泌ＣＨＯ細胞系でも観察された。血清を添 加することによって本来の発現水準を回復し得ることからこれらの成績は遺伝的 な不安定性を反映するものではない。

培養培地へリン脂質を添加することにより血清必要量の代わりとすることができ ることが判明したが、ただし比較的高濃度のリン脂質を必要とする（以前、血清 含有培地で使用されていたよりも１０〜２０倍高濃度）、Ｆ■活性回収率のリン 脂質濃度に対する依存性に関して特定培地（ＤＭ）を培地１ｍｌ当り大豆レシチ ン（ＳＬ）２４０ｕｇで補足すると、２４時間後に５Ｌ１６０μｇ／ｍｌを含有 するＤＭで得られる活性の約２倍のＦ■活性、５Ｌ８０μｇ／ｍ＋を含有するＤ Ｍで得られる活性の５倍のＦ■活性が収得されることが判明した。それでも５Ｌ ８０μｇ／ｍｌを含有するＤＭは１％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有するＤＭ（ 半特定培地）よりある程度高いＦ■活性を提供するが、半特定培地はＤＭ単独よ り著しく高いＦ■活性を提供する。培地中に５Ｌ２４０μｇ／ｍｌが存在する特 定培地で２４時間に生じるｒＦ■濃度は、少なくとも１０％ＦＢＳを補足したＤ Ｍで生じる活性と明らかに同程度である。この実験でＳＬ濃度を２４０μｇ／ｍ １以上に増量してもｒＦ■活性はもはや増加しない０例示的に１実験の成績を下 表に示す。

培地　　　　　　　　　　　　　　　２４時ｒｊｊＪ後のｒＦ■活性特定培地（ ＤＭ）　　　　　　　　　　　　　〜４０ｍｔＪ／ｍｌＤＭ十大豆レシチン（Ｓ Ｌ）　　　　　　　　〜２７０ｍＵ／ｍ１（２４０μｇ（ＳＬ）／ｍ！　（培地 ））ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有する 培地（１０％ＦＢＳ）　　　　　　　　　　〜２００ｍＵ／ｍｒこの成績はウシ 胎児血清が存在しない場合、比較的高濃度の大豆レシチンリン脂質によって（例 えば２４０μｇ／ｍ１）ｒＦ■：Ｃ活性の増加が得られることを示している。リ ン脂質が存在または存在しないウシ血清アルブミン５ｇ／ｌを含有する特定培地 またはｌＯ％ＦＢＳを含有する培地に、ＣＨＯ細胞（ＩＦ５．０．１μＭ　ＭＴ Ｘ）を３Ｘ１０’細胞／ｍ＋の濃度で３７℃で２４時間浮遊させた。

細胞を含有しない馴化培地のインキュベーション試料の結論は色原体検定によっ て分析した。

リン脂質を培地１ｍｌ当り約３２０μｇの量まで添加しても、特定培地でも半特 定培地でも細胞発育に何ら著しい変化が起こらないことが判った。１組の実験で 培地１ｍｌ当りリン脂質３２０μｇと添加した培養で最高のｒＦ■活性が得られ ることが判明した。半特定培地では大豆レシチン２４０μｇ／ｍ＋を添加したと き７２時間後に最高の濃度が得られた。これらおよびその他の成績は、大豆レシ チンを０．１．２および３日目に段階的に培養へ添加するとｒＦ■が支障なく生 産されることを示している。これらおよびその他の実験からリン脂質の調製方法 に関係なくその最適濃度はおよそ２４０μｇ／ｍ＋である。

上記と類似の実験により２つの異なったＣＨＯ細胞系の細胞生産能を下表に示す 。

１０％ＦＢＳ　　　　　　　　　　　　　　　０．１９５％ＦＢＳ　　　　　　 　　　　　　　　　　０．０３特定培地　　　　　　　　　　　　　　　　１７ ４〜０．０１特定培地＋ＳＬ　　　　　　　　　　　　　　０．２４特定培地＋ １％ＦＢＳ＋ＳＬ　　　　　　　　０．２５（表つづき） 培地　　　　　　　　　　　平均生産能”（細胞系−８９，０５＞１０％ＦＢＳ 　　　　　　　　　　　　　　　０．４３特定培地＋１％ＦＢＳ＋ＳＬ　　　　 　　　　０．５１會単位は前頁と同じ このようにリン脂質を補足した特定培地の場合、ｒｃＨｏ細胞からのｒＦ■生産 能は血清含有培地と少なくとも同等である。然しながら上記の成績が示すように 、特定培地で生産されるｒＦ■の見掛は量は血清含有培地より少ない、これは血 清含有培地では細胞が一層急速に、一層高い細胞密度で発育する事実に起因する （生産能が高いというよりむしろ）、少量の血清を特定培地に補足すると（例え ば１％）細胞発育は改善される。事実短期間の適応ののち、細胞は半特定培地お よび１０％ＦＢＳ補足培地とほとんど同様に良く発育する。ｒｃＨｏ細胞系（例 えば発明者らの８９．０５）はリン脂質補足半特定培地中で１０％ＦＢＳ補足培 地と類似した細胞密度で発育し、少な（とも同等の生産能（第■因子に関して） を有する。

なお発明者らは大豆レシチン製剤の物理的性質を調べた。大豆レシチンを食塩水 に懸濁し、マントン−ガラリン・ホモジナイザーを３回通し、ついで０．２μｍ のフィルターで枦遇した代表的なリン脂質の大きさの像と得た。この方法によっ て得らｈた大多数の１ノボソームの大きさの平均は直径約１００ｎ１００ｎ′Ｘ さ１）−紋服リポソーム（ＳＬＩＶ）であることを示している。下記の実＠Ｎヨ 大豆レシチンリポソームの大きさがリン脂質の効果、即ちＦ■：Ｃ発現の増大を 起こすＳＬの能力に重要な役割を果たしていることを示して１する。

大豆レシチン製剤を食塩水中で調製したが、ホモジナイズしなかった。この製剤 は正常の（即ちホモジナイズされた）製剤より著しく小さいｓｕｖ　＜リポソー ムの僅かに４４％がｌ　Ｑ　Ｑ　ｎ　ｒｎ以下、正常な製剤では７４％）を含ん でいる。またこの製剤は、正常な製剤ではごく少量しか存在しない（通常５％を 超えない）直径約５０ＯｎＩｎの極めて多数の多重層リポソーム（ＭＶ）を含ん でいる（リポソーム全体の３０〜４０％がＭＶ）、この試料の効率は正常試料の 約６０％と低く、リポソームの大きさがリン脂質の効率に重要な役割を果たして いることを示している。

実施例■ ブタＶＷＦは血清の存在なしで増殖したＣＨＯ細胞に作用して細胞から第■：Ｃ 因子を誘発することができる。

実施例１で得られたＬｉｇｌ　（２０μＭ　ＭＴＸ）細胞をすすぎ。

特定培地（インスリン、トランスフェリン、セレン、ヒドロコーチシン、プトレ ッシン、グルタミン、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含有するアルファ 培地）でウシ血清アルブミンの濃度を増加しながら、または同様の濃度の第■表 のオボアルブミンを戻し添加しなから流加培養した。二つのタンパク質とも作用 して第■：Ｃ因子発現を誘発することができた。然し部分的に精製したＶＷＦを ウシ血清アルブミン５ｇ／ｌを含有する培地へ戻し添加すると、第■：Ｃ因子活 性は１０％ウシ胎児血清で細胞を増殖したときに得られた水準以上になり４倍に 増大した。このことは血清の存在しな暫）場合に第■：Ｃ因子活性を誘発するＶ ＷＦの誘発能を劇的に証明している。ブタＶＷＦのさまざまな製剤および精製し たヒトＶＷＦでこの結果を再現させた。

第■：Ｃ因子誘発能がＶＷＦに起因することを証明するため、以下の実験を行っ た。ヒトＶＷＦ欠乏血漿から誘導された血清を含有する培地の存在で第■：Ｃ因 子を発現する細胞をインキュベートした。■ＷＦ欠乏血清でインキュベートした ＣＨＯ細胞内の第■：Ｃ因子活性は正常ヒト血清と比較した水準の２５％であっ た。ブタ■ＷＦ製剤をＶＷＦ欠乏血清へ戻し添加すると、第■因子活性は１０％ ウシ胎児血清の値まで増加した。その効果は２．５０μｇ／ｍ＋程度の少量のＶ ＷＦ″Ｃ−誘発された（第ＨＡ表参照）、また別の実験でＶＷＦ濃度を０．２５ μｇ／ｍｌに減少させると、活性は１０％ウシ胎児血清水準の僅か５０％であっ た。

ウシＶＷＦの残余量さえも存在しない特定培地で外来性ＶＷＦがｒＦ■発現水準 を増大し得ることを証明するため、血清の存在なしで２〜３ケ月間適応させて発 育させたＣＨＯ４１Ｂ胞系ＩＥ６を下記の実験に使用した。下記に示した成績は 特定培地へ約１μｇ／ｍ＋のブタＶＷＦを補足することによって１０％ウシ血清 補足培地と同等のｒＦ■を発現し得ることを示している。これらの細胞はＦＢＳ の存在なしで３ケ月以上発育させたのであるからウシ血清は痕跡さえも存在しな い、したがって観察されたｒＦ■：Ｃ水準の増加は外来性ＶＷＦに起因するもの と思われる。

血清が存在しない場合のｒＦ■発現に対するＶＷＦの効果培地　　　　　　　　 　　　　　　ｒＦ■（ｍａｌ／ｍｌ）特定培地（ＤＭ）　　　　　　　　　　　 　〜４０ＤＭ十ＶＷＦ　　　　　　　　　　　　　　〜１９０ＦＢＳ含有培地（ １０％）　　　　　　　〜２００この成績はウシ胎児血清の存在なしで外来性の 部分的に精製したＶＷＦ（ブタ）によってｒＦ■活性が増加することを示してい る。

部分的に精製したブタＶＷＦ　（約１μｇ／ｍｌ＞の存在または存在しないウシ 血清アルブミン５ｇ／ｌを含有する特定培地または１０％ＦＢＳ含有培地でＣＨ Ｏ細胞（ＩＥ６　；　０．ｌｕＭ　ＭＴＸ）を３×１０Ｅ５ｍ胞／ｍ１の濃度で ２４時間３７℃で浮遊させた。細胞を含有しない馴化培地インキュベーション試 着の結論はｒＦ■：Ｃ活性を色原体検定によって分析した。

第ｎ表ＶＷＦをＬｉ　ｇｌ細胞へ戻し添加した特定培地における第■、Ｃ因子発 現 特定培地＋　　　　　　　　　　　　　　　　　（単位／ｍｌ／日）オボアルブ ミン（ｇ／ｌ）　　　　ＯＯ，１６４５、ＯＯ，２９０ ２０，００−３８０ ＋ブタＶＷＦ　（２，５μｇ／ｍｌ）　　　　　１．２００特定培地士 ウシ血清アルブミン （ｇ／ｌ）　　　　　　　　ＯＯ，１９００，５０，３２０ １，００，３８０ ２，００，３７５ 〈第Ｂ表つづき） ５．０　　　　　０．４３０ ２０．０　　　　　０．４９０ ５．０ ＋ブタＶＷＦ　（２，５，ｃｚ　ｇ／ｍり　　　　　１．３５０１０％ウシ胎児 血清　　　　　　　　　　　０．９７８．１．０７５第１ＩＡ表第■因子生産に 対するＶＷＦ’の効果培地　　　　　　　　　　　　　　　ｍｕ／ｍｌ／日１０ ％ウシ胎児血清　　　　　　　　　　　　　　１３２１特定培地＋５ｇ／ｌ ウシ血清アルブミン　　　　　　　　　　　３４２１０％正常ヒト血清　　　　 　　　　　　　　　　９３７１０％ＶＷ欠乏ヒト血清　　　　　　　　　　　　 　２４６１０％ＶＷ欠乏ヒト血清士 ブタＶＷＦ戻し添加（濃度） ２．５μｇ／ｍｌ　　　　　　　　　　　　１１２４２０μｇ／ｍ１　　　　　 　　　　　　１．３９７馴化培地で第■：Ｃ因子量に対する■ＷＦ添加の効果を 検討するため、細胞を’３５３−メチオニンの１時間パルスで標識し、１０％ウ シ胎児血清、１０％ＶＷＦ欠乏ヒト血清、またはブタＷＷＦを戻し添加する１０ ％ＶＷＦ欠乏ヒト血清の何れかを含有する培地でこれを追跡した。その結果、Ｖ ＷＦ欠乏血清へＶＷＦを添加すると第■：Ｃ因子＜２００ｋＤａのｌ！および７ ６ｋＤａのＬＭの両方）が培地中に一層多量に存在することが証明された。第■ ：Ｃ因子の細胞内合成には変化が観察されなかった。１０％ウシ胎児血清へＶＷ Ｆを添加しても馴化培地内の第■：Ｃ因子濃度には何ら変化を生じなかった。こ れらの実験はＶＷＦが第■：Ｃ因子の分泌および／または安定性に必要であるこ とを示している。

実施例■ ｃｏｓａ胞でのヒトＶＷＦの発現 ヒトＶＷＦｃＤＮＡの部分断片のクローニングは以前報告されたくギンスバーグ ら、１９８５年、サイエンス）４この報告に引き続き完全鎖長のＶＷＦｃＤＮＡ が組立てられ、その配列が決定さｚ′した。ＶＷＦのクローニング、配列および 発現に関しては国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ８６１００７６０号（１９８６年 １０月２３日公開）に詳細に報告されている１発明者らは完全鎖長のｃＤＮＡク ローンを発現へ９　ター　ｐ　Ｍ　Ｔ　２　ｉ＼挿入してｐＭＴ２−ＶＷＦ　（ ＡＴＣＣ番号６７１２２）を作成した。ＰＭＴ２−ＶＷはアデノウィルス随伴（ ＶＡ）遺伝子、転写エンハンサ−を含んだＳＶ４０複製起源。

アデノウィルス３分節先導配列および免疫グロブリン遺伝子由来の５°スプライ ス部位、３“スズライス部位と含むアデノウィルス主後期プロモーター、ＶＶＪ Ｆ暗号化領域、非暗号化ＤＨＦＲ挿入、ＳＶ４０初期ポリアデニル化部位、およ びエシェリキア・コリで増殖するのに必要なｐＢＲ３２２配列を含んでいる。ｐ Ｑ２の誘導体であるこのベクターの詳細はカウフマンによって提供されている（ プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ ・オプ・ジ・ＵＳＡ、８２巻、６８９〜６９３頁（１９８５年））、ついでｃｏ ｓａ胞トランスフェクションのためＰＭＴ２−ＶＷＦ　ＤＮＡＥ通常の方法によ り作成した。ＤＥＡＥデキスト実施偽■ ランｇ介ｃＯ５４ｆ３胞トランスフェクションをして６０時間後、細胞を３５８ −メチオニンで標識し、培地および細胞抽出物分家先払ヒトポリクローナル抗体 （カルビオケム社）で免疫沈降し、沈殿物をＳＤＳ還元型ゲル；気泳動によって 分析した。その結果トランスフェクトされたＣＯ８細胞で著しい量のＶＷＦが合 成され、その大部分が分泌されていることが証明された９馴化培地には約２６０ ｋＤａのタンパク質と完全にプロセスされた形のＶ　ＩＶ　Ｆに似た２２０ｋＤ ａのタンパク質がある１合成されたＶＷＦの約５０％は２００ｋＤとの形ノープ ロセスされる。非還元型ゲル電気泳動によって５ＩＩＬ体形成について分析する とＶＷＦは多量体へ取り込まれるが血漿で見られるような極度に高い分子量でな いことが判る。ざっと見積もって多量体は１ミリオンダルトンまでの範囲である 。ＣＯＳ細胞馴化培地中のＶＷＦ抗原を分析すると０．３５μｇ／ｍＩの濃度で ヒトＶＷＦの存在を示している。また別の分析ではｃｏｓｉ胞で発現したＶＷＦ が血小板およびコラーゲンの双方と特異的に結合することを示している。

（表−）づき） 組換えＶＷＦはヒ１−第■：Ｃ因子の発現？誘発することができる、ＤＥＡＥデ キストラン媒介トランスフシスション′によって＼７　Ｗｌ’発現プラスミドｐ ＭＴ２−ＶＷＦをＣＯ８細胞へトランスフェクトし、トランスフェクション後３ ６時間に培地と無血清へ変えたくＤＭ　Ｅ　Ｍ欠乏血清）、７２時間後、ＣＯ８ 細胞馴化培地を回収し、あらかじめ無血清培地ですすいだＣＨＯＬｉｇｌ細胞（ ２０μ八・１λうＴＸ耐性）へ適用した（１０６細胞／ｍ＋）、２４時間後、培 地をＣＨＯ絽胞から取り、第■因子活性を検定した。その結果を１０％ウシ胎児 血清培地および無血清培地で２４時間増殖させたＣＨＯ細胞からの第■：Ｃ因子 活性と比較して下表に示す。これらの結果は第■因子をＣＨＯ細胞から誘発する ｒ　Ｖ　Ｗ　Ｆの誘発能を示している。

ＣＨＯＬｉｇｌに対する培地　　　　　　第■：Ｃ因子＜２０μＭ　ＭＴＸ＞　 　　　　　　　　（ｍｕ／ｎ−＋Ｉ）模擬トランスフェクトしたＣＯ８ 細胞からの馴化培地　　　　　　　　　　　　　】４１＼、’ＷＦトランスシス クトシたＣＯ８細胞からの馴化培地”　　　　　　　　　　　　４２３１０％ウ シ胎児血清　　　　　　　　　　　　　９５０無血清培地　　　　　　　　　　 　　　　　　　　３０１この実験の馴化培地はヒトＶＷＦ０．３μｇ／ｍｌを含 有している実施例■ 第■：Ｃ因子を発現するＣＨＯ細胞におけるＶＷＦ遺伝子の導入、その発現およ び増幅 ＶＷＦをチャイニーズ・ハムスター卵巣（Ｃ）ｔｏ）細胞で発現するため、アデ ノシンデアミナーゼ酵素と過剰発現する細胞を選択するプロトコールにより、別 の発現ベクターｐＭＴ２ＡＤＡ−ＶＷＦ（ＡＴＣＣ番号６７１７２）を使用して プラスミド配列を増幅した（カウフマンら、１９８６年、プロシーディングズ・ オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オプ・サイエンシズ・オブ・ジ・ＬＪＳＡ 、８３巻、３１３６頁、米国特許出願第６１９８０１号）、Ｌｉｇｌ２−ａ（実 施例１．１ｍＭＭＴＸ）からクローンし、１０Ａ１と命名した第■：Ｃ因子発現 細胞系とｐＭＴ２ＡＤＡ−ＶＷＦ伝達の受容紀胞として使用した。ＰＭＴ２ＡＤ Ａ−ＶＷＦ’ｉ；サンドリーゴルジンらの記載のようにプロトプラス）−融合に より１０Ａ１細胞へ導入したくモレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー 、１９８１年。

コ巻、７４３頁）、ｐＭＴ２ＡＤＡ−ＶｗＦ？保有しているｘシエリキア・コリ ＤＨ５細胞（ＤＨ５はＶ　ＷＦ配列の相同的な組換えおよび欠失な最小とするた めに使用）をアンピシリン５０ノ、ｔｇ／ｍｌ含有Ｌ−ブロス５０ｙｎｌ’′ｃ ″Ａ６゜。０．６となるまで発育させた。プラスミドコピー数を増幅するためク ロラムフェニコールを２５０μｇ／＋ｒ＋ｌまで添加してさらに培養を１６時間 ３７℃でインキュベートした。プロトプラスト浮遊液を調製しくサンドリーゴル ジン、１９８１年）、約１〜２Ｘ１０’プロトプラスト／細胞の割合でこれを１ ０Ａ１ａ胞ｌ＼添加し、ｌＥＣ−に型遠心機で２０００ｒｐｍで８分間細胞を遠 心した。遠心後、吸引により上滑を除去し、ポリエチレングリコール溶液（ＰＥ Ｇ　　１．４５０　５０ｇ、ベーカー・ケミカル・カンパニー、ダルベ・１コ修 飾培地５０ｍ１溶液）２ｍｌを各プレートへ添加した。細胞を再度２００Ｏｒｐ ｍで９０秒間遠心し、ポリエチしングリコールｉ容液テ除去し、プレート含】０ ％（〜・／Ｖ）ウシ胎児血清を含有するアルファ培地で３回洗浄した。ついで細 胞を組織培養皿でカナマイシン１１００ｚｚ／ｌｎｌ、ペニシリンおよびストレ プトマイシンそれぞれ１０ノ１ｇ／ｍｌおよび２０ｇＭＭＴＸをか有する培地で 培養した。２日後、細胞とトリプシン処理し、透析した１０９ｏウシ胎児血清、 ０，１μＭデオキシコフオルマイシン、１０ｇｇ／ｍｌペニシリンおよびストレ プトマイシンを含有し、２０ｇＭ　ＭＴＸを添加しまたは添加しないＡ　Ｄ　Ａ 　’ｆ４択培地へ１＝１５に継ｆ℃培養した。ＡＤＡＷｉ択培地（ＡＡＬＩ＞は １．１ｍＭアデノシ〉、１０ｇｇ　／ＩＩＩ　＋プラスシンおよび１ｍＭウリジ ンを含有する。

続いてこの段階でＭＴＸ選択を除くと第■二Ｃ因子発現が減少した。

引き続きＭ　Ｔ　ＸをＡＤＡ選択培地に残した。

細１２！毒性濃度のアデノシンの存在で２°−デオキシコツオルマイシン（ｄＣ Ｆ）濃度を増加して発育させる選択によってＶＷＦ遺伝子をｔｔ！！幅すること ができる。形質転換体（６コロニー）のプール（３−ａ）を１０Ａ１細胞から調 製し、２０ｇＭ　ＭＴＸの存在するＡＤＡで選択した。２０ｇＭ　ＭＴＸの存在 で２゛−デオキシコツオルマイシンの濃度をＰ９．階的に増加することによりＡ 　Ｄ　Ａ　ｐ択の値を変えたく０．１μＭ、０．５μＭ、１．０μＭおよび２， ０μＭの段階）。

各段陰毎に１〇九ウつ胎児血清（Ｆｅ２）または特定培地で２４時間後にＶＷＦ および第■：Ｃ因子の生産を測定した。その結果を下表にまとめた。

Ｃ）１０細胞系におけるＶＷＦおよびＦ■：Ｃの同時発現細胞系　　　　選択　 　　　　ＶＷＦ抗原　　　　　第■：ＣｄＣＦ　　　ＭＴＸ　　　　　　　　　 　　　　因子μＭ　　　　ｔｔＭ　　Ｊｔｇ／ｍＩ　ｐｇ／ｍ胞　μ単位／ｍ胞 （ＶＷＦ無添加）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．９３”０Ａ１３ ａ プール　　０．１　２０　　　０．０７　　０．１０．５　２０　　　０．８　 　　１．１４　　０．６３’０．８９゜ １．０　２０　　　２４　　　３０　　　０．６３”１　、１　” ２．０　１０００　７．４　　　２４　　　　１．４”１、．５” ＊特定培地、Ｖ″１１０％ウシ胎児血清含有培地、ｖＷＦ抗原ζま精製家兎抗＼ ７ＷＦ抗血清親和性を用いるエライサ検定法（加しビオクムーベーリング社、７ ８２３０１）によって測定した。正常ヒト血Ｍアールから精製したＶＷＦｖＬ原 を標準および対照として用ｔ１、ＩｇＧはカルビオゲムーベーリング、７８２３ ０１から単離し、アルカリ性ホスファターゼと結合させた。第■：Ｃ因子活性ζ １実施例■に記載した色原体検定法によって測定した。

これらの結果はＶＷＦの発現がＡ　Ｄ　Ａ　ｍ択の増加とともに増加することを 示している。また第■：Ｃ囚子の発現は、】ひＡ１３−ａ細胞系が２μＭ　ｄＤ Ｆおよび１０００μＭ　ＭＴＸで観察されたように特定培地で１．４μ単位／細 胞７日の第■：Ｃ因子を発現することから血清の存在とは！！量関係ある。

実施例■ 第ｖＩ：Ｃ因子を発現するＣＨＯ細胞とＶＷＦを発現するＣＨＯ繍胞との融合 ＶＷＦ遺伝子をＣＨＯＤ）ＩＦＲ欠乏細胞へ導入した（ＤＬＩＫＸ−Ｂ】】、チ ャシンおよびアーラウプ、１９８０年、１０シーデイングズ・オプ・ザ・ナショ ナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ・オブ・ジ・ＵＳＡ、７７巻、４４２１ ６）、ＶＷＦの発現に件ってＭ　Ｔ　Ｘ耐性またはｄＣＦ耐性の何れかを発現す る細胞を得るため２つの研究を行った。ついで両方の細胞系を引き続き使用して 他の細胞と融合し、ＭＴＸ耐性でもｄＣＦ耐性でも選択し得る選択能をもった第 ■：Ｃ因子を発現することができる。

（ＴＨＯＤＨＦＲ欠乏細胞におけるＭＴＸの増幅プラスミドｐ　Ｍ　Ｔ　２　Ｖ 　Ｗ　ＦとｐＡｃｌＤ２６ｓＶｐａ（３）を１０＝１に混合し、カウフマンおよ びシャープの報告のようにＣａ　Ｐ　Ｏａ共沈によってＣＨＯＤＵＫＸ−Ｂｌ　 １＋１ｆｔｌ胞へ同時トランスフェクトした（１９８２年、ジャーナル・オプ・ モレキュラー・バイオロジー、１５０巻、６０１頁）、ヌクレオシドの存在なし に細胞を発育させてＤ　）（Ｆ　Ｒ陽性表現型により選択し、コロニーをプール してＭ′「Ｘ耐性の増大について選択した９その結果、ＭＴＸ耐性の増大ととも にＶＷＦ発現が増加することが示された。これを下表に示す。

選択　　　　　　　　　　　　　　　＼：ＷＦ　　（ｎ　ｇ／ｍ１）０．０２Ｍ Ｍ　ＭＴＸ　　　　　　　　　　　　　　−−−−０２８Ｍ　八４ＴＸ　　　　 　　　　　　　　　　　　５６１．０８Ｍ　　八つＴＸ　　　　　　　　　　　 　　　　　９１５．０　８Ｍ　　ＭＴＸ　　　　　　　　　　　　　　　　２７ ８ＣＨＯＤＨＦＲ欠乏細胞におけるＶＷＦのためのｄＣＦ選択７ラスミドＰＭＴ ２ＡＤＡ−ＶＷＦを実施例■て゛報告したようにＣＨＯＤじＫＸ−Ｂｌｌ細胞へ 導入し、細胞を４ＭＭ　ｘｙｌ−Ａ。

０．０３ＭＭ　　ｄＣＦ、１０Ｍｇ／ｍｌ　ヒボキサンチン、１０Ｍｇ／ｍｌチ ミシ゛ンおよびペニシリンおよびストレプトマイシンそれぞれ１０Ｍｇ／ｍｌを 含有するＡＤＡＨ択アルファ培地における発育により選択した。■Ｗｆ：３〜５ ｐｇ／細胞／日を発現するークローンＰＭ５Ｆが誘導された９ついでこのクロー ンな第■：Ｃ因子細胞系への融合および第■：Ｃ因子道伝子導入のための受容細 胞として使用した。

第■：Ｃ型因子細胞系とＶＷＦ発現細胞系の融合第■：Ｃ因子型発現プラスミド ｐＬＡ２が報告されている（ｐＬＡ２はＦ■：Ｃの血液凝固促進Ｂ−ドメイン８ ８０アミノ酸欠失突然変異体の転写羊位を含んでいる（国際特許出願番号ＰＣＴ 八１へ８６１００７７４号参照））、このプラスミドをプロトアラスト融合によ りＤＬＩＫＸ−Ｂｌ　Ｉ　　ＣＨＯ細胞へ導入し、第■因子−ＤＨＰＲ転写の３ °領域からＤＨＦＨについて選択した（ＰＣＴ／ＵＳ８６１００７７４号参照） 、ｄ胞系を１．０ＭＭ八りＴＸに対するＭＴＸ耐性について選択することによっ て誘導しＬＡ３−５と命名した４この細胞系は３〜５μ単位／細胞７日の濃度で 第■：Ｃ因子の欠失形を発現する（１０％ウシ胎児血清中）、この修飾した第■ ：Ｃ因子もまたＶＷＦと結合し、効果的な合成のためＶＷＦを必要とする。１． Ａ３−５をＰＭ５Ｆと融合し、ハイブリッドをＭＴＸ耐性およびｄＣＦ耐性の表 現型をともに発現することで選択した。

融合のためＰＭ５Ｆを殺すためにＰＭ５Ｆをジエチルエビロカルボナート（ＤＥ ＰＣｌｏ、０３％）で処理した（氷上で３０分間）。

ポリエチνングリコールで誘導される細胞融合によってこれらの細胞をＬＡ３　 ５と融合した。ＤＥＰＣ処理をしたＰＭ５Ｆ細胞を１ＥＣ−）Ｃ型遠心機で２０ ００ｒｐｍて８分間、ＬＡ３−５　（１，５Ｘ１０６細胞）を遠心した、遠心後 、上滑を除き、５０％ＰＥＧ溶液２ｍｌを添加した。ＰＥＧを４５秒間放置し、 細胞を無血清培地で完全に洗浄した。細胞を血清含有培地で４８時間放置培養し 、ついでチミジン、ヒボキサンチン、ストレプトマイシン、ペニシリンそれぞれ １０Ｍｇ／ｍｌの存在で４ＭＭｘｙｉＡ、０．０３ＭＭｄＣＦを含有する選択培 地へ継代培養した。ただしチミジンおよびヒボキサンチンを含有する必要はなか った。ＶＷＦ　Ｏ，７３Ｍｇ／細胞／日および第■：Ｃ因子型タンパク質０．２ 〜２．０／単位ｍ１７日を発現するハイブリッドのプールを得た。引き続き０． ５ＭＭ　ＭＴＸの存在でチミジンおよびヒボキサンチンの存在なしにプールを発 育させた。これらの細胞を４ＭＭ　ｘｙ　ｌ−Ａ　４ｔｔＭ、０．０３ＭＭｄＣ Ｆおよび０．５ＭＭ　ＭＴＸ登含有するアルファ培地でクローニングした。得ら れたクローンを下記に示す。

ｖＷＦおよび第■：Ｃ因子タンパク質のＣＨＯ細胞での同時発現クローン　　ｖ ｗｐ発現　　　　　　第■：Ｃ因子型発現＜ｐｇ／細胞）　　　　　（μ華位／ 細胞−培地）Ｅ６　　　　　　１６　　　　　　　　２．８−特定培地３．８− １．０％ＦＣＳ ８９　　　　　２０　　　　　　　４．５−特定培地５、］、−１０％ＦＣ５ ）１６　　　　　　３４　　　　　　　　７．７−特定培地８．７−１０％ＦＣ ３ Ｇ］、２　　　　　８．　　　　　　　１０．５−特定培地１１．８−１０％Ｆ Ｃ３ これらの成績から細胞系が特定培地中でＶＷＦおよび第■：Ｃ因子型タンパク質 を同時発現し、高濃度の第■：Ｃ因子型タンパク質を生産する生産能が証明され る。

実施例■ ＶＷＦを発現する細胞への第■：Ｃ因子型遺伝子の導入９０ｋＤａ切断部位（７ ４０残基の位置）を７６ｋＤａ（１６４７残基の位置）へ直接融合するペテロ二 重鎮突然変異（ＰＣＴ／ＵＳ８６１００７７４）９０７個のアミノ酸からなる第 ■：Ｃ因子欠失突然変異体分組立てた。得られたプラスミドｐ９０−７６Ｒは、 八うＴ２に好適な第■：Ｃ因子型転写単位を有している。このプラスミドを保有 しているエシェリキア・コリＨＢＩＯＩのプロトプラストと作成し、実施例■で 報告したＶＷＦ発現細胞系ＰＭ５Ｆと融合した２１０ドブラスト融合から回収４ ８時間後、細胞をＤＨＦＲｆｆｌ択培地（１０％透析ウシつ児血清、４μＭｘｙ ｌ−Ａおよび０．０３μＭｄＣＦを含有し、ヌクレオシド類を欠いたアルファ培 地）へ継代培養した。２週間後、形質転換体を単離し、第■：Ｃ因子発現を検定 した。生成した形質転換体の約２０％がＶＷＦおよび第■：Ｃ因子欠失突然変異 体の双方を発現した。１形質転換体の成績を下表に示す。

細胞系　　　　　第■：Ｃ因子活性　　　　　　　培地Ｆ１１．５．ｕ単位／細 Ｄｌ（１３７５ｍ単位／ｍｌ＞　　特定培地０．９５μ羊位／＠胞（１３３０ｍ 単位／ｍ１）ｘｏ％ＰＣＳ（＋ＶＷＦ＝１．６９μｇ／ｍｌ、１．８５　ｐ　ｇ ／細胞）これらの結果はＰＭ５Ｆ細胞系におけるＤＨＰＲ表現型に対する選択能 と第■：Ｃ因子発現の血清依存性を軽減するため第■：Ｃ因子型タンパク質およ びＶＷＦを同時発現する発現能を示している。

実施例χ ＶＷＦ同時発現が存在しまたは存在しない場合の第■：Ｃ因子型タンパク質の蓄 積 実施例１と同様に第■：Ｃ因子型発現細胞をすすぎ、ついで１０％ウシ胎児血清 （ＦＣＳ）またはインスリン、トランスフェリン、セレン、ウシ血清アルブミン ＜５ｇ／ｌｅｔ含有する特定培地を戻し添加することにより、第■：Ｃ囚子型タ ンパク質の３日間の蓄積を測定した。結果を下記の４細胞系について示す、つい で第■：Ｃ因子検定を２４時間、４８時間および７２時間後に実施した。チャイ ニーズ・ハムスター第■：Ｃ因子発現細胞系１０ＡＩは実施例■で報告した。Ｃ ６はヒト組換えＶＷＦを同時発現する１０Ａ１３ａプールのサブクローンであっ て、実施例■から１μＭＭＴＸおよび２．０μＭ　ｄＣＦで選択した。ＬＡ３− ５クローンオよびＶＷＦ同時発現細胞系Ｇ１２は第■：Ｃ因子の欠失形を発現し 、実施例■で報告した。これらの結果は血清含有培地でも特定培地でも元の細胞 系と比較して極めて高濃度の第■：Ｃ因子型タンパク質を蓄積する同時発現細胞 系の蓄積能を示している。

第■因子活性 ：ａ胞系　　培地　　　　　ｎ１単位／ｍ１　　　　　　μ単位合計／細胞２４ 時間　４８時間　７２時間 野生型筒■：Ｃ因子 １０ＡＩ　　　ＦＣＳ　　　７３６　　　５５８　　　４１４　　　　０．３特 定　　　３０９　　　１１７　　　　７０　　　　０．０６Ｃ６ＦＣＳ　　　７ ９６　　　２９７６　　　５１７０　　　　５．９特定　　　５３１　　　１９ ２８　　２９８０　　　　３．２欠失した第■因子 ＬＡ３−５　　ＦＣＳ　　　１１９８　　　５９６　　　３７４　　　　０．５ 特定　　　３４１　　　１２８　　　１６３　　　　０．２Ｇ１２　　　ＦＣＳ 　　　３５２７　　　５４２０　　　６３８０　　　　２２．０特定　　　３０ １８　　４４００　　４１１０　　　１３．０実！１例ＸＩ 組換えＶＷＦの使用を含むこれまでの実施例で得られた成績と比転して改良され た結果が得られないにしても、ＶＷＦ型タンパク質３組換え野生型ＶＷＦと置換 してこの発明を実施することにより同様の結果を得ることができるはずである。

これは野生型ＶＷＦの代わりに所望のＶＷＦ型タンパク質の合成を指令する発現 ベクターと使用する方法を反復することによって容易に達成し得る。そのような ベクターは従来技術上既知の多数の任！の方法によって作成でき、あるいは所望 により上に報告したｗｊ−暗号化ベクターへオリゴヌクレオチド指向型突然変異 を実施することによって恐らくはさらに都合よく作成し得る。

国際調査報告 ■ＩＩＩＭｊｖａＩｍＩＬＩ−＾帥−Ｑ１噂内軸ｅ　Ｄｒ”１ｎｃＱＱノｎｉｌ ！４

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. １．第ＶＩＩＩ：ｃ因子型タンパク質を発現可能な哺乳動物細胞を培養すること からなる第ＶＩＩＩ：ｃ因子型タンパク質の生産方法において（ａ）外来性フォ ン・ビルブラント因子（ＶＷＦ）型タンパク質、（ｂ）リン脂質またはリン脂質 混合物、および（ｃ）（ａ）および（ｂ）の混合物 からなる群から選ばれた組成物の第ＶＩＩＩ：ｃ因子安定化量を含有する細胞培 養培地で細胞を培養することを合む改良方法。
2. ２．組成物が外来性ＶＷＦを培地１ｍｌ当り約０．１〜約１０μｇ量含有する請 求項１記載の方法。
3. ３．培地がさらに哺乳動物血清を含有する請求項１記載の方法。
4. ４．血清量が培地容量に対して約１０容量％までの血清である請求項３記載の方 法。
5. ５．血清量が培地容量に対して約５容量％までの血清である請求項３記載の方法 。
6. ６．血清量が培地容量に対して約１容量％までの血清である請求項３記載の方法 。
7. ７．第ＶＩＩＩ：ｃ因子型タンパク質に組換えヒト第ＶＩＩＩ：ｃ因子を包含す る請求項１記載の方法。
8. ８．培地が本質的に無血清である請求項１記載の方法。
9. ９．培地がＶＷＦ型タンパク質を生産するよう遠伝子操作された細胞で条件付け られることによってＶＷＦ型タンパク質を含有している請求項１記載の方法。
10. １０．ＶＷＦ型タンパク質を生産するよう遠伝子操作された細胞が第ＶＩＩＩ： ｃ因子型タンパク質を同時発現する請求項９記載の方法。
11. １１．第ＶＩＩＩ：ｃ因子型タンパク質とは別途にＶＷＦ型タンパク質を生産し 、第ＶＩＩＩ：ｃ因子型タンパク質を生産する細胞が培養される培地へこれを添 加する請求項１記載の方法。