PT99107A

PT99107A - Processo para a preparacao de factores hibridos de crescimento e de composicoesfarmaceuticas que os contem

Info

Publication number: PT99107A
Application number: PT99107A
Authority: PT
Inventors: Jonathan I Rosen
Original assignee: Ortho Pharma Corp
Priority date: 1990-09-28
Filing date: 1991-09-27
Publication date: 1992-08-31
Also published as: AU8735991A; JPH05502463A; CA2069746A1; IE913426A1; EP0503050A1; AU1157695A; EP0503050A4; WO1992006116A1; ZA917766B

Description

Descrição referente à patente de invenção de ORTHO PHARMACEUTICAL CORPORATION, norte-amaricana, industrial e comercial, estabelecida em U.S. Route 202, Raritan, New Jersey, Estados Unidos da América, (inventor: Jonathan I. Rosen, residente nos E.U.A.) «'PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE FACTORES HÍBRIDOS DE CRESCIMENTO I DE COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS QUE OS CONTEM

DESCRIÇÃO

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Dentro deste pedido são referenciadas várias publicações por números árabes entre parênteses. A lista completa destas referências pode ser encontrada no final desta descrição antecedendo imediatamente as reivindicações. As descobertas destas publicações na sua totalidade são aqui incorporados como referência neste pedido de modo a mais completamente descrever o estado de 1

técnica a que esta invenção se refere.

Muitos factores podem influenciar a actividade de uma célula. Frequentemente um factor exerce a sua influência por interactuação com um receptor na superfície de uma célula. Após se ligar ao receptor, o sinal que determina a resposta celular ao factor pode ser mediado através de vários acontecimentos diferentes, incluindo a internalização do factor ou alterações do receptor provocadas pela ligação do ligante. Durante a diferenciação hematopoiética, estão envolvidos vários factores diferentes na maturação de uma célula mastro pluripotente para uma célula totalmente diferenciada. As actividades destes factores durante a diferenciação hematopoiética resultaram no facto de estes factores serem caracterizados como factores iniciais ou factores finais. Por exemplo, os factores como a interleucina-3 (IL-3) e o factor estimulante da colónia de granulócitos-macrofagos (GM-CSF) são considerados factores iniciais, enquanto que a eritropoietina (Epo), o factor estimulante da colónia de macrofagos (M-CSF), e os factores estimulantes da colónia de granulócitos (G-CSF) são considerados factores finais.

Com base em estudos efectuados com factores purificados e em ensaios de unidades formadoras An vitro de colónias, parece que os factores IL-3 e GM-CSF actuam em células pluripotentes antes de se tornarem cometidos a uma via hematopoiética particular. Após os fenómenos estimulados por estes factores se terem iniciado, essa linhagem de 2 f

J células restritas torna-se receptiva a mais diferenciação mediada por esses factores finais tais como o Epo, (que conduz à maturação de eritrócitos), o G-CSf (que conduz a células no percurso dos granulócitos), e M-CSF (que conduz à maturação de macrofagos). As experiências descritas em publicações recentes (1,2,3) têm demonstrado in vitro que os factores iniciais ou finais isoladamente são fracos estímulos da formação de colónias. Contudo, quando se combina um factor inicial tal como o IL-3 ou o GM-CSF com um factor final, são observados níveis de formação de colónias equivalentes aos observados com meios condicionados possuindo actividade total. Assim, a diferenciação parece ser dependente de actividades duplas dos factores iniciais e finais.

Apesar de uma necessidade clara de IL-3 ou GM-CSF para Epo para a formação de unidades formadoras de colónias eritróides, os resultados publicados indicam que o IL-3 pode reduzir a modulação dos receptores de Epo de alta afinidade (4). Dado que a quantidade de IL-3 necessária para demonstrar a redução de modulação do receptor de Epo é superior à referida por outros investigadores que demonstraram a actividade completa funcional de IL-3 na presença de Epo, não é evidente se este fenómeno é relevante in vivo.

RESUMO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a moléculas híbridas compreendendo factores de diferenciação iniciais e 3 ί

finais produzidos por manipulação genética. Através da ligação covalente desses factores a concentração local do factor final é muito alta à superfície de uma célula a que o factor inicial está ligado. Além disso, se a redução da modulação for importante in vivo, a ligação dos factores finais a quaisquer receptores de baixa afinidade restantes, por exemplo os receptores de Epo, podia ser aumentada, reduzindo assim a quantidade do factor final necessária para estimular a célula. Além disso, por ligação de um factor inicial com um factor final, esse factor inicial pode actuar mais especificamente para estimular apenas a linhagem pretendida, reduzindo assim quaisquer efeitos indesejáveis mediados pelo factor inicial. Finalmente, é consideravelmente mais fácil produzir e administrar a um paciente um factor único com duas actividades em vez de produzir e administrar dois factores separados.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS > A Figura l mostra a sequência de aminoácidos da IL-3 humana e uma sequência de ADN de banda única codificando a IL-3. Também se mostram vários pontos de clivagem de enzima de restrição utilizados para construir as moléculas híbridas recombinantes da presente invenção. (*) indica um códão de paragem. A Figura 2 mostra a sequência de aminoácidos da Epo humana e uma sequência de ADN de banda única codificando a Epo. Também se mostram vários pontos de clivagem de enzima de restrição utilizados para construir as moléculas 4 híbridas recombinantes da presente invenção. (*) indica um códão de paragem. A Figura 3 mostra a sequência de aminoácidos de G-CSF humana e uma sequência de ADN de banda única codificando a G-CSF. Também se mostram vários pontos de clivagem de enzima de restrição utilizados para construir as moléculas híbridas recombinantes da presente invenção. (*) indica um códão de paragem. A Figura 4 mostra a sequência de aminoácidos e sequência de ADN codificando a construção IL-3:Epo da presente invenção, incluindo um líder sintético e sequências de ligação. (*) indica um códão de paragem. A Figura 5 mostra a sequência de aminoácidos e de ADN codificando Epo:IL-3 construtivo da presente invenção, incluindo um líder sintético e sequências de ligação. (*) indica um códão de paragem. A Figura 6 mostra a sequência de aminoácidos e de ADN codificando a construção IL-3:G-CSF da presente invenção, incluindo um líder sintético e sequências de ligação. (*) indica um códão de paragem. A Figura 7 mostra a sequência de aminoácidos e de ADN codificando a construção IL-3:Epo da presente invenção, incluindo sequências líder sintéticas e sequências de ligação. (*) indica um códão de paragem. A Figura 8 mostra a sequência de aminoácidos e de ADN codificando a construção Epo:IL-3 da presente invenção, incluindo sequências líder sintéticas e 5

sequências de ligação. (*) indica um códão de paragem. DESCRIÇÃO PERMONORIZADA DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona uma molécula hematopoiética recombinante compreendo pelo menos uma parte de uma primeira molécula hematopoiética possuindo uma actividade de diferenciação mielóide inicial e pelo menos uma parte de uma segunda molécula hematopoiética possuindo uma actividade de diferenciação mielóide final. Esta molécula recombinante tem uma actividade de diferenciação mielóide inicial associada com a primeira molécula hematopoiética e uma actividade de diferenciação mielóide final associada com a segunda molécula hematopoiética. Neste pedido, "molécula hematopoiética" significa uma molécula que promove e/ou regula a hematopoiese. As moléculas hematopoiéticas exercem actividades de promoção ou de regulação em fases diferentes durante a hematopoiese, sendo essas fases referidas aqui como diferenciação mielóide inicial e diferenciação mielóide final. Também neste pedido, "actividade de diferenciação mielóide inicial" significa a capacidade para promover a diferenciação, a sua própria renovação, ou a poliferação de células mielóides pluripotentes, isto é, células mastro ou unidade formadora de colónias, granulócitos-eritócitos-monócitos-megacariócitos, células. Além disso, neste pedido, "actividade de diferenciação mielóide final" significa a capacidade para promover a maturação ou diferenciação de uma linhagem restrita de células mielóides, isto é, uma célula 6

I

precursora mielóide cometida a uma linhagem de células específicas como por exemplo eritrócitos, megacariócitos, monócitoS/ neutrófilos, eosinófilos, e basófilos. )

Numa realização da invenção, a primeira molécula hematopoiética é escolhida no grupo consistindo em IL-3 e GM-CSF. Noutra realização da invenção, a segunda molécula hematopoiética é escolhida no grupo consistindo em Epo, G-CSF, IL-5 e M-CSF. Numa realização preferida da invenção, a parte da primeira molécula hematopoiética está ligada à parte da segunda molécula hematopoiética por meio de uma sequência ligante de aminoácidos compreendendo pelo menos dois resíduos de aminoácidos.

Dentro do contexto da presente invenção, deve entender-se que existem entre indivíduos variações de proteínas e ácidos nucleicos, por exemplo substituições, eliminações, inserções e grau de localização da glicosilação de aminoácidos ou nucleõtidos, e que os derivados funcionais que resultam dessas variações estão incluídos dentro do âmbito da presente invenção.

Numa realização preferida da invenção, a molécula recombinante compreende a sequência completa de aminoácidos da IL-3 humana. Além disso, a molécula hematopoiética recombinante pode compreender de preferência uma sequência de aminoácidos derivada da IL-3 humana e contida dentro da sequência de aminoácidos desde o aminoácido 1 até ao aminoácido 79 da Figura 1.

Ainda numa outra realização preferida da 7

invenção, a molécula recombinante compreende toda a sequência de aminoácidos da eritropoietina íxumana. Ainda numa outra realização da invenção, a molécula hematopoiética compreende uma sequência de aminoácidos drivadas da eritropoietina humana e contida dentro da sequência de aminoácidos desde o aminoãcido 7 até ao aminoácido 161 da Figura 2.

Ainda em outra realização preferida da invenção, a molécula hematopoiética recombinante compreende toda a sequência de aminoácidos da G-CSF humana.

Numa realização da invenção, a primeira molécula hematopoiética é a IL-3 e a segunda molécula hematopoiética é a eritropoietina. A primeira molécula hematopoiética, isto é a IL-3, pode compreender a parte de aminoácidos e a segunda molécula hematopoiética, isto é a Epo pode compreender a parte de carboxi da molécula recombinante. A molécula hematopoiética recombinante compreende, de preferência, a sequência de aminoácidos que se mostra na Figura 4 desde o aminoácido l até ao aminoácido 302. Também a molécula hematopoiética recombinante compreende, de preferência, a sequência de aminoácidos que se mostra na Figura 7 desde o aminoácido 1 até o aminoácido 321. Contudo, noutra realização da invenção, a primeira molécula hematopoiética, isto é a IL-3, pode compreender a parte de carboxi e a segunda molécula hematopoiética, isto é, a Epo pode compreender a parte de amino da molécula recombinante. Numa realização preferida da invenção, a molécula recombi- 8 f

nante compreende a sequência de aminoácidos que se mostra na Figura 5 desde o aminoãcido 1 até ao aminoácido 303. Em ainda outra realização preferida, a molécula recombinante compreende a sequência de aminoácidos que se mostra na Figura 8 desde o aminoácido 1 até ao aminoácido 322.

Em ainda outra realização da invenção, a primeira molécula hematopoiética é a IL-3 e a segunda molécula hematopoiética é a G-CSF. Numa dessas realizações, a primeira molécula hematopoiética compreende a parte de amino e a segunda molécula hematopoiética compreende a parte de carboxi da molécula recombinante. Em ainda outra realização mais específica, a molécula recombinante compreende a sequência de aminoácidos que se mostra na Figura 6 desde o aminoácido 1 até ao aminoácido 317. A presente invenção também proporciona moléculas de ácido nucleico que codificam as moléculas hematopoiéticas recombinantes da presente invenção. Exemplos dessas moléculas de ácido nucleico são as representadas nas Figuras 4, 5 e 6. Além disso, são também referidos vectores que compreendem as moléculas de ácido nucleico da presente invenção. Numa realização da invenção, o vector compreende um plasmídio. Além disso, são proporcionados sistemas de vectores hospedeiros para a produção de uma molécula hematopoiética recombinante da presente invenção que compreende um vector da presente invenção num hospedeiro adequado, de preferência uma célula de mamífero tal como uma célula CHO ou COS. Este sistema de vector hospedeiro 9 pode ser cultivado em condições adequadas que permitem a expressão da molécula hematopoiética recombinante, que pode ser recuperada por técnicas de purificação conhecidas, por exemplo cromatografia de permuta iónica, cromatografia de afinidade, e cromatografia por exclusão de tamanho. A presente invenção proporciona ainda composições farmacêuticas úteis para o tratamento dos pacientes que sofrem de anemias de várias origens, por exemplo a deficiência renal e a SIDA. Além disso, estas composições farmacêuticas são úteis para a administração a pacientes para doações de sangue autólogas pré-operativas, pacientes que recebem ou que são dadores da medula óssea para fins de transplante, e pacientes submetidos a tratamento por quimioterapia do cancro. Estas composições farmacêuticas compreendem quantidades eficazes da promoção da hetatopoiese de uma molécula recombinante da presente invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável. Os veículos farmaceuticamente aceitávéis são conhecidos e são referidos na Farmacopeia dos Estados Unidos e no "National Formulary”. Dependendo da aplicação específica pretendida, a composição farmacêutica pode ser formulada como solução, suspensão, composição parentérica, ou pulverização. As composições parentéricas podem incluir um veículo tal como a água isenta de pirogénios especialmente destilada, tampão de fosfato, ou solução salina normal. As formas de dosagem oral e/ou transmucosa podem compreender fosfolípidos, frequentemente sob a forma de lipossomas. 10

Também é referido um método de tratamento de um paciente para promover a hematopoiese que compreende a administração ao paciente de uma quantidade eficaz da promoção da hematopoiese de uma composição farmacêutica da presente invenção.

As moléculas hematopoiéticas recombinantes, moléculas de ácido nucleico, composições farmacêuticas e métodos da presente invenção serão melhor compreendidos com referência às seguintes experiências e exemplos, que são proporcionados com o objectivo de ilustração e não pretendem ser construídos de forma a limitar o âmbito da invenção, que é definido nas reivindicações anexas.

Exemplos

J

Construção dos genes da proteína híbrida; Foram adquiridos genes codificando a IL-3, a Epo e a G-CSF na British Bio-tech. Ltd. Estes genes foram utilizados para construir três proteínas hematopoiética híbridas diferentes, isto é, IL-3:Epo, Epo:IL-3 e IL-3:G-CSF. Nestes híbridos o primeiro gene nomeado forma a parte de amino e o segundo gene nomeado a parte de carboxi de proteína híbrida.

Exemplo 1

Foi construído a IL-3:Epo da forma seguinte: foi sintetizada a CSF, a sequência líder nativa da IL-3 sob a forma de 4 oligonucleótidos (oligonucleótidos 1-4 na Tabela I) que representa ambas as bandas da sequência 11

líder. Além disso, a extremidade 5' do líder (oligonucleótido l) codificava um braço da enzima de restrição conveniente (EcoRl), embora o ponto EcoRl não fosse regenerado, em frente do códão de início ATG. A extremidade 3' do líder (oligonucleótido 3) incluía os primeiros de vários códãos de aminoãcidos da IL-3 e um braço de Spel de forma a que a sequência líder tratada pudesse ser facilmente ligada a IL-3, que foi alterada pela British Biotech para incluir um ponto Spel. A sequência líder foi tratada e ligada a pKS (Stratagene Cloning Systems, Inc., San Diego, CA), clivada com EcoRl e Spel. O plasmídio resultante foi designado por pKSO. A IL-3 contendo o plasmídio pUC18 obtida de British Biotech foi clivada com Spel e Nhel, e em seguida ligada a um oligonucleótido ligante (oligonucleótidos complementares 5 e 6) que continham os seguintes três pontos de restrição: Nhel, Xbal e Ncol. A clivagem foi em seguida efectuada com Spel e Xbal. 0 fragmento de 379 pares de bases resultante foi em seguida ligado a pKSO clivado com Spel e Xbal. 0 plasmídio resultante (pKSOIL-a), continha a líder IL-3, o gene IL-3 e um pequeno fragmento de ligação. 0 gene de Epo foi inserido em pEE6 (Celltech, Ltd., Slough, Reino Unido), um vector de expressão em mamíferos que contem o promotor de Cytamegalovirus humano, uma região poli-ligante e um ponto de poli-A adição para além da resistência a ampicilina e uma origem bacteriana de replicação, por clivagem da Epo contendo o plasmídio obtido 12

da British Biotech com HindIII e BamHl. Foi em seguida clivada a Epo com Ncol. 0 mesmo ligante compreendendo os oligonucleótidos 5 e 6 foi ligado a Epo da forma anterior-mente descrita e em seguida clivada com Xbal para se obter todo o gene Epo. Este gene foi em seguida ligado a Xbal e pEE6 clivado com Bell para se obter pEE6 contendo o gene Epo (pEepo). Foi clivado o pKSOIL-a com EcoRV e foi ligado um ligante Xbal às extremidades cegas seguido de clivagem com Xbal, que libertou o gene IL-3 com a sequência líder. Esta foi em seguida ligada a pEepo clivado com Xbal para se obter um plasmídio contendo um gene de proteína híbrida completo (pEepie-a) (ver Figura 4 para a estrutura do gene inserido). 0 gene da glutamina sintetase (gs) foi em seguida inserido no ponto BamHl de pEepie-a para se obter pEe-pogs-a ou pEpogs-b, dependendo da orientação do gene gs. A glutamina sintetase confere resistência à metionina sulfox-imina (MSX) de modo a escolher células que absorvem o plasmídio após a transfecção. Após o plasmídio ter sido construído foi cultivado um grande lote, purificado por ultra centrifugação com CsCl, e utilizado para transfecção. Em cada uma das fases deste processo todas as juntas ligadas entre os fragmentos foram analisadas por análise de sequências de ADN de modo a assegurar que não existiam alterações que pudessem provocar desvios de estrutura e evitar que o gene híbrido fosse expresso.

Para construir a IL-3:Epo com uma sequência ligante mais comprida separando IL-3 e Epo, foi clivado 13

pEepie-a com Nhel e os oligonucleótidos 21 e 22 estabilizados foram ligados ao plasmídio clivado. Este ligante codifica a sequência de aminoácidos flexível (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3· Os clones com a inserção na orientação correcta foram escolhidos por colónias de prova com oligonucleótido de junção 23 (ver Figura 7 para a estrutura do gene inserido) . 0 gene da glutamina sintetase foi em seguida adicionado à construção da forma anteriormente descrita.

Exemplo 2

Foi construído a IL-3:G-CSF da forma seguinte: foi clivado com HindIII o pUC18 contendo G-CSF (British Biotech). Foi ligado um ligante constituído por um braço do ponto Xbal, um ponto Notl e um ponto de braço de HindIII (oligonucleótidos 7 e 8) a pUC18:G-CSF. Este produto foi em seguida clivado com Xbal e BamHl que libertou todo o gene de G-CSF. 0 fragmento de G-CSF foi em seguida inserido em Xbal e pEE6 clivado com Bell (pEE6:G-CSF). A IL-3 com a sua sequência de sinal foi removida do plasmídio de IL-3:Epo pEepogs-a como um fragmento de Xbal. Este fragmento de IL-3 foi em seguida inserido em pEE6-G-CSF clivado com Xbal. Após análise de restrição, foi obtido um plasmídio contendo o gene IL-3 na orientação correcta (pEGll), este plasmídio codificava um gene susceptível de expressar a IL-3 e a G-CSF como proteína híbrida (ver Figura 6 para a estrutura do gene inserido). O gene gs foi inserido neste plasmídio da forma descrita no Exemplo 1 anterior para se obterem os 14

plasmídios pGE13 e pEG14, dependendo da orientação do gene gs.

Exemplo 3

Foi construída a Epo:IL-3 por uma primeira síntese da sequência de sinal Epo nativa como oligonucleótidos (9-14). Estes produtos foram estabilizados para se obter uma sequência de braço 5' Xhol e uma sequência 3' PstI. Estas sequências foram em seguida ligadas e subclonadas como um fragmento Xhol/PstI (pEpol). Para se obter o quadro de leitura e o ponto de processamento da sequência de sinal adequados, o plasmídio contendo a sequência de sinal foi clivado com PstI e o braço 3' deixado por PstI foi removido enzimaticamente com T4 polimerase. Este produto foi em seguida clivado com BamHl. 0 gene Epo foi em seguida ampliado por PCR (reacção de cadeia de polimerase) como uma extremidade cega 5' utilizando o oligonucleótido 15 como primário e a extremidade 3# BamHl utilizando o oligonucleótido 16 como primário. Este fragmento foi em seguida ligado em pEpol para se obter um gene Epo completo com a sua sequência líder. Foi utilizada a técnica de PCR para ampliar o gene Epo com a sua sequência de sinal como um fragmento (5') Xbal e (3') Notl utilizando os oligonucleótidos 17 e 18 como primários. Estes produtos foram em seguida digeridos com Xbal e Notl. Ao mesmo tempo, foi ampliado um fragmento de IL-3 purificado por PCR como um fragmento (5') Notl e (3') BamHl utilizando os 15

oligonucleótidos 19 e 20, seguido da digestão com Notl e BamHl. Estes dois fragmentos foram ligados a pEE6 clivado com Xbal e Bell para se obter um gene híbrido de comprimento total codificando quer Epo quer IL-3 (pEG16) (ver Figura 5 para a estrutura do gene inserido). 0 gene gs foi inserido como descrito no Exemplo 1 anterior para se obter pEG17 e pEG18, dependendo da orientação do gene gs.

Foi inserido um ligador flexível em Epo:IL-3 por clivagem de pEG17 ou pEG18 com Notl. Os oligonucleótidos estabilizados 24 e 25 são em seguida ligados no plasmídio clivado. Os clones com a inserção na orientação correcta são escolhidos para ensaios de colónias com um oligonucleótido de ligação como acima descrito. Ver a Figura 8 para a estrutura do gene inserido.

J 16

TABELA I

OLIGONUCLEÓTIDOS

Todos os oligonucleótido são referidos na orientação 5' a 3’:

1. AÀTTGCCGCCACCATGAGCCGCCTGCCCGTCCTGCTCCT

2. GCTCCAACTCCTGGTCCGCCCCGGACTCCAAGCTCCCATGACGCAGACAA

3. CTAGTTGTCTGGGTCATGGGAGCTTGGAGTCCGGGGCGG

4. ACCAGGAGTTGGAGCAGGAGCAGGACGGGCAGGCGGCTCATGGTGGCGGC

5. CTAGCGATCTTTCTAGA

6. CATGTCTAGAAAGATCG

7. CTAGAAGCGGCCGCA

8. TTGGCCGGCGTTCGA

9. TCGAGCCATGGGGGTGCÀCGAATGTCCT

10 - GCCTGGCTGTGGCTTCTCCTGTCCCTGCTGTC

11. GCTCCCTCTGGGCCTCCCAGTCCTGGGCTGCA 12. GCCCAGGACTGGGAGGCCCAGAGGGÀ

13. GCGACAGCAGGGACAGGAGAAGCCACAGCCAGGCAGGACATT

14. CGTGCACCCCCATGGC

15. GCCCCACCACGCCTCATCTGT

16. GAATTCGGATCCTTATCATCT

17. CTAGTCTCTAGAATGGGGGTCCACGAATGT

18. AGCCATGGCGGCCGCTCTGTCCCCTGTCCT

19. GACAGAGCGGCCGCCATGGCTCCCATGACC

20. GAATTCGGATCCTTACTAAAAGATCGCTÀG

21. CTAGCGTCCGGAGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGCGGCTCGGGTGGCGGCGGCTCTGCG 17

22. CTAGCGCAGAGCCGCCGCCACCGCAGCCGCCACCGCCCGAGCCACCGCCTCCGGACG

23. TTGTCGCTAGCGTCCGGAGGC

24. GGCCGCTTCCGGÀGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGCGGCTCGGGTGGCGGCGGCTCTGC

25. GGCCGCAGAGCCGCCGCCACCCGAGCCGCCACCGCCCGAGCCACCGCCTCCGGCAGC 18

Exemplo 4

Transfecção dos plasmídios contendo o gene híbrido. Todas as transfecções foram efectuadas utilizando o dispositivo de transfeoção Lipofectin™ (Bethesda Research Labs, Gaithersburg, MD) utilizando 15 a 30 μg de ADN do plasmídio purificado (pEepogs-a, pEepogs-b, pEG13, pEG14, pEG17, e pEG18). Foram feitas as alterações seguintes ao procedimento fornecido pela companhia: o meio de cultura nestas experiências era o GMEM-S e as células CHO-K1 foram incubadas na presença de 10% de C02; após adição do complexo de lipofectina:ADN, as células foram incubadas sem selecção durante 24 horas. As células foram transfectadas para GMEM-S suplementado com MSX 25 μΜ passadas 24 horas. A concentração de MSX foi posteriormente aumentada para 50 μΜ após uma semana. Foram utilizados anéis de clonação para subclonar as colónias resistentes a MSX e cada uma destas colónias foi colocada num furo individual de uma placa de 24 furos. Foram incubados clones selecionados na ausência de MSX para assegurar que o gene da proteína híbrida era integrado da forma estável. Foram cultivados clones fortemente positivos em grandes estruturas para proporcionar quantidades maiores das proteínas híbridas para análise posterior.

Exemplo 5

Ensaios para a produção de proteína híbrida. Foram 19

ensaiados sobrenadantes de células transfectadas ou de controlo utilizando vários ensaios diferentes. Para demonstrar a produção de Epo, foi utilizado um dispositivo RIA para Epo (Incstar Corp., Stillwater, MN). A presença de IL-3 foi determinada utilizando um ensaio de ELISA em que o corpo de captura era um anti-IL-3 de cabra policlonal (R&D Systems, Minnneapolis, MN) e o anticorpo de sonda era uma anti-IL-3 de murina monoclonal. O conjugado anti-rato de cabra com peroxidase de rábano seguido por um subtrato adequado foi utilizado para detectar a presença da anti-lL-3 monoclonal. Foi utilizado um ensaio muito semelhante para demonstrar a presença das proteínas híbridas com a excepção de se ter utilizado uma anti-Epo monoclonal ou anti-G-CSF monoclonal em vez de anti-IL-3 monoclonal. Adicionalmente, foi analisada a lL-3:Epo por análise de revelação de Western. A mancha foi ensaiada com anti-corpo a Epo e em seguida com anti-rato de cabra com 125I. Apareceu uma única banda larga no auto-radiograma com um peso molecular ligeiramente superior a 50 000 daltons.

Exemplo £

Ensaios celulares. Foram utilizadas linhas de células dependentes de e com resposta a Epo e/ou IL-3 para ensaiar as actividades biológicas das proteínas híbridas. 0 B6SUtA (5) é linha de células progenitoras hematopiéticas multipotenciais estabelecida a partir de populações de células não aderentes removidas de uma cultura da medula 20 óssea de rato contínua B6-S. Esta linha de células demonstra uma dependência absoluta duma fonte dos factores de crescimento. Em resposta a Epo uma população das células sintetiza a hemoglobina. Estudos de expressão de globina indicavam que os programas de globina das células de B6SUtA são semelhantes aos dos progenitores eritróides no período de transição do saco de gema para a eritropoiese de fígado fetal. A TF-1 (6) é uma linha de células de origem eritróide madura estabelecida de um paciente com eritroleucemia. A linha de células revela uma dependência completa em GM-CSF ou IL-3. A Epo sustém um crescimento a curto termo de TF-1 e induz a síntese da hemoglobina numa população muito pequena de células (8%). A hemina e o ácido 1-aminolevulínico induzem a síntese da hemoglobina na maior parte das células. A IL-3 humana não se liga ao receptor de murina de IL-3, e assim as experiências que foram efectuadas com células B6SUtA medeiam apenas a funcionalidade do grupo Epo do híbrido. As células B6SUtA são transportadas para a IL-3 de murina. Em cada experiência, elas são bem lavadas e ajustadas com factores de crescimento a 105 células/ml. O crescimento das células e o teor de hemoglobina foram controlados nos dias 3 e 6 de cada experiência. As células crescem na presença de um meio condicionado (CM) concentrado (10 X) CHO contendo a IL-3: Epo a uma concentração final equivalente a 4,8 unidades/ml de Epo crescido bem como células cultivadas numa quantidade 21

equivalente de Epo humana recombinante (rHu). A percentagem de células que sintetizavam a hemoglobina em resposta a CH0-lL-3:Epo CM era sempre quatro vezes a das células expostas a rHu Epo. as células BSSUtA cultivadas na presença de rHu IL-3 e rHu Epo cresciam tão bem como as células cultivadas na presença de IL-3:Epo e induziam a síntese da hemoglobina na mesma percentagem de células da rHu Epo. As células expostas a IL-3 de murina recombinante (rMu) e rHu Epo cresciam de forma semelhante às células expostas apenas a rMu IL-3 e nenhuma delas induzia eficazmente as células para sintetizar a hemoglobina. A CHO CM de controlo não concentrada não suportava o crescimento de células B6SUTA nem influenciavam a síntese de hemoglobina. CHO CM e rHu Epo suportavam o crescimento das células e a hemoglibinização tal como CHO-IL-3:Epo CM. A CHO-IL-3:Epo CM suportava o crescimento de células humanas TF-1 tão bem como rHu Epo. A rHu IL-3 equivalia a duas vezes no suporte de crescimento das células TF-1 em relação à CHO-IL-3 :Epo CM. CHO CM de controlo suportava apenas um crescimento limitado das células TF-1.

Discussão

Estes resultados demonstram que uma proteína híbrida compreendendo dois factores de crescimento pode ser expressa em sistemas de cultura de células de mamíferos. Os ensaios ia vitro de IL-3:Epo indicam que esta proteína 22

Claims

híbrida tinha as actividades de IL-3 e de Epo. A aplicação terapêutica desses factores híbridos tem vantagem em relação à utilização de dois factores separadamente simplesmente em termo da administração ao paciente, e além disso a produção, purificação e formulação de um factor é menos intensiva do ponto de vista laborai do que para dois factores separados. Referências 1. Sonoda, e col., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 85:4630-4364 (1988).
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5. Enver, e col., Proc.Natl. Acad. Sei. Usa, 85:9091-9095 (1988).
6. Kitamura, e col., J. Physiol., 140:323-334 (1989). REIVINDICAÇÕES - lâ - Processo para a preparação de uma molécula hematopoiética recombinante compreendendo pelo menos uma parte duma primeira molécula hematopoiética possuindo uma actividade de diferenciação mielóide inicial e pelo menos uma segunda parte de uma molécula hematopoiética que possui 23

uma actividade de diferenciação final, caracterizado por se cultivar uma célula hospedeiro transformada com o vector de expressão que compreende a sequência de aminoácidos seguinte: -15 -10 , -5 MetSerArgLeuProValLeuLeuLeuLeuGlnLeuLeuValArgPro AATTGCCGCCACCATGAGCCGCCTGCCCGTCCTGCTCCTGCTCCAACTCCTGGTCCGCCC 60 EcoRI 15 10 15 GlyLeuGlnAlaProMetThrGlaíhrThrSerLeuLysThrSerTrpValAsaCysSer CGGACTCCAAGCTCCCAXGACCCAGACAACTAGTTTGAAGACAAGCTGGGTTAACTGCTC 120 Spel 20 25 30 35 AsnMetlleAspGluIlelleThrHisLeuLysGlnProProLeuProLeuLeuAspPhe T AACÀTGATCGATGAAATTATAAC ACACTTAAACGAGCCACCTTTGCCTTTGCTGGACTT 180 40 45 50 55 AsnÀsnLeuAsnGlyGluAspGlnAspIleLeuMetGluAsnAsaLeuArgArgProAsn CAACAACCTCAATGGGGAAGACCAAGACATTCTGATGGAAÀATAACCTTCGAAGGCCAAA 240 60 65 70 75 LeuGluAlaPheAsnArgAlaValLysSerLeuGlnAsnAlaSerAlalleGluSerlle CCTGGAGGCATTCAACAGGGCTGTCAAGAGTTTACÀGAATGCATCAGCAATTGAGAGCAT 300 80 85 90 95 LeuLysAsaLeuLeuProCysLeuProLeuAlaThrAlaAlaProThrArgHisProIle TCTTAAAAATCTCCTGCCATGTCTGCCCCTGGCCACGGCCGCACCCACGCGACATCCAAT 360 100 105 110 115 HisIleLysAspGlyAspTrpAsaGluPheArgArgLysLeuThrPheTyrLeuLysThr CCATATCAAGGACGGTGACTGGAATGAATTCCGGAGGAAACTGACGTTCTATCTGAAAAC 420 EcoRI 120 125 130 135 LeuGluAsnAlaGlnAlaGlnGlnThrThrLeuSerLeuAlallePheLeuGluAlaAla CCTTGAGAATGCGCAGGCTCAACAGACGACTTTGTCGCTAGCGATCTTTCTAGAAGCGGC Nhel Xbal Kotl 480 24 540 140 145 150 455 AlaSerLeuProAlaMetThrProLeuGlyProAlaSerSerLeuProGlnSerPheLeu cgcaagcttacctgccatgacccccctgggccctgccagctccctgccccagagcttcct HiadIII 160 165 170 175 LeuLysCysLeuGluGlnValArgLysIleGlnGlyAspGlyAlaAlaLeuGlnGluLys GCTCAAGTGCTTAGAGCAAGTGAGGAAGATCCAGGGCGATGGCGCAGCGCTCCAGGAGAA 180 185 190 195 LeuCysAlaThrTyrLysLeuCysHisProGluGluLeuValLeuLeuGlyHieSôrLeu GCTGTGTGCCACCTÂCAAGCTGTGCCACCCCGAGGAGCTGGTGCTGCTCGGACACTCTCT 200 205 210 215 GlylleProTrpAlaProLeuSerSerCysProSerGlnÀlaLeuGlnLeuAlaGlyCys GGGCATCCCCTGGGCTCCCCTGAGCTCCTGCCCCAGCCAGGCCCTGCAGCTGGCAGGCTG 220 225 230 235 LeuSerGlnLeuHisSerGlyLeuPheLeuTyrGlnGlyLeuLeuGlaAlaLeuGluGly CTTGAGCCAACTCCATAGCGGCCTTTTCCTCTACCAGGGGCTCCTGCAGGCCCTGGAAGG 240 245 ^ 250 . 255 ileSarProGluLeuGlyProThrLeuAspThrLeuGlnLeuAspValÀlaAspPheAla GATATCCCCCGAGTTGGGTCCCACCTTGCACACACTGCAGCTGGACGTCGCCGACTTTGC 260 265 270 . 275 ThrThrlleTrpGlnGlnMetGluGluLeuGlyMetAlaProAlaLeuGlnProThrGln CACCACCATCTGGCAGCAGATGGAAGAACTGGGAATGGCCCCTGCCCTGCAGCCCACCCA 280 285 290 295 GlyAlaMetProAlaPheAlaSerAlaPheGlnArgArgAlaGlyGlyValLeuValAla GGGTGCCATGCCGGCCTTCGCCTCTGCTTTCCAGCGCCGGGCAGGAGGGGTCCTGGTTGC 300 305 310 315 SerHisLeuGlnSerPheLeuGluValSerTyrArgValLeuArgHisLeuAlaGlnPro tagccatctgcagagcttcctggaggtgxcgtaccgcgttctacgccaccttgcgcagcc Fspl •V* * * CTGATAAGGATCCGAATTC BamHI EcoRI 600 660 720 780 840 900 960 1020 25 1039

desde o aminoácido 1 até ao aminoácido 317 em condições adequadas que permitam a expressão da referida molécula hematopoiética recombinante, e recuperar-se a referida molécula hematopoiética recombinante. - 2â - Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por a primeira molécula hematopoiética ser escolhida no grupo consistindo em IL-3 e GM-CSF. - 3a - Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por a segunda molécula hematopoiética ser escolhida no grupo consistindo em Epo, G-CSF, IL-5 e M-CSF. - 4â - Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por a parte da primeira molécula hematopoiética estar ligada à parte da segunda molécula hematopoiética por uma sequência de ligação de aminoácidos de pelo menos dois resíduos de aminoácidos, - 5* - Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por se incorporar toda a sequência de aminoácidos da IL-3 humana. - 6S - Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por compreender uma sequência de aminoácidos contida dentro da sequência de aminoácidos desde o 26

aminoácido 1 ao aminoácido 79 seguinte: 15 10 15 MetAlaProMetThrGlnThrThrSerLeuLysThrSerTrpValAsnCys aagcttaccatggctcccatgacccagacaactagtttgaagacaagctgggttaactgc 60 HinDIII HcoI Spel 20 25 30 35 SerAsnMetlleAspGluIlerleThrHisLeuLysGlaProProLeuProLeuLeuAsp TCTAACATGATCGATGAAATTATAACACACTTAAACGAGCCACCTTTGCCTTTGCTGGAC 120 40 45 50 55 PheAsnAsnLeuAsnGlyGluAspGlnAspIleLeuMetGluAsnAsnieuArgArgPro TTCAACAACCTCAATGGGGAAGACCAAGACÀTTCTGATGGAAAATAACCTTCGAAGGCCA 180 60 65 70 75 ÀsnLeuGluAlaPheAsnArgAlaValLysSerLeuGlnAsaAlaSerAlalleGluSer AÀCCTGGAGGCATTCAACAGGGCTGTCAAGAGTTTACAGAATGCATCAGCAATTGAGAGC 240 80 85 90 95 IleLeuLysAsnLeuLeuProCysLeuProLeuAlaThrAlaAlaProThrArgHisPro ATTCTTAAAAAXCTCCTGCCATGTCTGCCCCTGGCCACGGCCGCACCCACGCGACATCCA 300 100 105 110 115 lleHislleLysAspGlyAspTrpAsnGluPheArgArgLysLeuThrPheTyrLeuLys ÀTCCATATCAAGGACGGTGACTGGAATGAATTCCGGAGGAAACTGACGTTCTATCTGAAA 360 EcoRI 120 125 130 ThrLeuGluAs*nAlaGlnAlaGlnGlnThrThrLeuSerLeuAlaIlePhe * * ACCCTTGAGAATGCGCAGGCTCAACAGACGACTTTGTCGCTAGCGATCTTTTAGTAAGGA 420 Hhel BajnHI TCCGAATTC EcoRX j q - 7â - Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por se obter uma molécula hematopoiética recombinante gue compreende toda a sequencia de aminoácidos da Epo humana. 27 8â Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por se obter uma molécula hematopoiética recombinante que compreende uma sequência de aminoácidos contida dentro da sequência de aminoácidos desde o aminoácido 7 ao aminoácido 161 seguinte: 15 10 15 MetAlaProProArgLeuIleCysAspSerArgValLeuGluArgTyr AAGCmCCTGCCATGGCCCCACCACGCCTCATCTGTGACAGCCGAGTCCTGGAGAGGTA 60 HindIII ·' Ncol 20 . 25 30 35 LeuLeuGluAlaLysGluAlaGluAsnlleThrThrGlyCysAlaGluHisCysSerLeu CCTCTTGGAGGCCAAGGAGGCCGAGAATATCACGACGGGCTGTGCTGAACACTGCAGCTT 120 40 45 50 55 AsnGluXsnlleThrValProAspThrLysValAsnPheTyrAlaTrpLysArgMetGlu GAATGAOAATATCACTGTCCCAGACACCAAAGTTAATTTCTACGCGTGGAAGAGGATGGA 180 60 65 70 75 ValGlyGlnGlnAlaValGluValTrpGlnGlyLeuAlaLeuLeuSerGluAlaValLeu GGTCGGCCAGCAGGCCGTAGAAGTCTGGCAGGGCCTGGCCCTGCTGTCGGAAGCTGTCCT 240 80 85 90 95 ArgGlyGlnAlaLeuLeuValAsnSerSerGlnProTrpGluProLeuGlnLeuHisVal GCGGGGCCAGGCCCTGTTGGTCAACTCGAGCCAGCCGTGGGAGCCCCTGCAACTGCATGT 300 100 105 110 115 AspLysAlaValSerGlyLéoArgSerLeuThrThrLeuLeuArgAlaLeuGlyAlaGla GGATAAAGCCGTCAGTGGCCTTCGCAGCCTCACCACTCTGCTTCGGGCTCTGGGAGCTCA 360 120 125 130 135 LysGluAlalleSerProProAspAlaAlaSerAlaAlaProLeuArgThrlleThrAla GAAGGAAGCCATCTCCCCTCCAGATGCGGCCTCAGCTGCTCCACTCCGAACAATCACTGC 420 140 145 150 155 AspThrPbeArgLyeLeuPheArgValTyrSerAsnPheLeuArgGlyLysLeuLysLeu TGACACTTTCCGCAAACTCTTCCGAGTCTACTCCAATTTCCTCCGGGGAAAGCTGAAGCT 480 160 165 TyrThrGlyGluAlaCysArgThrGlyAspArg * * GTACACAGGGGAGGCATGCAGGACAGGGGACAGATGATAAGGATCCGAATTC ‘ 532 BamHI EcoRX 28

Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por compreende toda a sequência de aminoácidos de G-CSF humana. - 10* - Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por a primeira molécula hematopoiética ser IL-3 e a segunda molécula hematopoiética ser Epo. - 11a - Processcr de acordo com a reivindicação 10 caracterizado por a primeira molécula hematopoiética compreender a ^parte de amino e a segunda molécula hematopoiética a parte de carboxi da molécula hematopoiética recombinante. - 12a - Processo de acordo com a reivindicação 11 caracterizado por se obter uma molécula hematopoiética recombinante que compreende a sequência de aminoácidos seguinte: -15 -10 -5 MetSerArgLeuProValLeuLeuLeuLeuGlnLeuLeuVaiArgPro AATTGCCGCCACCATGAGCCGCCTGCCCGTCCTGCTCCTGCTCCAACTCCTGGTCCGCCC 60 EcoRl '1 5 10 15 GlyLeuGlnAlaProMetThrGlnThrThrSerLeuLysThrSerTrpValAsnCysSer cggactccaagctcccatgacccagacaactagttxgaagacaagctgggttaactgctc 120 Spel 20 25 30 35 AsnMetlleAspGluIlelleThrlílsLeuLysGlnProPróLeuProLeuLeuAspPhe TAACATGATCGATGAAATXATAACACACTTAAACGAGCCACCTTTGCCTTTGCTGGACTT 180 29 XsnAsnLeuAsnGlyGluAspGlnAspIleLeuMetGluAsnAsBLeuArgArgProAsn CAACAACCTCAATGGGGAAGACCAAGACATTCTGATGGAAAATAACCTÍC6AAGGCCAAA 240 60 65 70 75 LeuGluAlaPheAsBArgAlaValLysSerLeuGlnAsnAlaSerAlalleGluSerlle C CIGGXGGCATTCXACAGGGCTGTCAAGAGTTTACXGXATGCATCAGCAATTGAGAGCAT 300 80 85 90 95 LouLyaAsnbouLouProCysLeuProLeuAlaThrAlaAlaProThrArgHiiProIle TCTTXXXAXTCTCCTGCCXTGTCTGCCCCTGGCCXCGGCCGCACCCXCGCGACATCCXXT 360 100 " 105 110 115 HisIleLysAspGlyAspTrpAsaGluPheArgXrgLysLeuThrPbeSyrLauLysTbr CCATATCAAGGACGGTGACTGCUTGAATTCCGGAGGAAACTGACGTTCTATCXGAAAAC 420 BcoRI 120 125 130 135 LeuGluAsnAlaGlnXlaGlnGlaThrThrLeuSerLauXlallePheLauAjpMetAla CCTTGAGAATGCGCAGCCTCUCACXCGACTTTGTCGCTXGCGXTCTTTCTAGACATCCC - 480 Nhel XbaZ 140- * 145 150 155 ProProXrgleuIleCysAspSerArgValLeuGluArgTyrLeuLeuGluAlaLysGlu CCCXCCXCGCCTCATCTGTGXCXGCCCXGTCCTGGXGXGCTACÇTCTTCGACGCCAAGGA 540 160 165 170 175 XlaGluAsnlleThrTbrGlyCysAlaGluKisCys5erI>euAsnGluAaBll*TbrVal CCCCGXGXXTATCXCCACCGGCTGTOCTGXACXCTGCXGCTTGAATGAGAATXTCXCTGT 600 180 18S * 190 195 ProXspThrLysValAsftPbeTyrAlaTrpLysArgMetGluValGlyGlnClaAlaVal CCCAGACXCCXAXGTTAAXrXCTACGCGTGGAAGAGGATGGAGGTCGGCCAGCAGGCCGT 660 200 205 210 215 GluValTrpGlaGlyLeuAl aLeuLeuSerCluAlaValLeuArgGlyGlaXlat«ul<eu AGAAGTCTGGCXGGGCCTGGCCCTGCTGTCGGAXGCTGTCCTGCGGGGCCACCCCCIGTT 720 220 225 " 230 - 235 ValAsDSerSerGlaProIrpGluProLeuGloLeuMisValAspLysAlaValS«rGly GCTCAACTCGAGCCAGCCGTGGGAGCCCCICCAACTGCATGTGGATAAAGCCCTCAGIGG 780 240 245 250 255 . LeuArgSerLeuThrThrLeuLauArgAlal/euGlyAlaGlaLysGluAlaZlaStrPro CCTTCGCAGCCTCACCACTCTGCrrCGGGCTCTCGCAGCTCAGAAGGAAGCCATCTCCCC 840 260 265 270 275 P roAspAl aXl aSerAlaAlaProLeuXrgThr I 1 eThrXl aAspThrPhaArglysLeu TCCXGATGCGGCCTCAGCTGCTCCACTCCGAACAATCACTGCTGACACXTTCCGCAAACT 900 280 285 290 295 PheXrgValTyrSerAsnPheLeuArgGlyLysLeuLysLeuTyrThrGlyGluAlaCye CTTCCGAGTCTACTCCAATTTCCTCCGGGGXAAGCTGAAGCXGTACACAGGGGAGCCATG 960 •t 300 XrgThrGIyAspArg * * CXGGXCAGGGGACAGATGATAAGGATCCGAATTC 994 BamHI BcoRI 30 desde o aminoácido 1 até o aminoácido 302 - 13a - Processo de acordo com a reivindicação 11 caracterizado por se obter uma molécula hematopoiética recombinante que compreende a sequência de aminoácidos seguinte: -15 -10 , -5 MetSerArgLeuProValLeuLeuLeuLeuGlnLeuLeuValXrgPro AATTGCCGCCACCATGACCCGCCTGCCCGTCCTGCTCCTGCTCCAACTCCTGGTCCGCCC 60 EcoRI 1.5 10 15 GlyLeuGlnAlaProMetThrGlnThrThrSerLeuLysThrSerTrpValAanCysSer CGGACTCCAAGCTCCCATGACC(ÍAGACAACTAGTTTGAAGACAAGCTGGGTTAACTGCTC 120 Spel 20 25 30 35 AsnMetIleAspGluIleIleThrHisLeuLysGlnProProI*euProLeuLeuA8pPhe TAACATGATCGATGAAATTATAACACACTTAAACGAGCCACCTTTGCCTOGCTGGACTT 180 40 45 50 55 AsnAsaLeuAsnGlyGluAspGlnAspIleLeuMetGluAsnAsnLcuArgArgProAsn CAACAACCTCAATGGGGAAGACCAAGACATTCTGATGGAAAATAACCTTCGAAGGCCAAA 240 60 65 70 75 LeuGluAlaPbeAsnArgAlaValLysSerLeuGlaAsaAlaSerAlaZlaGluSerlle CCTGGAGGCATXCAACAGGGCIGTCAAGAGTTTACAGAATGCATCAGCAATTGAGAGCAT 300 80 85 90 95 LeuLysAsnLeuLeuProCysLeuProLeuAlaThrAlaAlaProThrArgHlsProIle TCTTAAAAATCTCCTGCCATGTCTGCCCCTGGCCACGGCCGCACCCACGCGACATCCAAT 360 100 105 110 lis HisIleLysAspGlyAspTrpAsaGluPheArgArgLysLeuThrPheiyrLouLysTbr CCATATCAAGGACGGTGACTGGAATGAATTCCGGAGGAAACTGACGTTCTATCTGAAAAC 4 2 0 ECORI 120 125 130 135 teuGluAsaAl&GlnAlaGlaGlaThrTbrLeuSerLeuAlaSerGlyGlyGlyeiySer CCTTGAGAATGCGCAGGCTCAACAGACGACXXXGTCGCTAGCGTCCGGAGGCCGXGGCTC 480 Kbel 140 145 150 155 ' GlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerAlaLeuAlaIlePbe£>euAspKetAlaPro GGGCGGTGGCGGCTCGGGTGGCGGCGGCTCTGCGCTAGCGATCTTXCTAGACAIGGCCCC 540 . Nhel XbaX

160 165 170 175 ProArgLettlleCysAspSerArgValLeuGluArgTyrLeuLeuGluAlaLysGluAla ACCACGCCTCATCTGTGACAGCCGAGTCCTGGAGAGGTACCTCTTGGAGGCCAAGGAGGC 600 180 185 190 195 GluAsnlleThrTbrGlyCysAlaGluHisCysSerLeuAsnGluAsnlleThrValPro CGAGAATATCACGACGGGCTGTGCTGAACACTGCAGCTTGAATGAGAATATCACTGTCCC 660 200 205 210 215 AspThrLysValAsnPheTyrAlATrpLysArgMetGluValGlyGlflGlnAlaValGlu AGACACCXAAGTTAXÍTTCTXCGCGTGGAAGXGGATGGAGGTCGGCCAGCAGGCCGTAGA 7 20 220 225 230 235 ValTrpGlnGlyLèuAlaLeuLeuSerGluAlaValLeuArgGlyGlnAlaLeuLeuVal AGTCTGGCAGGGCCTGGCCCXGCTGTCGGAAGCTGXCCTGCGGGGCCAGGCCCXGTTGGT 780 240 245 250 255 AsnSerSerGlnProTrpGluProLeuGlnLeuHisValÀspLysAlaValSerGlyLeu CAACTCGAGCCAGCCGTGGGAGCCCCTGCAACTGCATGTGGATAAAGCCGTCAGTGGCCT 840 260 265 270 275 ArgSerLeuThrThrLeuLeuArçAlaLeuGlyAlaGlaLysGluAlalleSerProPro TCGCAGCCTCACCXCTCTGCTTCGGGCTCTGGGAGCTCAGAAGGAAGCCATCTCCCCTCC 900 280 285 290 295 ‘ AspAlaAlaSerAlaAlaProLeuArgThrlleThrAlaAspThrPbeArgLyaLauPbe AGATGCGGCCTCAGCTGCTCCACTCCGAACAATCACTGCTGACACTXTCCGCAAACTCTT 960 300 305 310 315 ArgValTyrSerAenPheLeuArgGlyLysLeuLysLeuTyrThrGlyGluAlaCysArg CCGAGTCTACTCCAATTTCCTCCGGGGAAAGCTGAAGCTGTACACAGGGGAGGCAXGCAG 1020 320 ThrGlyAspArg * *. GACAGGGGACAGATGATAAGGATCCGAATTC 1051 BainHI EcoRI 32

desde o aminoácido 1 até o aminoácido 321. - 14a - Processo de acordo com a reivindicação 10 caracterizado por se obter uma molécula hematopoiética recombinante em que a primeira molécula hematopoiética compreende a parte de carboxi e a segunda molécula hematopoiética compreende a parte de amino da molécula hematopoiética recombinante. - 15* - Processõ de acordo com a reivindicação 14 caracterizado por se obter uma molécula hematopoiética recombinante que compreende a sequência de aminoãcidos seguinte: -25 -20 -15 -10 MetGlyValHisGluCysProAlaTrpLeuTrpLeuLeuLeuSerLeuLeuSer TCGAGCCATGGGGGTGCACGAATGTCCTGCCTGGCTGTGGCTTCTCCTGTCCCTGCTGTC 60 -5 15 10 LeuProLeuGlyLeuProValLeuGlyAlaProProArgLeuIleCysAspSerArgVal GCTCCGTCTGGGCCTCCCAGTCCTGGGCGCCCC ACCACGCCTC ATCTGTGACAGCCGAGT 120 15 20 25 30 LeuGluArgTyrLeuLeuGluAlaLysGluAlaGluAsnlleThrThrGlyCysAlaGlu CCTGGAGAGGTACCTCTTGGAGGCCAAGGAGGCCGAGAATATCACGACGGGCTGTGCTGA 180 35 40 45 50 HisCysSerLeuAsnGluAsnlleThrValProAspThrLysValAsnPheTyrAlaTrp ACACTGCAGCTTG AATGAGAATATCACTGTCCCAGACACCAAAGTTAATTTCTACGCGTG 2 4 0 55 60 65 70 LysArgMetGluValGlyGlnGlnAlaValGluValTrpGlnGlyLeuAlaLeuLeuSer GAAGAGGATGGAGGTCGGCCAGCAGGCCGTAGAAGTCTGGCAGGGCCTGGCCCTGCTGTC 300 75 80 85 . 90 GluAlaValLeuArgGlyClaAlaLeuLeuValAsnSerSerGlnProTrpGluProLeu GGAàGCTGTCCTGCGGGGCCAGGCCCTGTTGGTCAACTCGAGCCAGCCGTGGGAGCCCCT 360 33

95 100 105 110 GlnLeuHisValAspLysAl aValSerGlyLeuArgSerLeuXbrlhrLeuLeuArgAla GCAACTGCATGTGGATAAAGCCGXCAGIGGCCXXCGCAGCCXCACCACICTGCXXCGGGC 4 2 0 115 120 125 130 LeuGlyAlaGlnLysGluAlalleSerProProAspAlaAlaSerAlaAlaProLeuArg TCTGGGAGCTCAGAAGGAAGCCATCTCCCCTCCAGATGCGGCCTCAGCTGCTCCACTCCG 4 80 135 140 145 150 ThrlleXhrAlaAspXhrPheArgLysLeuPheArgValTyrSerAsnPheLeuArgGly AACAATCACTGCTGACACTTTCCGCAAACTCTTCCGAGTCTACTCCAATTTCCTCCGGGG 540 155 160 165 170 LysLeuLysLeuTyrThrGlyGluAlaCysArgThrGlyAspArgAlaAlaAlaMetAla AAAGCTGAAGCTGTACACAGGGGAGGCATGCAGGACAGGGGACAGAGCGGCCGCCATGGC 600 Notl Ncol 175 180 185 ' 190 ProMetThrGlnTbrThrSerLeuLysXhrSerlrpValAsnCysSerAsnMetlleAsp TCCCATGACCCAGACAACTÀGTTTGAAGACAAGCTGGGTTAACXGCTCTAACATGATCGA 660 Spel 195 200 205 210 GluIlelleThrHisLeuLysGlnProProLeuProLeuLeuAspPheAsnAsnLeuAsn TGAAATTATAAC ACACTTAAACGAGCCACCTTTGCCTTTGCTGGACTTCAACAACCTCAA 720 215 220 225 230 GlyGluAspGl nAspIleLeuMetGluAsnAsnLeuArgArgProAanLeuGluAlaPhe TGGGGAAGACCAAGACAXTCTGATGGAAAATAACCTTCGAAGGCCAAACCTGGAGGCATT 780 235 240 245 250 AsnArgAlaY.alLysSerLeuGlnAsnAlaSerAlalleGluSerIleLeuLysAsnLeu CAACAGGGCTGTCAAGAGTTTACAGAATGCATCAGCAATIGAGAGCATTCTTAAAAATCX 840 34 900 255 260 265 270 LeuProCysLeuProLeuAlaThrAlaAlaProThrArgHisProIleHisIleLysAsp cctgccatgtctgcccctggccacggccgcacccacgcgacatccaatccatatcaagga 275 280 265 290 GlyAspTrpAsnGluPheArgArgLysLeuThrPheTyrLeuLysThrLeuGluAsnAla CGGTGACTGGAATGAATTCCGGAGGAAACTGACGTTCTATCTGAAAACCCTTGAGAATGC 960 EcoRI 295 300 GlnAlaGlnGlnThrThrLeuSerLeuAlallePhe * * GCAGGCTCAACAGACGACTTTGTCGCTAGCGATCTTTTAGTAAGGATCCGAATTC 1015 Hhel BamHI EcoRI desde o aminoácido 1 ao aminoácido 303. - 16a - Processo de acordo com a reivindicação 14 caracterizado por se obter uma molécula hematopoiéti ca recombinante que compreende a sequência de aminoácidos seguinte: -25 -20 -15 . -10 MetGlyValHisGluCysProAlaTrpLeuTrpLeuLeuLeuSerLouLeuSer TCGAGCCATGGGGGTGCACGAATGTCCTGCCTGGCTGTGGCTTCTCCTGTCCCTGCTGTC 60 -5 15 10 LeuProLeuGlyLeuProValLeuGlyAlaProProArgLeuIleCysAspSerArgVal GCTCCCTCTGGGCCTCCCAGTCCTGGGCGCCCCACCACGCCTCATCTGTGACAGCCGAGT 120 15 20 25 30 LeuGluArgTyrLeuLeuGluÀlaLysGluAlaGluAsnlleThrThrGlyCysAlaGlu CCTGGAGAGGTACCTC1TGGAGGCCAAGGAGGCCG AGAATATCACGACGGGCTGTGCTGA 180 35

35 40 45 50 HisCysSerLeuÀsnGluAsnlleThrValProAspThrLysValAsnPheTyrAlaTrp ACACTGCAGCTTGAATGAGAATATCACTGTCCCAGACACCAAAGTTAATTTCTACGCGTG 240 55 60 65 70 LysArgMetGluValGlyGlnGlnAlaValGluValTrpGlnGlyLeuAlaLeuLeuSer GAAGAGGATGGAGGTCGGCCAGCAGGCCGTAGAAGTCTGGCAGGGCCTGGCCCTGCTGTC 300 75 80 85 90 GluAlaValLeuArgGlyGlnAlaLeuLeuValAsnSerSerGlnProTrpGluProLeu GGAAGCTGTCCTGCGGGGCCAGGCCCTGTTGGTCAACTCGAGCCAGCCGTGGGAGCCCCT 360 95 100 105 110 GlnLeuHisValAspLysAlaValSerGlyLeuArgSerLeuThrThrLeuLeuArgAla GCAACTGCATGTGGATAAAGCCGTCAGTGGCCTTCGCAGCCTCACCACXCTGCTTCGGGC 420 115 120 125 130 LeuGlyAlaGlnLysGluAlalleSerProProAspAlaAlaSerAlaAlaProLeuArg TCTGGGAGCTCAGAAGGAAGCCATCTCCCCTCCAGATGCGGCCTCAGCTGCTCCACTCCG 480 135 140 145 150 ThrlleThrAlaAspThrPheArgLysLeuPheArgValTyrSerAsnPheLeuArgGly AACÃATCACTGCTGACACTTTCCGCAAACTCTTCCGAGTCTACTCCAATTTCCTCCGGGG 540 > 155 160 165 170 LysLeuLysLeuTyrThrGlyGluAlaCysArgThrGlyAspArgAlaAlaAlaSerGly AAAGCTGAAGCTGTACACAGGGGAGGCATGCAGGACAGGGGACAGAGCGGCCGCCTCCGG —600 Notl 175 180 185 190 GlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerAlaAlaAlaMetAlaPro AGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGCGGCTCGGGTGGCGGCGGCTCTGCGGCCGCCATGGCTCC 660 Notl Ncol 36

195 200 205 210 MetXhrGlnXhrThrSerLeuLysXhrSerXrpValAsnCysSerAsnMetlleAspGlu CATGACCCAGACAACXAGXXTGAAGACAAGCXGGGIXAACXGCXCXAACAXGAXCGAXGA 7 20 Spel 215 220 225 230 IlelleXhrHisLeuLysGlnProProLeuProLeuLeuAspPheAsnAsnLeuAsnGly AATTATAACACACTTAAACGAGCCACCTTTGCCTTTGCTGGACTTCAACAACCTCAATGG 780 235 240 245 250 > GluAspGlnAsplleLeuMetGluAsnAsnLeuArgArgProAsnLeuGluAlaPheAsn GGAAGACCAAGACATTCTGATGGAAAATAACCTTCGAAGGCCAAACCTGGAGGCATTCAA 840 255 260 265 270 ArgAlaValLysSerLeuGInAsnAlaSerAlalleGlwSerlleLeuLysAsnLeuLeu CAGGGCXGICAAGAGIIXACAGAAXGCAICAGCAAIIGAGAGCAXXCXIAAAAAXCXCCI 900 275 280 285 290 ProCysLeuProLeuAlaThrAlaAlaProThrArgHisProIleHisIleLysAspGly GCCATGTCTGCCCCTGGCCACGGCCGCACCCACGCGACATCCAATCCATATCAAGGACGG 960 295 300 305 310 AspTrpAsnGluPheArgArgLysLeuThrPheTyrLeuLysThrLeuGluAsnAlaGln TGACTGGAATGAATTCCGGAGGAAACTGACGTTCTATCTGXAAACCCTTGAGAATGCGCA 1020 EcoRI 315 320 AlaGlnGlnThrThrLeuSerLeuAlallePhe * * GGCTCAACAGACGACTXTGTCGCTAGCGATCXTTTAGTAAGGATCCGAATTC 1072 Nhel BamHI EcoRI 37

desde o aminoácido 1 ao aminoácido 322. - 17a - Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por a primeira molécula hematopoiética ser IL-3 e a segunda molécula hematopoiética ser G-CSF. - 18* - Processo de acordo com a reivindicaçãos 17 caracterizado por se obter uma molécula hematopoiética recombinante em que a primeira molécula hematopoiética compreende a parte de carboxi e a segunda molécula hematopoiética compreende a parte de amino da molécula hematopoiética recombinante. - 19a - Processo de acordo com a reivindicação 18 caracterizado por se obter uma molécula hematopoiética recombinante que compreende a sequência de aminoácidos desde o aminoácido 1 ao aminoácido 317 seguinte: -15 -10 , -5 MetSerArgLeuProValLeuLeuLeuLeuGlnLeuLeuValArgPro AATTGCCGCCACCATGAGCCGCCTGCCCGTCCTGCTCCTGCTCCAACTCCTGGTCCGCCC 60 EcoRI 15 10 15 GlyLeuGlnAlaProMetThrGlnThrThrSerLeuLysThrSerTrpValAsnCysSer CGGACTCCAAGCTCCCATGACCCAGACAACTAGTTTGAAGACAAGCTGGGTTAACTGCTC 120 Spel 20 25 30 35 AsnMetlleAspGluIlelleThrHisLeuLysGlnProProLeuProLeuLeuAspPhe TAACATGATCGATGAAATTATAACACACTTAAACGAGCCACCTTTGCCTTTGCTGGACTT 180 40 45 50 55 AsnAsnLeuAsnGlyGluAspGlnAspIleLeuMetGluAsnAsnLeuArgArgProAsn C AAC AACCTC AATGGGGAAGACCAAGAC AXTCTGATGGAAAATAACCXTCGAAGGCCAAA 240 38 300 LeuGluAlaPheAsaArgAlaValLysSerLeuGlnAsnAlaSerAlalleGluSerlle CCIGGAGGCATXCAACAGGGCTGTCAAGAGTTTACAGAATGCATCAGCAATTGAGAGCAX 80 8S 90 95 LeuLysXsnLauLeuProCysLeuProLouMaThrAlaAlaProThrArçrHisProIle tcttaaaaaxctcctgccatgtctgcccctggccacggccgcacccacgcgacatccaat 100 105 110 115 HisIleLyíAspGlyAspTrpAsnGluPheArgArgLysLeuThrPheTyrt/euLysThr ccatatcaaggacôgtgactgsaaxgaaxxccggaggaaacxgacgxxcxaicxgaaaac EcoRI 120 125 130 135 LeuGluAsnAlaGlaAlaOlnGlaXhrXhrLeuSerLeuAlallePheLeuGluAlaAla ccttgagaatgcgcasgctcaacagacgaciiigicgctagcgatctxxctagaagccgc Hhel Xbal Kotl 140 145 150 155 AlaSerLeuProAlaMetXhrProLeuGlyProAlaSerSerLeuProGlnSerPheLeu CGCAAGCTTACCTGCCATGACCCCCCTGGGCCCTGCCAGCTCCCTGCCCCAGAGCTTCCX HindIII 160 165 . 170 175 LeuLysCysLeuGluGlnValArgLysIleGlnGlyAspGlyAlaAlaLeuGlnGluLya GCXCAAGTGCIIAGAGCAAGTGAGGAAGAICCAGGGCGAIGGCGCACCCCXCCAGCAGAA 180 185 190 195 LeuCysAlaThrlyrLysteuCysHisProGluGluLeuValLeuLeuGlyHisSerLeu GCIGXGIGCCACCIACAAGCIGTGCCACCCCGAGGAGCIGGIGCTGCICGGACACXCXCT 200 205 210 215 GlylleProXrpAlaProI/euSerSerCysProSerGlnAlaLeuGlnLeuAlaGlyCys gggcaiccccxgggctccccxgagcxccxgccccagccaggcccxgcagcxggcaggcxg 220 225 230 235 LeuSerGlnLeuHisSerGlyLauPheC%u7yrGlsGlyLeuLeúGlnAlaLeuGluGly CTXGAGCCAACICCAIAGCGGCCTTTXCCTCTACCAGGGGCTCCTGCAGGCCCIGGAAGG 240 245 250 2SS IleSerProGluLeuGlyProThrLeuAspThrLeuGInLeuAspValAlaAspPhoAla GATATCCCCCGAGTTGGGTCCCACCTTGCACACACTGCAGCTGGACGTCGCCGACTTTGC 260 265 270 275 ThrThrlleTrpGlnGlnMetGluGluLeuGlyMetAlaProAlaLeuGlnProXhrGln CACCACCATCTGGCAGCAGATGGAAGAACTGGGAATGGCCCCTGCCCXGCAGCCCACCCA 280 285 290 295 GlyAlaKetProAlaPheAlaSerAlaPheGlnArgArgAlaGlyGlyValLeuValAla GGGIGCCAXGCCGGCCXXCGCCXCXGCXXXCCAGCGCCGGGCAGGAGGGGTCCXGGXXGC 300 ' 305 310 315 SerHisteuGlnSerPheLeuGluValSerTyrArgValLeuArgHisLeuAlaGlnPro TAGCCAXCIGCAGAGCXXCCXGGAGGIGXCGXACCGCGXXCXACGCCACCXXGCGCAGCC Fspl 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 39 1039 - 203 - Processo para a preparação de uma composição farmacêutica caracterizado por se incorporar uma molécula hematopoiética recombinante guando preparada de acordo a reivindicação 1 em associação com um veículo farmaceuticamente aceitável. A requerente reivindica a prioridade do pedido norte-americano apresentado em 28 de Setembro de 1990, sob o NE 589,958. > Lisboa, 27 de Setembro de 1991 J

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