JP3996655B2 - 混合組成物からなるリポソーム様物質の存在中での組換え因子viiiの産生 - Google Patents
混合組成物からなるリポソーム様物質の存在中での組換え因子viiiの産生 Download PDFInfo
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Description
【発明の属する技術分野】
本開示は、一般的には哺乳類細胞発現系における組換え因子VIIIの産生に関する。具体的には本開示は、組換え因子VIIIの収率を増加させるための、哺乳類細胞培養培地に対して特定された比率で脂質類を含むリポソーム様物質の添加に関する。
【0002】
【従来の技術】
因子VIIIは正常な止血もしくは血液の凝固に必要とされる血漿蛋白質である。機能的な因子VIIIは血友病Aの個体においては欠損しており、X−染色体中に存在するこの蛋白質をコードする遺伝子の突然変異がその理由となっている。出血現象を制御するためには血友病患者を因子VIIIで処理する必要があり、この因子VIIIは歴史的にヒト血液の血漿から単離されている。
【0003】
ヒトの因子VIII遺伝子は186,000の塩基対を含み、かつ全X−染色体の0.1%を構成しており、そのためこの遺伝子は中でも既知の最大遺伝子となっている(1)。26のエキソンに由来するこの因子の転写産物は約9000塩基対の長さのメッセンジャーRNAであり、これが2351のアミノ酸からなる巨大蛋白質をコードしている。因子VIIIの構造研究により、この因子は有意な数の炭化水素残基を含む糖蛋白質であることが示されている。因子VIIIをコードするcDNAがクローン化されており(2、3)、そしてハムスター幼仔の腎細胞(BHK−21)(3)およびチャイニーズ(Chinese)ハムスターの卵巣細胞(4)中で安定に発現されている。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】
これらの高産生性細胞クローンの入手が可能になったことから、組換え因子VIII(rFVIII)の大量産生が容易となった。rFVIIIの商業的産生上の2つの重要な挑戦項目は、(i)高密度培養物を支持しかつrFVIIIを安定化させるであろう無血清培地の開発、および(ii)高純度のrFVIIIを生じるであろう効率のよい精製法である。
【0005】
ウシのリポ蛋白質もしくはヒトの低密度リポ蛋白質の無血清培地への添加により、組換えBHK−21細胞およびヒト胎児腎臓(293S)細胞が発現するrFVIIIの産生性が有意に改善されたことがこれまでに論証されている(5)。フォン ビルブラント(von Willebrand)因子の同時発現およびリン脂質類の無血清培地への添加がrFVIII発現性CHO細胞により産生されるrFVIIIの安定性を亢進させるのに有効であることが示されている(6)。
【0006】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、少なくとも2種(好ましくは、少なくとも3種)の脂質を含むある種のリポソーム様物質を、rFVIIIの無血清産生の際に培養補足物として用いることが可能であることを発見した。従来の技術(6)とは対照的に、本発明者は、単一の脂質(例えば、ホスファチジルコリン(PC)、ホスファチジルエタノールアミン(PE)、もしくはホスファチジルセリン(PC)のようなもの)からなる所定のリポソーム様物質はBHK−21細胞および293S細胞でのrFVIII発現には全く影響を及ぼさないという所見を得た。しかしながら異なる脂質[例えば、コレステロール、脂肪酸(例、リノール酸およびパルミチン酸)PC、PE、およびPS]の所定の比率での組み合わせ物を含むリポソーム様物質はBHK−21細胞および293S細胞でのrFVIII発現に有意な増強効果を及ぼすことが見いだされた。rFVIIIの長期産生のための無血清産生培地はこれらの新規の所見から開発された。
【0007】
本発明者は、約4倍を上回る倍率で組換え因子VIIIを産生する哺乳類細胞発現系の生産性の実質的な増加のための方法および培地を発見した。この方法の必須の段階は、発現系の細胞増殖培地へのリポソーム様物質の添加からなる。本明細書に用いられる際には「リポソーム様物質」は、固定されたモル比での少なくとも2種の脂質から構成される一つもしくは複数の二分子層を含んでなる小胞を意味する。モル比はおおよそのものであると理解されるべきである。
【0008】
本発明は以下の実施例に具体的に説明され、それらの実施例によっては高レベルのrFVIIIを発現する組換え細胞の脂質補足物を供給するためにリポソーム様物質を用いるrFVIIIの産生(好ましくは連続的産生)のための典型的な方法および細胞培養培地が記載される。
【0009】
リポソーム様物質の調製 全合成性リン脂質はAvanti Polar Lipids,Inc.社(Alabaster、Alabama)から取得した。リン脂質は0.1μのリポソーム様物質として供給した。凍結乾燥化リン脂質を50mMのトリス(Tris)−150mMのNaCl(pH7.4)中で再構成し、そして取っ手型装置であるLiposoFast(Avestin,Inc.社、Ottawa、Canada)の助けを借りて0.1μのポリカーボネート膜を通して押し出した。サイズ揃えを施したリポソーム様物質をその後に0.2μのフィルターで濾過し、そして無菌的に培地に添加した。ホスファチジルエタノールアミン(PE)、ホスファチジルコリン(PC)、およびホスファチジルセリン(PS)を、単一構成成分もしくは混合物のいずれかとして調査した。他の脂質(例えば、コレステロールおよび遊離脂肪酸)もそのリポソーム様物質内に取り込ませた。
【0010】
【実施例】
実施例I
293S細胞におけるrFVIIIの発現における様々な脂質混合物の効果
GS−10(高レベルの因子VIIIを発現する組換え293S細胞)細胞を、インシュリン(10μg/ml)およびトランスフェリン(25μg/ml)を補足してある無血清培地(Life Technologies社、Bethesda、MD、から得られる1:1での比率のダルベッコーの(Dulbecco’s)最少必須培地およびF12)を用いて震盪フラスコ内で無血清培養物として維持した。長期的評価は、3×106細胞/mlの初期撒種密度を用いて震盪フラスコ内で実施した。完全な培地交換は24時間の間隔で実施し、この際に細胞を遠心、洗浄、および3×106細胞/mlで再撒種した。典型的な震盪器内培養物は25〜50mlの細胞を含む。因子VIIIの活性を発色性アッセイであるCoatest VIII(Kabi Pharmacia社、Franklin、Ohio)により製造業者の指示書に従って測定した。
【0011】
リン脂質の初回スクリーニングを24時間目のプレート培養物を用いて実施した。様々なリン脂質の至適比率を決定した後、この結果を10〜14日の期間にわたり震盪フラスコ内で確認した。
【0012】
【表1】
【0013】
表1に示されるように、PCおよびPEが単独であると因子VIII発現には全く影響を示さない一方で、PSが単独であると阻害性を示すことが見いだされた。PC、PS、およびPEを様々な比率で組み合わせることにより因子VIII発現における有意な増加が観察された。最高の産生性は、PC:PE:PS(4:1:1)、PC:PS:コレステロール(8:1:1)、およびPC:PS:パルミチン酸:リノール酸(7:3:0.5:0.5)を補足した細胞において観察された。リン脂質の至適濃度は30μg/mlであることが見いだされた。様々なリン脂質のアシル側鎖の至適鎖長はC18であると決定された。全ての至適化研究を、引き続きジオレオイルリン脂質類に関して実施した。
【0014】
実施例II
連続培養における因子VIIIの発現
本発明者は、PC:PE:PS(4:1:1)、PC:PS:パルミチン酸:リノール酸(7:3:0.5:0.5)、およびPC:PS:コレステロール(8:1:1)を用い、長期震盪フラスコ培養による因子VIIIの産生性における各種リポソーム様物質の効果を測定した。培養条件は実施例Iに記載されるように実施した。
【0015】
リポソーム様物質の濃度は30μg/mlであった。完全な培地交換を24時間の間隔で実施した。結果を表2に示す。
【0016】
【表2】
【0017】
実施例III
連続培養における因子VIIIの発現
短縮された因子VIII(因子VIIIのBドメインの全部または一部の欠失)の産生に対する各種リポソーム類の効果を、因子VIIIの90kDおよび80kDのフラグメントに結合する下記配列(SEQ ID No.1)を有するBドメイン欠失因子VIIIの高レベル発現組換え293S細胞で試験した。
【0018】
90-kD--SFSQNPPVLKRHQR--80kD
(上記配列中のアミノ酸の略号は、引用文献(7)に示されるとおりであり、この文献は引用することによって本明細書の内容となる。)
上記短縮された因子VIIIは、引用文献(8)に記載されており、この文献は引用することによって本明細書の内容となる。
【0019】
培養は、5%ウシ胎児血清を補足したDMEM/F12(1:1)中で、ウェル当り2×105細胞の初期撒種密度により、12ウェルプレートにより行った。細胞が集密になった後、細胞をPBSで洗浄し、次いで実施例Iに記載したように無血清産物を添加した。結果を表3に示す。
【0020】
【表3】
【0021】
表3から、対照生理食塩水より、少なくとも3倍生産性が高まることがわかる。最高の生産性は、ジオレオイルPC/PE/PS(8:1:1)およびジオレオイルPC/PS/コレステロール(8:1:1)を補足した細胞で観察された。
【0022】
引用文献
1.Gitschierら、1984 Nature 312:326−329
2.Woodら、1984 Nature312:330−337
3.Tooleら、1984 Nature312:342−347
4.Kaufmanら、1989 Mol.Cell Biol.9:1233−1242
5.Chanら、1991 In Vitro 27:121
6.Kaufmanら、10/1993 米国特許第5,250,421号
7.Scholzら、5/1993 米国特許第5,210,075号
8.Almstedtら、6/1991 国際公開第91/09122号。
【0023】
本発明の主な特徴または態様は以下のとおりである。
【0024】
1. 哺乳類細胞培養発現系において組換え因子VIIIの産生レベルを少なくとも4倍増加させるための方法であって、産生性の4倍の増加を確実に行わせるに十分であるモル比および条件下で少なくとも2つの異なる脂質を含むリポソーム様物質をその培養系に添加する段階を含んでなる方法。
【0025】
2. リポソーム様物質が少なくとも3つの異なる脂質からなる、前記1に記載の方法。
【0026】
3. リポソーム様物質が、約4:1:1のモル比のホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、およびホスファチジルセリンからなる、前記2に記載の方法。
【0027】
4. リポソーム様物質が、約8:1:1のモル比のホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、コレステロールからなる、前記2に記載の方法。
【0028】
5. リポソーム様物質が、約7:3:0.5:0.5のモル比のホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、パルミチン酸、リノール酸からなる、前記2に記載の方法。
【0029】
6. リポソーム様物質を含む細胞培養培地であって、前記リポソーム様物質が哺乳類細胞培養系における因子VIII発現の4倍増加を確実に行うに十分なモル比で少なくとも2つの異なる脂質を含む細胞培養培地。
【0030】
7. リポソーム様物質が、約4:1:1のモル比のホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、およびホスファチジルセリンからなる、前記2に記載の細胞培養培地。
【0031】
8. リポソーム様物質が、約8:1:1のモル比のホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、コレステロールからなる、前記2に記載の細胞培養培地。
【0032】
9. リポソーム様物質が、約7:3:0.5:0.5のモル比のホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、パルミチン酸、リノール酸からなる、前記2に記載の細胞培養培地。
【0033】
【発明の効果】
本発明によれば、リポソーム様物質の形態で供給した場合、脂質混合物は、組換え細胞における因子VIIIの産生を有意に増強することを実証した。これらのリポソーム様物質を培地補足物として用いて、因子VIIIの産生、好ましくは因子VIIIの連続生産を支持することが可能である。なお、本明細書で使用される場合、因子VIIIの語は、因子VIIIの活性を有する因子VIIIのすべての変異体または短縮された形態のものも包含することを意図している。
【0034】
【表4】
Claims (9)
- 哺乳類細胞培養発現系における組換え因子VIIIの生産方法であって、
A.(1)4:1:1のモル比のホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミンおよびホスファチジルセリン、(2)8:1:1のモル比のホスファチジルコリン、ホスファチジルセリンおよびコレステロール、または(3)7:3:0.5:0.5のモル比のホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、パルミチン酸およびリノール酸の一つから選ばれるリン脂質混合物を含んでなるリポソームを前記培養発現系に添加する工程、および
B.前記哺乳類細胞を培養して組換え因子VIIIを発現する工程、
を含んでなる上記方法。 - 組換え因子VIIIが、配列番号1の配列を有するポリペプチドに連結されている90kDフラグメントおよび80kDフラグメントを含んでなる請求項1記載の方法。
- リン脂質混合物が、4:1:1のモル比のホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミンおよびホスファチジルセリンである請求項1記載の方法。
- リン脂質混合物が、8:1:1のモル比のホスファチジルコリン、ホスファチジルセリンおよびコレステロールである請求項1または2記載の方法。
- リン脂質混合物が、7:3:0.5:0.5のモル比のホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、パルミチン酸およびリノール酸である請求項1記載の方法。
- リポソームを含む細胞培養培地であって、前記リポソームが(1)4:1:1のモル比のホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミンおよびホスファチジルセリン、(2)8:1:1のモル比のホスファチジルコリン、ホスファチジルセリンおよびコレステロール、または(3)7:3:0.5:0.5のモル比のホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、パルミチン酸およびリノール酸の一つから選ばれるリン脂質混合物を含んでなる、上記培地。
- リン脂質混合物が、4:1:1のモル比のホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミンおよびホスファチジルセリンである、請求項6記載の培地。
- リン脂質混合物が、8:1:1のモル比のホスファチジルコリン、ホスファチジルセリンおよびコレステロールである、請求項6記載の培地。
- リン脂質混合物が、7:3:0.5:0.5のモル比のホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、パルミチン酸およびリノール酸である、請求項6記載の培地。
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