JP2644084B2 - 組換えヒト▲ｖｉｉｉ▼因子誘導体 - Google Patents
組換えヒト▲ｖｉｉｉ▼因子誘導体Info
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- JP2644084B2 JP2644084B2 JP3501715A JP50171591A JP2644084B2 JP 2644084 B2 JP2644084 B2 JP 2644084B2 JP 3501715 A JP3501715 A JP 3501715A JP 50171591 A JP50171591 A JP 50171591A JP 2644084 B2 JP2644084 B2 JP 2644084B2
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- Japan
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- factor viii
- kda
- human factor
- dna
- viii
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
- C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、生物学的に活性な組換えヒトVIII因子誘導
体をコードするDNA配列、そのようなDNAを含む組換え発
現ベクター、そのような組換え発現ベクターで形質転換
した宿主及び組換えヒトVIII因子誘導体の製造方法に関
する。本発明は、金属イオンブリッジにより結合した２
つのポリペプチドを含むヒトVIII因子誘導体にも関す
る。
体をコードするDNA配列、そのようなDNAを含む組換え発
現ベクター、そのような組換え発現ベクターで形質転換
した宿主及び組換えヒトVIII因子誘導体の製造方法に関
する。本発明は、金属イオンブリッジにより結合した２
つのポリペプチドを含むヒトVIII因子誘導体にも関す
る。
発明の背景 従来の血友病、即ち、血友病Ａは、最も一般的な遺伝
性の出血性疾患である。これは染色体Ｘに関連した血液
凝固VIII因子中の欠失により発症する。この病気は殆ど
男性に作用し、その発生率は男性１万人当たり１〜２人
である。Ｘ−染色体の欠陥は、その人自身は血友病でな
い女性キャリヤによって遺伝される。Ｘ−染色体中の変
異の種類に応じて、VIII因子は正常に機能しなくなる
か、または存在しなくなり、血液凝固が遅くなる。血友
病Ａの臨床兆候は、異常な出血傾向であり、VIII因子濃
縮製剤による治療法が導入される以前は、重症の血友病
Ａ患者の平均寿命は、20年未満であった。血漿からのVI
II因子濃縮製剤の使用により、血友病患者の症状はかな
り改善された。平均寿命は非常に延び、その殆どの人が
多かれ少なかれ通常の生活を送れるようになった。しか
しながら、濃縮製剤及びその使用に関しては問題があ
る。最も深刻な問題は、ウイルスの媒介である。これま
で、ウイルスによるAIDS、Ｂ型肝炎及び非Ａ非Ｂ型肝炎
が、血友病患者を襲っている。近年、種々のウイルス不
活法が、多くの市販の濃縮製剤の製造法に導入された。
ウイルス伝搬の危険に関して、従来の濃縮製剤と比較し
て非常に安全であると予測される、新規の高度精製VIII
因子濃縮製剤も市販されている。しかしながら、ウイル
スが存在しないという保証はできない。さらに、濃縮製
剤は、その原料である血漿の供給が制限されているの
で、非常に高価である。
性の出血性疾患である。これは染色体Ｘに関連した血液
凝固VIII因子中の欠失により発症する。この病気は殆ど
男性に作用し、その発生率は男性１万人当たり１〜２人
である。Ｘ−染色体の欠陥は、その人自身は血友病でな
い女性キャリヤによって遺伝される。Ｘ−染色体中の変
異の種類に応じて、VIII因子は正常に機能しなくなる
か、または存在しなくなり、血液凝固が遅くなる。血友
病Ａの臨床兆候は、異常な出血傾向であり、VIII因子濃
縮製剤による治療法が導入される以前は、重症の血友病
Ａ患者の平均寿命は、20年未満であった。血漿からのVI
II因子濃縮製剤の使用により、血友病患者の症状はかな
り改善された。平均寿命は非常に延び、その殆どの人が
多かれ少なかれ通常の生活を送れるようになった。しか
しながら、濃縮製剤及びその使用に関しては問題があ
る。最も深刻な問題は、ウイルスの媒介である。これま
で、ウイルスによるAIDS、Ｂ型肝炎及び非Ａ非Ｂ型肝炎
が、血友病患者を襲っている。近年、種々のウイルス不
活法が、多くの市販の濃縮製剤の製造法に導入された。
ウイルス伝搬の危険に関して、従来の濃縮製剤と比較し
て非常に安全であると予測される、新規の高度精製VIII
因子濃縮製剤も市販されている。しかしながら、ウイル
スが存在しないという保証はできない。さらに、濃縮製
剤は、その原料である血漿の供給が制限されているの
で、非常に高価である。
組換えVIII因子は、血漿から誘導したVIII因子濃縮製
剤の使用に関連する問題の多くを解決できるだろう。血
友病Ａの治療に組換えVIII因子が必要であるという観点
から、現在幾つかのグループがそのような製品の開発に
携わっている。しかしながら、組換えVIII因子の開発
は、幾つかの困難に突き当たっている。主な問題の一つ
は、組換えVIII因子を十分に高収率で製造しなければな
らないということである。開発されてきた研究の殆ど
は、VIII因子分子の全長をコードするcDNA遺伝子を使用
していた。
剤の使用に関連する問題の多くを解決できるだろう。血
友病Ａの治療に組換えVIII因子が必要であるという観点
から、現在幾つかのグループがそのような製品の開発に
携わっている。しかしながら、組換えVIII因子の開発
は、幾つかの困難に突き当たっている。主な問題の一つ
は、組換えVIII因子を十分に高収率で製造しなければな
らないということである。開発されてきた研究の殆ど
は、VIII因子分子の全長をコードするcDNA遺伝子を使用
していた。
本発明は、分子量及び他の生化学的特徴に関し、市販
の濃縮製剤にかなりの量で存在する上述の血漿VIII因子
型と対応する、組換えVIII因子誘導体をコードする欠失
型VIII因子cDNAについて記載する［Andersson,L−O.ら
（1986）,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83,2979−1983］。
動物細胞培養物中にこの分子を発現することにより得ら
れらた発現レベルは、完全長VIII因子cDNAをVIII因子の
発現に使用するときと比較して非常に高いことが証明さ
れた。新規の欠失型VIII因子cDNAは、組換えVIII因子を
医薬製剤にするための工業的工程で使用すべき組換えVI
II因子を十分に高収率で提供するだろう。
の濃縮製剤にかなりの量で存在する上述の血漿VIII因子
型と対応する、組換えVIII因子誘導体をコードする欠失
型VIII因子cDNAについて記載する［Andersson,L−O.ら
（1986）,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83,2979−1983］。
動物細胞培養物中にこの分子を発現することにより得ら
れらた発現レベルは、完全長VIII因子cDNAをVIII因子の
発現に使用するときと比較して非常に高いことが証明さ
れた。新規の欠失型VIII因子cDNAは、組換えVIII因子を
医薬製剤にするための工業的工程で使用すべき組換えVI
II因子を十分に高収率で提供するだろう。
用語の定義 以下、2332アミノ酸一本鎖完全長VIII因子の種々の構
造ドメインの名称は、Vehar,GA.ら（1984）,Nature 31
2,337−342ににより定義されたのと同様である。従っ
て、A1及びA2ドメインは、約200kDa（アミノ酸１〜164
8）〜約90kDa（アミノ酸１〜740）のVIII因子の重鎖型
内に含まれている。A3、C1およびC2ドメインは、約80kD
a（アミノ酸1649〜2332）のVIII因子の軽鎖に含まれて
いる。Ｂドメインは、完全長１本鎖VIII因子の高度にグ
リコシル化された中間領域（heavily glycosylated mid
dle region）または、VIII因子重鎖（アミノ酸741〜164
8）の200kDa型のＣ−末端部分を構成する。『VIII因子
欠失誘導体』という用語は、１個以上のアミノ酸を欠失
することにより完全長VIII因子ポリペプチドから誘導し
たVIII:C因子活性を有する１本以上のポリペプチド鎖と
して定義される。『VIII:QD因子』という用語は、アミ
ノ酸745〜1562を欠損している完全長VIII因子から誘導
したポリペルチド鎖として定義される。『VIII:RE因
子』という用語は、アミノ酸741〜1648を欠損している
完全長VIII因子から誘導したポリペプチド鎖として定義
される。『VIII:SQ因子』という用語は、アミノ酸743〜
1636を欠損している完全長VIII因子から誘導したポリペ
プチド鎖として定義される。
造ドメインの名称は、Vehar,GA.ら（1984）,Nature 31
2,337−342ににより定義されたのと同様である。従っ
て、A1及びA2ドメインは、約200kDa（アミノ酸１〜164
8）〜約90kDa（アミノ酸１〜740）のVIII因子の重鎖型
内に含まれている。A3、C1およびC2ドメインは、約80kD
a（アミノ酸1649〜2332）のVIII因子の軽鎖に含まれて
いる。Ｂドメインは、完全長１本鎖VIII因子の高度にグ
リコシル化された中間領域（heavily glycosylated mid
dle region）または、VIII因子重鎖（アミノ酸741〜164
8）の200kDa型のＣ−末端部分を構成する。『VIII因子
欠失誘導体』という用語は、１個以上のアミノ酸を欠失
することにより完全長VIII因子ポリペプチドから誘導し
たVIII:C因子活性を有する１本以上のポリペプチド鎖と
して定義される。『VIII:QD因子』という用語は、アミ
ノ酸745〜1562を欠損している完全長VIII因子から誘導
したポリペルチド鎖として定義される。『VIII:RE因
子』という用語は、アミノ酸741〜1648を欠損している
完全長VIII因子から誘導したポリペプチド鎖として定義
される。『VIII:SQ因子』という用語は、アミノ酸743〜
1636を欠損している完全長VIII因子から誘導したポリペ
プチド鎖として定義される。
従来の技術 プロテアーゼ阻害剤の存在下で製造した新鮮な血漿
中、VIII因子は、分子量280kDaで且つ、各々分子量200k
Da及び80kDaを有する２本のペプチド鎖を含むことが知
られている［Andersson,L−O.ら（1986）Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA.83,2979−2983］。これらの鎖は、金属イオ
ン橋かけにより結合されている。多少蛋白質分解された
分解型のVIII因子分子は、市販の濃縮製剤から精製した
VIII因子物質中に活性フラグメントとして発見された
［Anderssn,L−O.ら1986;Anderssonら（1985）欧州特許
第0197901号］。分子量260kDa〜170kDaのVIII因子フラ
グメント型は、80kDaの軽鎖として結合した分子量180kD
a〜90kDaの範囲の１本の重鎖（総ての変形体は、同一の
Ｎ−末端を有する）からなっていた。この重鎖のＮ−末
端領域は、VIII因子cDNAのヌクレオチド配列データ［Wo
od,W.I.ら（1984）Nature 312,330〜336,Vehar,G.A.ら
（1984）Nature 312,337〜342］から得られた一本鎖のV
III因子のＮ−末端領域と同一である。
中、VIII因子は、分子量280kDaで且つ、各々分子量200k
Da及び80kDaを有する２本のペプチド鎖を含むことが知
られている［Andersson,L−O.ら（1986）Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA.83,2979−2983］。これらの鎖は、金属イオ
ン橋かけにより結合されている。多少蛋白質分解された
分解型のVIII因子分子は、市販の濃縮製剤から精製した
VIII因子物質中に活性フラグメントとして発見された
［Anderssn,L−O.ら1986;Anderssonら（1985）欧州特許
第0197901号］。分子量260kDa〜170kDaのVIII因子フラ
グメント型は、80kDaの軽鎖として結合した分子量180kD
a〜90kDaの範囲の１本の重鎖（総ての変形体は、同一の
Ｎ−末端を有する）からなっていた。この重鎖のＮ−末
端領域は、VIII因子cDNAのヌクレオチド配列データ［Wo
od,W.I.ら（1984）Nature 312,330〜336,Vehar,G.A.ら
（1984）Nature 312,337〜342］から得られた一本鎖のV
III因子のＮ−末端領域と同一である。
１本の90kDa鎖及び１本の80kDa鎖を有する、分子量17
0kDaの最小の活性型は、高分子型と同程度にしてトロン
ビンで活性化され得た。従って、これは不活化型を表
す。血友病の犬で試験したように十分な生物学的in viv
o活性を有していることも知見された［Brinkhous,K.M.
ら（1985）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82,8752−8756］。
かくして、止血効果は、VIII因子の高分子型と同じであ
る。さらに、170kDa型は、高分子型と比較して50％も長
いin vivo残存時間を有することが知見された。
0kDaの最小の活性型は、高分子型と同程度にしてトロン
ビンで活性化され得た。従って、これは不活化型を表
す。血友病の犬で試験したように十分な生物学的in viv
o活性を有していることも知見された［Brinkhous,K.M.
ら（1985）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82,8752−8756］。
かくして、止血効果は、VIII因子の高分子型と同じであ
る。さらに、170kDa型は、高分子型と比較して50％も長
いin vivo残存時間を有することが知見された。
アミノ酸Arg−739とGlu−1649との間にあるVIII因子
ポリペプチド鎖の高度にグリコシル化された中間部分
は、完全な生物学的活性には必要ではないということ
は、何人もの研究者を刺激して、この領域を欠損する組
換えVIII因子の誘導体の産生を試みさせた。これは、VI
II因子の中間の高度にグリコシル化された部分をコード
するcDNA部分を全体若しくは一部欠失することにより達
成された。
ポリペプチド鎖の高度にグリコシル化された中間部分
は、完全な生物学的活性には必要ではないということ
は、何人もの研究者を刺激して、この領域を欠損する組
換えVIII因子の誘導体の産生を試みさせた。これは、VI
II因子の中間の高度にグリコシル化された部分をコード
するcDNA部分を全体若しくは一部欠失することにより達
成された。
例えば、J.J.Tooleらは、各々アミノ酸982〜1562及び
760〜1639を欠損するVIII因子の構築及び発現について
報告した。［Proc.Natl.Acad.Sci.USA（1986）83,5939
−5942］。D.L.Eatonらは、アミノ酸797〜1562を欠損す
るVIII因子の構築及び発現について報告した［Biochemi
stry（1986）25,8343−8347］。R.J.Kaufmanは、アミノ
酸741〜1646を欠損するVIII因子の発現について報告し
た［PCT出願公開第87/04187号］。N.Sarverらは、アミ
ノ酸747〜1560を欠損するVIII因子の構築及び発現につ
いて報告した［DNA（1987）6.553−564］。M.Pasekは、
各々アミノ酸745〜1562及びアミノ酸741〜1648を欠損す
るVIII因子の構築及び発現について報告した［PCT出願
公開第88/00831号］。Ｋ−D Langnerは、各々アミノ酸8
16〜1598及びアミノ酸741〜1689を欠損するVIII因子の
構築及び発現について報告した［Behring Inst.Mitt.,
（1988）No 82,16−25,欧州特許第295 597号］。P.Meul
ienらは、各々アミノ酸868〜1562及びアミノ酸771〜166
6を欠損するVIII因子の構築及び発現について報告した
［Protein Engineering（1988）２（４）,301−306,欧
州特許出願公開第0 303 540 A1号］。VIII因子cDNAのこ
れらの欠失型を哺乳類細胞内で発現させると、産生レベ
ルは、完全長VIII因子と比較して通常10倍も高い。
760〜1639を欠損するVIII因子の構築及び発現について
報告した。［Proc.Natl.Acad.Sci.USA（1986）83,5939
−5942］。D.L.Eatonらは、アミノ酸797〜1562を欠損す
るVIII因子の構築及び発現について報告した［Biochemi
stry（1986）25,8343−8347］。R.J.Kaufmanは、アミノ
酸741〜1646を欠損するVIII因子の発現について報告し
た［PCT出願公開第87/04187号］。N.Sarverらは、アミ
ノ酸747〜1560を欠損するVIII因子の構築及び発現につ
いて報告した［DNA（1987）6.553−564］。M.Pasekは、
各々アミノ酸745〜1562及びアミノ酸741〜1648を欠損す
るVIII因子の構築及び発現について報告した［PCT出願
公開第88/00831号］。Ｋ−D Langnerは、各々アミノ酸8
16〜1598及びアミノ酸741〜1689を欠損するVIII因子の
構築及び発現について報告した［Behring Inst.Mitt.,
（1988）No 82,16−25,欧州特許第295 597号］。P.Meul
ienらは、各々アミノ酸868〜1562及びアミノ酸771〜166
6を欠損するVIII因子の構築及び発現について報告した
［Protein Engineering（1988）２（４）,301−306,欧
州特許出願公開第0 303 540 A1号］。VIII因子cDNAのこ
れらの欠失型を哺乳類細胞内で発現させると、産生レベ
ルは、完全長VIII因子と比較して通常10倍も高い。
さらに、同一細胞内の２つの異なるcDNA誘導体から別
個に90kDa及び80kDa鎖を発現させる試みも為された［Bu
rke,R.L.ら（1986）,J.Biol.Chem.261,12574−12578,Pa
virani,Aら（1987）Biochem.Biophys.Res.Comm.,145,23
4−240］。しかしながら、この系に於いては、in vivo
再構築は、VIII:C因子活性が回収されたことによりその
構築効率が制限されているようである。
個に90kDa及び80kDa鎖を発現させる試みも為された［Bu
rke,R.L.ら（1986）,J.Biol.Chem.261,12574−12578,Pa
virani,Aら（1987）Biochem.Biophys.Res.Comm.,145,23
4−240］。しかしながら、この系に於いては、in vivo
再構築は、VIII:C因子活性が回収されたことによりその
構築効率が制限されているようである。
発明の説明 本発明は、VIII:C因子活性を有する１本以上のポリペ
プチド鎖からなる蛋白質を製造する方法に関する。さら
に具体的には、本発明は、動物細胞内で発現して、各々
分子量90kDa及び80kDaの２本のポリペプチド鎖から本質
的になるVIII:C因子活性を有する蛋白質を高レベルで産
生する、完全長VIII因子cDNAから誘導した変形cDNA配列
を提供する。
プチド鎖からなる蛋白質を製造する方法に関する。さら
に具体的には、本発明は、動物細胞内で発現して、各々
分子量90kDa及び80kDaの２本のポリペプチド鎖から本質
的になるVIII:C因子活性を有する蛋白質を高レベルで産
生する、完全長VIII因子cDNAから誘導した変形cDNA配列
を提供する。
従って、本発明は、生物学的に活性な組換えヒトVIII
因子誘導体をコードするDNA配列であって、ヒトVIII因
子の90kDa鎖をコードする第１のDNAセグメント及びヒト
VIII因子の80kDa鎖をコードする第２のDNAセグメントを
含み、前記セグメントは、ヒトVIII因子のＢドメイン４
〜約100アミノ酸残基のリンカーペプチドをコードする
リンカーDNAセグメントを介して相互に結合されてお
り、前記アミノ酸残基の少なくとも４個は前記ドメイン
のＣ末端由来である、該DNA配列を提供する。
因子誘導体をコードするDNA配列であって、ヒトVIII因
子の90kDa鎖をコードする第１のDNAセグメント及びヒト
VIII因子の80kDa鎖をコードする第２のDNAセグメントを
含み、前記セグメントは、ヒトVIII因子のＢドメイン４
〜約100アミノ酸残基のリンカーペプチドをコードする
リンカーDNAセグメントを介して相互に結合されてお
り、前記アミノ酸残基の少なくとも４個は前記ドメイン
のＣ末端由来である、該DNA配列を提供する。
前記リンカーは、ヒトVIII因子のＢドメインのＣ末端
由来の少なくとも４個のアミノ酸残基をコードするのが
好ましい。本発明の好ましい実施態様に於いて、前記リ
ンカー遺伝子は、ヒトVIII因子のＢドメインの約20個以
下のアミノ酸残基をコードする。
由来の少なくとも４個のアミノ酸残基をコードするのが
好ましい。本発明の好ましい実施態様に於いて、前記リ
ンカー遺伝子は、ヒトVIII因子のＢドメインの約20個以
下のアミノ酸残基をコードする。
本発明の特に好ましい実施態様に於いて、前記DNA配
列は、ヒトVIII因子のＢドメイン由来の12個のアミノ酸
を含むアミノ酸配列をコードするリンカーを含む。
列は、ヒトVIII因子のＢドメイン由来の12個のアミノ酸
を含むアミノ酸配列をコードするリンカーを含む。
好ましい具体例としては、前記リンカーは、ヒトVIII
因子のＢドメインの少なくとも７個のアミノ酸残基、Ｃ
末端由来の少なくとも７個のアミノ酸残基及び前記ドメ
インのＮ末端由来の少なくとも２個のアミノ酸残基をコ
ードし得る。
因子のＢドメインの少なくとも７個のアミノ酸残基、Ｃ
末端由来の少なくとも７個のアミノ酸残基及び前記ドメ
インのＮ末端由来の少なくとも２個のアミノ酸残基をコ
ードし得る。
本発明の特定の実施態様において、DNA配列はヒトVII
I因子のＢドメインのＣ末端由来の12個のアミノ酸残基
及びＮ末端由来の２個のアミノ酸残基をモードするリン
カーを含む。
I因子のＢドメインのＣ末端由来の12個のアミノ酸残基
及びＮ末端由来の２個のアミノ酸残基をモードするリン
カーを含む。
本発明は、略述した上記DNA配列と、さらにプロモー
ター及びポリアデニル化シグナル配列とを含む転写ユニ
ットを含む組換え発現ベクターに関する。
ター及びポリアデニル化シグナル配列とを含む転写ユニ
ットを含む組換え発現ベクターに関する。
本発明は、上記定義の組換え発現ベクターで形質転換
した、動物由来の宿主細胞にも関する。
した、動物由来の宿主細胞にも関する。
さらに、本発明は、上記の生物学的に活性な組換えヒ
トVIII因子誘導体の製造方法であって、上記定義の組換
え発現ベクターで形質転換した動物細胞系を栄養培地で
増殖させ、90kDaドメインと、これに金属イオン結合で
結合している80kDaドメインを含むヒトVIII因子誘導体
を発現且つ分泌させ、次いで、前記発現した誘導体を培
養培地から回収することを含む該方法も提供する。
トVIII因子誘導体の製造方法であって、上記定義の組換
え発現ベクターで形質転換した動物細胞系を栄養培地で
増殖させ、90kDaドメインと、これに金属イオン結合で
結合している80kDaドメインを含むヒトVIII因子誘導体
を発現且つ分泌させ、次いで、前記発現した誘導体を培
養培地から回収することを含む該方法も提供する。
また、本発明は、ヒトVIII因子の90kDaドメインと、
場合によりこれにリンカーペプチドまたはその一部を介
して金属イオン結合により結合した80kDaドメインとを
含むヒトVIII因子誘導体を提供する。
場合によりこれにリンカーペプチドまたはその一部を介
して金属イオン結合により結合した80kDaドメインとを
含むヒトVIII因子誘導体を提供する。
上記２本のポリペプチド鎖からなるVIII:C因子活性を
有する蛋白質を得るために、in vivo翻訳中に作られた
単一のポリペプチド鎖が、産生細胞中での翻訳後プロセ
シング（post−translational processing）またはin v
itroでの蛋白質分解プロセシングまたはその両方により
切断されるべきである。分子量200kDa及び80kDaの２本
のポリペプチド鎖からなるヒトVIII因子を有する蛋白質
は、ヒト血漿から単離し得るため、上記に従って、単一
鎖の完全長VIII因子一次翻訳産物上には、プロセシング
酵素のための好適な切断部位があると思われる。多分、
重要なin vivoプロセシング部位は、Arg−1648のカルボ
キシ−末端側に位置しているのであろう。突然変異時、
Arg−1648での切断により、分子量200kDa及び80kDaの２
本の鎖からなるVIII因子蛋白質が産生する。Arg−1648
は、VIII因子分子の構造ドメイン間の境界に位置してい
ると考えられるため、プロセシング酵素の立体的に許容
可能な標的を構成する。多分、Arg−740にもう１つプロ
セシング部位があり、in vitroでは、その部位で200kDa
鎖が90kDa鎖に変換され、従って市販のヒト血漿から誘
導したVIII因子濃縮製剤中に存在するVIII因子の90kDa
及び80kDa型が形成されるのであろう。本発明により、i
n vivo若しくはin vitroまたはその両方で、90kDa及び8
0kDaのポリペプチド鎖からなる２本の鎖の蛋白質に、プ
ロセシングされ得るVIII因子欠失誘導体を製造するため
に、Arg−740及びArg−1648を取り囲むアミノ酸配列
は、正しい切断の為の構造的要件を維持するために保存
されねばならないということが知見された。具体的に
は、例えば、完全長VIII因子ポリペプチドのアミノ酸74
3〜1636までが欠失している場合、14個のアミノ酸がArg
−740及びArg−1648に結合している新しいポリペプチド
鎖が得られる。これら14個のアミノ酸のうち、５アミノ
−末端アミノ酸の配列は、完全長VIII因子のArg−740よ
り後の５個のアミノ酸と直接対応している。また、上記
14アミノ酸フラグメントの12カルボキシ−末端アミノ酸
の配列は、完全長VIII因子のGlu−1649より前の12個の
アミノ酸に直接対応し、従ってＢドメインのＮ−末端領
域とＣ−末端領域との間に重複する３個のアミノ酸が生
じる。
有する蛋白質を得るために、in vivo翻訳中に作られた
単一のポリペプチド鎖が、産生細胞中での翻訳後プロセ
シング（post−translational processing）またはin v
itroでの蛋白質分解プロセシングまたはその両方により
切断されるべきである。分子量200kDa及び80kDaの２本
のポリペプチド鎖からなるヒトVIII因子を有する蛋白質
は、ヒト血漿から単離し得るため、上記に従って、単一
鎖の完全長VIII因子一次翻訳産物上には、プロセシング
酵素のための好適な切断部位があると思われる。多分、
重要なin vivoプロセシング部位は、Arg−1648のカルボ
キシ−末端側に位置しているのであろう。突然変異時、
Arg−1648での切断により、分子量200kDa及び80kDaの２
本の鎖からなるVIII因子蛋白質が産生する。Arg−1648
は、VIII因子分子の構造ドメイン間の境界に位置してい
ると考えられるため、プロセシング酵素の立体的に許容
可能な標的を構成する。多分、Arg−740にもう１つプロ
セシング部位があり、in vitroでは、その部位で200kDa
鎖が90kDa鎖に変換され、従って市販のヒト血漿から誘
導したVIII因子濃縮製剤中に存在するVIII因子の90kDa
及び80kDa型が形成されるのであろう。本発明により、i
n vivo若しくはin vitroまたはその両方で、90kDa及び8
0kDaのポリペプチド鎖からなる２本の鎖の蛋白質に、プ
ロセシングされ得るVIII因子欠失誘導体を製造するため
に、Arg−740及びArg−1648を取り囲むアミノ酸配列
は、正しい切断の為の構造的要件を維持するために保存
されねばならないということが知見された。具体的に
は、例えば、完全長VIII因子ポリペプチドのアミノ酸74
3〜1636までが欠失している場合、14個のアミノ酸がArg
−740及びArg−1648に結合している新しいポリペプチド
鎖が得られる。これら14個のアミノ酸のうち、５アミノ
−末端アミノ酸の配列は、完全長VIII因子のArg−740よ
り後の５個のアミノ酸と直接対応している。また、上記
14アミノ酸フラグメントの12カルボキシ−末端アミノ酸
の配列は、完全長VIII因子のGlu−1649より前の12個の
アミノ酸に直接対応し、従ってＢドメインのＮ−末端領
域とＣ−末端領域との間に重複する３個のアミノ酸が生
じる。
上記の２本のポリペプチド鎖からなるVIII:SQ因子蛋
白質を高レベルで製造するために、このVIII因子欠失誘
導体をコードするcDNAを、当業者には公知の方法により
E.coli中で増殖させ得るクローニングベクター内の、好
適な調節要素を含む効率的な転写ユニット中に組み込
む。効率的な転写調節要素は、真核細胞の染色体DNAか
ら誘導され得た。例えば、強く構造的に転写される遺伝
子からのプロモーター−エンハンサーの組み合わせが使
用でき、メタロチオネイン、β−アクチンまたはGRP78
が好ましい。効率的な転写調節要素は、その天然宿主と
してのウイルス含有真菌細胞から誘導し得る。例えば、
動物宿主に生息するウイルスから誘導したプロモーター
−エンハンサーの組み合わせを使用でき、ラウス肉腫ウ
イルスLTR（Long Terminal Repeat）に発生するエンハ
ンサー及びプロモーター、SV40、アデノウイルス後期プ
ロモーター（major late promoter）並びにヒトサイト
メガロウイルス即時型プロモーター（immediate early
promoter）が好ましい。VIII:SQ因子cDNAから転写した
安定な高レベルの量のmRNAを得るために、転写ユニット
は、転写停止−ポリアデニル化配列をコードするDNA領
域をその３′近位部分に含むべきである。この配列は、
SV40初期転写領域またはウサギβ−グロブリン遺伝子か
ら誘導されるのが好ましい。
白質を高レベルで製造するために、このVIII因子欠失誘
導体をコードするcDNAを、当業者には公知の方法により
E.coli中で増殖させ得るクローニングベクター内の、好
適な調節要素を含む効率的な転写ユニット中に組み込
む。効率的な転写調節要素は、真核細胞の染色体DNAか
ら誘導され得た。例えば、強く構造的に転写される遺伝
子からのプロモーター−エンハンサーの組み合わせが使
用でき、メタロチオネイン、β−アクチンまたはGRP78
が好ましい。効率的な転写調節要素は、その天然宿主と
してのウイルス含有真菌細胞から誘導し得る。例えば、
動物宿主に生息するウイルスから誘導したプロモーター
−エンハンサーの組み合わせを使用でき、ラウス肉腫ウ
イルスLTR（Long Terminal Repeat）に発生するエンハ
ンサー及びプロモーター、SV40、アデノウイルス後期プ
ロモーター（major late promoter）並びにヒトサイト
メガロウイルス即時型プロモーター（immediate early
promoter）が好ましい。VIII:SQ因子cDNAから転写した
安定な高レベルの量のmRNAを得るために、転写ユニット
は、転写停止−ポリアデニル化配列をコードするDNA領
域をその３′近位部分に含むべきである。この配列は、
SV40初期転写領域またはウサギβ−グロブリン遺伝子か
ら誘導されるのが好ましい。
効率的な転写ユニットに組み込まれたVIII:SQ因子cDN
Aは、次に、VIII:SQ因子蛋白質を発現するための好適な
宿主生物中に導入される。好ましくは、この生物は、正
しい折り畳み（folding）、ジスルフィド結合形成及び
分泌並びに他の翻訳後修飾を確実に行うために、脊椎動
物起源の動物細胞系であるべきである。翻訳修飾の例と
しては、アスパラギン結合グリコシル化、チロシンＯ−
硫酸化並びに、90kDa及び80kDaの２本の鎖からなるVIII
因子蛋白質の形成に不可欠である新生の単一ポリペプチ
ド鎖の蛋白質分解プロセシングが得らけれる。使用し得
る細胞系の例としては、サルCOS−細胞、マウスＬ−細
胞、マウスC127−細胞、ハムスターBHK−21細胞及び好
ましくはCHO−細胞が挙げれられる。
Aは、次に、VIII:SQ因子蛋白質を発現するための好適な
宿主生物中に導入される。好ましくは、この生物は、正
しい折り畳み（folding）、ジスルフィド結合形成及び
分泌並びに他の翻訳後修飾を確実に行うために、脊椎動
物起源の動物細胞系であるべきである。翻訳修飾の例と
しては、アスパラギン結合グリコシル化、チロシンＯ−
硫酸化並びに、90kDa及び80kDaの２本の鎖からなるVIII
因子蛋白質の形成に不可欠である新生の単一ポリペプチ
ド鎖の蛋白質分解プロセシングが得らけれる。使用し得
る細胞系の例としては、サルCOS−細胞、マウスＬ−細
胞、マウスC127−細胞、ハムスターBHK−21細胞及び好
ましくはCHO−細胞が挙げれられる。
VIII:SQ因子cDNAをコードする転写ユニットは、数種
類の方法で動物細胞系に導入し得る。これらの一例とし
ては、上記転写ユニットと種々の動物ウイルスベクター
とから組換体を形成することが挙げられる。これらの例
としては、ワクシニアウイルス、SV40ウイルス及び好ま
しくはウシ乳頭腫ウイルスベクターが挙げられる。
類の方法で動物細胞系に導入し得る。これらの一例とし
ては、上記転写ユニットと種々の動物ウイルスベクター
とから組換体を形成することが挙げられる。これらの例
としては、ワクシニアウイルス、SV40ウイルス及び好ま
しくはウシ乳頭腫ウイルスベクターが挙げられる。
VIII:SQ因子cDNAをコードする転写ユニットは、ゲノ
ムに組換えDNAが組み込まれた特定の細胞クローンの単
離を容易にするための、細胞中に優性な選択可能なマー
カーとして機能し得るもう１つの組換え遺伝子と共に、
動物細胞系中に導入することもできる。優性な選択可能
なマーカー遺伝子のこの種の例としては、Tn5アミノグ
リコシドホスホトランスフェラーゼ（Geneticin,G418耐
性）及びピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼ
（ピューロマイシン耐性）が挙げられる。このような選
択可能なマーカー遺伝子をコードする転写ユニットは、
VIIISQ因子ユニットをコードするベクターと同一ベクタ
ー上に存在させ得る。これはまた、宿主細胞のゲノム中
に同時に導入され且つ組み込まれる別個のベクター上に
もコードされ得、これによって、異なる転写ユニット間
に強い物理的結合が形成されることが多い。
ムに組換えDNAが組み込まれた特定の細胞クローンの単
離を容易にするための、細胞中に優性な選択可能なマー
カーとして機能し得るもう１つの組換え遺伝子と共に、
動物細胞系中に導入することもできる。優性な選択可能
なマーカー遺伝子のこの種の例としては、Tn5アミノグ
リコシドホスホトランスフェラーゼ（Geneticin,G418耐
性）及びピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼ
（ピューロマイシン耐性）が挙げられる。このような選
択可能なマーカー遺伝子をコードする転写ユニットは、
VIIISQ因子ユニットをコードするベクターと同一ベクタ
ー上に存在させ得る。これはまた、宿主細胞のゲノム中
に同時に導入され且つ組み込まれる別個のベクター上に
もコードされ得、これによって、異なる転写ユニット間
に強い物理的結合が形成されることが多い。
VIII:SQ因子cDNAと共に使用し得る優性な選択可能な
マーカーの他の型は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（dhf
r）をコードする種々の転写ユニットに基づいている。
この種の遺伝子を内因性dhfr活性欠損細胞、好ましくは
CHO−細胞（DUKX−B11,DG−44）に導入後、ヌクレオシ
ド欠損培地内で増殖させることができる。このような培
地の例としては、ヒポキサンチン、チミジン及びグリシ
ンを含まないHam F12が挙げられる。これらのdhfr遺伝
子は、同一ベクター上に結合したかまたは２種類のベク
ターに結合した、上記型のCHO−細胞中のVIII:SQ因子転
写ユニットと結合して使用し得、従って組換えVIII:SQ
因子蛋白質を産生するdhfr陽性の細胞系を製造し得る。
マーカーの他の型は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（dhf
r）をコードする種々の転写ユニットに基づいている。
この種の遺伝子を内因性dhfr活性欠損細胞、好ましくは
CHO−細胞（DUKX−B11,DG−44）に導入後、ヌクレオシ
ド欠損培地内で増殖させることができる。このような培
地の例としては、ヒポキサンチン、チミジン及びグリシ
ンを含まないHam F12が挙げられる。これらのdhfr遺伝
子は、同一ベクター上に結合したかまたは２種類のベク
ターに結合した、上記型のCHO−細胞中のVIII:SQ因子転
写ユニットと結合して使用し得、従って組換えVIII:SQ
因子蛋白質を産生するdhfr陽性の細胞系を製造し得る。
上記細胞系を、細胞毒性のdhfr−阻害剤メトトレキセ
ートの存在下に増殖させると、メトトレキセート耐性の
新規細胞系が現れる。これらの細胞系は、結合したdhfr
及びVIII:SQ因子転写ユニット数の増幅のために、増大
速度で組換えVIII:SQ因子蛋白質を産生し得る。これら
の細胞系をメトトレキセート（１〜10000nM）の増大す
る濃度中で増殖させると、非常に速い速度でVIII:SQ因
子蛋白質を産生する新規細胞系が得られる。
ートの存在下に増殖させると、メトトレキセート耐性の
新規細胞系が現れる。これらの細胞系は、結合したdhfr
及びVIII:SQ因子転写ユニット数の増幅のために、増大
速度で組換えVIII:SQ因子蛋白質を産生し得る。これら
の細胞系をメトトレキセート（１〜10000nM）の増大す
る濃度中で増殖させると、非常に速い速度でVIII:SQ因
子蛋白質を産生する新規細胞系が得られる。
VIII:SQ因子蛋白質を産生する上記細胞系は、懸濁培
養液中または種々の固体の支持体上で、大きなスケール
でも増殖可能である。これらの支持体の例としては、デ
キストラン若しくはコラーゲンマトリックス、または中
空糸繊維若しくは種々のセラミック材料型の固体支持体
をベースとしたミクロキャリヤが挙げられる。懸濁培養
液中またはミクロキャリヤ上で増殖させる場合、上記細
胞系の培養は、バッチ培養としてまたは長時間にわたる
ならし培地での連続生産潅流培養として実施できる。本
発明により、上記細胞系は、ヒト血漿から単離し得る、
真正な２本のポリペプチド鎖（90kDa及び80kDa）からな
るVIII因子に対応する組換えVIII:SQ因子を製造するた
めの工業的な方法の開発に適している。
養液中または種々の固体の支持体上で、大きなスケール
でも増殖可能である。これらの支持体の例としては、デ
キストラン若しくはコラーゲンマトリックス、または中
空糸繊維若しくは種々のセラミック材料型の固体支持体
をベースとしたミクロキャリヤが挙げられる。懸濁培養
液中またはミクロキャリヤ上で増殖させる場合、上記細
胞系の培養は、バッチ培養としてまたは長時間にわたる
ならし培地での連続生産潅流培養として実施できる。本
発明により、上記細胞系は、ヒト血漿から単離し得る、
真正な２本のポリペプチド鎖（90kDa及び80kDa）からな
るVIII因子に対応する組換えVIII:SQ因子を製造するた
めの工業的な方法の開発に適している。
上記種類のCHO−細胞の培地中で蓄積する組換えVIII:
SQ因子蛋白質は、ならし培地中での組換えVIII:SQ因子
と他の物質との間のサイズ、電荷、溶解性、疎水性、特
異的親和性等の違いを利用する方法を含む種々の生化学
的な方法により濃縮且つ精製できる。
SQ因子蛋白質は、ならし培地中での組換えVIII:SQ因子
と他の物質との間のサイズ、電荷、溶解性、疎水性、特
異的親和性等の違いを利用する方法を含む種々の生化学
的な方法により濃縮且つ精製できる。
そのような精製法の１例としては、固体支持体に固定
化されたモノクローナル抗体への組換えVIII:SQ因子の
吸着が挙げられる。脱着後、VIII:SQ因子蛋白質を、上
記特性に基づいた種々のクロマトグラフ法によりさらに
精製し得る。
化されたモノクローナル抗体への組換えVIII:SQ因子の
吸着が挙げられる。脱着後、VIII:SQ因子蛋白質を、上
記特性に基づいた種々のクロマトグラフ法によりさらに
精製し得る。
本発明で記載したVIII因子活性を有する蛋白質は、治
療に使用するための医薬製剤中に配合し得る。製造され
た組換えVIII:SQ因子蛋白質は、慣用の生理学的に適合
し得る緩衝水溶液に溶解し、これに、場合により医薬用
アジュバントを添加して医薬製剤とする。
療に使用するための医薬製剤中に配合し得る。製造され
た組換えVIII:SQ因子蛋白質は、慣用の生理学的に適合
し得る緩衝水溶液に溶解し、これに、場合により医薬用
アジュバントを添加して医薬製剤とする。
本発明を、以下の非限定的な実施例によりさらに詳細
に説明する。本発明の特定の実施態様は、添付図面と組
み合わせて説明される。図面の説明を以下に記す。
に説明する。本発明の特定の実施態様は、添付図面と組
み合わせて説明される。図面の説明を以下に記す。
図１は、完全長VIII因子とVIII:SQ因子との間の関係
を示す図面である、90kDa鎖のＣ末端と、80kDa鎖のＮ末
端との間の領域の一次構造が示されている。垂直な矢印
は、ここで切断されて２つの鎖産物を与えるペプチド結
合を示している。
を示す図面である、90kDa鎖のＣ末端と、80kDa鎖のＮ末
端との間の領域の一次構造が示されている。垂直な矢印
は、ここで切断されて２つの鎖産物を与えるペプチド結
合を示している。
図２は、ヒトサイトメガロウイルスプロモーターの転
写制御下でのVIII:SQ因子cDNAを含むプラスミドpKGE436
を示す図である。
写制御下でのVIII:SQ因子cDNAを含むプラスミドpKGE436
を示す図である。
図３は、マウス哺乳類腫瘍ウイルスLTRの転写制御下
にあるマウスジヒドロ葉酸レダクターゼcDNAを含むプラ
スミドpKGE327を示す図である。
にあるマウスジヒドロ葉酸レダクターゼcDNAを含むプラ
スミドpKGE327を示す図である。
図４は、ドデシル硫酸ナトリウム存在下のポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動後の、組換えVIII:SQ因子のイム
ノブロックティングを示す図である。
ルアミドゲル電気泳動後の、組換えVIII:SQ因子のイム
ノブロックティングを示す図である。
図５は、トロンビンとインキュベーションした後の組
換えVIII:SQ因子のVIII因子活性変化を示すグラフであ
る。
換えVIII:SQ因子のVIII因子活性変化を示すグラフであ
る。
図６は、ヒトα−トロンビンとのインキュベーション
後の組換えVIII:SQ因子のSDS−PAGE及びイムノブロッテ
ィングのパターンの変化を示す図である。
後の組換えVIII:SQ因子のSDS−PAGE及びイムノブロッテ
ィングのパターンの変化を示す図である。
実施例１ 一次転写産物を２本のポリペプチド鎖にin vivo蛋白
質分解プロセシングするのに不可欠である、Ｂ−ドメイ
ンのアミノ末端及びカルボキシ末端配列の一部を含む
が、Ｂドメインの大部分を含まないポリペプチド鎖をコ
ードする、VIII因子cDNAの欠失誘導体を構築した。
質分解プロセシングするのに不可欠である、Ｂ−ドメイ
ンのアミノ末端及びカルボキシ末端配列の一部を含む
が、Ｂドメインの大部分を含まないポリペプチド鎖をコ
ードする、VIII因子cDNAの欠失誘導体を構築した。
VIII因子cDNAの突然変異誘発 アミノ酸Leu587〜Ala1702をコードするVIII:QD因子欠
失誘導体cDNAから得られた894塩基対のKpnI−PstI制限
フラグメント（M.Pasek,PCT出願公開第88/00831号）
を、この分野の標準法によりバクテリオファージベクタ
ーM13mp19［Yanisch−Perron,C.ら（1985）Gene 33,103
−119］に導入した。得られた組換えファージクローン
を、オリゴヌクレオチド依存性突然変異誘発用の鋳型と
して使用した１本鎖DNAを調製するための供給源として
使用した［Nakamaye,K及びEckstein,F.（1986）Nucleic
Acids Res.14,9679−9698］。精製した環状一本鎖ベク
ターDNA10μｇを以下の配列： ５′−GCCATTGAACCAAGAAGCTTCTCTCAGAATCCACCAGTCTTGAA
ACGC−３′ を有する５′−リン酸化したオリゴヌクレオチド8pmol
にアニーリングした。
失誘導体cDNAから得られた894塩基対のKpnI−PstI制限
フラグメント（M.Pasek,PCT出願公開第88/00831号）
を、この分野の標準法によりバクテリオファージベクタ
ーM13mp19［Yanisch−Perron,C.ら（1985）Gene 33,103
−119］に導入した。得られた組換えファージクローン
を、オリゴヌクレオチド依存性突然変異誘発用の鋳型と
して使用した１本鎖DNAを調製するための供給源として
使用した［Nakamaye,K及びEckstein,F.（1986）Nucleic
Acids Res.14,9679−9698］。精製した環状一本鎖ベク
ターDNA10μｇを以下の配列： ５′−GCCATTGAACCAAGAAGCTTCTCTCAGAATCCACCAGTCTTGAA
ACGC−３′ を有する５′−リン酸化したオリゴヌクレオチド8pmol
にアニーリングした。
全部で４種類のデオキシヌクレオチド、dCTPαＳ、DN
A−ポリメラーゼＩのクレノウフラグメント12ユニット
及びT4 DNA−リガーゼ12ユニットを添加することによ
り、得られた鋳型上に環状DNAの第２の鎖を合成した。1
6℃で一晩インキュベーションした後、500mM NaClの存
在下にニトロセルロースを通して過することにより、
反応混合物を二重鎖DNAの豊富な画分とした。精製二重
鎖DNAの1/5を制限酵素NciI 5ユニットとインキュベーシ
ョンしてニックを形成し、ファージDNAの鋳型鎖が部分
的に除去されるような程度までエキソヌクレアーゼIII
50ユニットで処理した。得られた部分二重鎖を、全部で
４種類のデオキシヌクレオチドトリホスフェートの存在
下、DNAポリメラーゼI 3ユニットとT4 DNAリガーゼ２ユ
ニットで16℃３時間処理することにより二重鎖DNAに再
変換した。得られた混合物の1/4を使用して、E.coli TG
1 300μを形質転換した。得られた突然変異誘発され
たファージクローンのうち10クローンを、ジデオキシシ
ークエンシング（Sanger,F.ら1977,Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA 74,5463〜5467）にかけた。得られたファージク
ローンのうちの１つは、228塩基対セグメントが除去さ
れたことを示し、且つVIII:QD因子のアミノ酸Asp 1563
〜Ser 1637に対応する、期待されたヌクレオチド配列を
示した。このクローンは、VIII因子蛋白質のPhe742〜Se
r1637の間の融合物（fusion）をコードする,M13mp19ベ
クター内のVIII因子cDNAの新規666塩基対KpnI−PstIフ
ラグメント（VIII:SQ因子）を産生する。
A−ポリメラーゼＩのクレノウフラグメント12ユニット
及びT4 DNA−リガーゼ12ユニットを添加することによ
り、得られた鋳型上に環状DNAの第２の鎖を合成した。1
6℃で一晩インキュベーションした後、500mM NaClの存
在下にニトロセルロースを通して過することにより、
反応混合物を二重鎖DNAの豊富な画分とした。精製二重
鎖DNAの1/5を制限酵素NciI 5ユニットとインキュベーシ
ョンしてニックを形成し、ファージDNAの鋳型鎖が部分
的に除去されるような程度までエキソヌクレアーゼIII
50ユニットで処理した。得られた部分二重鎖を、全部で
４種類のデオキシヌクレオチドトリホスフェートの存在
下、DNAポリメラーゼI 3ユニットとT4 DNAリガーゼ２ユ
ニットで16℃３時間処理することにより二重鎖DNAに再
変換した。得られた混合物の1/4を使用して、E.coli TG
1 300μを形質転換した。得られた突然変異誘発され
たファージクローンのうち10クローンを、ジデオキシシ
ークエンシング（Sanger,F.ら1977,Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA 74,5463〜5467）にかけた。得られたファージク
ローンのうちの１つは、228塩基対セグメントが除去さ
れたことを示し、且つVIII:QD因子のアミノ酸Asp 1563
〜Ser 1637に対応する、期待されたヌクレオチド配列を
示した。このクローンは、VIII因子蛋白質のPhe742〜Se
r1637の間の融合物（fusion）をコードする,M13mp19ベ
クター内のVIII因子cDNAの新規666塩基対KpnI−PstIフ
ラグメント（VIII:SQ因子）を産生する。
VIII:SQ因子をコードする哺乳類発現ベクターの構築 上記のVIII:SQ因子融合物をコードする666塩基対KpnI
−PstIフラグメントを、二重鎖複製型M13mp19ファージD
NAから単離し、ベクターpKGE431に導入した。このベク
ターは、pUC19内のVIII:RE因子蛋白質のアミノ酸Leu587
〜Met2176をコードするVIII:RE cDNA因子由来の2046塩
基対KpnI−SphIフラグメント（M.Pasek,PCT特許出願公
開第88/00831号、ATCC受託番号第53517号）からなる。V
III:SQ因子666塩基対KpnI−PstIフラグメントを所望の
形で挿入するために、pKGE431 DNAは、完全KpnI消化及
び部分PstI消化により開環されねばならなかった。VII
I:RE因子蛋白質中のAla1702に対応する位置のPstIが切
断されたpKGE431フラグメントを単離し、VIII:SQ cDNA
因子の上記KpnI−PstIフラグメントに結合してベクター
pKGE432を作製した。ベクターpKGE432をKpnI及びApaIで
消化し、VIII:SQ因子蛋白質のLeu587〜Ala2047をコード
する対応する1700塩基対KpnI−ApaIフラグメントを、Kp
nI及びApaIで消化しておいたベクターpKGE347の大きな
フラグメントに結合した。E.coliクローニングベクター
pBR327をベースにしたベクターpKGE347は、３′−近位
部分にSV40 t−抗原イントロン及びポリアデニル化配列
を有するVIII:QD因子cDNAの上流の741塩基対DNAセグメ
ント［ヌクレオチド位置−671〜＋71,Boshart,Mら（198
5）Cell 41,521〜530］上にコードされたヒトサイトメ
ガロウイルスエンハンサー／プロモーターからなる。図
２に示されている得られたベクター（pKGE436）は、完
全なVIII:SQ cDNA因子を含み、且つコードされるVIII因
子欠失誘導体が異なること以外はpKGE347と同一であ
る。
−PstIフラグメントを、二重鎖複製型M13mp19ファージD
NAから単離し、ベクターpKGE431に導入した。このベク
ターは、pUC19内のVIII:RE因子蛋白質のアミノ酸Leu587
〜Met2176をコードするVIII:RE cDNA因子由来の2046塩
基対KpnI−SphIフラグメント（M.Pasek,PCT特許出願公
開第88/00831号、ATCC受託番号第53517号）からなる。V
III:SQ因子666塩基対KpnI−PstIフラグメントを所望の
形で挿入するために、pKGE431 DNAは、完全KpnI消化及
び部分PstI消化により開環されねばならなかった。VII
I:RE因子蛋白質中のAla1702に対応する位置のPstIが切
断されたpKGE431フラグメントを単離し、VIII:SQ cDNA
因子の上記KpnI−PstIフラグメントに結合してベクター
pKGE432を作製した。ベクターpKGE432をKpnI及びApaIで
消化し、VIII:SQ因子蛋白質のLeu587〜Ala2047をコード
する対応する1700塩基対KpnI−ApaIフラグメントを、Kp
nI及びApaIで消化しておいたベクターpKGE347の大きな
フラグメントに結合した。E.coliクローニングベクター
pBR327をベースにしたベクターpKGE347は、３′−近位
部分にSV40 t−抗原イントロン及びポリアデニル化配列
を有するVIII:QD因子cDNAの上流の741塩基対DNAセグメ
ント［ヌクレオチド位置−671〜＋71,Boshart,Mら（198
5）Cell 41,521〜530］上にコードされたヒトサイトメ
ガロウイルスエンハンサー／プロモーターからなる。図
２に示されている得られたベクター（pKGE436）は、完
全なVIII:SQ cDNA因子を含み、且つコードされるVIII因
子欠失誘導体が異なること以外はpKGE347と同一であ
る。
実施例２ チャイニーズハムスター卵巣細胞のトランスフェクショ
ン 直径10センチメートルの細胞培養皿に、ジヒドロ葉酸
レダクターゼ欠失チャイニーズハムスター卵巣細胞［CH
O−DG 44,Dr.L.A.Chasin,Columbia University,New Yor
kより入手］50万を、10％ウシ胎児血清を補ったダルベ
ッコの改良イーグル培地/Ham′s F12（1:1）に接種し、
５％二酸化炭素インキュベータ内で37℃で一晩インキュ
ベートした。翌日、細胞を新鮮な培地で洗浄し、従来法
により、VIII:SQ因子発現ベクターpKGE436とジヒドロ葉
酸レダクターゼベクターpKGE327の1:1混合物10μｇで、
リン酸カルシウム方法によりトランスフェクトした。ベ
クターpKGE327は、SV40 t−抗原を有するマウスジヒド
ロ葉酸レダクターゼcDNAの上流のマウス哺乳類腫瘍ウイ
ルスLTRと、右回りにベクターpML2中にクローニングさ
れた３′近位部分のポリアデニル化配列とからなる転写
ユニットを含む（図３）。３日目、培地を除去し、細胞
を洗浄し、新しい細胞培養皿に分配した。４日目、培地
を、ヒポキサシチン、グリシン及びチジミンを欠損し、
且つ十分に透析された10％ウシ胎児血清を補充した上記
の培養培地と置き換えることにより、ジヒドロ葉酸レダ
クターゼ陽性細胞の選択を開始した。培地を１週間に２
回取り替え、約２週間後、ジヒドロ葉酸レダクターゼ陽
性細胞のコロニーを収穫できた。これらのコロニーをさ
らに、25cm2細胞培養ボトル内で増殖させ、小集落（sub
confluency）の形成後、培地を３％ウシ胎児血清を含む
新鮮培地で置き換えた。24時間経過後、培養培地内のVI
II:C因子の活性を、合成基質法を使用して試験した（Co
atest VIII:C因子,KABI）。結果を以下の表１に示す。
ン 直径10センチメートルの細胞培養皿に、ジヒドロ葉酸
レダクターゼ欠失チャイニーズハムスター卵巣細胞［CH
O−DG 44,Dr.L.A.Chasin,Columbia University,New Yor
kより入手］50万を、10％ウシ胎児血清を補ったダルベ
ッコの改良イーグル培地/Ham′s F12（1:1）に接種し、
５％二酸化炭素インキュベータ内で37℃で一晩インキュ
ベートした。翌日、細胞を新鮮な培地で洗浄し、従来法
により、VIII:SQ因子発現ベクターpKGE436とジヒドロ葉
酸レダクターゼベクターpKGE327の1:1混合物10μｇで、
リン酸カルシウム方法によりトランスフェクトした。ベ
クターpKGE327は、SV40 t−抗原を有するマウスジヒド
ロ葉酸レダクターゼcDNAの上流のマウス哺乳類腫瘍ウイ
ルスLTRと、右回りにベクターpML2中にクローニングさ
れた３′近位部分のポリアデニル化配列とからなる転写
ユニットを含む（図３）。３日目、培地を除去し、細胞
を洗浄し、新しい細胞培養皿に分配した。４日目、培地
を、ヒポキサシチン、グリシン及びチジミンを欠損し、
且つ十分に透析された10％ウシ胎児血清を補充した上記
の培養培地と置き換えることにより、ジヒドロ葉酸レダ
クターゼ陽性細胞の選択を開始した。培地を１週間に２
回取り替え、約２週間後、ジヒドロ葉酸レダクターゼ陽
性細胞のコロニーを収穫できた。これらのコロニーをさ
らに、25cm2細胞培養ボトル内で増殖させ、小集落（sub
confluency）の形成後、培地を３％ウシ胎児血清を含む
新鮮培地で置き換えた。24時間経過後、培養培地内のVI
II:C因子の活性を、合成基質法を使用して試験した（Co
atest VIII:C因子,KABI）。結果を以下の表１に示す。
VIII:SQ因子産生CHO−DG44細胞系の遺伝子増幅 VIII:SQ因子467mU/ml/日を産生する表１のCHO−DG44
細胞系208:22を、さらに遺伝子増幅させるために、メト
トレキセート中での選択及び増殖により選択した。20nM
メトトレキセート内で数週間培養後、細胞系208:22は、
幾つかの新しい耐性細胞クローンを産生した。これらの
クローンを個別に収穫し、上記の通りの別個の培養物と
してさらに増殖させた。これらのクローンの培地中のVI
II:C因子の生産性を、実施例１と同様に分析した。結果
を表２に示す。
細胞系208:22を、さらに遺伝子増幅させるために、メト
トレキセート中での選択及び増殖により選択した。20nM
メトトレキセート内で数週間培養後、細胞系208:22は、
幾つかの新しい耐性細胞クローンを産生した。これらの
クローンを個別に収穫し、上記の通りの別個の培養物と
してさらに増殖させた。これらのクローンの培地中のVI
II:C因子の生産性を、実施例１と同様に分析した。結果
を表２に示す。
実施例３ VIII:SQ因子の精製及び生物学的な特徴付け 増幅したCHO−DG44細胞系208:22により産生したVIII:
SQ因子を、生物学的な特性について調査した。この研究
前に、培養培地からのVIII因子物質を部分精製した。こ
の精製では、VIII因子に対するモノクローナル抗体を含
むマトリックスを使用する免疫アフィニティークロマト
グラフィー工程、次いでイオン交換クロマトグラフィー
工程を実施した。得られた精製VIII因子物質の比活性
は、3000〜4000 IU/A280の範囲であり、VIII因子活性/V
III因子抗原比は、１に近かった［活性はCoatest（KAB
I）で測定し、抗原は、80kDa鎖に対するモノクローナル
抗体を使用したElisa分析により決定した］。精製VIII:
SQ因子物質をSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（S
DS−PAGE）及びウエスタンブロット分析にかけた。SDS
−PAGEは、Laemmli（1970）Nature 227,680〜685に記載
の方法により実施した。ウサギポリクローナル抗ヒトVI
II因子抗体をウエスタンブロット分析に使用し、分析を
実質的にTowbin,H.ら（1979）Proc.Natl.Acad.Sci.USA,
76,4350〜4354の記載と同様に実施した。得られた結果
を図４に示す。図中、 レーン1:80kDa軽鎖及び200kDa〜90kDaの重鎖を含む血漿
VIII因子、 レーン２及び3:80kDa及び90kDa鎖を含む組換えVIII:SQ
因子、 を示す。２つの異なるバッチのVIII:SQ因子由来の物質
を上記通りに精製した。この分析により、VIII:SQ因子
物質内に２本の主バンドの存在、90kDaに１本及び80kDa
にダブレットバンド１つを示した。２本のバンドが、ゲ
ル上、血漿VIII因子の生物学的に活性な最小複合体を表
す90kDa及び80kDaペプチドと同じ位置に認められた。少
量の170kDaバンド（全物質の５％未満）が、VIII:SQ因
子物質にも認められたが、これは多分、未開裂の一次翻
訳産物を表すものであろう。さらに、VII:SQ蛋白質の自
動エドマン分解を使用するＮ−末端配列決定は、90kDa
及び80kDa鎖のＮ−末端が、血漿から誘導した90kDaプラ
ス80kDaVIII因子のＮ−末端と同一であることを示し
た。この結果より、一次翻訳産物の、２本のポリペプチ
ド鎖へのin vivo蛋白質分解プロセシングが有効であっ
たことが分かった。
SQ因子を、生物学的な特性について調査した。この研究
前に、培養培地からのVIII因子物質を部分精製した。こ
の精製では、VIII因子に対するモノクローナル抗体を含
むマトリックスを使用する免疫アフィニティークロマト
グラフィー工程、次いでイオン交換クロマトグラフィー
工程を実施した。得られた精製VIII因子物質の比活性
は、3000〜4000 IU/A280の範囲であり、VIII因子活性/V
III因子抗原比は、１に近かった［活性はCoatest（KAB
I）で測定し、抗原は、80kDa鎖に対するモノクローナル
抗体を使用したElisa分析により決定した］。精製VIII:
SQ因子物質をSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（S
DS−PAGE）及びウエスタンブロット分析にかけた。SDS
−PAGEは、Laemmli（1970）Nature 227,680〜685に記載
の方法により実施した。ウサギポリクローナル抗ヒトVI
II因子抗体をウエスタンブロット分析に使用し、分析を
実質的にTowbin,H.ら（1979）Proc.Natl.Acad.Sci.USA,
76,4350〜4354の記載と同様に実施した。得られた結果
を図４に示す。図中、 レーン1:80kDa軽鎖及び200kDa〜90kDaの重鎖を含む血漿
VIII因子、 レーン２及び3:80kDa及び90kDa鎖を含む組換えVIII:SQ
因子、 を示す。２つの異なるバッチのVIII:SQ因子由来の物質
を上記通りに精製した。この分析により、VIII:SQ因子
物質内に２本の主バンドの存在、90kDaに１本及び80kDa
にダブレットバンド１つを示した。２本のバンドが、ゲ
ル上、血漿VIII因子の生物学的に活性な最小複合体を表
す90kDa及び80kDaペプチドと同じ位置に認められた。少
量の170kDaバンド（全物質の５％未満）が、VIII:SQ因
子物質にも認められたが、これは多分、未開裂の一次翻
訳産物を表すものであろう。さらに、VII:SQ蛋白質の自
動エドマン分解を使用するＮ−末端配列決定は、90kDa
及び80kDa鎖のＮ−末端が、血漿から誘導した90kDaプラ
ス80kDaVIII因子のＮ−末端と同一であることを示し
た。この結果より、一次翻訳産物の、２本のポリペプチ
ド鎖へのin vivo蛋白質分解プロセシングが有効であっ
たことが分かった。
VIII:SQ因子は、用量依存的にヒトトロンビンにより
活性化できた。続いて不活化した。図５では、精製VII
I:SQ因子1 IU当たり0.1Uトロンビンを添加したときの、
得られた活性変化曲線が示されている。１段階血液凝固
法［Mikaelsson,M.ら（1983）Blood 62,1006−1015］
を、反応混合物からのサンプルの迅速なアッセイに使用
した。１分以内に15倍の活性が得られ、これを続いて不
活化した。ドデシル硫酸ナトリウム0.02g/mlを分析用サ
ンプル内の反応を停止するために添加した。ヒトVIII因
子に対するウサギポリクローナル抗体を使用してSDS−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びウエスタンブロッ
ト分析を、反応中の様々な時間間隔で採取したサンプル
で実施した（図６）。電気泳動及びイムノブロッティン
グを、図４の記載通りに実施した。
活性化できた。続いて不活化した。図５では、精製VII
I:SQ因子1 IU当たり0.1Uトロンビンを添加したときの、
得られた活性変化曲線が示されている。１段階血液凝固
法［Mikaelsson,M.ら（1983）Blood 62,1006−1015］
を、反応混合物からのサンプルの迅速なアッセイに使用
した。１分以内に15倍の活性が得られ、これを続いて不
活化した。ドデシル硫酸ナトリウム0.02g/mlを分析用サ
ンプル内の反応を停止するために添加した。ヒトVIII因
子に対するウサギポリクローナル抗体を使用してSDS−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びウエスタンブロッ
ト分析を、反応中の様々な時間間隔で採取したサンプル
で実施した（図６）。電気泳動及びイムノブロッティン
グを、図４の記載通りに実施した。
得られた結果は、トロンビンとのインキュベーション
中のVIII因子ペプチドの分子変化は、血漿VIII因子の分
子変化と同一であったことを示した。このように、90kD
aペプチドはトロンビンにより切断されて、50kDaプラス
40kDaペプチドを形成した。80kDaペプチドが切断して70
kDaペプチドが形成された。VIII:SQ因子サンプル中の17
0kDaに見られた弱いバンドは、トロンビンとのインキュ
ベーションで１分以内に消失し、90kDa−80kDa複合体か
ら形成されたものと明らかに同一のペプチドが形成され
た。トロンビンを使用した研究により、VIII:SQ因子
は、この酵素を用いた相互作用に於いて、血漿VIII因子
として挙動することが分かった。この特徴は、in vivo
での生物学的活性にとって不可欠であると考えられる。
中のVIII因子ペプチドの分子変化は、血漿VIII因子の分
子変化と同一であったことを示した。このように、90kD
aペプチドはトロンビンにより切断されて、50kDaプラス
40kDaペプチドを形成した。80kDaペプチドが切断して70
kDaペプチドが形成された。VIII:SQ因子サンプル中の17
0kDaに見られた弱いバンドは、トロンビンとのインキュ
ベーションで１分以内に消失し、90kDa−80kDa複合体か
ら形成されたものと明らかに同一のペプチドが形成され
た。トロンビンを使用した研究により、VIII:SQ因子
は、この酵素を用いた相互作用に於いて、血漿VIII因子
として挙動することが分かった。この特徴は、in vivo
での生物学的活性にとって不可欠であると考えられる。
VIII:SQ因子とヒトフォン・ビルブラント（von Wille
brand）因子との相互作用を、セファロースCL−6B上の
サイズ排除クロマトグラフィーを使用して研究した。VI
II:SQ因子の10 IUを、30 U精製ヒトフォン・ビルブラン
ト因子と37℃で20分インキュベートした。インキュベー
ション混合物を次いで、セファロースCL−6Bを充填した
カラム上に載せた。VIII因子活性を有する物質を総てフ
ォン・ビルブラントを含むボイド容積中に溶離した。フ
ォン・ビルブラント因子を添加しないVIII:SQ因子をカ
ラム上に載置した時、VIII因子活性を有する物質は、血
漿VIII因子の90kDa−80kDa型も溶離した位置で、内部画
分中のみに溶出した。この結果は、VIII:SQ因子は、良
好なin vivo残存に必要な特性である、フォン・ビルブ
ラント因子に結合する能力［Brinkhous,K.M.ら（1985）
Proc.Natl.Acd.Sci.USA 82,8752−8756］を有している
ことを示している。
brand）因子との相互作用を、セファロースCL−6B上の
サイズ排除クロマトグラフィーを使用して研究した。VI
II:SQ因子の10 IUを、30 U精製ヒトフォン・ビルブラン
ト因子と37℃で20分インキュベートした。インキュベー
ション混合物を次いで、セファロースCL−6Bを充填した
カラム上に載せた。VIII因子活性を有する物質を総てフ
ォン・ビルブラントを含むボイド容積中に溶離した。フ
ォン・ビルブラント因子を添加しないVIII:SQ因子をカ
ラム上に載置した時、VIII因子活性を有する物質は、血
漿VIII因子の90kDa−80kDa型も溶離した位置で、内部画
分中のみに溶出した。この結果は、VIII:SQ因子は、良
好なin vivo残存に必要な特性である、フォン・ビルブ
ラント因子に結合する能力［Brinkhous,K.M.ら（1985）
Proc.Natl.Acd.Sci.USA 82,8752−8756］を有している
ことを示している。
本発明のVIII:SQ因子DNAは、Deutsche Sammlung von
Mikroorganismen und Zellkulturenに1989年12月13日に
寄託され、寄託番号DSM 5693が与えられた。
Mikroorganismen und Zellkulturenに1989年12月13日に
寄託され、寄託番号DSM 5693が与えられた。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ラーシヨン，チエシユテイン スウエーデン国、エス―196・35・クン グセンゲン、オルイエルステイーゲン・ ３ (72)発明者 リンド・ペーテル スウエーデン国、エス―752・27・ウプ サラ、リングガータン・47・セー (72)発明者 サンドベルイ，ヘレナ・インガ スウエーデン国、エス―161・37・ブロ ンマ、イゲルコツツベーゲン・21 (72)発明者 スピーラ，ヤツク スウエーデン国、エス―171・35・スト ツクホルム、トツトベーゲン・６ (72)発明者 スユドウ―ベツクマン，モーナ スウエーデン国、エス―117・24・スト ツクホルム、タバストガータン・25 (56)参考文献 特表 63−503275（ＪＰ，Ａ)
Claims (5)
- 【請求項１】本質的に分子量90kDa及び80kDaの、それぞ
れアミノ酸１〜740及びアミノ酸1649〜2332からなる生
物学的に活性な組換えヒトVIII因子誘電体をコードする
DNAであって、前記DNAは、前記誘導体を発現させること
ができ、ヒトVIII因子の90kDa鎖をコードする第１のDNA
セグメント及びヒトVIII因子の80kDa鎖をコードする第
２のDNAセグメントを含み、前記セグメントは、ヒトVII
I因子のＢドメインのＣ端末由来の12アミノ酸残基とヒ
トVIII因子のＢドメインのＮ末端由来の２アミノ酸残基
からなるリンカーペプチドをコードするリンカーDNAセ
グメントを介して相互に結合されている、ことを特徴と
する前記DNA。 - 【請求項２】請求項１に記載のDNA、プロモーター及び
ポリアデニル化シグナル配列を含む転写ユニットを含む
組換え発現ベクター。 - 【請求項３】請求項２に記載の組換え発現ベクターで形
質転換した動物起源の宿主細胞。 - 【請求項４】請求項２に記載の組換え発現ベクターで形
質転換した動物細胞系を栄養培地中で培養して、各々金
属イオン橋かけで互いに結合した分子量90kDa及び80kDa
の２本のポリペプチドから構成されるヒトVIII因子誘導
体を発現且つ分泌させ、次いで前記誘導体を培養培地か
ら回収することを特徴とする、請求項１に記載のDNAに
より発現された生物学的に活性な組換えヒトVIII因子誘
導体の製造法。 - 【請求項５】ヒトVIII因子の90kDaドメインと、これに
ヒトVIII因子のＢドメインのＣ末端由来の12アミノ酸残
基と該ＢドメインのＮ末端由来の２アミノ酸残基からな
るリンカーペプチドを介して結合した80kDaドメインと
を含む、請求項１記載のDNAによってコードされるヒトV
III因子誘導体。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SE8904239-4 | 1989-12-15 | ||
| SE8904239A SE465222C5 (sv) | 1989-12-15 | 1989-12-15 | Ett rekombinant, humant faktor VIII-derivat och förfarande för dess framställning |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05502161A JPH05502161A (ja) | 1993-04-22 |
| JP2644084B2 true JP2644084B2 (ja) | 1997-08-25 |
Family
ID=20377785
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3501715A Expired - Lifetime JP2644084B2 (ja) | 1989-12-15 | 1990-12-06 | 組換えヒト▲ｖｉｉｉ▼因子誘導体 |
Country Status (21)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (3) | EP1293513A3 (ja) |
| JP (1) | JP2644084B2 (ja) |
| AT (2) | ATE232213T1 (ja) |
| AU (1) | AU645539B2 (ja) |
| BR (1) | BR9007921A (ja) |
| CA (1) | CA2071875C (ja) |
| DE (3) | DE19975066I2 (ja) |
| DK (2) | DK0786474T3 (ja) |
| ES (2) | ES2119769T5 (ja) |
| FI (1) | FI104260B1 (ja) |
| HK (2) | HK1019449A1 (ja) |
| HU (1) | HU211504A9 (ja) |
| IE (1) | IE904510A1 (ja) |
| LU (1) | LU90457I2 (ja) |
| NL (1) | NL990035I2 (ja) |
| NO (1) | NO309041B1 (ja) |
| NZ (1) | NZ236276A (ja) |
| PT (1) | PT96208B (ja) |
| SE (1) | SE465222C5 (ja) |
| SG (1) | SG66753A1 (ja) |
| WO (1) | WO1991009122A1 (ja) |
Families Citing this family (136)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5595886A (en) | 1986-01-27 | 1997-01-21 | Chiron Corporation | Protein complexes having Factor VIII:C activity and production thereof |
| US6060447A (en) * | 1987-05-19 | 2000-05-09 | Chiron Corporation | Protein complexes having Factor VIII:C activity and production thereof |
| IE69026B1 (en) | 1987-06-12 | 1996-08-07 | Immuno Ag | Novel proteins with factor VIII activity process for their preparation using genetically-engineered cells and pharmaceutical compositions containing them |
| US6346513B1 (en) | 1987-06-12 | 2002-02-12 | Baxter Trading Gmbh | Proteins with factor VIII activity: process for their preparation using genetically-engineered cells and pharmaceutical compositions containing them |
| US5629287A (en) * | 1991-01-18 | 1997-05-13 | University College London | Depot formulations |
| US5610148A (en) * | 1991-01-18 | 1997-03-11 | University College London | Macroscopically oriented cell adhesion protein for wound treatment |
| SE468050C (sv) * | 1991-03-15 | 1998-02-11 | Pharmacia & Upjohn Ab | Rekombinant derivat av human faktor VIII |
| US5364771A (en) * | 1992-04-07 | 1994-11-15 | Emory University | Hybrid human/porcine factor VIII |
| US5888974A (en) * | 1992-04-07 | 1999-03-30 | Emory University | Hybrid human/animal factor VIII |
| US5663060A (en) * | 1992-04-07 | 1997-09-02 | Emory University | Hybrid human/animal factor VIII |
| US5744446A (en) * | 1992-04-07 | 1998-04-28 | Emory University | Hybrid human/animal factor VIII |
| DK53792D0 (da) * | 1992-04-24 | 1992-04-24 | Novo Nordisk As | Fremgangsmaade til fremstilling af proteiner |
| DE69333974T2 (de) * | 1992-10-02 | 2006-08-03 | Genetics Institute, LLC, Cambridge | Zusammensetzung, welche den Koagulationsfaktor VIII beinhaltet; Verfahren zu deren Herstellung und die Benutzung eines Oberflächenaktiven Stoffes als Stabilisator |
| SE9300509D0 (sv) * | 1993-02-16 | 1993-02-16 | Kabi Pharmacia Ab | Peg treatment |
| SE9301581D0 (sv) * | 1993-05-07 | 1993-05-07 | Kabi Pharmacia Ab | Protein formulation |
| SE504074C2 (sv) * | 1993-07-05 | 1996-11-04 | Pharmacia Ab | Proteinberedning för subkutan, intramuskulär eller intradermal administrering |
| SE9303601D0 (sv) * | 1993-11-01 | 1993-11-01 | Kabi Pharmacia Ab | Improved cell cultivation method and medium |
| US6288030B1 (en) | 1993-12-22 | 2001-09-11 | Amgen Inc. | Stem cell factor formulations and methods |
| IL113010A (en) * | 1994-03-31 | 1999-10-28 | Pharmacia & Upjohn Ab | Pharmaceutical formulation comprising factor viii with an activity of at least 500iu/ml and an enhancer for improved subcutaneous intramuscular or intradermal administration |
| SE9403915D0 (sv) * | 1994-11-14 | 1994-11-14 | Annelie Almstedt | Process A |
| SE503424C2 (sv) * | 1994-11-14 | 1996-06-10 | Pharmacia Ab | Process för rening av rekombinant koagulationsfaktor VIII |
| US6818439B1 (en) | 1994-12-30 | 2004-11-16 | Chiron Corporation | Methods for administration of recombinant gene delivery vehicles for treatment of hemophilia and other disorders |
| SE9501189D0 (sv) * | 1995-03-31 | 1995-03-31 | Pharmacia Ab | Protein formulation |
| WO1997003193A1 (en) * | 1995-07-11 | 1997-01-30 | Chiron Corporation | Novel factor viii:c polypeptide analogs with altered metal-binding properties |
| SE9503380D0 (sv) * | 1995-09-29 | 1995-09-29 | Pharmacia Ab | Protein derivatives |
| US5851800A (en) * | 1996-05-14 | 1998-12-22 | Pharmacia & Upjohn Ab | Process for producing a protein |
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