HU211504A9 - Recombinant human factor viii derivatives - Google Patents

Recombinant human factor viii derivatives Download PDF

Info

Publication number
HU211504A9
HU211504A9 HU95P/P00489P HU9500489P HU211504A9 HU 211504 A9 HU211504 A9 HU 211504A9 HU 9500489 P HU9500489 P HU 9500489P HU 211504 A9 HU211504 A9 HU 211504A9
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
factor
viii
human
domain
kda
Prior art date
Application number
HU95P/P00489P
Other languages
English (en)
Inventor
Jack Spira
Mona Sydow-Backman
Anelli B Almstedt
Eva Maria Hellstroem
Kerstin Larsson
Peter Lind
Helena Inga Sandberg
Original Assignee
Kabi Pharmacia Ab
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=20377785&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=HU211504(A9) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Kabi Pharmacia Ab filed Critical Kabi Pharmacia Ab
Publication of HU211504A9 publication Critical patent/HU211504A9/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • General Preparation And Processing Of Foods (AREA)
  • Confectionery (AREA)

Description

A találmány tárgyát biológiailag aktív rekombináns humán VIII. faktor származékokat kódoló DNS-szekvenciák. a DNS-szekvenciákat hordozó rekombináns expressziós vektorok, a rekombináns expressziós vektorokkal transzformált gazdasejtek valamint a rekombináns humán Vili. faktor származékok előállítására szolgáló eljárások képezik. A találmány tárgyát képezik továbbá az említett humán VIII. faktor származékok. melyek két fémionhíddal összekötött polipeptidet tartalmaznak
A TALÁLMÁNY HÁTTERE
A klasszikus hemofília vagy A-hemofília a legelterjedtebb véralvadással összefüggő öröklődő rendellenesség. A betegség a VIII. véralvadási faktor X-kromoszómához kapcsoltan öröklődő rendellenességének a következménye. A betegség szinte kizárólag férfiakat érint. 10 000 férfi közül 1 és 2 közötti előfordulási gyakorisággal. Az X-kromoszómához kapcsolt rendellenességet olyan nők adják tovább, akik maguk nem hemofíliásak. Az X-kromoszőmán található mutáció jellegétől függően a VIII, faktor vagy működésképtelen. vagy hiányzik, ami retardált véralvadáshoz vezet. Az A-hemofília klinikailag abnormális vérzést hajlandóságban nyilvánul meg. és a VIII. faktor koncentrátumokkal végzett kezelés bevezetése előtt a súlyos A-hemofíliás betegek átlagéletkora nem érte el a 20 évet. A vérplazmából előállított VIII. faktor koncentrátumok alkalmazásának bevezetése jelentősen javította a hemofíliás betegek helyzetét. A betegek átlagos életkora jelentősen megnőtt, és legtöbbjüknek lehetősége nyílt löbhé-kevésbé normális életvitel folytatására. Mindazáltal mutatkoztak bizonyos problémák a VIII. faktor koneentrátumokkal és alkalmazásukkal. A legsúlyosabb ilyen probléma a vírusok átvitele. Mindez idáig az AIDS-et. hepatitis-B-t és a non-A-non-B hepatitist okozó vírusok súlyosan veszélyeztetik a hemofíliás populációt. Legújabban sok kereskedelmi forgalomban lévő Vili. faktor koncentrátum előállítási eljárásába különböző vírus-inakiiválási lépéseket vezettek be. Megjelentek a piacon új, nagy mértékben tisztított Vili. faktor koncentrátumok is. melyektől azt várják, hogy a régebbi VIII. faktor koncentrátumokhoz képest vírusátvitel szempontjából sokkal biztonságosabbak lesznek. Mindazáltal lehetetlen garanciát adni arra nézve. hogy a készítmény valóban teljesen vírusmentes. Továbbá, a VIII. faktor koncentrátumok meglehetősen drágák, mivel alapanyaguk, a vérplazma a korlátozott hozzáférhetőség miatt drága.
A rekombináns Vili. faktor alkalmazása nagy valószínűséggel megoldja a vérplazma-eredetű VIII. faktor koncentrátumok alkalmazásával kapcsolatos problémák jelentős részét. Mivel az A-hemofília kezelésében nyilvánvaló az igény a rekombináns VIII. faktor készítményekre, számos kutatócsoport dolgozik ilyen készítmények előállításán Mindazáltal a rekombináns Vili. faktor előállítása bizonyos nehézségekbe ütközik. Az egyik legnagyobb gondot a rekombináns Vili. faktor megfelelően magas hozammal történő előállítása jelenti. Mindeddig a fejlesztő munka legnagyobb részét a teljes hosszúságú VIII. faktor molekulát kódoló cDNS gén alkalmazásával végezték.
A találmány tárgyát képezi egy olyan deléciós VIII. faktor cDNS amely egy olyan rekombináns VIII. faktor származékot kódol, amely molekulatömeg és egyéb biokémiai sajátságok tekintetében megegyezik egy korábban leírt vérplazmában előforduló VHI. faktor formával, amely jelentős mennyiségben megtalálható a kereskedelmi forgalomban lévő koncentrátumokban [Andersson, L. O. és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 2979 (1986)]. Állati sejttenyészetben ennek a molekulának az expressziós szintje lényegesen magasabbnak bizonyult annál, mint amikor a teljes hosszúságú VIII. faktor cDNS-t alkalmazták VIII. faktor kifejezésére. Az új, deléciós VIII. faktor cDNS valószínűleg elég magas rekombináns VHI. faktor hozamot képes biztosítani ahhoz, hogy rekombináns VIH. faktor tartalmú gyógyászati készítmények előállítását célzó ipari eljárásban alkalmazni lehessen.
A LEÍRÁSBAN HASZNÁL! DEFINÍCIÓK
A leírás további részeiben a 2332 aminosavat tartalmazó egyláncú, teljes hosszúságú VHI. faktor különböző strukturális doménjeinek alkalmazott nevezéktana hasonló lesz a Vehar, G. A. és mtasi. által definiált nómenklatúrához (Natúré 312, 337 (1984)). Ennek megfelelően az Al- és A2-domének a VIII. faktor körülbelül 200 kDa-tól (1-1648. aminosavak) körülbelül 90 kDa-ig (1-740 aminosavak) terjedő méretű nehéz láncában találhatók. Az A3-, Cl- és C2-domének a Vili. faktor körülbelül 80 kDa (1649-2332. aminosavak) méretű könnyű láncában találhatók. A B-domén a teljes hosszúságú egyláncú VIH. faktor erősen glikozilált középső régiójából áll, vagy pedig a VIH. faktor 200 kDa-os formájú nehéz láncának C-terminális régiójából (741-1648. aminosavak). A VIH. faktor deléciós származék egy vagy több polipeptidláncot jelent, amelynek VIII:C faktor aktivitása van, és amelyet a teljes hosszúságú VIII. faktor polipeptidből egy vagy több aminosav deléciójával származtathatunk. A VIII:QD faktor kifejezés olyan teljes hosszúságú VIII. faktorból származtatott polipeptidláncot jelöl, melyből a 745-1562. aminosavak hiányoznak. A VIILRE faktor kifejezés olyan teljes hosszúságú VIII. faktorból származtatott polipeptidláncot jelöl, melyből a 7411648. aminosavak hiányoznak. A VIII:SQ faktor kifejezés olyan teljes hosszúságú Vili. faktorból származtatott polipeptidláncot jelöl, melyből a 743-1636. aminosavak hiányoznak.
A TECHNIKA ÁLLÁSA
Kimutatták, hogy a frissen levett, proteáz inhibitorok jelenlétében készített vérplazmában a két, egyenként 200 és 80 kDa molekulatömegú peptidláncból álló VIH faktor molekulatömege 280 kDa (Andersson, L. O. és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 2979 (1986)). A peptidláncokat fémionhidak tartják össze. A kereskedelmi forgalomban lévő koncentrátumokból tisztított VIII. faktor preparátumokban találtak proteolitikusan többé-kevésbé degradálódott, aktív VIII. fak2
HU 211 504 A9 tor fragmenseket [Andersson és mtsai. (1986); Andersson és mtsai.; EP 0197901 (1985)]. A Vili. faktor 260-170 kDa molekulatömegű fragmentált formái a 80 kDa molekulatömegű könnyű lánccal kombinálódott 180-90 kDa molekulatömegű nehéz lánc variánsokból (valamennyi variáns N-terminálisa azonos volt) álltak. A nehéz láncok N-terminális régiója azonosnak bizonyult az egyláncú VIII. faktort kódoló VIII. faktor cDNS nukleotidszekvenciája alapján várttal [Wood, W. 1. és mtsai.: Natúré 312, 330 (1984); Vehar, G. A. és mtsai.: Natúré 312, 337 (1984)].
Az egy 90 kDa és egy 80 kDa molekulatömegű láncot tartalmazó, 170 kDa molekulatömegű legkisebb aktív fragmens ugyanolyan mértékben aktiválható trombinnal, mint a nagyobb molekulatömegű formák. Ez a fragmens éppen ezért egy aktiválatlan VIII. faktor származék. Hemofíliás kutyákon végzett vizsgálatokkal azt is kimutatták, hogy ennek a fragmensnek teljes in vivő biológiai aktivitása van [Brinkhous, K. M. és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 8752 (1985)]. Ily módon a fragmens hemosztatikus hatékonysága azonosnak bizonyult a nagy molekulatömegű Vili. faktor formákéval. Továbbá, arra is indikációt találtak, hogy a 170 kDa molekulatömegű forma in vivő túlélési ideje 50%-kal hosszabb mint a nagyobb molekulatömegű formáké.
Az a tény. hogy a Vili. faktor polipeptidlánc Arg739 és Glu-1649 közötti erősen glikozilált középső része valószínűleg nem szükséges a teljes biológiailag aktív meglétéhez, arra indított néhány kutatót, hogy megpróbáljanak olyan rekombináns Vili. faktor származékokat előállítani, melyekből ez a régió hiányzik. Ezt úgy érték el. hogy a cDNS-ből részben vagy egészében kivágták a VIII. faktor erősen glikozilált középső régióját kódoló részletet.
J. J. Toole és mtsai. például beszámoltak olyan Vili. faktor származékok kialakításáról és expressziójáról. melyekből hiányoznak a 982-1562. vagy a 7601639. aminosavak [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 5939 (1986,1], D. L. Eaton és mtsai. olyan Vili. faktor származék kialakításáról és expressziójáról számoltak be, amelyből a 797-1562. aminosavak hiányoztak (Biochemistry 25, 8343 (1986)). R. J. Kaufman egy olyan VIII. faktor származék expressziójáról számolt be, melyből a 741-1646. aminosavak hiányoztak (WO 87/04187 publikációs számú PCT bejelentés). N. Sarver és mtsai. olyan VIII. faktor származék kialakításáról és expressziójáról számoltak be, amelyből a 7471560. aminosavak hiányoztak [DNA 6, 553 (1987)]. M. Pasek olyan VIII, faktor származékok kialakításáról és expressziójáról számolt be, amelyekből a 745-1562. vagy a 741-1648. aminosavak hiányoztak (WO 88/00831 publikációs számú PCT bejelentés). K. D. Langner olyan Vili. faktor származékok kialakításáról és expressziójáról számolt be, melyekből a 816-1598. vagy a 741-1689. aminosavak hiányoztak [Behring Inst. Mitt. 82, 16 (1988), EP 295 597], P. Meulien és mtsai, olyan Vili, faktor származékok kialakításáról és expressziójáról számoltak be. melyekből a 868-1562. vagy a 771-1666. aminosavak hiányoztak [Protein Engineering 2 (4), 301 (1988), EP 0 303 540 Al], Emlős sejtekben az ezeknek a deléciós VIII. faktor származékoknak megfelelő cDNS-ekel a teljes hosszúságú VIII. faktor cDNS-nél tipikusan 10-szer nagyobb hozammal lehetett expresszáltatni.
Továbbá, arra is történtek kísérletek, hogy a 90 kDa és 80 kDa molekulatömegű láncokat egyazon sejtben két különböző cDNSszármazkről, külön-külön fejezzék ki (Bürke, R. L. és mtsai.: J. Bioi. Chem. 267, 12574 (1986), Pavirani, A. és mtsai,: Biochem. Biophys. Rés. Comm. 145, 234 (1987)). Mindazáltal, az ilyen rendszerekben VIILC faktor aktivitás vonatkozásában az in vivő összeszerelődés korlátozott hatékonyságúnak látszik.
A TALÁLMÁNY SZERINTI MEGOLDÁS KIFEJTÉSE
A találmány tárgyát eljárások képezik olyan egy vagy több polipeptidláncból álló fehérjék előállítására, melyeknek VIII:C faktor aktivitásuk van. Közelebbről, a találmány tárgya egy olyan, teljes hosszúságú VIII. faktor cDNS-ből származó módosított cDNS-szekvencia amely állati sejtekben történő expresszió során olyan VIII:C faktor aktivitással bíró fehérje nagy mértékű termelődését teszi lehetővé, amely lényegében két, egyenként 90 és 80 kDa molekulatömegű polipeptidláncból áll.
Az elmondottak értelmében a találmány tárgyát képezi egy biológiailag aktív rekombináns humán VIII. faktor származékot kódoló DNS-szekvencia, amely tartalmaz egy első DNS-régiól, ami a humán Vili. faktor 90 kDa molekulatömegű láncát kódolja és egy második DNS-régiót, ami a humán VIII. faktor 80 kDa molekulatömegű láncát kódolja, amely régiókat egy olyan kapcsoló DNS-régió kapcsol össze, amely a humán VIII. faktor B-doménjének 4-től körülbelül 100 aminosavig terjedő hosszúságú részletét kódolja, amely aminosavak közül legalább 4 az említett dómén C-terminálisáról származik.
Az említett kapcsoló szekvencia előnyösen legalább 4 humán VIII. faktor B-doménjének C-terminálisáról származó aminosavat kódol. A találmány egyik előnyös megvalósítási módja szerint az említett kapcsolórégió a humán VIII. faktor B-doménjéből származó körülbelül legfeljebb 20 aminosavat kódol.
A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint az említett kapcsoló szekvencia adott esetben a humán VIII. faktor B doménjéből származó körülbelül legalább 7 aminosavat kódol, legalább 4 aminosavat, amely az említett dómén C-terminálisáról származik és legalább 2 aminosavat, amely a dómén N-terminálisáról származik.
A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint a DNS szekvencia olyan kapcsoló szekvenciát tartalmaz, amely 12 humán VIII. faktor B-doménjének C-terminálisáról származó aminosavat és 2 humán Vili. faktor B-doménjének N-terminálisáról származó aminosavat kódol.
A találmány tárgyát képezik továbbá olyan rekombináns expressziős vektorok is. melyek olyan transz3
HU 211 504 A9 kripciós egységet tartalmaznak melyek magukba foglalják a fent leírt DNS-szekvenciákat, és promótert, valamint poliadenilációs szignálszekvenciát is tartalmaznak.
A találmány tárgyát képezik a fent definiált expressziós vektorokkal transzformált állati eredetű gazdasejtek is.
Az elmondottakon túl a találmány tárgyát képezi egy eljárás is, a fent leírt biológiailag aktív rekombináns humán VIII, faktor származékok előállítására, amely eljárás a következő lépéseket tartalmazza: a fent definiált expressziós vektorral transzformált állati sejtvonalat olyan táptalajban tenyésztünk, amely lehetővé teszi a fémionkötéssel összekapcsolt, egyenként 90 és 80 kDa molekulatömegű doménekből álló humán Vili. faktor származék expresszióját és kiválasztódását, majd a termelődött származékot kinyerjük a táptalajból.
Végül, a találmány tárgyát képezi humán VIII. faktor származék amelyekben a humán VIII. faktor egyenként 90 és 80 kDa molekulatömegű doménjeit, adott esetben a kapcsoló pepiiden vagy annak egy részletén keresztül, fémionkötés kapcsolja össze.
Ahhoz, hogy a fenti két polipeptidláncból VIII:C faktor aktivitással bíró fehérjét kapjunk, az in vivő transzlációs folyamat során keletkezett egyetlen polipeptidláncnak el ke!) hasadnia, vagy a termelő sejtben a poszttranszláeiós módosítások során, vagy in vitro proteolitikus hasítás útján, vagy mindkét módon. Mivel a humán vérplazmából olyan VIII. faktor aktivitással bíró fehérjét lehet izolálni, amely két, egyenként 200 és 80 kDa molekulatömegű polipeptidláncból áll. az elmondottak értelmében feltételezhető, hogy az egyláneú. teljes hosszúságú elsődleges VIII. faktor transzlációs terméken találhatók a processzáló enzimek számára megfelelő hasítóhelyek. Nagyon valószínű, hogy található egy ilyen fontos in vivő processziós hasítóhely az elsődleges transzlációs termék C-terminális végénél, az Arg-1648-as pozícióban. Az elsődleges transzlációs termék érése során az Arg-1648-as pozícióban történő hasítás eredményeként két egyenként 200 és 80 kDa molekulatömegű polipeptidláncból álló Vili. faktor fehérje keletkezik. Mivel az Arg-1648 aminosav feltehetőleg két strukturális dómén határán található a VIII. faktor molekulában, feltehető, hogy a processzáló enzimek számára térben hozzáférhető célpontot képez. Feltételezhető, hogy van egy másik processziós hely az Arg-740 aminosavnál is, amely in vitro lehetővé teszi a 200 kDa molekulatömegű lánc 90 kDa molekulatömegű lánccá való átalakulását, és így a két, egyenként 90 és 80 kDa molekulatömegű polipeptidláncból álló. kereskedelmi forgalomban lévő VIII. faktor koncentrátumokban is megtalálható Vili. faktor származék keletkezik Felismertük, hogy ahhoz hogy akár in vivő. akár in vitro. akár mindkét módon a két, egyenként 90 és 80 kDa molekulatömegű polipeptidláncból álló kétláncú fehérjévé processzálható deléciós Vili. faktor származékot állíthassunk elő. az Arg-740 és az Arg-1648 körüli aminosav-szekvenciarészleteket érintetlenül kell hagyni, hogy megőrizzük a korrekt hasítások strukturális feltételeit. Részletesebben kifejtve, ha például a teljes hosszúságú Vili. faktor polipeptid 743-1636. aminosavait kiejtjük, olyan új polipeptidláncot kapunk, amelyben az Arg-740-et és az Arg-1648-at 14 aminosav kapcsolja össze. E 14 aminosav közül az 5 N-terminális aminosav szekvenciája pontosan megfelel a teljes hosszúságú Vili. faktorban az Arg-740-et követő 5 aminosav szekvenciájának. Hasonlóképpen, a 14 aminosav közül a 12 C-terminális aminosav szekvenciája pontosan megfelel a teljes hosszúságú VIÜ. faktorban a Glu-1649-et megelőző 12 aminosav szekvenciájának, és ily módon 3 aminosavnyi átfedés keletkezik a B-domén N- és C-terminális régiói között.
A fentiek szerinti két polipeptidláncból álló VIII:SQ faktor fehérje nagy hozammal történő előállítása céljából a megfelelő deléciós VIII. faktor származékot kódoló cDNS-t - szakember számára ismert módszerek alkalmazásával - a megfelelő szabályozó elemekkel egy E. coliban fenntartható expressziós vektorban hatékony transzkripciós egységgé építjük össze. A megfelelő hatékony transzkripciós szabályozó elemeket eukarióta sejtek kromoszómális DNS-éből nyerhetjük. Alkalmazhatunk például erősen, konstitutívan átíródó génekből, előnyösen metallotionein-, béta-aktinvagy GRP74B-génekből származó promóter-enhanszer kombinációkat. Alkalmazhatunk olyan vírusokból származó hatékony transzkripciós szabályozó elemeket is, melyek természetes gazdasejtjei eukarióta sejtek. Alkalmazhatunk például állati sejteket fertőző vírusokból származó promóter-enhanszer kombinációkat, előnyösen a Rousszarkómavírus hosszú terminális ismétlődésénél és az 5V40-majomvírusban található enhanszert és promótert. az adenovírus fő késői promólerét és a humán citomegalovírus közvetlen korai promólerét. Ahhoz, hogy a VIII:SQ faktor cDNS-ről stabilan elegendően nagy mennyiségű mRNS íródjon át szükséges, hogy a transzkripciós egység a 3’-végén tartalmazzon egy transzkripciós terminációs - poliadenilációs szekvenciát, előnyösen az SV40-vírus korai transzkripciós régiójából vagy a nyúl-béta-globin-génből származó ilyen szekvenciákat alkalmazzuk.
A hatékony transzkripciós egységbe épített VIII:SQ faktor cDNS-t azután megfelelő gazdaszervezetbe juttatjuk a VIII:SQ faktor fehérje kifejezése céljából. Előnyösen a gazdaszervezet valamely gerinces eredetű állati sejtvonal, amely képes biztosítani a megfelelő foldingot, diszulfidhídképződést, szekréciót és a többi szükséges poszttranszlációs módosítást. A szükséges poszttranszlációs módosítások példái: az aszparaginoldallánc glikozilációja, a tirozinoldallánc O-szulfatálása, valamint a naszcens polipeptidlánc proteolitikus processziója. amely elengedhetetlen az egyenként 90 és 80 kDa molekulatömegű polipeptidláncokból álló kétláncú Vili. faktor fehérje kialakulásához. Alkalmazható sejtvonalak példái: majom-COS-sejtek, egér-Lsejtek, egér-C127-sejtek, hörcsög-BHK-21- sejtek, és előnyösen CHO-sejtek.
A Vili. faktor cDNS-t magába foglaló transzkripciós egységet több különböző módszer alkalmazásával bejuttathatjuk valamely állati eredetű sejtvonalba. Az
HU 211 504 A9 egyik ilyen lehetőség rekombinánsok előállítása a fent leírt transzkripciós egység és különböző állati vírus eredetű vektorok felhasználásával. Alkalmazható vektorok példái: vakcíniavírus-, SV40-vírus-, és előnyösen bovin papillomavírus-alapú vektorok.
A VIILSQ faktor cDNS-t tartalmazó transzkripciós egységgel együtt más rekombináns gént is bejuttathatunk az állati eredetű sejtvonalba, amely a sejtekben domináns szelekciós markerként funkcionálhat, ami megkönnyíti azon specifikus sejtklónok izolálását, melyek a rekombináns DNS-t beintegrálták a genomjukba Alkalmazható domináns szelekciós marker gének példái: Tn5 aminoglikozid foszfotranszferáz gén (Geneticin, G418 rezisztenciát okoz) és puromicin acetiltranszferáz gén (puromicin rezisztenciát okoz). A szelekciós marker gént tartalmazó transzkripciós egység elhelyezkedhet a VIILSQ faktort tartalmazó transzkripciós egységet hordozó vektoron, de kódolhatja más vektor is. melyet az említett vektorral párhuzamosan juttatunk a gazdasejtbe, és vele párhuzamosan integrálódik a gazdasejt genomjába is, aminek gyakran a két transzkripciós egység közötti szoros fizikai kapcsoltság a következménye.
A VIILSQ faktor cDNS-sel együtt alkalmazható, más típusú domináns szelekciós markerek különböző dihidrofolát reduktázt ídhfr-t) kódoló transzkripciós egységeken alapulnak. Ha az ilyen típusú géneket olyan sejtekbe - előnyösen CHO-sejtekbe (DUKX-B
11. DG-44) -juttatjuk, melyekből hiányzik az endogén dhfr-aktivitás, a kifejeződött markergén alkalmassá teszi a sejteket olyan táptalajon történő növekedésre, amelyben nincsenek nukleozidok. Egy ilyen táptalaj például a Ham-féle hipoxantin-, timidin- és glicinmentes FI2-táptalaj. Ezeket a dhfr-géneket alkalmazhatjuk a VIII.SQ faktor transzkripciós egységekkel együtt a fent megadott típusú CHO-sejtekben, akár egyazon vektoron, akár két különböző vektoron kódolva, és így olyan dhfr-pozitív sejtvonalakat kaphatunk, melyek rekombináns VIILSQ faktor fehérjéi termelnek.
Amennyiben a fenti sejtvonalakat a citotoxikus dhfr-inhibitor metotrexát jelenlétében növesztjük, új. metotrexát-rezisztens sejtvonalak keletkeznek. Ezek a sejlvonalak lehetséges hogy nagyobb mennyiségű VIILSQ faktor fehérjét fognak termelni, mint elődeik, a kapcsolt dhfr és VIILSQ faktor transzkripciós egységek amplifikálódása következtében. Ha ezeket a sejtvonalakat egyre növekvő koncentrációjú metotrexát (1-10 000 nmől/1) jelenlétében tenyésztjük, olyan új sejtvonalakat kaphatunk, melyek rendkívül nagy mennyiségű VIILSQ faktor fehérjét termelnek.
A fenti VIILSQ faktor fehérjét termelő sejtvonalakat nagy mennyiségben is lehet tenyészteni, akár szuszpenziós tenyészetben, akár különböző szilárd hordozókon. Alkalmas szilárd hordozók példái: dextránvagy kollagén-mátrixon alapuló mikrohordozók és belül üreges szálakból vagy különböző kerámiákból készített szilárd hordozók. Ha a fenti sejtvonalakat szuszpenzióban vagy mikrohordozókon tenyésztjük, alkalmazhatunk mind batch. mind perfúziós tenyésztési technikát, az utóbbi esetén a tenyészeten hosszú időintervallumokon keresztül folyamatosan cseréljük a sejteken a kondicionált táptalajt. Ily módon a találmány szerinti fenti sejtvonalak rendkívül alkalmasak rekombináns VIILSQ faktor előállítását célzó ipari eljárás kifejlesztésére, amely faktor a humán vérplazmából izolálható autentikus, két polipeptidláncú (90 kDa és 80 kDa) VIII. faktorral azonos szerkezetű.
A táptalajban felszaporodó rekombináns VIILSQ faktor fehérjét számos biokémiai eljárás alkalmazásával töményíthetjük és tisztíthatjuk, mint például a VIILSQ faktor és a kondicionált táptalaj egyéb komponensei között meglévő méretbeli, töltésbeli, oldhatóságbeli, hidrofóbicitásbeli, sjjecifikus affinitásbeli, stb. különbségeket kihasználó módszerek alkalmazásával.
Az ilyen tisztítási eljárások egy példája a rekombináns VIILSQ faktor szilárd hordozóhoz immobilizált monoklonális ellenanyaghoz történő kötése. A kötés megbontása után a VIILSQ faktor fehérje tovább tisztítható különböző, a fent felsorolt sajátságbeli különbségek valamelyikén alapuló kromatográfiás eljárások alkalmazásával.
A találmány szerinti VIII. faktor aktivitású fehérjéből terápiás felhasználásra alkalmas gyógyászati készítményeket állíthatunk elő. Az előállított rekombináns VIII.SQ faktor fehérjét feloldhatjuk hagyományos fiziológiásán kompatíbilis vizes pufferoldatokban, melyekhez adott esetben gyógyászatilag alkalmazott segédanyagokat adhatunk és így gyógyászati készítményeket kapunk.
A találmány szerinti megoldást a továbbiakban a bemutatott, nem korlátozó jellegű példák segítségével kívánjuk részletesebben megvilágítani. A találmány előnyős megvalósítási módjait az alábbiakban ismertetett, csatolt ábrákkal összefüggésben fogjuk bemutatni.
Az 1. ábrán sematikusan szemléltetjük a teljes hoszszúságú VIII. faktor és a VIILSQ faktor szerkezete közötti összefüggést. Bemutatjuk a 90 kDa lánc C-terminálisa és a 80 kDa lánc N-tenninálisa közötti régió elsődleges szerkezetét. A függőleges nyíl azt a peptidkötést jelzi, amelynek elhasadásával keletkezik a kétláncú termék.
A 2. ábrán a VIILSQ faktor cDNS-t a humán citomegalovírus promóter transzkripciós szabályozása alatt tartalmazó pKGE436-plazmid szerkezetét mutatjuk be.
A 3. ábrán az egér dihidrofolát reduktáz cDNS-t az egéremlő-tumor vírus hosszú terminális ismétlődés promóter transzkripciós szabályozása alatt tartalmazó pKGE327-plazmid szerkezetét mutatjuk be.
A 4. ábrán egy immunblot-kísérlet eredményét láthatjuk, ahol a rekombináns VIILSQ faktort blotoltuk nátrium-dodecil-szulfát jelenlétében végzett poliakrilamid-gélelektroforézis után.
Az 5. ábrán egy diagramot láthatunk, amely a rekombináns VIILSQ faktor VIII. faktor aktivitásának változását mutatja, trombinnal történő inkubálás után.
A 6. ábrán a rekombináns VIILSQ faktor SDSPAGE- és immunblotmintázatában humán alfa-trombinnal történő inkubálás hatására bekövetkező változást láthatjuk.
1. PÉLDA
Olyan delcciós Vili. faktor cDNS-t állítottunk elő, melyből hiányzott csaknem a teljes B-domén, de tartal5
HU 211 504 A9 mazta a B-domén azon aminoterminális és karboxi-terminális szekvenciarészleteit, melyek az elsődleges transzlációs tennék kél polipeptidlánccá történő in vivő hasításához esszenciálisak.
Λ Vili. faktor cDNS mutagenezise
Egy VÜI:QD faktor deléciós származék cDNS-éből (Pasek, M. W088/00831 számú PCT közzétételi irat) származó, a Leu-587 és Ala-1702 közötti aminosavszekvenciát kódoló 894 bázispáros KpnI-PstI restrikciós fragmenst M13mp 19-bakteriofág-vektorba építettünk [Yanisch-Perron, C. és mtsai.: Gene 33, 103 (1985)], a szakember számára ismert eljárások alkalmazásával. A kapott rekombináns fágklónt használtuk az oligonukleotiddal vezérelt helyspecifikus mutagenezis [Nakamye, K. és mtsa.: Nucleic Acids Rés. 14, 9679 (1986)) templátjául szolgáló egyszálú DNS előállítására. A tisztított egyszálú vektor-DNS 10 pg-jához 8 pmól alább megadott szekvenciájú, 5’-foszforilált oligonukleotidot hibridizáltunk:
5- -GCC ATTG A ACC AAG AAGCTTCTCTC AG A ATCCACCAGTCTTGAAACGC-3 ’.
A cirkuláris DNS másik szálát a keletkezeti lempláton szintetizáltattuk meg, mind a négy különböző dezoxinukleotid. aS-dCTP, 12 egység DNS polimeráz-I Klenow-fragmens és 12 egység T4 DNS ligáz hozzáadásával. A reakcióelegyet egy éjszakán át tartó 16 °C-os inkubálás után 500 mmól/1 NaCl jelenlétében, nitrocellulóz szűrön történő átszűréssel kettős szálú DNS-re vonatkozóan dúsítottuk. A tisztított kétszálú DNS ötödrészét 5 egység Ncil restrikciós enzim és 50 egység exonukleáz-III alkalmazásával oly mértékben behasogatluk, hogy a fág-DNS templát-szálát így részlegesen eltávolítottuk. A kapott részlegesen kettős szálú DNS-t 3 egység DNS polimeráz-I és 2 egység T4 DNS ligáz alkalmazásával, mind a négy különböző dezoxinukleotid jelenlétében, 3 óra alatt 16 °C-on visszaalakítottuk kettős szálú DNS-sé. A kapott reakcióelegy negyed részével 300 μΐ E. coli TGI-sejteket transzformáltunk. A kapott mutagenizált fágklónok közül tízet didezoxi-szekvenálásnak vetettünk alá [Sanger. F. és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463 (1977)]. A szekvenált tíz klón közül az egyik szekvenciája a várakozásnak megfelelő volt, azaz hiányzót! belőle egy 228 bázispáros régió, amely a VIIFQD faktor Asp-1563 és Ser-1637 közötti aminosav-szekvenciáját kódolta. Ebben a kiónban tehát, az M13mp 19-vektorban egy új VIH. faktor cDNS-fragmens, a 666 bázispáros KpnI-PstI-fragmens keletkezett, amely fragmens a VIII. faktor fehérje Phe-742 és Ser-1637 aminosavai közötti fúziót (VIIFSQ faktor) kódolta.
A VI1LQS faktort kódoló emlős expressziós vektor előállítása
A fentiek szerinti. VIII:SQ faktor fúziót kódoló 666 bázispáros Kpnl-Pstl-fragmenst izoláltuk az M13mp 19 fág-DNS kettős szálú replikatív formájából, és a pKGE431-vektorba építettük. Ez a vektor tartalmaz egy VIILRE faktor cDNS-ből (Pasek, M.: WO 88/00831 publikációs számú PCT-bejelentés. ATCC No. 53517 deponálási számú izolátum) származó 2046 bázispáros KpnI-SphI-fragmenst, amely apUC19-vektorban klónozott VIILRE faktor Leu-587 és Met-2176 közötti aminosav-szekvenciáját kódolja. Annak érdekében, hogy a VULSQ faktor 666 bázispáros KpnlPstO-fragmensét megfelelő módon tudjuk beépíteni, a pKGE431-DNS-t teljes KpnI- és részleges Pstl-emésztéssel kellett felnyitnunk. A pKGE432-vektort úgy állítottuk elő, hogy azt a pKGE431 -fragmenst, amelybe a PstI a VIH:RE faktor fehérje Ala-1702 pozíciójának megfelelő helyen hasított bele, izoláltuk, és a VIILSQ faktor cDNS fent leírt KpnI-Pstl-fragmenséhez ligáltuk. A kapott vektort megemésztettük KpnI-gyel és Apai-gyei, majd a megfelelő - VIH:SQ faktor fehérje Leu-587 és Ala-2047 közötti szekvenciáját kódoló 1700 bázispáros KpnI-Apal-fragmenst a KpnI-gyel és Apai-gyei emésztett pKGE347-vektor nagy fragmenséhez ligáltuk. A pBR327 E. coli klónozó vektorból származó pKGE347-vektor tartalmaz egy 741 bázispáros DNS-régió által kódolt humán citomegalovírus enhanszer/promóter szekvenciát [-671 és +71 közötti nukleotidpozíciók, Boshart és mtsai.: Cell 41, 521 (1985)], amely a VHLQD faktor cDNS-től upstream (a leolvasás irányában valamit megelőzően) található, valamint egy SV40 t-antigén intron-szekvenciát és egy, a közeli 3’-régióban található poliadenilációs szekvenciát. A kapott vektor (pKGE347), melynek szerkezetét a 2. ábrán láthatjuk, tartalmazza a teljes VIILSQ faktor cDNSszekvenciát, és azonos a pKGE347-vektorral, azzal a különbséggel, hogy a VIII. faktor egy másik deléciós származékát kódolja.
2. PÉLDA
Aranyhörcsög petefészeksejtek (CHO-sejtek) transzfektálása
Félmillió dihidrofolát reduktáz deficiens aranyhörcsög petefészeksejtet (CHO-DG44-sejteket, melyeket Dr. L. A. Chasin bocsátott rendelkezésünkre, Columbia Egyetem, New York) 10% borjúsavóval kiegészített Dulbecco-féle módosított Eagles-táptalaj és Ham-féle F12 táptalaj 1:1 arányú keverékét tartalmazó, 10 cm átmérőjű szövettenyésztő tálcára oltottunk, és a tálcát egy éjszakán át 5% szén-dioxidot tartalmazó 37 °C-os inkubátorban inkubáltunk. A következő napon a sejteket friss táptalajjal mostuk, majd ezt követően a VIILSQ faktor expressziós vektor, a pKGE436 és a dihidrofolát reduktáz vektor, a pKGE327 1:1 arányú keverékének 10pg-jával kálcium-foszfátos módszerrel transzfektáltuk őket, a szakember számára ismert eljárások alkalmazásával. A pKGE327-vektor egy olyan transzkripciós egységet tartalmaz, amely az egér-emlőrákvírus hosszú terminális ismétlődéséi tartalmazza az egér dihidrofolát reduktáz cDNS-től upstream, valamint a közeli 3’ régióban az SV40 t-antigént és poliadeniláeiós szekvenciát, melyek a pML2-vektorban lettek klónozva, az óramutató járásának irányában (3. ábra). A harmadik napon a táptalajt eltávolítottuk, a sejteket megmostuk és új tenyésztőtálcára vittük át őket. A negyedik napon megkezdtük a dihidrofolát pozitív sejtekre történő szelekciót, úgy, hogy a táptalajt olyan, a fentivel lényegében azonos táptalajra cseréltük. amelyből a hipoxantin. a glicin és a timidin hiány6
HU 211 504 A9 zott, és a táptalajt 10% alaposan dializált magzati borjúsavóval egészítettük ki. A táptalajt hetente kétszer cseréltük a sejteken, és körülbelül két hét elteltével begyűjthettük a dihidrofolát pozitív sejtklónokat. Ezeket a kiónokat 25 cm3-es sejttenyésztő lombikokban tovább tenyésztettük, és mielőtt a tenyészet a szubkonfluenciát elérte volna, a táptalajt 3% magzati borjúsavót tartalmazó friss táptalajra cseréltük. Ezután 24 óra elteltével a szintetikus szubsztrátos módszert alkalmazva (Coatest VIII:C faktor, KABI) megmértük a táptalaj VIII:C faktor aktivitását. Az eredményeket az alábbi 1. táblázat foglalja össze.
1. TÁBLÁZAT
A VIILSQ faktort termelő CHO-DG44-sejtvonalak
Sejtvonal szá- Coatest eredmény (mE/ml) Sejtvonal szá- Coatest ered-
ma ma meny (mE/ml)
208: l 10 208:13 107
2 73 14 167
3 147 15 253
4 27 16 253
5 107 17 313
6 80 18 307
7 73 19 27
8 í 87 20 287
9 ί 93 21 393
10 33 22 467
ll 47 23 107
12 147 24 180
Génamplifikáció a V!1I:SQ faktor termelő CHODG44-sejtvonalakban
A 467 mE/ml/nap mennyiségű VIILSQ faktort termelő. 1. táblázat szerinti 208:22 számú sejtvonalat választottuk ki a további, metotrexát jelenlétében történő tenyésztéssel és szelekcióval végzett génamplifikációs kísérletek céljára. Néhány hetes, 20 nmól/1 metotrexát jelenlétében folytatott tenyésztés után a 208:22-sejtvonalból keletkezett néhány új rezisztens klón. Ezeket a kiónokat külön-külön begyűjtöttük és külön tenyészetként tovább tenyésztettük őket a fent leírlak szerint. A kiónok táptalajában található VIILC faktor aktivitást az 1. példában leírtak szerint mértük. A kapott eredményeket a 2. táblázatban foglaltuk össze.
2. TÁBLÁZAT
A VIILSQ faktort termelő 208:22 számú CHO-DG44-sejtvonalból származó amplifikált sejtvonalak
Sejtvonal száma Coatest eredmény (mE/ml) Sejt vonal száma Coatest eredmény (mE/ml)
208:22:1 1040 208:22:13 1070
2 690 14 860
3 660 15 930
4 720 16 680
-- 5 800 17 790
6 940 18 750
7 1100 19 960
8 260 20 80
9 900 21 1130
10 660 22 920
11 720 23 950
12 870 24 1010
3. PÉLDA
A VIIL’QS faktor tisztítása és biokémiai jellemzése A 208:22 számú amplifikált CHO-DG44-sejtvonallal termeltetett VIILSQ faktort biokémiailag jellemeztük. A biokémiai jellemzés előtt a táptalajból kinyert Vili. faktort részlegesen tisztítottuk. Ez a részleges tisztítás magába foglalt egy VIII. faktor ellen termeltetett monoklonális ellenanyagot tartalmazó mátrix alkalmazásával végrehajtott immunaffinitáskromatográfiás lépést és egy azt követő ioncserés kromatográfiás lépést. A kapott VIII. faktor tartalmú anyag specifikus aktivitása 3000-4000 NE/A280 volt és a VIII. faktor aktivitás / VIII. faktor antigén arány 1-hez közeli volt [az aktivitást Coatest-tel (KABI) mértük, az antigénmennyiséget pedig egy, a 80 kDa molekulatömegű lánc ellen termeltetett monoklonális ellenanyagon alapuló ELISA-teszt alkalmazásával], A tisztított VIILSQ faktor tartalmú anyagot SDS-poliakrilamid-gélelektroforézisnek (SDS-PAGE) és Western-blol-analízisnek vetettük alá. Az SDS-PAGE eljárást Laemmli módszere szerint végeztük [Natúré 227, 680 (1970)]. A Westernblot-analízishez poliklonális nyúl anti-humán VIII. faktor ellenanyagot alkalmaztunk és az eljárást lényegében Towbin, H. és mtsai. módszere szerint végeztük [Proc. Natl. Acad. Sci. USA76. 4350 (1979)]. Akapott eredményeket a 4. ábrán láthatjuk, részletezve: 1. sáv: vérplazma eredetű VIII. faktor, amely 80 kDa molekulatömegű könnyű láncot és 200-90 kDa között változó molekulatömegű nehéz láncot tartalmazott; 2. és 3. sáv: 80 és 90 kDa molekulatömegű láncokat tartalmazó rekombináns VIILSQ faktor. A 2. és 3. sávokban futtatott anyagok két különböző VIILSQ faktor sarasból származtak, melyeket fentiek szerint végzett tisztítások eredményeként kaptunk. A vizsgálat láthatóan két fő
HU 211 504 A9 csík jelenlétét mutatta a VIILSQ faktor tartalmú anyagban, az egyik fő esik a 90 kDa molekulatömegnél futott, a másik pedig (egy kettős csík) a 80 kDa molekulatömegnél. A két említeti csík a legkisebb vérplazma eredetű biológiailag aktív Vili. faktor komplexnek megfelelő csíkokkal azonos pozícióba futott. A VIILSQ faktor tartalmú anyagban található volt egy kisebb mennyiségben jelenlévő (mennyisége < a teljes anyag 5%-ánál), 170 kDa-nál futó csík is, amely valószínűleg a hasítatlan elsődleges transzlációs terméknek felelt meg. Ezenfelül, automatikus Edman-lebontással végzett szekvencia-meghatározással kimutattuk, hogy a VIILSQ faktor fehérje 90 kDa és 80 kDa molekulatömegű láncainak N-terminálisai megegyeznek a vérplazmából izolált, 90 és 80 kDa molekulatömegű láncokat tartalmazó Vili, faktor láncainak N-terminálisai val. Ez az eredmény azt mutatta, hogy az elsődleges transzlációs tennék in vivő proteolitikus hasítása hatékonyan megtörtént.
Az előállított VIILSQ faktor humán trombinnal. mennyiséggel arányos módon aktiválhatónak bizonyult. Ezt inaktiválódás követte. Az 5. ábrán egy olyan aktivitásváltozási görbét láthatunk, ahol 1 NE tisztított VIILSQ faktorra számítva 0.1 E trombint adtunk. A reakcióelegyből vett mintákat azonnal egylépéses véralvadásos módszerrel vizsgáltuk [Mikaelsson, M. és mtsai.: Blood 62. 1006-1015 (1983)]. Egy percen belül 15-szörös aktiválódást detektáltunk, amit inaktiválódás követett. Az analízis céljaira vett mintákhoz 0,02 g/ml koncentrációban nátrium-dodecil-szulfálot adtunk a reakció leállítása céljából. A reakció során különböző időpontokban vett mintákat SDS-poliakrilamid-gélelektroforézisriek és Western-blot-analízisnek vetettük alá. humán Vili. faktor elleni nyúl poliklonális ellenanyag alkalmazásával (6. ábra). Az elektroforézisl és az immunblot-analízist a 4. példa esetén elmondottaknak megfelelően végeztük.
A kapott eredmények azt mutatták, hogy a vizsgált Vili. faktor peplidek szerkezetében trombinnal való aktiválás során azonos változások történnek, mint a vérplazma eredetű VIII. faktor esetén, azaz a 90 kDa molekulatömegű pepiidet a trombin elhasítotla és egy 50 kDa, valamint egy 40 kDa molekulatömegű peptid keletkezett A 80 kDa molekulatömegű peptid is elhasadt és egy 70 kDa molekulatömegű peptid keletkezett. A VIILSQ faktor mintában látható gyenge 170 kDa-os csík a trombinnal történő inkubálás első percében eltűnt. és feltehetőleg a 90 kDa - 80 kDa komplexből keletkező peptidekkel azonos peplidek keletkeztek belőle. A trombinnal végzett vizsgálatok tehát kimutatták, hogy a V1II:SQ faktor ezzel az enzimmel a vérplazma eredetű VIII. faktorral azonos módon lép kölcsönhatásba. Ez a sajátság esszenciális az in vivő biológiailag aktív megléte szempontjából.
A VIILSQ faktor humán von Willebrand-faktorral való kölcsönhatását Sepharose-CI-6B oszlopon végzett méretkizárásos kromalográfával vizsgáltuk. Tíz (10) NE VIILSQ faktort 37 l'C-on 20 percig inkubáltunk 30 E tisztított humán von Willebrand-faktorral. Az inkubációs reakcióelegyet azután egy Sepharose-CL-6Bvel megtöltött oszlopra vittük. Az összes VÜI. faktor aktivitású anyag a von Willebrand-faktorral együtt, kizárási térfogaton jött le az oszlopról. Amikor a VIILSQ faktort von Willebrand-faktor hozzáadása nélkül vittük fel ugyanarra az oszlopra, VÜI. faktor aktivitású anyag csak a közbülső frakciókban volt található, abban a pozícióban, ahol a vérplazma eredetű 90 kDa - 80 kDa formájú VIII. faktor szokott eluálódni. Ez az eredmény azt mutatja, hogy az előállított VIILSQ faktor képes von Willebrand-faktorhoz kötődni, ami a jó in vivő túléléshez szükséges sajátság (Brinkhous, K. M. és mtsai.: Proc. Natl: Acad. Sci. USAS2, 8752 (1985)].
A találmány tárgyát képező VIII:SQ faktor DNS-t 1989. december 13-án deponáltuk a Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen-nél, ahol a DSM 5693 deponálási számot kapta.

Claims (12)

1. DNS-szekvencia, amely lényegében két, egyenként 90 és 80 kDa molekulatömegű polipeptidláncból álló, biológiailag aktív rekombináns humán VIII. faktor származékot kódol, továbbá alkalmas arra, hogy az említett származék róla kifejeződjön és azután kiválasztódjon, és amely szekvencia egyrészt egy, a 90 kDa molekulatömegű humán Vili. faktor láncot kódoló első DNS-régiót, másrészt egy, a 80 kDa molekulatömegű humán VIII. faktor láncot kódoló második DNS-régiót tartalmaz, amely régiók egy, a humán Vili. faktor Bdoménjének 4-től körülbelül 100 aminosavig terjedő hosszúságú részletéből álló kapcsoló peptidet kódoló kapcsoló DNS-régióval vannak összekapcsolva, amely aminosavak közül legalább 4 az említett dómén C-terminálisáról származik.
2. Az 1. igénypont szerinti DNS-szekvencia, amely legalább 4. a humán Vili. faktor B-doménjének C-terminálisáról származó aminosavat kódoló kapcsoló szekvenciát tartalmaz.
3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti DNS-szekvencia, amely a humán Vili. faktor B-doménjének legfeljebb körülbelül 20 aminosavat kódoló kapcsoló szekvenciát tartalmaz.
4. Az 1., 2. vagy 3. igénypont szerinti DNS-szekvencia, amely a humán VIII. faktor B-doménjéből származó 12 aminosav hosszúságú aminosav-szekvenciál kódoló kapcsoló szekvenciát tartalmaz.
5. Az előző igénypontok bármelyike szerinti DNSszekvencia, amely a humán VÜI. faktor B-doménjének legalább 7 aminosavát kódoló kapcsoló szekvenciát tartalmaz, mely aminosavak közül legalább 4 az említett dómén C-terminálisáról, legalább 2 pedig az N-terminálisáról származik.
6. Az előző igénypontok bármelyike szerinti DNSszekvencia, amely a humán VIII. faktor B-doménjének C-lerminálisáról származó 12 aminosavat és az N-terminálisáról származó 2 aminosavat kódoló kapcsoló szekvenciái tartalmaz.
7. Rekombináns expressziós vektor, amely az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti DNS-szekvenciát.
HU 211 504 A9 promótert és poliadeniláciős szignálszekvenciát magába foglaló transzkripciós egységet tartalmaz.
8. Állati eredetű gazdasejt, ami a 7. igénypont szerinti rekombináns expressziós vektorral van transzformálva.
9. Eljárás az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti DNS-szekvencia által expresszált biológiailag aktív rekombináns humán VIII. faktor származék előállítására, azzal jellemezve, hogy a 7. igénypont szerinti rekombináns expressziós vektorral transzformált állati eredetű sejtvonalat olyan táptalajban tenyésztjük, amely lehetővé teszi a két, egyenként 90 és 80 kDa molekulatötnegű, fémionhíddal összekapcsolt polipeptidláncból álló humán VIII. faktor származék expresszióját és szekrécióját, és az említett származékot a táptalajból kinyerjük.
10. Humán VIII. faktor származék, amely a 9. igénypont szerinti eljárással van előállítva.
5
11. A 10. igénypont szerinti humán Vili. faktor származék, amely tartalmazza a humán Vili. faktor 90 kDa molekulatömegű doménjét amelyhez - adott esetben a kapcsoló peptiden vagy annak egy részletén keresztül - fémionkötéssel hozzá van kapcsolva a 80
10 kDa molekulatömegű dómén.
12. Az 1. igénypont szerinti DNS-szekvencia, amely lényegében megegyezik a példák bármelyikében leírt valamely DNS-szekvenciával.
HU95P/P00489P 1989-12-15 1995-06-28 Recombinant human factor viii derivatives HU211504A9 (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SE8904239A SE465222C5 (sv) 1989-12-15 1989-12-15 Ett rekombinant, humant faktor VIII-derivat och förfarande för dess framställning

Publications (1)

Publication Number Publication Date
HU211504A9 true HU211504A9 (en) 1995-11-28

Family

ID=20377785

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU95P/P00489P HU211504A9 (en) 1989-12-15 1995-06-28 Recombinant human factor viii derivatives

Country Status (21)

Country Link
EP (3) EP0506757B2 (hu)
JP (1) JP2644084B2 (hu)
AT (2) ATE232213T1 (hu)
AU (1) AU645539B2 (hu)
BR (1) BR9007921A (hu)
CA (1) CA2071875C (hu)
DE (3) DE69034040T2 (hu)
DK (2) DK0506757T4 (hu)
ES (2) ES2189897T3 (hu)
FI (1) FI104260B1 (hu)
HK (2) HK1009290A1 (hu)
HU (1) HU211504A9 (hu)
IE (1) IE904510A1 (hu)
LU (1) LU90457I2 (hu)
NL (1) NL990035I2 (hu)
NO (1) NO309041B1 (hu)
NZ (1) NZ236276A (hu)
PT (1) PT96208B (hu)
SE (1) SE465222C5 (hu)
SG (1) SG66753A1 (hu)
WO (1) WO1991009122A1 (hu)

Families Citing this family (139)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5595886A (en) 1986-01-27 1997-01-21 Chiron Corporation Protein complexes having Factor VIII:C activity and production thereof
US6060447A (en) * 1987-05-19 2000-05-09 Chiron Corporation Protein complexes having Factor VIII:C activity and production thereof
IL86693A (en) 1987-06-12 1994-06-24 Stichting Centraal Lab Proteins that have the activity IIIV of the blood, a process for their preparation that uses cells are produced through genetic engineering and pharmaceutical preparations that contain them
US6346513B1 (en) 1987-06-12 2002-02-12 Baxter Trading Gmbh Proteins with factor VIII activity: process for their preparation using genetically-engineered cells and pharmaceutical compositions containing them
US5629287A (en) * 1991-01-18 1997-05-13 University College London Depot formulations
US5610148A (en) * 1991-01-18 1997-03-11 University College London Macroscopically oriented cell adhesion protein for wound treatment
SE468050C (sv) * 1991-03-15 1998-04-27 Pharmacia & Upjohn Ab Rekombinant derivat av human faktor VIII
US5888974A (en) * 1992-04-07 1999-03-30 Emory University Hybrid human/animal factor VIII
US5663060A (en) * 1992-04-07 1997-09-02 Emory University Hybrid human/animal factor VIII
US5744446A (en) * 1992-04-07 1998-04-28 Emory University Hybrid human/animal factor VIII
US5364771A (en) * 1992-04-07 1994-11-15 Emory University Hybrid human/porcine factor VIII
DK53792D0 (da) * 1992-04-24 1992-04-24 Novo Nordisk As Fremgangsmaade til fremstilling af proteiner
KR100303872B1 (ko) * 1992-10-02 2001-11-22 크리스터 발스트룀, 프레드릭 베르그, 하랄트 알름 응고인자ⅷ제형을포함하는조성물,이것의제조방법및안정화제로서의계면활성제의사용방법
SE9300509D0 (sv) * 1993-02-16 1993-02-16 Kabi Pharmacia Ab Peg treatment
SE9301581D0 (sv) * 1993-05-07 1993-05-07 Kabi Pharmacia Ab Protein formulation
SE504074C2 (sv) * 1993-07-05 1996-11-04 Pharmacia Ab Proteinberedning för subkutan, intramuskulär eller intradermal administrering
SE9303601D0 (sv) * 1993-11-01 1993-11-01 Kabi Pharmacia Ab Improved cell cultivation method and medium
US6288030B1 (en) 1993-12-22 2001-09-11 Amgen Inc. Stem cell factor formulations and methods
IL113010A0 (en) * 1994-03-31 1995-10-31 Pharmacia Ab Pharmaceutical formulation comprising factor VIII or factor ix with an activity of at least 200 IU/ml and an enhancer for improved subcutaneous intramuscular or intradermal administration
SE9403915D0 (sv) * 1994-11-14 1994-11-14 Annelie Almstedt Process A
SE503424C2 (sv) * 1994-11-14 1996-06-10 Pharmacia Ab Process för rening av rekombinant koagulationsfaktor VIII
US6818439B1 (en) 1994-12-30 2004-11-16 Chiron Corporation Methods for administration of recombinant gene delivery vehicles for treatment of hemophilia and other disorders
SE9501189D0 (sv) * 1995-03-31 1995-03-31 Pharmacia Ab Protein formulation
WO1997003193A1 (en) * 1995-07-11 1997-01-30 Chiron Corporation Novel factor viii:c polypeptide analogs with altered metal-binding properties
SE9503380D0 (sv) * 1995-09-29 1995-09-29 Pharmacia Ab Protein derivatives
US5851800A (en) * 1996-05-14 1998-12-22 Pharmacia & Upjohn Ab Process for producing a protein
EP1318198B1 (en) * 1996-05-14 2006-03-22 Biovitrum Ab Process for producing a recombinant polypeptide involving the addition of an inhibitor of chymotrypsins to the cell culture medium
US6475725B1 (en) 1997-06-20 2002-11-05 Baxter Aktiengesellschaft Recombinant cell clones having increased stability and methods of making and using the same
AU735763B2 (en) * 1997-12-05 2001-07-12 Immune Response Corporation, The Novel vectors and genes exhibiting increased expression
US7820796B2 (en) 1998-03-12 2010-10-26 Genetics Institute, Llc. Methods for producing Factor VIII proteins
US6797505B2 (en) * 1998-05-27 2004-09-28 Cell Genesys, Inc. Recombinant AAV vectors for gene therapy of hemophilia A
US6200560B1 (en) * 1998-10-20 2001-03-13 Avigen, Inc. Adeno-associated virus vectors for expression of factor VIII by target cells
US6221349B1 (en) 1998-10-20 2001-04-24 Avigen, Inc. Adeno-associated vectors for expression of factor VIII by target cells
US6358703B1 (en) 1998-12-10 2002-03-19 Bayer Corporation Expression system for factor VIII
DE60035260T2 (de) 1999-02-22 2007-10-18 The University Of Connecticut, Farmington Neue albuminfreie faktor viii formulierungen
SE9901379D0 (sv) 1999-04-19 1999-04-19 Pharmacia & Upjohn Ab Receptor structures
AT409379B (de) 1999-06-02 2002-07-25 Baxter Ag Medium zur protein- und serumfreien kultivierung von zellen
CA2404163C (en) * 2000-03-22 2009-09-29 Octagene Gmbh Production of recombinant blood clotting factors in human cell lines
WO2004099231A2 (en) 2003-04-09 2004-11-18 Neose Technologies, Inc. Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods
GB0207092D0 (en) 2002-03-26 2002-05-08 Sod Conseils Rech Applic Stable pharmaceutical composition containing factor VIII
JP2005532057A (ja) 2002-07-09 2005-10-27 バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッド 細胞を培養するための動物性タンパク質非含有培地
EP1596887B1 (en) * 2003-02-26 2022-03-23 Nektar Therapeutics Polymer-factor viii moiety conjugates
TWI353991B (en) 2003-05-06 2011-12-11 Syntonix Pharmaceuticals Inc Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
WO2005012484A2 (en) 2003-07-25 2005-02-10 Neose Technologies, Inc. Antibody-toxin conjugates
EP2298926A1 (en) 2003-09-30 2011-03-23 The Trustees of The University of Pennsylvania Adeno-associated virus (AAV) clades, sequences, vectors containing same, and uses thereof
US20080305992A1 (en) 2003-11-24 2008-12-11 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated erythropoietin
EP1814573B1 (en) 2004-10-29 2016-03-09 ratiopharm GmbH Remodeling and glycopegylation of fibroblast growth factor (fgf)
US20060094104A1 (en) 2004-10-29 2006-05-04 Leopold Grillberger Animal protein-free media for cultivation of cells
EP2371856B1 (en) 2004-11-12 2022-05-18 Bayer HealthCare LLC Site-directed modification of FVIII
ES2449195T3 (es) 2005-01-10 2014-03-18 Ratiopharm Gmbh Factor estimulante de colonias de granulocitos glicopegilado
EP1707634A1 (en) 2005-03-29 2006-10-04 Octapharma AG Method for isolation of recombinantly produced proteins
EP3409296A1 (en) 2005-04-07 2018-12-05 The Trustees of the University of Pennsylvania Method of increasing the function of an aav vector
EP1871795A4 (en) 2005-04-08 2010-03-31 Biogenerix Ag COMPOSITIONS AND METHOD FOR PRODUCING GLYCOSYLATION MUTANTS OF A PROTEASE-RESISTANT HUMAN GROWTH HORMONE
EP1739179A1 (en) 2005-06-30 2007-01-03 Octapharma AG Serum-free stable transfection and production of recombinant human proteins in human cell lines
US20070105755A1 (en) 2005-10-26 2007-05-10 Neose Technologies, Inc. One pot desialylation and glycopegylation of therapeutic peptides
US20090048440A1 (en) 2005-11-03 2009-02-19 Neose Technologies, Inc. Nucleotide Sugar Purification Using Membranes
EP2522717B1 (en) 2006-01-04 2014-04-02 Baxter International Inc Oligopeptide-free cell culture media
US7645860B2 (en) 2006-03-31 2010-01-12 Baxter Healthcare S.A. Factor VIII polymer conjugates
US7683158B2 (en) 2006-03-31 2010-03-23 Baxter International Inc. Pegylated factor VIII
US7982010B2 (en) 2006-03-31 2011-07-19 Baxter International Inc. Factor VIII polymer conjugates
US7985839B2 (en) 2006-03-31 2011-07-26 Baxter International Inc. Factor VIII polymer conjugates
CN101516388B (zh) 2006-07-21 2012-10-31 诺和诺德公司 通过o-联糖基化序列的肽的糖基化
WO2008057683A2 (en) 2006-10-03 2008-05-15 Novo Nordisk A/S Methods for the purification of polypeptide conjugates
EP2101821B1 (en) 2006-12-15 2014-08-13 Baxter International Inc. Factor viia- (poly) sialic acid conjugate having prolonged in vivo half-life
KR101389376B1 (ko) 2007-02-23 2014-04-29 에스케이케미칼주식회사 제 ８ 인자 및 그의 유도체의 제조 및 정제 방법
KR20100016160A (ko) 2007-04-03 2010-02-12 바이오제너릭스 에이지 글리코페길화 ｇ―ｃｓｆ를 이용하는 치료 방법
WO2008154639A2 (en) 2007-06-12 2008-12-18 Neose Technologies, Inc. Improved process for the production of nucleotide sugars
DK2235197T3 (en) 2007-12-27 2017-10-09 Baxalta GmbH Methods of cell culture
ES2476690T3 (es) 2008-02-27 2014-07-15 Novo Nordisk A/S Moléculas conjugadas del Factor VIII
EP2393828B1 (en) 2009-02-03 2016-10-12 Amunix Operating Inc. Extended recombinant polypeptides and compositions comprising same
NO2440239T3 (hu) 2009-06-09 2018-02-10
EP2459224B1 (en) 2009-07-27 2016-06-01 Baxalta GmbH Blood coagulation protein conjugates
US8809501B2 (en) 2009-07-27 2014-08-19 Baxter International Inc. Nucleophilic catalysts for oxime linkage
US8642737B2 (en) 2010-07-26 2014-02-04 Baxter International Inc. Nucleophilic catalysts for oxime linkage
SG10201401194VA (en) 2009-07-27 2014-07-30 Lipoxen Technologies Ltd Glycopolysialylation of non-blood coagulation proteins
NZ597600A (en) 2009-07-27 2014-05-30 Lipoxen Technologies Ltd Glycopolysialylation of non-blood coagulation proteins
WO2011028229A1 (en) 2009-08-24 2011-03-10 Amunix Operating Inc. Coagulation factor ix compositions and methods of making and using same
GB0915481D0 (en) 2009-09-04 2009-10-07 Arecor Ltd Stable manufacture of factor V111
EP4382170A2 (en) 2009-12-06 2024-06-12 Bioverativ Therapeutics Inc. Factor viii-fc chimeric and hybrid polypeptides, and methods of use thereof
WO2011095604A1 (en) 2010-02-04 2011-08-11 Octapharma Biopharmaceuticals Gmbh Half-life prolongation of proteins
US9315825B2 (en) 2010-03-29 2016-04-19 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Pharmacologically induced transgene ablation system
SG10201908848RA (en) 2010-03-29 2019-10-30 Univ Pennsylvania Pharmacologically induced transgene ablation system
EP3508573A1 (en) 2010-07-09 2019-07-10 Bioverativ Therapeutics Inc. Systems for factor viii processing and methods thereof
AU2011274423B2 (en) 2010-07-09 2016-02-11 Bioverativ Therapeutics Inc. Chimeric clotting factors
CN103209992A (zh) * 2010-09-15 2013-07-17 诺沃—诺迪斯克有限公司 具有减少的细胞摄取的因子viii变体
NZ612320A (en) 2010-12-22 2015-06-26 Baxter Healthcare Sa Materials and methods for conjugating a water soluble fatty acid derivative to a protein
PL2675902T3 (pl) 2011-02-17 2019-08-30 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Kompozycje i sposoby do zmieniania specyficzności względem tkanki i poprawy transferu genu z udziałem aav9
AU2012267484B2 (en) 2011-06-10 2017-03-23 Bioverativ Therapeutics Inc. Pro-coagulant compounds and methods of use thereof
AR087091A1 (es) 2011-07-08 2014-02-12 Biogen Idec Hemophilia Inc Polipeptidos quimericos e hibridos del factor viii, y sus metodos de uso
EA028914B1 (ru) 2011-07-25 2018-01-31 Байоджен Хемофилия Инк. Исследования для мониторинга нарушений свертываемости крови
WO2013098676A1 (en) 2011-12-30 2013-07-04 Grifols, S.A. Method for purifying factor viii
LT2804623T (lt) 2012-01-12 2019-12-10 Bioverativ Therapeutics Inc Chimeriniai viii faktoriaus polipeptidai ir jų panaudojimas
EA038705B1 (ru) 2012-01-12 2021-10-07 Биовератив Терапьютикс Инк. Способы снижения иммуногенности фактора свёртывания крови viii у пациентов, получающих лечение фактором viii
RS63870B1 (sr) 2012-02-15 2023-01-31 Bioverativ Therapeutics Inc Sastavi faktora viii i postupci za pravljenje i upotrebu istih
HUE043537T2 (hu) 2012-02-15 2019-08-28 Bioverativ Therapeutics Inc Rekombináns VIII faktor fehérjék
JP2015521589A (ja) 2012-06-08 2015-07-30 バイオジェン・エムエイ・インコーポレイテッドＢｉｏｇｅｎ ＭＡ Ｉｎｃ． プロコアグラント化合物
JP2015525222A (ja) 2012-06-08 2015-09-03 バイオジェン・エムエイ・インコーポレイテッドＢｉｏｇｅｎ ＭＡ Ｉｎｃ． キメラ性凝固因子
WO2014008480A2 (en) 2012-07-06 2014-01-09 Biogen Idec Ma Inc. Cell line expressing single chain factor viii polypeptides and uses thereof
LT2882450T (lt) 2012-07-11 2020-03-25 Bioverativ Therapeutics Inc. Faktoriaus viii komplekso su xten ir von vilebrando faktoriumi baltymas ir jo panaudojimas
RU2500818C1 (ru) * 2012-07-19 2013-12-10 Общество с ограниченной ответственностью "Международный биотехнологический центр "Генериум" ("МБЦ "Генериум") РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК рАР227, КОДИРУЮЩАЯ ПОЛИПЕПТИД РЕКОМБИНАНТНОГО ФАКТОРА VIII СВЕРТЫВАЕМОСТИ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА, ЛИНИЯ КЛЕТОК Cricetulus griseus CHO 2H5 - ПРОДУЦЕНТ РЕКОМБИНАНТНОГО ФАКТОРА VIII СВЕРТЫВАЕМОСТИ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИПЕПТИДА, ОБЛАДАЮЩЕГО АКТИВНОСТЬЮ ФАКТОРА VIII
WO2014018777A2 (en) 2012-07-25 2014-01-30 Biogen Idec Ma Inc. Blood factor monitoring assay and uses thereof
CA2888806A1 (en) 2012-10-18 2014-04-24 Biogen Idec Ma Inc. Methods of using a fixed dose of a clotting factor
EP3943102A1 (en) 2012-10-30 2022-01-26 Bioverativ Therapeutics Inc. Methods of using fviii polypeptide
RS61387B1 (sr) 2013-02-15 2021-02-26 Bioverativ Therapeutics Inc Gen optimizovanog faktora viii
UY35462A (es) 2013-03-15 2014-10-31 Biogen Idec Inc Formulación de un polipéptido del factor viii.
EP2968498A4 (en) 2013-03-15 2016-09-07 Biogen Ma Inc PREPARATIONS CONTAINING FACTOR IX POLYPEPTIDE
WO2015012924A2 (en) 2013-04-29 2015-01-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Tissue preferential codon modified expression cassettes, vectors containing same, and use thereof
EP3013358A4 (en) 2013-06-28 2017-03-22 Biogen MA Inc. Thrombin cleavable linker with xten and its uses thereof
WO2015021423A2 (en) 2013-08-08 2015-02-12 Biogen Idec Ma Inc. Purification of chimeric fviii molecules
US10548953B2 (en) 2013-08-14 2020-02-04 Bioverativ Therapeutics Inc. Factor VIII-XTEN fusions and uses thereof
WO2015023894A1 (en) 2013-08-14 2015-02-19 Biogen Idec Ma Inc. Recombinant factor viii proteins
US10611794B2 (en) 2013-09-25 2020-04-07 Bioverativ Therapeutics Inc. On-column viral inactivation methods
MX2016005333A (es) 2013-10-22 2017-02-15 Dbv Tech Método para tratar la hemofilia induciendo tolerancia a factores sanguíneos.
EP3065769A4 (en) 2013-11-08 2017-05-31 Biogen MA Inc. Procoagulant fusion compound
US10325687B2 (en) 2013-12-06 2019-06-18 Bioverativ Therapeutics Inc. Population pharmacokinetics tools and uses thereof
US9771403B2 (en) 2013-12-09 2017-09-26 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for treating hemophilia
CN116731201A (zh) 2014-01-10 2023-09-12 比奥贝拉蒂治疗公司 因子viii嵌合蛋白及其用途
KR102567586B1 (ko) 2014-02-04 2023-08-16 바이오젠 엠에이 인코포레이티드 번역 후 변형을 강화시키기 위한 통류 방식 양이온 교환 크로마토그래피의 용도
WO2016012595A1 (en) * 2014-07-25 2016-01-28 Csl Behring Gmbh Improved factor viii preparations suitable for therapeutic use and processes to obtain these
MA40864A (fr) 2014-10-31 2017-09-05 Biogen Ma Inc Hypotaurine, gaba, bêta-alanine et choline pour la régulation de l'accumulation de sous-produits résiduaires dans des procédés de culture de cellules mammifères
US10058624B2 (en) 2015-04-16 2018-08-28 Emory University Recombinant promoters and vectors for protein expression in liver and use thereof
EP3331608A4 (en) 2015-08-03 2019-05-01 Bioverativ Therapeutics Inc. FUSION XI FUSION PROTEINS AND METHODS OF MAKING AND USING THE SAME
AU2017214378B2 (en) 2016-02-01 2023-05-04 Bioverativ Therapeutics Inc. Optimized Factor VIII genes
MA46968A (fr) 2016-12-02 2019-10-09 Bioverativ Therapeutics Inc Procédés d'induction de tolérance immunitaire à des facteurs de coagulation
KR20190090827A (ko) 2016-12-02 2019-08-02 바이오버라티브 테라퓨틱스 인크. 키메라 응고 인자를 사용해 혈우병성 관절증을 치료하는 방법
EP3665289A1 (en) 2017-08-09 2020-06-17 Bioverativ Therapeutics Inc. Nucleic acid molecules and uses thereof
CA3077380A1 (en) 2017-09-27 2019-04-04 Sigilon Therapeutics, Inc. Methods, compositions, and implantable elements comprising active cells
WO2019152692A1 (en) 2018-02-01 2019-08-08 Bioverativ Therapeutics, Inc. Use of lentiviral vectors expressing factor viii
UY38160A (es) 2018-04-04 2019-11-29 Sigilon Therapeutics Inc Partículas implantables y métodos relacionados
US20210145889A1 (en) 2018-04-04 2021-05-20 Sigilon Therapeutics, Inc. Methods, compositions, and implantable elements comprising stem cells
WO2019222682A1 (en) 2018-05-18 2019-11-21 Bioverativ Therapeutics Inc. Methods of treating hemophilia a
US20200069817A1 (en) 2018-08-09 2020-03-05 Bioverativ Therapeutics Inc. Nucleic acid molecules and uses thereof for non-viral gene therapy
UY38389A (es) 2018-09-27 2020-04-30 Sigilon Therapeutics Inc Dispositivos implantables para terapia celular y métodos relacionados
MX2021015897A (es) 2019-06-19 2022-04-18 Bioverativ Therapeutics Inc Factor viii recombinante-fc para el tratamiento de la hemofilia y la densidad mineral osea baja.
US20240043494A1 (en) 2020-08-07 2024-02-08 Amicus Therapeutics, Inc. Vesicle Targeting Proteins And Uses Of Same
KR20240049332A (ko) 2021-08-23 2024-04-16 바이오버라티브 테라퓨틱스 인크. 최적화된 인자 viii 유전자
IL311725A (en) 2021-09-30 2024-05-01 Bioverativ Therapeutics Inc Nucleic acids encoding factor VIII polypeptides with reduced immunogenicity
WO2024081309A1 (en) 2022-10-11 2024-04-18 Sigilon Therapeutics, Inc. Engineered cells and implantable elements for treatment of disease
WO2024081310A1 (en) 2022-10-11 2024-04-18 Sigilon Therapeutics, Inc. Engineered cells and implantable elements for treatment of disease

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR910006424B1 (ko) * 1985-08-21 1991-08-24 인코텍스 비.브이 편성브리프(brief) 제조방법
EP0253870B1 (en) * 1986-01-03 1993-03-31 Genetics Institute, Inc. Method for producing factor viii:c-type proteins
EP0251843A1 (fr) * 1986-06-06 1988-01-07 Transgene S.A. Procédé de préparation de facteur VIII à partir de cellules de mammifères
JPH0637425B2 (ja) * 1986-11-11 1994-05-18 株式会社クラレ 高沸点（メタ）アクリル酸エステルの製造方法
FR2619314B1 (fr) * 1987-08-11 1990-06-15 Transgene Sa Analogue du facteur viii, procede de preparation et composition pharmaceutique le contenant
JP2586092B2 (ja) * 1988-04-06 1997-02-26 三菱瓦斯化学株式会社 多官能（メタ）アクリル酸エステルの製造法
DK0500734T3 (da) * 1989-11-17 1998-03-30 Chiron Corp Proteinkomplekser med faktor VIII:C-aktivitet samt frembringelse deraf

Also Published As

Publication number Publication date
EP0506757B2 (en) 2005-10-26
HK1009290A1 (en) 1999-05-28
SE465222C5 (sv) 1998-02-10
DK0506757T3 (da) 1999-05-25
DE69032600T3 (de) 2006-07-20
EP1293513A3 (en) 2003-04-02
BR9007921A (pt) 1992-11-10
AU7039391A (en) 1991-07-18
NL990035I2 (nl) 2000-01-03
ES2189897T3 (es) 2003-07-16
DE69034040T2 (de) 2003-11-20
SE465222B (sv) 1991-08-12
WO1991009122A1 (en) 1991-06-27
SE8904239D0 (sv) 1989-12-15
NO922325D0 (no) 1992-06-12
DK0506757T4 (da) 2006-02-20
DK0786474T3 (da) 2003-03-03
CA2071875C (en) 2006-08-08
AU645539B2 (en) 1994-01-20
EP0786474B1 (en) 2003-02-05
CA2071875A1 (en) 1991-06-16
SG66753A1 (en) 2001-12-19
FI104260B (fi) 1999-12-15
EP1293513A2 (en) 2003-03-19
DE69032600T2 (de) 1999-01-07
DE69034040D1 (de) 2003-03-13
ES2119769T5 (es) 2006-04-16
ATE232213T1 (de) 2003-02-15
PT96208B (pt) 1998-05-29
EP0786474A1 (en) 1997-07-30
JPH05502161A (ja) 1993-04-22
NZ236276A (en) 1993-03-26
DE19975066I2 (de) 2005-07-07
FI922745A0 (fi) 1992-06-12
NL990035I1 (nl) 1999-12-01
IE904510A1 (en) 1991-07-17
SE8904239L (sv) 1991-06-16
ES2119769T3 (es) 1998-10-16
NO309041B1 (no) 2000-12-04
PT96208A (pt) 1991-09-30
JP2644084B2 (ja) 1997-08-25
EP0506757A1 (en) 1992-10-07
LU90457I2 (fr) 2001-04-13
HK1019449A1 (en) 2000-02-11
FI104260B1 (fi) 1999-12-15
NO922325L (no) 1992-08-11
ATE170219T1 (de) 1998-09-15
EP0506757B1 (en) 1998-08-26
DE69032600D1 (de) 1998-10-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0786474B1 (en) A recombinant human factor VIII derivative
US5661008A (en) Recombinant human factor VIII derivatives
EP0533862B1 (en) Recombinant human factor viii derivatives
US5451521A (en) Procoagulant proteins
US6228620B1 (en) Protein complexes having factor VIII:C activity and production thereof
CA2068728A1 (en) Protein complexes having factor viii:c activity and production thereof
EP1673391B1 (en) MODIFIED cDNA FOR HIGH EXPRESSION LEVELS OF FACTOR VIII AND ITS DERIVATIVES

Legal Events

Date Code Title Description
HPC4 Succession in title of patentee

Owner name: PHARMACIA & UPJOHN AKTIENBOLAG, SE

HPC4 Succession in title of patentee

Owner name: BIOVITRUM AB, SE