KR102567586B1 - 번역 후 변형을 강화시키기 위한 통류 방식 양이온 교환 크로마토그래피의 용도 - Google Patents

번역 후 변형을 강화시키기 위한 통류 방식 양이온 교환 크로마토그래피의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 양이온 교환 매질의 사용을 통해 복합체 혼합물로부터 번역 후 변형을 갖는 재조합 폴리펩티드의 분리에 있어서의 개선된 방법에 관한 것이다.

Description

번역 후 변형을 강화시키기 위한 통류 방식 양이온 교환 크로마토그래피의 용도{USE OF CATION-EXCHANGE CHROMATOGRAPHY IN THE FLOW-THROUGH MODE TO ENRICH POST-TRANSLATIONAL MODIFICATIONS}
특이적 번역 후 변형 및 불순물 수준은 흔히 인간 투여용으로 의도된 재조합 폴리펩티드에 대해 규제 기관에 의해 통제된다. 흔히, 시험관내 세포주에서 생산된 재조합 폴리펩티드의 번역 후 변형 수준은 인간 투여용으로 의도된 재조합 폴리펩티드를 위해 요구되는 번역 후 변형 수준과는 상이하다. 폴리펩티드의 당화 프로필은 생산 세포주의 유형, 성장 조건 및 폴리펩티드 서열을 포함하는 다수의 인자에 의해 영향을 받을 수 있다. [문헌참조: Shiestl, M., et al. Nature Biotechnology 29(4):310 (2011)].
제조 방법에 순응할 수 있는, 즉 허용가능한 생성물 회수 및 수율을 유지하는 규모로 특정 번역 후 변형의 특정 수준으로 재조합 폴리펩티드의 강화(enrichment)를 제공하는 방법이 당업계에 요구된다.
발명의 요약
본 발명은 상이한 수준의 번역 후 변형을 갖는 초기 집단의 재조합 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 통류 방식(flow through mode)으로 작동하는 양이온 교환 크로마토그래피(CEX) 매질과 접촉시킴을 포함하는 재조합 폴리펩티드의 번역 후 변형 수준을 강화시키는 방법을 제공하고, 여기서, CEX 매질에 결합하지 않는 재조합 폴리펩티드는 CEX 매질에 결합하는 재조합 폴리펩티드로부터 분리되고, CEX 매질에 결합하지 않는 재조합 폴리펩티드는 결합된 재조합 폴리펩티드와 비교하여 보다 높은 수준의 번역 후 변형을 포함한다.
본 발명은
a) 상이한 수준의 번역 후 변형을 갖는 초기 집단의 재조합 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 통류 방식으로 작동하는 양이온 교환 크로마토그래피(CEX) 매질과 접촉시키고;
b) CEX 매질에 결합하지 않는 재조합 폴리펩티드를 CEX 매질에 결합하는 재조합 폴리펩티드로부터 분리함을 포함하는, 재조합 폴리펩티드의 번역 후 변형 수준을 강화시키는 방법을 제공하고;
여기서, 회수된, CEX 매질에 결합하지 않는 재조합 폴리펩티드는 결합된 재조합 폴리펩티드와 비교하여 보다 높은 수준의 번역 후 변형을 포함한다.
본 발명은
a) 상이한 수준의 번역 후 변형을 갖는 초기 집단의 재조합 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 통류 방식으로 작동하는 양이온 교환 크로마토그래피(CEX) 매질과 접촉시키고;
b) CEX 매질에 결합하지 않는 재조합 폴리펩티드를 CEX 매질에 결합하는 재조합 폴리펩티드로부터 분리하고;
c) CEX 매질에 결합하지 않는 재조합 폴리펩티드를 회수함을 포함하는, 재조합 폴리펩티드의 번역 후 변형 수준을 강화시키는 방법을 제공하고;
여기서, CEX 매질에 결합하지 않는 재조합 폴리펩티드는, 결합된 재조합 폴리펩티드와 비교하여 보다 높은 수준의 번역 후 변형을 포함한다.
본 발명은
a) 상이한 수준의 번역 후 변형을 갖는 초기 집단의 재조합 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 제공하고;
b) 상기 조성물을 통류 방식으로 작동하는 양이온 교환 크로마토그래피(CEX) 매질과 접촉시키고;
c) CEX 매질에 결합하지 않는 재조합 폴리펩티드를 CEX 매질에 결합하는 재조합 폴리펩티드로부터 분리하고;
d) CEX 매질에 결합하지 않는 재조합 폴리펩티드를 회수함을 포함하는, 재조합 폴리펩티드의 번역 후 변형 수준을 강화시키는 방법을 제공하고;
여기서, CEX 매질에 결합하지 않는 재조합 폴리펩티드는, 결합된 재조합 폴리펩티드와 비교하여 보다 높은 수준의 번역 후 변형을 포함한다.
일부 양태에서, 상기 방법은 CEX 매질에 결합하지 않는 재조합 폴리펩티드를 회수함을 추가로 제공한다.
일부 양태에서, 번역 후 변형은 시알화 또는 감마-카복시글루타메이트 (Gla) 형성이다. 일부 양태에서, 번역 후 변형은 시알화이다.
일부 양태에서, CEX 매질에 결합하지 않는 재조합 폴리펩티드의 총 시알산 함량은 단백질 몰당 약 0.5 내지 약 6 몰의 시알산이고 이는 초기 집단의 재조합 폴리펩티드의 시알산 함량 보다 높다. 일부 양태에서, CEX 매질에 결합하지 않는 재조합 폴리펩티드의 총 시알산 함량은 단백질 몰당 약 0.5 내지 약 4몰의 시알산이고 초기 집단의 재조합 폴리펩티드의 시알산 함량 보다 높다. 일부 양태에서, CEX 매질에 결합하지 않는 재조합 폴리펩티드의 총 시알산 함량은 초기 집단의 재조합 폴리펩티드의 시알산 함량 보다 약 5% 내지 약 100% 높다. 일부 양태에서, CEX 매질에 결합하지 않는 재조합 폴리펩티드의 총 시알산 함량은 초기 집단의 재조합 폴리펩티드의 시알산 함량 보다 약 5% 내지 약 40% 높다. 일부 양태에서, CEX 매질에 결합하지 않는 재조합 폴리펩티드의 총 시알산 함량은 단백질의 몰당 약 12 내지 약 20몰의 시알산이다. 일부 양태에서, CEX 매질에 결합하지 않는 재조합 폴리펩티드의 총 시알산 함량은 단백질의 몰당 약 14 내지 약 17몰의 시알산이다.
일부 양태에서, 초기 집단의 재조합 폴리펩티드의 총 시알산 함량은 단백질의 몰당 약 10 내지 약 14몰의 시알산이다. 일부 양태에서, 초기 집단의 재조합 폴리펩티드의 총 시알산 함량은 단백질의 몰당 약 13 내지 14몰의 시알산이다.
일부 양태에서, 재조합 폴리펩티드는 Fc 도메인을 포함한다. 일부 양태에서, 재조합 폴리펩티드는 항체를 포함한다.
일부 양태에서, 재조합 폴리펩티드는 수용체의 리간드 결합 도메인을 포함하는 Fc 융합 폴리펩티드를 포함한다. 특정 양태에서, 상기 수용체는 TNF 수용체이다. 보다 특정 양태에서, 재조합 폴리펩티드는 에타너셉트이다.
일부 양태에서, 재조합 폴리펩티드는 응고 인자를 포함한다. 일부 양태에서, 재조합 폴리펩티드는 단량체-이량체 혼성체이다. 응고 인자의 예는 인자 VII (FVII), FVIIa, 인자 VIII (FVIII), 인자 IX (FIX), 또는 FIXa (FIX)를 포함한다. FVIII은 전장 FVIII 또는 B 도메인 결실된 FVIII일 수 있다. FVIII는 단일쇄 FVIII 또는 이원 쇄 FVIII일 수 있다.
일부 양태에서, 상기 접촉은 약 30 내지 약 100mg의 총 단백질/ml CEX 매질의 로딩 비율로 일어난다. 일부 양태에서, 상기 접촉은 약 33 내지 약 54mg의 총 단백질/ml CEX 매질의 로딩 비율로 일어난다. 일부 양태에서, 상기 접촉은 적어도 약 41mg의 총 단백질/ml CEX 매질의 로딩 비율로 일어잔다.
일부 양태에서, 상기 접촉은 약 4 내지 약 7의 pH에서 일어난다. 일부 양태에서, 상기 접촉은 약 5 내지 약 6의 pH에서 일어난다. 일부 양태에서, 상기 접촉은 약 5.5 내지 약 5.8의 pH에서 일어난다. 일부 양태에서, 상기 접촉은 적어도 약 5.6의 pH에서 일어난다.
일부 양태에서, 상기 접촉은 약 8 내지 약 12 mS/cm의 전도도에서 일어난다. 일부 양태에서, 상기 접촉은 약 9.5 내지 약 11 mS/cm의 전도도에서 일어난다. 일부 양태에서, 상기 접촉은 적어도 약 10mS/cm의 전도도에서 일어난다.
일부 양태에서, CEX 매질에 결합하지 않는 재조합 폴리펩티드는 약 25% 내지 약 80%의 초기 집단의 재조합 폴리펩티드를 포함한다. 일부 양태에서, CEX 매질에 결합하지 않는 재조합 폴리펩티드는 약 55% 내지 약 80%의 초기 집단의 재조합 폴리펩티드를 포함한다.
일부 양태에서, CEX 매질은 하기의 리간드 중 하나를 포함한다: 설포에틸; 설포프로필(sulphopropyl); 설포프로필(sulfopropyl); CH2-S03 -; CH2CH2CH2S03 -; S03 -; 또는 CH2-COO-. 일부 양태에서, CEX 매질은 설포에틸 리간드를 포함한다.
일부 양태에서, CEX 매질은 약 120 내지 약 160mg의 리소자임/ml 수지의 결합 능력을 포함한다.
일부 양태에서, 재조합 폴리펩티드는 진핵 숙주 세포에 의해 제조된다. 특정 양태에서, 진핵 숙주 세포는 포유동물 숙주 세포이다.
일부 양태에서, 상기 접촉은 제조 규모로 수행된다.
일부 양태에서, 상기 조성물은 적어도 하나의 불순물을 추가로 포함한다. 불순물의 예는 DNA, RNA, 지질 또는 단백질을 포함한다. 일부 양태에서, 불순물은 단백질을 포함한다. 단백질 불순물의 예는 절단된 형태의 재조합 폴리펩티드, 응집된 형태의 재조합 폴리펩티드 또는 잘못 폴딩된 형태의 재조합 폴리펩티드를 포함한다.
일부 양태에서, 상기 방법은 CEX 매질에 결합하지 않는 재조합 폴리펩티드를 포함하는 최종 조성물을 제공하고, 여기서, 상기 최종 조성물은 초기 집단의 폴리펩티드를 포함하는 조성물 보다 적은 불순물을 포함한다.
도 1은 시알화된 에타너셉트의 강화를 위한 SE 하이캡 크로마토그램을 설명한다. 로딩 비율은 31 mg/ml이고, 로딩 pH는 5.6이고, 로딩 전도도는 10 mS/cm이었다. 생성물 수율은 67%이고, 생성물의 총 시알산은 15몰의 시알산/단백질 몰이었다. 피크 1은 클립된(clipped) 에타너셉트로 구성된다. 피크 2는 천연 에타너셉트로 구성된다. 피크 3은 잘못 폴딩된 에타너셉트로 구성된다.
도 2는 다양한 CEX 수지 (SE 하이캡, SP 세파로스, SP 세파로스 XL, Nuvia S, Eshmuno, GigaCap S, 및 GigaCap CM)에 의한 에타너셉트의 TSA 강화의 비교를 설명한다. 상기 결과는 50% 생성물 수율로 정규화되었다.
도 3은 다양한 CEX 수지(SE 하이캡, SP 세파로스, SP 세파로스 XL, Nuvia S, Eshmuno, GigaCap S, 및 GigaCap CM)에 의한 에타너셉트를 포함하는 조성물로부터 제거된 불순물의 비교를 설명한다. 상기 결과는 50% 생성물 수율로 정규화되었다.
본 발명은 크로마토그래피 매질의 사용을 통해 재조합 폴리펩티드의 번역 후 변형 수준을 강화시키는 방법에 관한 것이다. 바람직한 양태에서, 상기 크로마토그래피 매질은 통류 방식 작동에 사용되는 이온 교환 크로마토그래피 매질이다.
명세서 및 청구항의 명백한 이해를 제공하기 위해, 하기의 정의가 제공된다.
정의
용어 "a" 또는 "an" 실체는 상기 실체의 하나 이상을 언급하는 것으로 주지되어야 하고; 예를 들어, "뉴클레오티드 서열"은 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 나타내는 것으로 이해된다. 이와 같이, 용어 "a" (또는 "an"), "하나 이상" 및 "적어도 하나"는 본원에서 상호교환적으로 사용될 수 있다.
추가로, 본원에 사용되는 경우 "및/또는"은 다른 것의 존재 또는 부재하에 2개의 특정된 특징 또는 성분들 각각의 특정 기재로서 취해져야만 한다. 따라서, 본원 사용된 바와 같은 용어 "및/또는", 예를 들어, 본원에서 "A 및/또는 B"는 "A 및 B", "A 또는 B", "A" (단독) 및 "B" (단독)을 포함하는 것으로 의도된다. 마찬가지로, 문구에 사용된 바와 같은 용어 "및/또는", 예를 들어, "A, B, 및/또는 C"는 하기의 측면 중 각각을 포함하는 것으로 의도된다: A, B, 및 C; A, B, 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A (단독); B (단독); 및 C (단독).
측면이 용어 "포함하는"과 함께 본원에 기재되는 경우, "로 이루어진" 및/또는 "로 필수적으로 이루어진"과 관련하여 기재된 다른 유사한 측면이 또한 제공되는 것으로 이해된다.
달리 정의되지 않는 경우, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본원 기재와 관련된 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 예를 들어, 문헌[참조: the Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press; and the Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Press]은 당업자에게 본원에 사용된 많은 용어의 일반 사전적 의미를 제공한다.
단위, 접두어, 및 심볼은 기관[Systeme International de Unites (SI)]에서 허용된 형태로 나타낸다. 수치적 범위는 상기 범위를 한정하는 숫자를 포함한다. 달리 지적되지 않는 경우, 아미노산 서열은 좌측에서 우측으로 아미노에서 카복시 배향으로 기술된다. 본원에 제공된 표제는 전반적으로 본 명세서에서 참조될 수 있는 본원의 다양한 측면의 제한은 없다. 따라서, 바로 아래에 한정된 용어는 이의 전문이 본원에 참조로 보다 완전하게 정의된다.
용어 "약"은 대략적으로, 거의, 주변에 또는 이의 영역 내를 의미하기 위해 본원에 사용된다. 용어 "약"이 수치적 범위와 연계하여 사용되는 경우, 이것은 제시된 수치 값 초과 및 미만으로 경계를 연장함에 의해 상기 범위를 변형시킨다. 일반적으로, 용어 "약"은 예를 들어, 10% 상향 또는 하향(보다 높거나 보다 낮은)변수에 의해 진술된 값 초과 및 미만의 수치적 값을 변형시킬 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "단백질" 또는 "폴리펩티드"는 천연 아미노산 또는 비-천연 아미노산의 2개 이상의 중합체를 언급한다.
폴리펩티드는 단량체 또는 다량체일 수 있다. 예를 들어, 하나의 양태에서, 본 발명의 단백질은 이량체이다. 본 발명의 이량체성 폴리펩티드는 2개의 폴리펩티드 쇄를 포함할 수 있거나 하나의 폴리펩티드 쇄(예를 들어, scFc 분자의 경우에)로 이루어질 수 있다. 하나의 양태에서, 본 발명의 이량체는 동종이량체이고 2개의 동일한 단량체성 하부단위 또는 폴리펩티드(예를 들어, 2개의 동일한 Fc 모이어티 또는 2개의 동일한 생물학적 활성 모이어티)를 포함한다. 또 다른 양태에서, 본 발명의 이량체는 이종이량체이고 2개의 동일하지 않은 단량체성 하부단위 또는 폴리펩티드(예를 들어, 2개의 상이한 응고 인자 또는 이의 부분 또는 유일한 하나의 응고 인자)를 포함한다. 예를 들어, 이의 전문이 본원에 참조로 인용되는 미국 특허 제7,404,956호를 참조한다.
"재조합적으로 벌현된 폴리펩티드" 및 "재조합 폴리펩티드"는 상기 폴리펩티드를 발현시키기 위해 유전학적으로 가공된 숙주 세포로부터 발현된 폴리펩티드를 언급한다. 재조합적으로 발현된 폴리펩티드는 포유동물 숙주 세포에서 정상적으로 발현되는 폴리펩티드와 동일하거나 유사할 수 있다. 상기 재조합적으로 발현된 폴리펩티드는 또한 숙주 세포에 외래성일 수 있고, 즉 포유동물 숙주 세포에 정상적으로 발현되는 펩티드에 이종성일 수 있다. 대안적으로, 상기 재조합적으로 발현된 폴리펩티드는 폴리펩티드 부분이 포유동물 숙주 세포에 정상적으로 발현되는 폴리펩티드와 동일하거나 유사한 아미노산 서열을 함유하고 다른 부분은 숙주 세포에 외래성일 수 있다는 점에서 키메라성일 수 있다. 숙주 세포에서 발현 가능한 임의의 폴리펩티드는 본 발명에 따라 제조될 수 있다. 폴리펩티드는 숙주 세포에 내인성인 유전자로부터 또는 유전학적 가공을 통해 숙주 세포로 도입된 유전자로부터 발현될 수 있다. 상기 폴리펩티드는 천연적으로 존재하는 하나 일 수 있거나 대안적으로 인간의 손에 의해 가공되거나 선택된 서열을 가질 수 있다. 가공된 폴리펩티드는 개별적으로 천연에 존재하는 다른 폴리펩티드 분절로부터 어셈블리되거나 천연적으로 존재하지 않는 하나 이상의 분절을 포함할 수 있다. 본 발명에 따라 바람직하게 발현될 수 있는 폴리펩티드는 흔히 목적하는 생물학적 또는 화학적 활성을 기준으로 선택된다. 예를 들어, 본 발명은 임의의 약제학적으로 또는 상업적으로 관련된 효소, 수용체, 항체, 호르몬, 조절 인자, 항원, 결합제 등을 발현하기 위해 사용될 수 있다.
또 다른 펩티드의 "변이체"인 폴리펩티드는 출발 폴리펩티드와 비교하여 하나 이상의 돌연변이를 가질 수 있고, 예를 들어, 하나 이상의 아미노산 잔기가 또 다른 아미노산 잔기로 치환되거나 하나 이상의 아미노산 잔기 삽입 또는 결실을 갖는다. 하나의 양태에서, 폴리펩티드는 천연적으로 존재하지 않는 아미노산 서열을 포함한다. 상기 변이체는 필연적으로 출발 폴리펩티드와 100% 미만의 서열 동일성 또는 유사성을 갖는다. 또 다른 양태에서, 상기 변이체는 출발 폴리펩티드의 아미노산 서열과 약 75% 내지 100% 미만의 아미노산 서열 동일성 또는 유사성을 갖고, 예를 들어, 변이체 분자의 길이에 대해, 예를 들어, 출발 폴리펩티드의 아미노산 서열과 약 80% 내지 100% 미만, 약 85% 내지 100% 미만, 약 90% 내지 100% 미만 (예를 들어, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) 및 약 95% 내지 100% 미만의 아미노산 서열 동일성 또는 유사성을 갖는다. 하나의 양태에서, 출발 폴리펩티드 서열과 이로부터 유래된 서열 간에 하나의 아미노산 차이가 있다. 상기 서열과 관련하여 동일성 또는 유사성은 상기 서열을 정렬하고 필요한 경우 최대 % 서열 동일성을 성취하기 위해 갭을 도입한 후 출발 아미노산 잔기와 동일한(즉, 동일한 잔기) 후보 서열에서 아미노산 잔기의 %로서 본원에 정의된다.
"융합" 또는 "키메라" 단백질은 이것이 천연적으로는 연결되어 있지 않은 제2 아미노산 서열에 연결된 제1 아미노산 서열을 포함한다. 별도의 단백질에서 정상적으로 존재하는 아미노산 서열은 융합 폴리펩티드에 함께 도입될 수 있거나 동일한 단백질에 정상적으로 존재하는 아미노산 서열은 융합 폴리펩티드, 예를 들어, 본 발명의 인자 VIII 도메인과 IgFc 도메인의 융합체에서 새로운 정렬로 위치할 수 있다. 융합 단백질은 예를 들어, 화학적 합성에 의해 제조되거나 펩티드 영역이 목적하는 관계로 암호화된 폴리뉴클레오티드를 제조하고 번역시킴에 의해 제조된다. 키메라 단백질은 공유, 비-펩티드 결합 또는 비공유 결합에 의해 제1 아미노산 서열과 연합된 제2 아미노산 서열을 추가로 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "응집체"는 폴리펩티드 응집체를 언급한다. 이것은 정제될 재조합 폴리펩티드의 다량체(예를 들어, 이량체, 사량체 또는 보다 높은 정도의 응집체)를 포함하고 예를 들어, 고분자량의 응집체로 유도될 수 있다.
용어 "크로마토그래피"는 목적하는 재조합 폴리펩티드를 혼합물 중에 존재하는 다른 분자로부터 분리하는 임의의 종류의 기술을 언급한다. 일반적으로 목적하는 재조합 폴리펩티드는 결합 친화성의 차이의 결과로서 다른 분자로부터 분리된다.
분자가 크로마토그래피 수지에 "결합하는" 용어는 상기 분자가 리간드-단백질 상호작용에 의해 크로마토그래피 수지내 또는 크로마토그래피 수지상에 가역적으로 고정화되도록 하는 적당한 조건(예를 들어, pH/전도도)하에 상기 분자를 크로마토그래피 수지에 노출시킴을 의미한다. 비제한적인 예는 상기 분자와 이온 교환 물질 및 면역글로불린의 하전된 그룹 또는 하전된 그룹들 간의 이온 상호작용을 포함한다.
본원에서 상호교환적으로 사용되는 바와 같은 용어 "통류", "통류 과정", "통류 방식" 및 "통류 크로마토그래피"는 생성물 분리 기술을 언급하고, 여기서, 샘플내 함유된 적어도 하나의 생성물(예를 들어, 특이적 번역 후 변형을 갖는 재조합 폴리펩티드)은 크로마토그래피 수지 또는 매질을 통류하도록 의도되고 적어도 하나의 잠재적 오염물 또는 불순물은 상기 크로마토그래피 수지 또는 매질에 결합한다.
용어 "크로마토그래피 수지", "크로마토그래피 매질(media)" 및 "크로마토그래피 매질(medium)"은 상호교환적으로 사용되고, 목적하는 재조합 폴리펩티드를 혼합물 중에 존재하는 다른 분자로부터 분리하는 임의의 종류의 고형상을 언급한다. 일반적으로, 목적하는 재조합 폴리펩티드는 임의의 공지되거나 후속적으로 기재되거나 개발된 크로마토그래피 매질 또는 매트릭스를 사용하여 혼합물 중 다른 분자와 목적하는 재조합 폴리펩티드 간의 결합 친화성 차이의 결과로서 다른 분자로부터 분리된다. 상기 매질의 제한 없는 예는 다음을 포함한다: 이온 교환 매질; 음이온 교환 매질; 양이온 교환 매질; 하이드록시애퍼타이트 매질; 소수성 상호작용 크로마토그래피 매질; 항체-친화성 매질(예를 들어, 단백질-A 또는 이의 변이체); 면역글로불린 Fc-영역 친화성 매질(예를 들어, Fc-수용체 친화성 매질); 및, 리간드-친화성 매질; 수용체-친화성 매질; 및 혼합 방식 매질.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "이온 교환" 및 "이온 교환 크로마토그래피"는 크로마토그래피 공정을 언급하기 위해 사용되고 여기서, 목적하는 재조합 폴리펩티드는 고형상 이온 교환 물질에 연결된 (예를 들어, 공유 부착에 의해) 하전된 화합물과 상호작용하거나 상호작용하지 않아 목적하는 재조합 폴리펩티드는 혼합물 중에 다른 재조합 폴리펩티드 또는 불순물 보다 크거나 적게 하전된 화합물과 비특이적으로 상호작용한다. 혼합물 중의 오염물은 목적하는 재조합 폴리펩티드 보다 신속하거나 느리게 이온 교환 물질의 칼럼으로부터 용출되거나 목적하는 재조합 폴리펩티드에 상대적으로 수지에 결합되거나 이로부터 배제된다. "이온 교환 크로마토그래피"는 구체적으로 양이온 교환, 음이온 교환 및 혼합 방식의 이온 교환 크로마토그래피를 포함한다.
폴리펩티드의 "pI" 또는 "등전점"은 폴리펩티드의 양전하가 이의 음전하와 균형을 이루는 pH를 언급하고, pI는 폴리펩티드의 부착된 탄수화물의 아미노산 잔기 또는 시알산 잔기의 총 전하로부터 계산되거나 등전점 포커싱에 의해 결정될 수 있다.
용어 "이온 교환 물질"은 음으로 하전(즉, 양이온 교환 수지) 또는 양으로 하전(즉, 음이온 교환 수지)된 고형상을 언급한다. 상기 전하는 하나 이상의 하전된 리간드를 고형상에 부착시킴에 의해, 예를 들어, 공유 결합에 의해 제공될 수 있다. 대안적으로, 또는 추가로, 전하는 고형상의 고유 성질일 수 있다(예를 들어, 전체 음전하를 갖는, 실리카에 대한 경우에서와 같이).
용어 "음이온 교환 수지" 또는 "AEX"는 양으로 하전된 고형상, 예를 들어, 여기에 부착된 4급 아미노 그룹과 같은 하나 이상의 양으로 하전된 리간드를 갖는 고형상을 언급한다. 시판되는 음이온 교환 수지는 DEAE 셀룰로스, QAE SEPHADEX™ 및 FAST Q SEPHAROSE™ (Pharmacia)을 포함한다. 음이온 교환 크로마토그래피는 표적 분자(예를 들어, Fc 영역 함유 표적 단백질)에 결합하고 이어서 용출될 수 있거나 주로 불순물에 결합하고 표적 분자는 칼럼을 "통류"한다.
용어 "양이온 교환 수지" 또는 "CEX"는 음으로 하전되고 따라서 고형상에 통과되거나 이를 통류하는 수용액 중 양이온과의 교환을 위한 유리된 양이온을 갖는 고형상을 언급한다. 양이온 교환 수지를 형성하기 위해 고형상에 부착된 음으로 하전된 리간드는 예를 들어, 탄수화물 또는 설포네이트일 수 있다. 예를 들어, 양이온 교환 크로마토그래피는 수지가 표적 분자(예를 들어, Fc 영역 함유 표적 단백질)에 결합하고 이어서 용출되는(양이온 교환 결합 및 용출 크로마토그래피 또는 "CIEX") 조건하에서 수행될 수 있다. 대안적으로, CEX는 이것이 주로 불순물에 결합하고 표적 분자는 칼럼(양이온 교환 통류 크로마토그래피)을 "통류"하는 방식으로 전개될 수 있다. 시판되는 CEX 수지는 Fractogel SE 하이캡, GE SPXL, GE SP 세파로스, Millipore Eshmuno S, Tosoh Gigacap CM, Tosoh Gigacap S-650, 또는 BioRad Nuvia S를 포함한다. 용어 "양이온 교환 수지" 또는 "CEX"는 또한 크로마토그래피의 양이온 교환 방식으로 부분적으로 또는 전체적으로 작동되는 혼합 방식 수지를 언급한다. 시판되는 혼합 방식 수지는 Capto MMC를 포함한다. 본원에 기재된 변형 방법은 통류 방식으로 수행되는 양이온 교환 크로마토그래피 단계를 사용한다.
크로마토그래피 방법
본 발명은 "통류" 작동 방식을 사용하고, 여기서, 재조합 폴리펩티드는 크로마토그래피 매질(또는 다른 매트릭스)과 접촉하도록 허용된다. 상기 접촉 동안에, 선택된 특성(예를 들어, 특정 번역 후 변형)을 갖는 재조합 폴리펩티드는 우선적으로 크로마토그래피 매질 (또는 다른 매트릭스)에 결합하지 않고 선택된 특성을 갖지 않거나 선택된 특성이 적은 재조합 폴리펩티드(또한 다른 불순물) (예를 들어, 보다 낮은 총 네트 음전하 또는 보다 낮은 시알산 함량을 갖는 재조합 폴리펩티드)는 매질(또는 매트릭스)에 결합한다. 강화된 재조합 폴리펩티드를 함유하는 통류물이 회수된다. 수득된 재조합 폴리펩티드 혼합물은 크로마토그래피 매질과 접촉하기 전 초기 집단의 재조합 폴리펩티드를 함유하는 조성물과 비교하여 선택된(표적) 특성을 갖는 보다 높은 농도의 생성물로 강화된다.
일부 양태에서, 본 발명은 재조합 폴리펩티드를 선택적으로 강화시키는 것에 관한 것이고, 여기서, 상기 선택되거나 목적하는 생성물 속성은 증가되거나 증진된 시알산 함량의 전체 (총) 수준을 갖는다. 일부 양태에서, 증가된 총 시알산 함량을 갖는 재조합 폴리펩티드는 교환 크로마토그래피 매질(예를 들어, SE Hicap) 집단을 함유하는 조성물을 재조합 폴리펩티드의 혼합물과 접촉시킴에 의해 수득된다. 목적하지 않은 생성물 (예를 들어, 보다 낮은 시알산 함량 및 다른 불순물을 갖는 생성물)은 크로마토그래피 매질에 결합하는 것으로 허용되고 이어서 선택된 생성물(높은 시알산 함량을 갖는)은 칼럼을 통해 통류시키고 회수된다.
본 발명의 방법은 임의의 수의 물리학적, 생물학적 및/또는 화학적 특성을 기준으로 재조합 폴리페타이드의 분리/정제에 채택되고 적용될 수 있다. 예를 들어, 생성물 이소형은 적당한 흡착제(예를 들어, 소수성을 기초로 하는 분리를 위한 전하 기반 분리 및 소수성 흡착제를 위한 강하거나 약한 양이온 교환 수지와 같은)를 사용함에 의해 전하 및/또는 소수성을 기초로 선택적으로 분리될 수 있다. 추가로, 본 발명의 방법은 2개의 직교 생성물 속성(예를 들어, 전하 및 소수성)을 기초로 하는 분리를 위한 혼합 방식 크로마토그래피(혼합 방식 매체)를 사용하여 적용될 수 있다.
일부 양태에서, 본 발명은 상이한 수준의 번역 후 변형을 갖는 초기 집단의 재조합 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 통류 방식으로 작동하는 양이온 교환 크로마토그래피(CEX) 매질과 접촉시킴을 포함하는, 재조합 폴리펩티드의 번역 후 변형 수준을 강화하거나, 증가시키거나, 증진시키거나, 증강시키는 방법에 관한 것이고; 여기서, CEX 매질에 결합하지 않는 재조합 폴리펩티드는 CEX 매질에 결합하는 재조합 폴리펩티드로부터 분리되고, CEX 매질에 결합하지 않는 재조합 폴리펩티드는 결합된 재조합 폴리펩티드와 비교하여 보다 높거나 증가된 수준의 번역 후 변형을 포함한다.
일부 양태에서, CEX 매질에 결합하지 않는 재조합 폴리펩티드는 CEX 수지에 결합하는 폴리펩티드 또는 다른 불순물 보다 음으로 하전되어 있다. 일부 양태에서, 본 발명은 CEX 매질에 결합하지 않는 재조합 폴리펩티드를 회수함을 추가로 포함한다.
일부 양태에서, 보다 높은 수준의 특이적 번역 후 변형을 갖는 재조합 폴리펩티드는 통류 방식으로 작동하는 CEX 매질의 사용을 통해 보다 낮은 수준의 번역 후 변형을 갖는 재조합 폴리펩티드로부터 분리된다. "분리"는 폴리펩티드 및 하나 이상의 불순물 또는 오염물을 포함하는 조성물 또는 샘플로부터 목적하는 재조합 폴리펩티드의 순도를 증가시킴을 언급한다. 일부 양태에서, 목적하는 재조합 폴리펩티드는 전하 사용을 통해 조성물에서 다른 폴리펩티드 또는 불순물로부터 분리된다. 일부 양태에서, 목적하는 재조합 폴리펩티드는 목적하는 재조합 폴리펩티드가 통류 방식으로 작동하는 CEX 매질에 결합하지 않도록 하는, 조성물에서 다른 폴리펩티드 또는 불순물 보다 음으로 하전되어 있다. 일부 양태에서, 목적하는 재조합 폴리펩티드의 순도의 정도는 상기 조성물로부터 적어도 하나의 불순물을 제거(완전히 또는 부분적으로)함에 의해 증가된다. 일부 양태에서, 번역 후 변형은 시알화 또는 감마-카복시글루타메이트(Gla) 형성이다.
일부 양태에서, 번역 후 변형은 시알화이다. 시알화는 인간 당화의 최종 단계이다. 총 시알산 잔기는 소정의 재조합 폴리펩티드 상에서 시알산 잔기의 총수를 언급한다. 단백질의 시알화는 당화된 단백질의 생체내 생물학적 활성이 분자당 시알산 단위의 수에 의존하는 것으로 공지되어 있기 때문에 단백질 기능에 중요하다. [문헌참조: Shiestl, M., et al. Nature Biotechnology 29(4):310 (2011)]. 시알산 빈도의 상실은 감소된 당단백질 용해도 및 감소된 순환 반감기를 유도한다. 결과로서, 재조합 폴리펩티드의 정제 및 치료학적 효과는 시알산 함량에 의존한다. 폴리펩티드의 당화 프로필은 생산 세포주 유형, 성장 조건 및 폴리펩티드 서열을 포함하는 많은 인자에 의해 영향을 받을 수 있다. [문헌참조: Shiestl, M., et al. Nature Biotechnology 29(4):310 (2011)].
일부 양태에서, 재조합 폴리펩티드의 총 시알산 함량은 단백질 몰 당 약 0.5 내지 약 6, 약 1 내지 약 4, 또는 약 1 내지 약 3 몰의 시알산이고 이는 초기 집단의 재조합 폴리펩티드의 시알산 보다 높다. 일부 양태에서, 재조합 폴리펩티드의 총 시알산 함량은 단백질 몰 당 약 0.6 내지 약 2.7 몰의 시알산이고 이는 초기 집단의 재조합 폴리펩티드의 시알산 보다 높다. 일부 양태에서, 재조합 단백질의 총 시알산 함량은 단백질의 몰 당 적어도 약 0.5, 적어도 약 1.0, 적어도 약 1.5, 적어도 약 2.0, 적어도 약 2.5, 적어도 약 3.0, 적어도 약 3.5, 적어도 약 4.0, 적어도 약 4.5, 적어도 약 5.0, 적어도 약 5.5, 또는 적어도 약 6.0몰의 시알산이고 이는 초기 집단의 재조합 폴리펩티드의 시알산 보다 높다.
일부 양태에서, CEX 배지에 결합하지 않은 재조합 폴리펩티드의 총 시알산 함량은 초기 집단의 재조합 폴리펩티드를 함유하는 조성물의 것 보다 약 5% 내지 약 100%, 약 5% 내지 약 90%, 약 5% 내지 약 80%, 약 5% 내지 약 70%, 약 5% 내지 약 60%, 약 5% 내지 약 50%, 및 약 5% 내지 약 40% 더 높다. 일부 양태에서, CEX 매질에 결합하지 않는 재조합 폴리펩티드의 총 시알산 함량은 초기 집단의 재조합 폴리펩티드를 함유하는 조성물의 것 보다 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99% 또는 적어도 약 100% 더 높다.
일부 양태에서, CEX 매질에 결합하지 않는 재조합 폴리펩티드의 총 시알산 함량은 단백질의 몰당 약 13 내지 약 20, 약 13.5 내지 약 19, 약 14 내지 약 18, 약 14 내지 약 17, 또는 약 14 내지 약 16.5 몰의 시알산이다. 일부 양태에서, CEX 매질에 결합하지 않는 재조합 폴리펩티드의 총 시알산 함량은 약 14.1 내지 약 16.2이다.
일부 양태에서, 초기 집단의 재조합 폴리펩티드의 초기 함량의 총 시알산 함량은 단백질의 몰당 약 10 내지 약 14, 약 10.5 내지 약 14, 약 11 내지 약 14, 약 11,5 내지 약 14, 약 12 내지 약 14, 약 12.5 내지 약 14, 또는 약 13 내지 약 14몰의 시알산이다. 일부 양태에서, 초기 집단의 재조합 폴리펩티드의 총 시알산 함량은 단백질의 몰당 적어도 약 10, 적어도 약 10.5, 적어도 약 11, 적어도 약 11.5, 적어도 약 12, 적어도 약 12.5, 적어도 약 13, 적어도 약 13.5 또는 적어도 약 14몰의 시알산이다. 일부 양태에서, 초기 집단의 재조합 폴리펩티드의 총 시알산 함량은 단백질의 몰 당 적어도 약 13.5 몰이다.
일부 양태에서, 번역 후 변형은 감마-카복시글루타메이트 (Gla) 형성이다. 카복실화/감마-카복시글루탐산 (GLA) 도메인은 비타민-K 의존성 도메인이다. GLA 도메인에서, 비타민 K는 감마-카복시글루타메이트(Gla)를 형성하기 위해 글루타메이트 잔기의 카복실화를 매개한다. [문헌참조: Vermeer, C. Biochem J. 266: 625-636 (1990)]. Gla는 칼슘 결합에 주요 역할을 수행하고 응고 인자 단백질에서 특이적 형태 전이를 위해 중요한 것으로 밝혀졌다. [문헌참조: Freedman, S.J. et al., J. Biol. Chem. 271(27): 16227-36 (1996)].
일부 양태에서, CEX 매질에 결합하지 않는 재조합 폴리펩티드의 Gla 함량은 초기 집단의 재조합 폴리펩티드의 것 보다 약 5% 내지 약 100%, 약 5% 내지 약 90%, 약 5% 내지 약 80%, 약 5% 내지 약 70%, 약 5% 및 약 60%, 약 5% 내지 약 50%, 및 약 5% 내지 약 40% 더 높다.
일부 양태에서, CEX 매질에 결합하지 않는 재조합 폴리펩티드의 총 Gla 함량은 초기 집단의 재조합 폴리펩티드의 것 보다 약 5% 내지 약 100%, 약 5% 내지 약 90%, 약 5% 내지 약 80%, 약 5% 내지 약 70%, 약 5% 내지 약 60%, 약 5% 내지 약 50%, 및 약 5% 내지 약 40% 더 높다.
본 발명의 일부 양태에서, "통류" 작동 방식의 크로마토그래피 매질은 특이적 번역 후 변형을 갖는 재조합 폴리펩티드의 조성물을 강화시키기 위해 사용된다.
로딩 비율은 매질의 용적 당 크로마토그래피 매질과 접촉하는 조성물의 총 양을 기재한다. 로딩 비율이 너무 높은 경우, 이어서, 통류 방식의 칼럼 전개의 경우에, 일부 불순물은 매질에 결합할 수 없다. 일부 양태에서, 상기 조성물과 매질의 접촉은 적어도 약 30 mg의 총 단백질/ml CEX 매질, 적어도 약 35 mg의 총 단백질/ml CEX 매질, 적어도 약 40 mg의 총 단백질/ml CEX 매질, 적어도 약 45 mg의 총 단백질/ml CEX 매질, 적어도 약 50 mg의 총 단백질/ml CEX 매질, 적어도 약 55 mg의 총 단백질/ml CEX 매질, 적어도 약 60 mg의 총 단백질/ml CEX 매질, 적어도 약 70 mg의 총 단백질/ml CEX 매질, 적어도 약 80 mg의 총 단백질/ml CEX 매질, 적어도 약 90 mg의 총 단백질/ml CEX 매질, 적어도 약 100 mg의 총 단백질/ml CEX 매질, 적어도 약 110 mg의 총 단백질/ml CEX 매질, 적어도 약 120 mg의 총 단백질/ml CEX 매질, 적어도 약 130 mg의 총 단백질/ml CEX 매질, 적어도 약 140 mg의 총 단백질/ml CEX 매질, 또는 적어도 약 150 mg의 총 단백질/ml CEX 매질의 로딩 비율로 일어난다. 일부 양태에서, 상기 접촉은 41 mg의 총 단백질/ml CEX 매질의 로딩 비율로 일어난다. 일부 양태에서, 조성물과 매질의 접촉은 약 30 mg의 총 단백질/ml CEX 매질 및 약 150 mg의 총 단백질/ml CEX 매질, 약 30 mg의 총 단백질/ml CEX 매질 및 125 mg의 총 단백질/ml CEX 매질, 약 30 mg의 총 단백질/ml CEX 매질 및 100 mg의 총 단백질/ml CEX 매질, 약 30 mg의 총 단백질/ml CEX 매질 및 75 mg의 총 단백질/ml CEX 매질, 약 30 mg의 총 단백질/ml CEX의 매질 및 60 mg의 총 단백질/ml CEX 매질, 또는 약 33 mg의 총 단백질/ml CEX 매질 및 54 mg의 총 단백질/ml CEX 매질의 로딩 비율에서 일어난다.
상기 접촉 단계의 pH는 어느 하전된 분자가 칼럼에 결합할 것인지 및 결합하지 않을 것인지를 결정하기 때문에 중요하다. 일부 양태에서, 상기 조성물과 배지의 접촉은 적어도 약 3, 적어도 약 4, 적어도 약 5, 적어도 약 5.5, 적어도 약 6, 적어도 약 6.5, 적어도 약 7, 적어도 약 8 또는 적어도 약 9의 pH에서 일어난다. 일부 양태에서, 상기 접촉은 5.6의 pH에서 일어난다. 일부 양태에서, 조성물과 배지의 접촉은 약 3 내지 약 9, 약 4 내지 약 8, 약 4 내지 약 7, 약 5 내지 약 7, 약 5 내지 약 6 또는 약 5.5 내지 약 5.8의 pH에서 일어난다.
상기 접촉 단계의 전도도는 이것이 어느 분자가 칼럼에 결합하고 어느 것이 결합하지 않을 것인지를 결정하기 때문에 중요하다. 일부 양태에서, 상기 조성물과 배지의 접촉은 적어도 약 8 mS/cm, 적어도 약 8.5 mS/cm, 적어도 약 9 mS/cm, 적어도 약 10 mS/cm, 적어도 약 10.5 mS/cm, 적어도 약 11 mS/cm, 적어도 약 11.5 mS/cm, 적어도 약 12 mS/cm, 적어도 약 12.5 mS/cm, 또는 적어도 약 13 mS/cm의 전도도에서 일어난다. 일부 양태에서, 상기 접촉은 10 mS/cm의 전도도에서 일어난다. 일부 양태에서, 상기 접촉은 약 8 mS/cm 내지 약 12 mS/cm, 약 8.5 mS/cm 내지 11.5 mS/cm, 약 9 mS/cm 내지 약 11.5 mS/cm, 약 9 mS/cm 내지 약 11 mS/cm, 또는 약 9.5 mS/cm 내지 11 mS/cm의 전도도에서 일어난다.
일부 양태에서, 상기 크로마토그래피 매질은 이온 교환 매질; 음이온 교환 매질; 양이온 교환 매질; 하이드록시애퍼타이트 매질; 소수성 상호작용 크로마토그래피 매질; 항체 친화성 매질(예를 들어, 단백질-A 또는 이의 변이체); 면역글로불린 Fc-영역 친화성 매질 (예를 들어, Fc-수용체 친화성 매질); 및, 리간드-친화성 매질; 수용체-친화성 매질; 또는 혼합 방식 매질이다. 바람직한 양태에서, 크로마토그래피 매질은 CEX 수지이다. 본 발명의 양태는 임의의 공지되거나 후속적으로 기재되거나 개발된 CEX 크로마토그래피 매질 또는 매트릭스의 사용을 포함한다. 일부 양태에서, CEX 수지는 Fractogel SE 하이캡, GE SPXL, GE SP 세파로스, Millipore Eshmuno S, Tosoh Gigacap CM, Tosoh Gigacap S-650, BioRad Nuvia S, 또는 Capto MMC이다. 일부 양태에서, 상기 CEX 매질은 설포에틸; 설포프로필; 설포프로필; CH2-SO3 -; CH2CH2CH2SO3 -; SO3 -; CH2-COO-; 또는 다중방식 약한 양이온 교환제인 리간드를 포함한다. 일부 양태에서, CEX 매질은 가교결합된 폴리메타크릴레이트, 덱스트란 표면 연장제를 갖는 6% 가교결합된 아가로스, 아가로스, 표면 그래프트된 경질 폴리비닐 에테르 친수성 중합체 또는 고도로 가교결합된 아가로스인 매트릭스를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 CEX 매질은 임의의 공지된 매트릭스이다. 일부 양태에서, CEX 매질은 설포에틸 리간드를 포함한다. 일부 양태에서, CEX 수지는 Fractogel SE 하이캡이다.
일부 양태에서, CEX 매질은 약 100 내지 약 200 mg의 리소자임/ml 수지, 약 110 내지 190 mg 리소자임/ml 수지, 약 120 내지 약 180 mg 리소자임/ml 수지, 약 120 내지 약 170 mg 리소자임/ml 수지, 약 120 내지 약 160 mg 리소자임/ml 수지, 또는 약 125 내지 160 mg 리소자임/ml 수지의 결합 능력 또는 리간드 능력을 포함한다.
매질과 조성물 간의 이온 교환율은 온도가 상승함에 따라 증가한다. 온도는 또한 칼럼의 선택성에 영향을 줄 수 있다. 일부 양태에서, 조성물과 매질의 접촉 동안에 온도는 약 16℃ 내지 약 26℃, 약 18 내지 약 24℃, 또는 약 20 내지 약 23℃이다. 일부 양태에서, 상기 조성물과 매질의 접촉 동안에 온도는 적어도 약 15 ℃, 적어도 약 16℃, 적어도 약 17℃, 적어도 약 18℃, 적어도 약 19℃, 적어도 약 20℃, 적어도 약 21℃, 적어도 약 22℃, 적어도 약 23℃, 적어도 약 24℃, 적어도 약 25℃, 적어도 약 26℃ 또는 적어도 약 30℃이다. 일부 양태에서, 상기 조성물과 매질의 접촉 동안에 온도는 약 22℃이다.
보다 높은 유속은 공정 시간을 감소시키지만 보다 높은 유속이 상기 조성물과 매질 간의 감소된 접촉 시간으로 인한 분리의 효율을 감소시킬 수 있다. 일부 양태에서, 상기 공정 유속은 약 75 cm/hr 내지 약 150 cm/hr, 약 100 cm/hr 내지 약 150 cm/hr, 또는 약 120 cm/hr 내지 약 150 cm/hr이다. 일부 양태에서, 상기 공정 유속은 적어도 약 75 cm/hr, 적어도 약 80 cm/hr, 적어도 약 90 cm/hr, 적어도 약 100 cm/hr, 적어도 약 110 cm/hr, 적어도 약 115 cm/hr, 적어도 약 120 cm/hr, 적어도 약 125 cm/hr, 적어도 약 130 cm/hr, 적어도 약 135 cm/hr, 적어도 약 140 cm/hr, 또는 적어도 약 150 cm/hr이다. 일부 양태에서, 상기 공정 유속은 약 125 cm/hr이다.
본 발명의 양태는 제조 규모에서 선택된 재조합 폴리펩티드를 회수하기 위한 방법을 포함하고, 여기서, 상기 선택된 재조합 폴리펩티드가 치료학적으로 유용하거나 이로운 화합물인 방법을 포함한다.
일부 양태에서, 초기 집단의 재조합 폴리펩티드를 함유하는 조성물은 상이한 수준의 선택된 특성을 갖는 목적하는 재조합 폴리펩티드만을 함유한다. 일부 양태에서, 초기 집단의 재조합 폴리펩티드를 함유하는 조성물은 또한 목적하는 재조합 폴리펩티드와는 상이한 아미노산 서열을 갖는 추가의 폴리펩티드를 함유한다. 일부 양태에서, 상기 추가의 폴리펩티드는 재조합이다. 일부 양태에서, 초기 집단의 재조합 폴리펩티드를 함유하는 조성물은 또한 불순물을 함유한다. 일부 양태에서, 상기 불순물은 DNA, RNA, 지질 또는 단백질 분자이다. 일부 양태에서, 불순물은 절단된 형태의 재조합 폴리펩티드, 응집된 형태의 재조합 폴리펩티드 또는 잘못 폴딩된 형태의 재조합 폴리펩티드이다. 일부 양태에서, CEX 매질에 결합하지 않는 재조합 폴리펩티드를 함유하는 조성물은 초기 집단의 재조합 폴리펩티드를 함유하는 조성물 보다 적은 불순물을 갖는다. 일부 양태에서, CEX 매질에 결합하지 않는 재조합 폴리펩티드를 함유하는 조성물은 초기 집단의 재조합 폴리펩티드를 함유하는 조성물 보다 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 25%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 99% 적은 불순물을 갖는다.
일부 양태에서, CEX 매질에 결합하지 않는 재조합 폴리펩티드는 초기 집단을 포함하는 조성물의 재조합 폴리펩티드의 약 10% 내지 약 90%, 약 20% 내지 약 80%, 약 30% 내지 약 80%, 약 40% 내지 약 80%, 약 50% 내지 약 80%, 또는 약 55% 내지 약 80%이다. 일부 양태에서, CEX 매질에 결합하지 않은 재조합 폴리펩티드는 초기 집단을 포함하는 조성물의 재조합 폴리펩티드의 약 55% 내지 약 80%이다.
하나의 양태에서, 생성물은 예를 들어, 피크 생성물 pI 값을 기준으로 선택적으로 강화되고/분리될 수 있고, 여기서, 예를 들어, 보다 높은 pI 이소형은 양이온 교환 흡착제 상에서 보다 낮은 pI 생성물 이소형으로부터 분리될 수 있다.
일부 양태에서, CEX 매질에 결합하지 않는 재조합 폴리펩티드는 CEX 크로마토그래피 후 하나 이상의 추가의 정제 단계에 적용된다. 일부 양태에서, 초기 집단의 재조합 폴리펩티드를 함유하는 조성물은 CEX 매질과 접촉시키기 전에 하나 이상의 정제 단계에 적용된다. 일부 양태에서, 초기 집단의 재조합 폴리펩티드를 갖는 조성물의 pH 및 전도도는 상기 조성물을 CEX 매질과 접촉시키기 전에 조정된다. 일부 양태에서, CEX 매질에 결합하지 않는 재조합 폴리펩티드의 pH는 CEX 매질과의 접촉 후 조정된다.
본 발명의 재조합 폴리펩티드
본 발명의 양태는 특정 수준의 번역 후 변형을 갖는 다양한 재조합 폴리펩티드의 고도로 균일한 혼합물을 수득하기 위해 유용하다. 상기 재조합 폴리펩티드의 일부 예는 제한 없이 단백질 및 단백질 단편(즉, 전장 및 부분적 길이의 폴리펩티드/펩티드), 항체 (면역글로불린), 이종성 융합 단백질 등을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 폴리펩티드는 이량체이다. 일부 양태에서, 상기 폴리펩티드는 단량체이다.
하나의 양태에서, 상기 재조합 폴리펩티드는 면역글로불린(또는 이의 단편의 도메인, 영역)과 융합된 비-면역글로불린 단백질(또는 이의 단편)이다. 일부 양태에서, 재조합 폴리펩티드는 Fc 도메인을 포함한다. 일부 양태에서, 재조합 폴리펩티드는 항체를 포함한다. 하나의 양태에서, 예를 들어, 본 발명의 방법은 면역글로불린의 Fc 영역(예를 들어, IgG 분자의 Fc 영역)과 연결된(즉, "융합된") 세포외 수용체 리간드 결합 도메인을 포함하는 재조합 폴리펩티드의 분리/정제를 위해 사용한다. Fc 융합 단백질의 예는 표 1에 나타낼 수 있다.
표 1. 임상에서 주요 Fc-융합 단백질 및 모노클로날 항체(mAb)
Figure 112022033358606-pat00001
Figure 112022033358606-pat00002
하나의 양태에서, 상기 재조합 폴리펩티드는 수용체의 리간드 결합 도메인을 포함하는 Fc 융합 폴리펩티드이다. 일부 양태에서, 상기 수용체는 종양 괴사 인자("TNF") 수용체이다. 일부 양태에서, 상기 재조합 폴리펩티드는 에타너셉트이다. 에타너셉트는 이량체성 재조합 치료학적 당단백질이고, 이는 인간 IgG1의 불변 영역 (Fc)에 연결된 인간 75킬로돌턴 인간 종양 괴사 인자 수용체의 세포외 리간드 결합부로 이루어진다. TNF 수용체 영역은 혈류에서 발견되는 가용성 TNF-α에 결합하여 많은 자가면역 질환을 포함하는 다양한 염증 반응을 감소시킨다. 에타너셉트는 TNF 억제제로서 TNF에 결합하는 데코이 수용체로서 작용한다. [문헌참조: Zalevsky, J. et al., J. Immunol. 179(3): 1872-83]. 에타너셉트는 천연적으로 존재하는 가용성 TNF 수용체와 유사한 기능으로 작용한다. 그러나, 에타너셉트는 융합 단백질이기 때문에 혈류에서 보다 큰 반감기를 갖고 따라서 천연의 수용체 보다 긴 영향력을 갖는다. [문헌참조: Madhusudan, S. J. Clin Oncol. 23(25): 5950-9]. 융합 단백질의 Fc 부분은 일시적으로 내피 세포의 표면상에 발현된 Fc 수용체에 부착되고 이는 에타너셉트의 분해를 지연시키고 반감기를 증가시킨다.
에타너셉트는 생물학적 활성을 위해 N-당화를 요구한다. 당화된 단백질은 복합체 분자이고 심지어 잘 제어된 생성물은 동일한 아미노산 서열 상에 상이한 글리칸 조성을 갖는 수백개 이상의 당형태로 이루어질 수 있다. 당화된 단백질의 생체내 생물학적 활성은 분자당 시알산 단위 수에 의존하는 것으로 공지되어 있고 이는 가용한 시알화 부위, N-글리칸의 안테나성 및 시알화의 완전성의 결과이다. [문헌참조: Shiestl, M., et al. Nature Biotechnology 29(4):310 (2011)].
일부 양태에서, 상기 재조합 폴리펩티드는 응고 인자를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 응고 인자는 인자 VII (FVII), FVIIa, 인자 VIII (FVIII), 인자 IX (FIX), 또는 FIXa (FIX)로부터 선택된다. 일부 양태에서, FVIII는 전장 FVIII 또는 B-도메인 결실된 FVIII로부터 선택된다. 일부 양태에서, FVIII는 단일쇄 FVIII 또는 이원 쇄 FVIII이다.
일부 양태에서, 상기 재조합 폴리펩티드는 단량체-이량체 혼성체이다. 단량체-이량체 혼성체는 이량체 측면 및 단량체 측면을 갖는 키메라 단백질이고, 여기서, 상기 이량체 측면은 이것이 각각 면역글로불린 불변 영역 부분으로 이루어진 2개의 폴리펩티드 쇄로 이루어진다는 사실에 대한 것이고 단량체성 측면은 2개의 쇄 중 하나만이 치료학적 생물학적 활성 분자로 이루진다는 사실에 대한 것이다. 단량체-이량체 혼성체는 이들의 전문이 본원에 참조로서 인용되는 미국 특허 제7,404,956호에 상세히 기재되어 있다.
"인자 VII" 또는 "FVII"는 간에서 합성되고 분자량이 대략 50 kDa인 단일쇄 자이모겐으로서 혈액으로 분비되는 응고 인자 단백질을 언급한다. FVII 자이모겐은 단백질분해 절단에 의해 활성화된 형태(FVIIa)로 전환된다. FVII는 이의 각각의 전문이 본원에 참조로서 인용되는 미국 공개공보 제 2011/0046061호 및 국제 출원 번호 제PCT/US2013/44842호에 기재되어 있다.
"인자 VIII" 또는 "FVIII"은 혈액 응고 인자 단백질 및 종 및 이의 서열 변이체를 언급하고 이는 2351개 아미노산 단일쇄 전구체 단백질(19-아미노산 소수성 신호 펩티드를 갖는), 도메인 구조 A1-A2-B-A3-C1-C2를 갖는 대략 270 내지 330 kDa의 성숙한 2332 아미노산 인자 VIII 단백질, 및 아미노산 1-1648 (성숙한 FVIII 형태와 비교하여 번호를 매긴)의 A1-A2-B(90 내지 220 kD의 범위에서)로 구성된 중쇄 형태 및 아미노산 1649 내지 2232의 80 kDa의 경쇄 A3-C1-C2 (이의 각각은 도 1에 도식적으로 도시되어 있다)의 R1648 후 단백질분해 절단의 결과서 형성되는 2개의 쇄의 순환 이종이량체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. "인자 VIII" 또는 "FVIII"은 또한 절단된 서열, 이종성 아미노산을 포함하는 서열, 또는 중쇄 및 경쇄가 링커에 의해 공유적으로 연결된 단일쇄 FVIII(scFVIII)를 포함하는 천연 순환 단백질의 생물학적 활성의 적어도 일부를 보유하는 서열 변이체일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 "FVIII"는 인간 인자 VIII 결핍(예를 들어, 혈우병 A)의 생체내 또는 시험관내 보정할 수 있는 혈액 응고 인자 VIII의 전형적인 특성을 갖는 임의의 기능성 형태의 인자 VIII 분자일 것이다. FVIII 또는 서열 변이체는 이의 각각의 전문이 본원에 참조로서 인용된 미국 특허 또는 공개 공보 제4,757,006호; 제7,138,505호; 제5,004,804호; 제5,198,349호, 제5,250,421호; 제5,919,766호; 제2010/0081615호; 제2013/0017997호 및 제2013/0108629호에 기재된 바와 같이 분리되고, 특성 분석되고, 클로닝되었다.
본원에 사용된 바와 같은 인자 VIII의 "B 도메인"은 내부 아미노산 서열 동일성 및 트롬빈에 의한 단백질분해 절단 부위, 예를 들어, 전장 인간 인자 VIII의 잔기 Ser741 - Arg1648에 의해 정의되는 당업계에 공지된 B 도메인과 동일하다. 다른 인간 인자 VIII 도메인은 하기의 아미노산 잔기에 의해 정의된다: A1, 잔기 Ala1-Arg372; A2, 잔기 Ser373-Arg740; A3, 잔기 Ser1690-Ile2032; C1, 잔기 Arg2033-Asn2172; C2, 잔기 Ser2173-Tyr2332. A3-C1-C2 서열은 잔기 Ser1690-Tyr2332를 포함한다. 나머지 서열인 잔기 Glu1649-Arg1689는 일반적으로 인자 VIII 경쇄 활성화 펩티드로서 언급된다. 돼지, 마우스 및 개 인자 VIII에 대한 B 도메인을 포함하는 도메인 모두에 대한 경계선의 위치는 또한 당업계에 공지되어 있다. 바람직하게, 인자 VIII의 B 도메인은 결실되어 있다("B 도메인 결실된 인자 VIII" 또는 "BDD FVIII"). BDD FVIII의 하나의 예는 REFACTO (재조합 BDD FVIII)이다. FVIII의 B 도메인은 이의 전문이 본원에 참조로 인용되는 미국 공개 공보 제2013/0108629호에서 논의된다.
"B 도메인 결실된 인자 VIII"은 이의 각각의 전문이 본원에 참조로 인용되는 미국 특허 제6,316,226호, 제6,346,513호, 제7,041,635호, 제5,789,203호, 제6,060,447호, 제5,595,886호, 제6,228,620호, 제5,972,885호, 제6,048,720호, 제5,543,502호, 제5,610,278호, 제5,171,844호, 제5,112,950호, 제4,868,112호, 및 제6,458,563호에 기재된 완전하거나 부분적인 결실을 가질 수 있다. 일부 양태에서, 본 발명의 B 도메인 결실된 인자 VIII 서열은 미국 특허 제6,316226호 (또한 미국 특허 제6,346,513호)의 칼럼 4, 4행 내지 칼럼 5, 28행 및 실시예 1 내지 5에 기재된 결실들 중 어느 하나를 포함한다. 일부 양태에서, 본 발명의 B 도메인 결실된 인자 VIII는 미국 특허 제5,789,203호 (또한 미국 특허 제6,060,447호, 미국 특허 제5,595,886호, 및 미국 특허 제6,228,620호)의 칼럼 2, 26 내지 51행 및 실시예 5 내지 8에 기재된 결실을 갖는다. 일부 양태에서, B 도메인 결실된 인자 VIII는 미국 특허 제5,972,885호의 칼럼 1, 25행 내지 칼럼 2, 40행; 미국 특허 제6,048,720호의 칼럼 6, 1 내지 22행 및 실시예 1; 미국 특허 제5,543,502호의 칼럼 2, 17행 내지 46행; 미국 특허 제5,171,844호의 칼럼 4, 22행 내지 칼럼 5, 36행; 미국 특허 제5,112,950호의 칼럼 2, 55행 내지 68행, 도 2 및 실시예 1; 미국 특허 제4,868,112호의 칼럼 2, 2행 내지 칼럼 19, 21행 및 표 2; 미국 특허 제7,041,635호의 칼럼 2, 1행 내지 칼럼 3, 19행, 칼럼 3, 40행 내지 칼럼 4, 67행, 칼럼 7, 43행 내지 칼럼 8, 26행 및 칼럼 11, 5행 내지 칼럼 13, 39행; 또는 미국 특허 제6,458,563호의 칼럼 4, 25행 내지 53행에 기재된 결실을 갖는다. 일부 양태에서, B 도메인 결실된 인자 VIII는 B 도메인의 대부분의 결실을 갖지만 이의 전문이 본원에 참조로서 인용되는 WO 91/09122에 기재된 바와 같은 1차 번역 생성물의 2개의 폴리펩티드 쇄로의 생체내 단백질분해 프로세싱을 위해 필수적인 B 도메인의 아미노-말단 서열을 여전히 함유한다. 일부 양태에서, B 도메인 결실된 인자 VIII는 B 도메인의 아미노산 747 내지 1638의 결실, 즉 실제로 완전한 결실과 함께 작제된다. [문헌참조: Hoeben R. C, et al, J. Biol. Chem. 265 (13): 7318-7323 (1990)]. A. B 도메인 결실된 인자 VIII는 또한 인자 VIII의 아미노산 771 내지 1666 또는 아미노산 868 내지 1562의 결실을 함유할 수 있다. [문헌참조: 이의 전문이 본원에 참조로서 인용되는 Meulien P., et al. Protein Eng. 2(4): 301-6 (1988)]. 본 발명의 일부인 추가의 B 도메인 결실은 예를 들어 다음을 포함한다: 아미노산 982 내지 1562 또는 760 내지 1639 (Toole et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1986) 83, 5939-5942))의 결실, 아미노산 797 내지 1562의 결실(문헌참조: Eaton, et al. Biochemistry (1986) 25:8343-8347)), 아미노산 741 내지 1646의 결실(문헌참조: Kaufman (PCT 공개 출원 번호 WO 87/04187)), 아미노산 747-1560의 결실 (Sarver, et al, DNA (1987) 6:553-564)), 아미노산 741 내지 1648의 결실 (Pasek (PCT 출원 번호 제88/00831호)), 아미노산 816 내지 1598 의 결실 또는 아미노산 741 내지 1689의 결실(문헌참조: Lagner (Behring Inst. Mitt. (1988) No 82: 16-25, EP 295597)), 이의 각각은 전문이 본원에 참조로 인용된다. 이전의 결실의 각각은 임의의 인자 VIII 서열에 수행될 수 있다. FVIII의 B 도메인 결실은 이의 전문이 본원에 참조로 인용되는 미국 공개 공보 제2013/0108629호에 기재되어 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "인자 IX" 및 "FIX"는 달리 특정되지 않는 경우 이의 정상 역할에서 기능성 인자 IX 폴리펩티드를 의미한다. 따라서, 용어 인자 IX는 기능성인 변이체 폴리펩티드 및 상기 기능성 변이체 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 바람직한 인자 IX 폴리펩티드는 인간, 소, 돼지, 고양이 및 뮤린 인자 IX 폴리펩티드이다. 인자 IX의 전장 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드 서열은 많은 기능성 변이체, 예를 들어, 단편, 돌연변이체 및 변형된 버젼으로서 공지되어 있다. 인자 IX 폴리펩티드는 전장 인자 IX, N-말단에서 전장 인자 IX 마이너스 Met, 전장 인자 IX 마이너스 신호 서열, 성숙한 인자 IX (마이너스 신호 서열 및 프로펩티드) 및 N-말단에서 추가의 Met를 갖는 성숙한 인자 IX를 포함한다. 인자 IX는 바람직하게 재조합 수단("재조합 인자 IX" 또는 "rFIX")에 의해 제조되고, 즉, 이것은 천연적으로 존재하지 않거나 혈장으로부터 유래된다. FIX는 이의 각각의 전문이 참조로 인용되는 미국 공개 공보 제2011/0046060호 및 제2013/0202595호에 기재되어 있다.
일부 양태에서, 재조합 폴리펩티드는 항체이다. 일부 양태에서, 상기 재조합 폴리펩티드는 모노클로날 항체이다. 일부 양태에서, 상기 항체는 인간화된 항체이다. 일부 양태에서, 재조합 폴리펩티드는 키메라 항체이다. 일부 양태에서, 재조합 폴리펩티드는 이의 전문이 본원에 참조로 인용되는 미국 특허 제7,300,773호에 기재된 임의의 항체이다.
일부 양태에서, 재조합 폴리펩티드는 수용체이다. 일부 양태에서, 상기 항체는 수용체 티로신 키나제이다. 일부 양태에서, 상기 수용체는 이의 전문이 본원에 참조로 인용되는 미국 특허 제7,300,773호에 기재된 임의의 수용체이다.
일부 양태에서, 재조합 폴리펩티드는 성장 인자 또는 다른 신호 전달 분자이다. 일부 양태에서, 재조합 폴리펩티드는 G-단백질 커플링된 수용체이다. 일부 양태에서, 재조합 폴리펩티드는 미국 특허 제7,300,773호에 기재된 임의의 폴리펩티드이다.
일부 양태에서, 상기 재조합 폴리펩티드는 숙주 세포에 의해 제조된다. 일부 양태에서, 상기 재조합 폴리펩티드는 진핵 숙주 세포에 의해 제조된다. 일부 양태에서, 재조합 폴리펩티드는 포유동물 숙주 세포에 의해 제조된다.
약어:
AEX: 음이온 교환 크로마토그래피
CEX: 양이온 교환 크로마토그래피
CV: 칼럼 용적
DF: 희석여과
DoE: 실험 디자인
HIC: 소수성 상호작용 크로마토그래피
HMW: 고분자량 응집체
LMW: 저분자량 응집체
HCP: 숙주 세포 단백질
피크 1 : 클립된 에타너셉트
피크 2: 천연 에타너셉트
피크 3: 잘못 폴딩된 에타너셉트
LRV: log10 (로딩 중 총 불순물/용출액 중 총 불순물)
CV: 칼럼 용적
PS: 파일럿 규모
OD: 광학 밀도
TSA: 총 시알산
UF: 한외여과
WFI: 주사용수
당업자의 기술 범위내 지식을 적용함에 의해, 본 발명의 양태는 본 발명의 일반적 개념으로부터 벗어나지 않고 과도한 실험 없이 다양한 응용을 위해 변형되고/되거나 채택될 수 있다. 따라서, 상기 채택 및 변형은 본원에 제공된 교시 및 가이드를 기준으로, 기재된 양태의 등가물의 의미 및 범위 내에 있는 것으로 의도된다.
실시예
실시예 1
SE 하이캡 칼럼 요약의 사용을 통한 TSA의 강화 및 불순물의 제거
크로마토그래피 프로세스는 동일한 초기 혼합물 중에 존재하는 감소되거나 보다 낮은 수준의 시알화를 갖는 재조합 폴리펩티드와 비교하여 증진되거나 증가된 수준의 시알화를 갖는 재조합 폴리펩티드의 단리/정제/강화를 위해 개발되었다.
본 실시예에 사용되는 재조합 폴리펩티드는 TNFR-Fc 융합 단백질 에타너셉트이다. 고도로 시알화된 형태의 재조합 폴리펩티드는 고도로 바람직한 부류의 치료학적으로 유리한 단백질 이소형을 나타낼 수 있다. 본 실시예는 회수된/단리된, 고도로 시알화된 형태의 재조합 폴리펩티드의 함량을 강화시키면서 허용되는 생성물 회수 및 수율을 유지할 수 있는 강력한 프로세스의 개발을 기재하고 있다. 상기 특정 실시예에서, SE 하이캡 크로마토그래피를 사용하여 고도로 시알화된 형태의 Fc 융합 단백질을 회수하고/단리하는 프로세스가 개발되었다.
통류 방식에서 활용되는 SE 하이캡은 주로 이의 TSA 강화 잠재력, 피크 3 및 응집을 감소시키는 능력, 강한 DNA 제거에 대한 능력 및 다른 프로세스 단계와 함께 계면의 용이함 때문에 선택되었다. SE 하이캡은 음으로 하전된 시알화된 에타너셉트를 정전기적으로 통류물로 반발시키면서 이의 pI 미만의 pH에서 전개되는 경우 보다 양으로 하전된 (보다 덜 시알화된) 단백질을 보유함에 의해 TSA를 강화시킨다. 로딩 pH, 로딩 전도도 및 로딩 비율은 상기 칼럼을 위한 모든 주요하고 중요한 파라미터인 것으로 밝혀졌다. 프로세스 온도, 프로세스 유속 및 수지 리간드 능력은 연구된 조건하에서 수율 및 생성물 속성에 무시할만한 영향을 갖고 있고 비-주요 프로세스 파라미터인 것으로 판단되었다.
재료
용액: 각각의 완충액의 pH 및 전도도는 사용 전에 입증하였다.
로딩 재료 및 흡착제: 모든 샘플은 -70℃에서 동결시키고 크로마토그래피를 개시하기 전에 주위 온도에서 해동시켰다. 모든 실험을 위해, 로딩 pH는 1 M 아세트산, 1 M 시트르산, 또는 2.4 M 트리스 염기로 조정하였다. 이어서, 로딩 전도도는 아세테이트 또는 시트레이트 완충액 중에서 1 M NaCl로 조정하였다. RO/DI 물은 로딩 전도도가 너무 높은 경우 첨가하였다.
크로마토그래피 방법
모든 칼럼에 20% 압착 인자를 팩킹된 베드 높이가 15 cm 또는 16 cm가 되도록 팩킹하였다. 상기 크로마토그래피 단계는 하향 통류 방식으로 대략 22℃에서 AKTA 익스플로러 900 (GE Healthcare Life Sciences) 및 유니콘 계면 소프트웨어 (버젼 5.11)를 사용하여 수행하였다. 통류 방식으로 작동하는 모든 개발 연구에 걸쳐, 크로마토그래피 방법은 일반적으로 평형화 단계, 로딩 단계, 비결합된 단백질을 제거하기 위한 세척 단계, 분석을 위해 불순물을 제거하기 위한 스트립 단계, 1 N NaOH를 사용한 세정 단계 및 0.1 N NaOH 중에서 저장 단계로 이루어졌다. 상기 단계를 위한 세정 및 저장 조건은 연구되지 않았고 차라리 이들은 제조업자의 추천에 따른다. 상기 세척 분획물은 달리 주지되지 않는 경우 통류 분획물과 함께 모았다. 통류, 세척 및 스트립 분획물은 수율 및 생성물 속성에 대해 분석하였다.
수지 스크리닝, 칼럼 계면 및 완충제 매트릭스 방법
정전기 결합 능력 계산을 사용하여 단백질에 결합하는 이들의 능력에 대해 후보물 CEX 수지를 스크리닝하였다. 이것은 후보물 수지를 평형 완충액으로 완충액 교환시킴에 이어서 에타너셉트를 함유하는 조성물을 밤새 공지된 용적의 후보물 수지와 진탕기상에서 항온처리함에 의해 결정하였다. 수지 및 단백질의 혼합물은 최전 하향시키고 상청액은 A280에 대해 후속적으로 측정하였다. 높은 정전기 능력을 갖는 수지는 이어서 칼럼에 팩킹시키고 결합/용출 또는 통류 방식으로 추가로 평가하였다. 생성물 수율, 응집체, 피크 1, 피크 2, 피크 3, TSA, HCP, 및 DNA를 측정하여 분리 수행능을 게이지하였다. 용출 동안에 생성물 관련 불순물의 불량한 분리를 가졌던 높은 능력의 수지는 포획 단계로서 추가로 평가하고 연마 단계로서 제거하였다. 그러나, 불순물의 우수한 분리를 가졌던 낮은 능력을 갖는 수지는 SE 하이캡을 사용한 경우에서 처럼 통류 방식에서 추가로 평가하였다.
SE 하이캡은 TSA를 강화시키고 응집체, DNA 및 일부 피크 3 및 HCP를 제거하는 능력에 대해 특이적으로 선택하였다. 추가로, 통류 방식의 SE 하이캡은 이전 및 후속적 정제 단계와 챌린지 계면을 갖지 않았고 임의의 중간 단계에 대한 필요성을 제거하였다. 아세테이트 완충제는 상기 프로세스에 사용될 가장 최적의 완충제인 것으로 결정되었다.
DOE 방법
DoE (중추 혼성) 연구를 디자인하여 로딩 비율, 로딩 전도도 및 로딩 pH를 특징 분석하였고 제2 DoE (스크리닝)을 디자인하여 상기 프로세스 온도, 수지 능력 및 프로세스 유속을 특징 분석하였다. 2개의 DoE 연구는 디자인 익스퍼트(Expert) (버젼 8.0.6)을 사용하여 디자인하였다. 로딩 비율, 로딩 전도도 및 로딩 pH는 보다 이른 실험이 이들이 생성물 수율 및 생성물 속성에 대해 영향을 가짐을 보여주었기 때문에 제1 DoE에서 변수로서 선택하였다. 프로세스 온도, 수지 능력, 및 로세스 유속은, 보다 이른 연구가, 이들 파라미터가 생성물 수율 및 생성물 속성에 대한 최소 효과를 가짐을 보여주었기 때문에 별도의 DoE에서 평가하였다.
상기 데이터에 대한 회귀 분석을 수행하기 위해, 상기 결과는 디자인 익스퍼트에 입력하고 각각 Box Cox 및 외용적으로 스튜던트화된 잔사(Externally Studentized Residuals)를 통해 정규 분포 및 분리물에 대해 먼저 분석하였다. 상기 데이터가 정상적으로 분포되지 않는 경우, 형질전환은 소프트웨어의 추천을 기준으로 수행하였다(예를 들어, log10). 상기 모델을 상당히 약화시키는 임의의 분리물은 상기 분석으로 부터 공제하였다. 이후에, 유의적이지 않은 파라미터(p-값 >0.05)은 모델을 단순화하기 위해 역행 또는 수동적 제거 기능을 사용하여 제거하였다. 몇개의 사례에서, 유의적이지 않은 파라미터는 상기 모델에 보유시켜 피트의 R2 및 부재를 강화하였다. 모든 모델은 단지 주요 효과 및 2-수준 상호작용이 유의적이고 혼동되지 않는다는 추측상에서 만들어졌다.
분석학적 방법
모든 실험을 위해 사용된 분석학적 방법은 표 2에 요약한다. 출발 물질은 OD280 방법을 사용한 생성물 수율의 측정이 SE 하이캡 칼럼을 위해 정확할 정도로 충분히 순수하다.
표 2. 분석 방법의 개요
Figure 112022033358606-pat00003
DOE 1 (중추 혼성)
로딩 비율, 로딩 pH 및 로딩 전도도를 특징 분석하는 DoE 연구는 연구 디자인으로부터 임의의 이탈 없이 성공적으로 완성되었다. 제어 조건하에 전형적인 SE 하이캡 크로마토그램은 평형에 도달하기 전에 어떻게 UV가 로딩 동안에 사전 피크를 전환시키고 UV에서 감소시키고 이어서 UV에서 증가시키는지를 보여준다(도 1). 약한 단백질 결합은 불충한 TSA 강화를 유도할 수 있는 것으로 밝혀졌다(데이터는 나타내지 않음). 강한 단백질 결합은 생성물 손실을 유도할 수 있는 것으로 밝혀졌다(데이터는 나타내지 않음).
낮은 로딩 pH 및 낮은 로딩 전도도는 생성물 수율을 감소시키고 TSA 함량을 강화시키고 피크 1 불순물을 증가시키고 응집체 수준을 감소시키고 단량체 함량을 증가시시켰다(표 3, 또한 표 4를 참조한다). 로딩 pH 및 로딩 전도도는 낮은 로딩 pH가 이들 생산에 대해 높은 로딩 전도도의 효과를 상쇄시키고 그 반대일 수 있는 상호작용을 갖는다. 로딩 전도도 또는 로딩 pH가 증가함에 따라, 피크 2 수준은 피크 3 수준에서 증가된 양으로 감소하였다(표 3, 또한 표 4를 참조한다). 이것은 다양한 로딩 전도도 및 로딩 pH가 피크 1, 2 및 3의 상대적 분포를 변화시킬 수 있음을 보여주었다.
표 3. DOE 1 (중추 혼성) 데이터 #1
Figure 112022033358606-pat00004
표 4. 수율, TSA, 응집 및 피크 크기에 대한 로딩 비율, 로딩 pH 및 로딩 전도도의 효과
Figure 112022033358606-pat00005
표 5. DOE 1 (중추 혼성) 데이터 #2
Figure 112022033358606-pat00006
높은 로딩 전도도 또는 높은 로딩 pH는 DNA 제거를 감소시켰다(표 5). 그러나, 로딩 pH는 전도도 보다 큰 정도로 DNA 제거를 감소시켰다. 또한, 높은 로딩 pH는 또한 HCP 제거를 감소시켰다 (표 5).
낮은 로딩 pH 및 낮은 로딩 전도도는 순도 수준을 감소시켰다(모든 불순물에 상대적으로) (표 5). 로딩 pH 및 로딩 전도도는 낮은 로딩 pH가 순도 수준에 대한 높은 로딩 전도도의 효과를 상쇄시킬 수 있다는 상호작용을 갖는다. 로딩 전도도 또는 로딩 pH가 증가함에 따라, 최고의 단일 불순물 수준 및 LMW는 감소하였다(표 5).
음으로 하전된 산성 이소형은 낮은 전도도 및 낮은 pH에서 강화되었지만 기본 및 주요 이소형은 높은 전도도 또는 높은 pH에서 칼럼으로부터 탈착되는 경우 농도에서 감소하였다(표 5). 따라서, 로딩 pH 및 로딩 전도도는 로딩 pH가 이소형에 대한 로딩 전도도의 효과를 상쇄시킬 수 있다는 상호작용을 갖는다.
이들 실험은 SE 하이캡에 대한 작동 공간이 5.5 내지 5.8의 범위와 함께 5.6의 로딩 pH 표적, 및 9.5 내지 11 mS/cm의 범위와 함께 10.0 mS/cm의 로딩 전도도 표적 및 33 내지 54 mg/mL 수지의 범위와 함께 41mg/mL 수지의 로딩 비율 표적을 가져야만 함을 지적한다. 이들 로딩 조건은 통류/세척 풀이 15 내지 16.5 몰/몰의 TSA 수준, <6%의 응집체 수준, <6%의 피크 1, 약 1.5 LRV의 DNA 제거 및 55 내지 80%의 충분한 생성물 수율을 가짐을 보장한다.
DoE 2 (스크리닝)
프로세스 온도, 수지 능력 및 프로세스 유속을 특징 분석하는 DoE 연구는 프로토콜로부터 임의의 이탈 없이 성공적으로 완성하였다. 상기 DoE 연구로부터의 데이터는 표 6에 열거한다. 가장 유의적인 변수는 수지 능력 및 프로세스 온도이지만, 생성물 수율 및 생성물 속성에 대한 이들의 영향은 무시할만하다. 따라서, 상기 프로세스는 강하고 온도, 수지 능력 및 유속에 대한 광범위 작동 범위에 내성을 가질 수 있다.
표 6. DOE 2 (스크리닝) 데이터
Figure 112022033358606-pat00007
결론
SE 하이캡 통류 크로마토그래피는 TSA 수준을 15 내지 16.5 몰/몰로 강화시키고, 응집체를 약 12%로 감소시키고 DNA를 약 1.5 LRV로 감소시키면서 표적 작동 조건하에서 55 내지 75% (A280)의 높은 생성물 회수를 유지하는 제2 정제 단계로서 성공적으로 개발되었다. 이들 주요하고 중요한 생성물 속성을 충족하기 위해, SE 하이캡에 대한 추천된 작동 공간은 5.6 ± 0.2의 로딩 pH 표적, 9.5 내지 11 mS/cm의 범위와 함께 10.0mS/cm의 로딩 전도도 표적, 및 DoE 결과를 기준으로 41 mg/mL 수지 ± 8 mg/mL 수지의 로딩 비율 표적을 갖는다. 프로세스 온도, 프로세스 유속 및 수지 능력과 같은 다른 프로세스 파라미터는 생성물 수율 및 생성물 속성에 대해 무시할만한 영향을 가졌다.
실시예 2
CEX 수지를 사용한 TSA의 강화
SE 하이캡 CEX 수지에 대한 강화 파라미터를 결정한 후, TSA를 강화시키고 응집체 및/또는 잘못된 폴딩을 제거하기 위해 필요한 작동 조건은 다른 CEX 수지에 대해 결정하였다. 시험된 수지는 다음과 같다: GE SPXL, GE SP 세파로스, Millipore Eshmuno S, Tosoh Gigacap CM, Tosoh Gigacap S-650, 및 BioRad Nuvia S. 각각의 칼럼에 대한 최종 작동 조건은 하기 표 7에 나타낼 수 있다:
표 7. CEX 칼럼에 대한 작동 조건
Figure 112022033358606-pat00008
생성물 수율의 50%로 정규화된 결과와 각각의 칼럼에 의한 TSA 강화의 비교는 도 2에 나타낼 수 있다. 각각의 칼럼에 의해 제거된 응집체 및 잘못 폴딩된 것의 비교는 생성물 수율의 50%까지 정규화된 결과와 함께 도 3에 나타낼 수 있다.
본 발명은 본 발명의 개별 측면의 설명으로서만 의도되어 기재된 특정 양태에 의한 범위로 제한되지 않아야하고 기능적으로 균등한 임의의 조성물 또는 방법은 본 발명의 범위내에 있다. 실제로, 본원에 나타내고 기재된 것들 뿐만 아니라 본 발명의 다양한 변형은 이전의 기재 및 첨부된 도면으로부터 당업자에게 자명할 것이다. 상기 변형은 첨부된 청구항의 범위 내에 있는 것으로 의도된다.
본원에 언급된 모든 문헌, 논문, 공보물, 특허, 및 특허 출원은 각각의 개별 공보 또는 특허 출원이 구체적으로 및 개별적으로 참조로 인용되는 것과 동일한 정도로 본원에 인용된다.

Claims (48)

  1. Fc 융합 폴리펩티드의 시알화 수준을 강화시키는 방법으로서,
    상이한 수준의 시알화를 갖는 초기 집단의 Fc 융합 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 통류 방식(flow-through mode)으로 작동하는 양이온 교환 크로마토그래피(CEX) 매질과 접촉시키는 단계를 포함하고,
    상기 접촉이 5 내지 6 의 pH 및 8 내지 12 mS/cm 의 전도도에서 일어나고,
    CEX 매질에 결합하지 않는 Fc 융합 폴리펩티드는 CEX 매질에 결합하는 Fc 융합 폴리펩티드로부터 분리되고, CEX 매질에 결합하지 않는 Fc 융합 폴리펩티드는 결합된 Fc 융합 폴리펩티드와 비교하여 보다 높은 수준의 시알화를 포함하는, 방법.
  2. Fc 융합 폴리펩티드의 시알화 수준을 강화시키는 방법으로서,
    상이한 수준의 시알화를 갖는 초기 집단의 Fc 융합 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 통류 방식으로 작동하는 양이온 교환 크로마토그래피(CEX) 매질과 접촉시키는 단계; 및
    CEX 매질에 결합하지 않는 Fc 융합 폴리펩티드를 CEX 매질에 결합하는 Fc 융합 폴리펩티드로부터 분리하는 단계를 포함하고,
    상기 접촉이 5 내지 6 의 pH 및 8 내지 12 mS/cm 의 전도도에서 일어나고,
    CEX 매질에 결합하지 않는 Fc 융합 폴리펩티드는 결합된 Fc 융합 폴리펩티드와 비교하여 보다 높은 수준의 시알화를 포함하는, 방법.
  3. Fc 융합 폴리펩티드의 시알화 수준을 강화시키는 방법으로서,
    상이한 수준의 시알화를 갖는 초기 집단의 Fc 융합 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 통류 방식으로 작동하는 양이온 교환 크로마토그래피(CEX) 매질과 접촉시키는 단계;
    CEX 매질에 결합하지 않는 Fc 융합 폴리펩티드를 CEX 매질에 결합하는 Fc 융합 폴리펩티드로부터 분리하는 단계; 및
    CEX 매질에 결합하지 않는 Fc 융합 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하고,
    상기 접촉이 5 내지 6 의 pH 및 8 내지 12 mS/cm 의 전도도에서 일어나고,
    CEX 매질에 결합하지 않는 Fc 융합 폴리펩티드는 결합된 Fc 융합 폴리펩티드와 비교하여 보다 높은 수준의 시알화를 포함하는, 방법.
  4. Fc 융합 폴리펩티드의 시알화 수준을 강화시키는 방법으로서,
    상이한 수준의 시알화를 갖는 초기 집단의 Fc 융합 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 제공하는 단계;
    조성물을 통류 방식으로 작동하는 양이온 교환 크로마토그래피(CEX) 매질과 접촉시키는 단계;
    CEX 매질에 결합하지 않는 Fc 융합 폴리펩티드를 CEX 매질에 결합하는 Fc 융합 폴리펩티드로부터 분리하는 단계; 및
    CEX 매질에 결합하지 않는 Fc 융합 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하고,
    상기 접촉이 5 내지 6 의 pH 및 8 내지 12 mS/cm 의 전도도에서 일어나고,
    CEX 매질에 결합하지 않는 Fc 융합 폴리펩티드는 결합된 Fc 융합 폴리펩티드와 비교하여 보다 높은 수준의 시알화를 포함하는, 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, CEX 매질에 결합하지 않는 Fc 융합 폴리펩티드를 회수하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    CEX 매질에 결합하지 않는 Fc 융합 폴리펩티드의 총 시알산 함량이, 초기 집단의 Fc 융합 폴리펩티드의 총 시알산 함량보다 단백질의 몰 당 시알산 0.5몰 내지 6몰 더 높고/높거나;
    CEX 매질에 결합하지 않는 Fc 융합 폴리펩티드의 총 시알산 함량이, 초기 집단의 Fc 융합 폴리펩티드의 총 시알산 함량보다 5% 내지 100% 더 높고/높거나;
    CEX 매질에 결합하지 않는 Fc 융합 폴리펩티드의 총 시알산 함량이, 단백질의 몰 당 시알산 12몰 내지 20몰인, 방법.
  7. 제 1 항에 있어서, Fc 융합 폴리펩티드가 벨라타셉트(belatacept), 아플리버셉트(aflibercept), 릴로나셉트(rilonacept), 로미플로스팀(romiplostim), 아바타셉트(abatacept), 및 알레파셉트(alefacept)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 접촉이 30 내지 100 mg 총 단백질/mL CEX 매질의 로딩 비율에서 일어나는, 방법.
  9. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, CEX 매질에 결합하지 않는 Fc 융합 폴리펩티드가 25% 내지 80%의 초기 집단의 Fc 융합 폴리펩티드를 포함하는, 방법.
  10. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, CEX 매질이 설포에틸; 설포프로필(sulphopropyl); 설포프로필(sulfopropyl); CH2-S03 -; CH2CH2CH2S03 -; S03 -; 및 CH2-COO-로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 리간드를 포함하는, 방법.
  11. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, CEX 매질이 120 내지 160mg의 리소자임/mL 수지의 결합 능력을 포함하는, 방법.
  12. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 융합 폴리펩티드가 진핵 숙주 세포에 의해 생성되는, 방법.
  13. 제 12 항에 있어서, 진핵 숙주 세포가 포유동물 숙주 세포인, 방법.
  14. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 접촉이 제조 규모(manufacturing scale)로 수행되는, 방법.
  15. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 적어도 하나의 불순물을 추가로 포함하는, 방법.
  16. 제 15 항에 있어서, 불순물이 DNA, RNA, 지질 또는 단백질을 포함하는, 방법.
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