CN103209992A

CN103209992A - 具有减少的细胞摄取的因子viii变体

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Publication number: CN103209992A
Application number: CN2011800549583A
Authority: CN
Inventors: H.梅姆斯; A.B.梅耶斯; K.默滕斯; O.H.奥尔森; K.兰贝尔特; P.L.内尔比; L.B.约翰森; M.克雅尔克; H.R.施滕尼克; J.J.福尔贝格; M.范登比格拉尔
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Sanquin Blood Supply Foundation; Novo Nordisk AS
Priority date: 2010-09-15
Filing date: 2011-09-14
Publication date: 2013-07-17
Also published as: WO2012035050A2; JP6336522B2; US10047142B2; JP2016180002A; JP2013541521A; EP3466968A1; US20180327479A1; US20140057848A1; EP2616486B1; PL2616486T3; US20160002314A1; EP2616486A2; US20170066813A1; WO2012035050A3; JP6042335B2; CN104788557A; US10906960B2; AU2011303916A1; US9321827B2

Abstract

本发明涉及修饰的凝血因子。尤其，本发明涉及具有减少的细胞摄取的修饰因子VIII分子。

Description

具有减少的细胞摄取的因子VIII变体

发明领域

本发明涉及修饰的凝血因子。本发明更具体地涉及具有减少的细胞摄取的修饰凝血因子，其导致清除率降低/细胞摄取减少和/或免疫原性降低。本发明另外涉及这样的分子的用途以及用于产生这样的分子的方法。

发明背景

A型血友病是由凝血因子VIII (FVIII)活性缺乏或功能异常引起的遗传性出血性疾病。因为通常发生初始血凝块的形成，所以临床表现不是基于初级止血。而是由于缺乏次级凝血酶形成和初级凝块的血纤蛋白稳定化，凝块不稳定。通过静脉内注射分离自血液或重组产生的FVIII治疗该病。FVIII给予后在大约20-40%的重度A型血友病患者中发生针对FVIII的中和抗体(抑制剂)的形成，致使用FVIII的进一步治疗无效。对抑制剂的诱导因此在血友病保健中提供主要难题。

当前的治疗推荐正从传统应要求治疗转向预防。与von Willebrand因子(vWF)结合的内源性FVIII的循环半寿期是12-14小时，因此将进行一周数次的预防治疗以便让患者获得实际上无症状的生活。对于许多人，尤其是儿童和少年，静脉内给药与显著不便和/或疼痛联系在一起。

在开发具有显著延长的循环半寿期的FVIII变体中已使用多种方法。多种这些方法涉及FVIII与亲水聚合物例如PEG (聚乙二醇)的缀合。WO03031464公开了其中PEG基团可与多肽上存在的聚糖连接的酶促方法。

亦有人建议，调节低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)介导的FVIII清除以便获得具有减少的细胞摄取/清除率的FVIII变体，并因此增加体内循环半寿期，但该方法受FVIII表面上存在的潜在LRP结合位点的显著大量冗余和这些位点作用的不确定性所限制。此外，这些位点中一些紧密靠近对FVIII:C活性关键的区域，降低的LRP结合可伴随活性的实质性损失，其使得FVIII变体作为治疗剂是较不吸引人的。认为LRP和相关受体与其配体的相互作用涉及配体表面上的赖氨酸残基在受体的酸性“项链(necklace)”中对接(Mol Cell 2006; 22: 277-283)。此外有人表明，疏水残基与赖氨酸残基一起可涉及与LRP家族成员的相互作用(FEBS J 2006; 273: 5143-5159, J Mol Biol 2006;362: 700-716)，并可因此推测，是否除了关键赖氨酸残基或其他带正电荷残基外的这些疏水残基的修饰可导致与LRP家族成员的相互作用减少和潜在延长和/或减少的清除。

为了具有治疗吸引力，FVIII变体应该保留FVIII促凝血功能。由此可见，本领域需要具有维持的FVIII活性以及显著延长的体内循环半寿期和/或降低的免疫原性的特定FVIII变体。

发明概述

本发明因此涉及具有FVIII活性的重组FVIII变体，其中所述变体包含命名为“C1足”和/或“C2足”的FVIII C1和/或C2结构域的2、3、4、5、6、7、8、9或10个表面可接近的带正电荷残基的取代，其中所述表面可接近的带正电荷氨基酸残基(例如赖氨酸、精氨酸或组氨酸残基)被但不限于丙氨酸或谷氨酰胺取代，和其中取代导致细胞摄取减少。本发明另外涉及重组FVIII变体，其中所述FVIII变体包含K2092A取代和F2093A取代，其中所述变体与半寿期延长部分例如PEG缀合。本发明亦涉及具有FVIII活性的重组FVIII变体，其中所述变体包含引起额外的糖基化位点的突变，其中所述糖基化位点的聚糖赋予降低的与KM33抗体结合的能力。

本发明的FVIII变体具有与增加的循环半寿期相关的减少的细胞摄取。本发明的FVIII变体可另外有具有减少的LRP结合的优势。本发明的FVIII变体与无该突变类型的FVIII分子相比可另外有具有降低的免疫原性的优势。关于降低的免疫原性的解释可为，带正电荷的残基在FVIII的C1和/或C2足被取代，导致负责呈递FVIII至免疫系统的细胞摄取减少。

附图简述

图1：以正面和背面方向示出的FVIII (pdb登录码3cdz)的x射线晶体结构的表面模型。标示了A1、A2、A3、C1和C2结构域的位置。赖氨酸和精氨酸残基为黑色。

图2：突出FVIII的C1和C2结构域的FVIII (pdb登录码3cdz)的x射线晶体结构的表面模型。C1和C2结构域的较低部分为白色，描绘其假定的膜结合区，分别指定为C1足和C2足。赖氨酸和精氨酸残基为黑色。

图3：图1. 由质谱监测的氢交换(HX)鉴定涉及4F30和KM33结合的FVIII区，(A) 对应于肽片段2078-2095的质/荷谱，([M+H]⁺ = 672.3818, z = 3)，鉴定为与FVIII结合的4F30和KM33两者的表位部分。(B) 对应于肽片段2148-2161的质/荷谱，(m/z = 565.6554, z= 3)，鉴定为与FVIII结合的4F30和KM33两者的表位部分。对于所有的谱，较上的图(panel)显示非氘化的对照，第二的图显示在不存在配体时用D₂O交换10秒后的肽，第三和第四的图分别显示在存在4F30和KM33时用D₂O交换10秒后的肽。

图4：在4F30和KM33存在时FVIII的代表性肽的氢交换时间图。在不存在(实方块)或存在4F30 (空三角)或KM33(空方块)时针对对数尺度上的时间绘制FVIII肽的氘掺入(Da)。涵盖残基氨基酸2062-2073和2163-2168的肽代表不受与4F30和KM33两者形成复合物影响的FVIII区。涵盖残基氨基酸 2078-2095和2148-2161的肽代表为4F30和KM33两者的结合表位部分的FVIII区。

图5：在KM33和4F30存在时FVIII的HX分析肽的序列涵盖。原始序列(使用成熟的编号：水平图A：氨基酸2062-2100，水平图B：氨基酸2139-2168)呈现在HX分析肽(以水平条示出)上面。在存在和不存在4F30和KM33时显示类似交换模式的肽以未填充(空条)呈现，而在4F30和KM33结合时显示降低的氘掺入的肽以黑色填充(闭条)。

发明详述

定义

因子VIII分子：FVIII/因子VIII是主要由肝细胞产生的大的复合糖蛋白。人FVIII由2351个氨基酸(包含信号肽)组成，并包含若干个不同的结构域，如通过同源性所限定。有3个A-结构域、1个唯一的B-结构域和2个C-结构域。结构域顺序可列为NH₂-A1-A2-B-A3-C1-C2-COOH。FVIII在血浆中以在B-A3边缘处分开的两条链循环。通过二价金属离子结合将链连接。A1-A2-B链命名为重链(HC)，而A3-C1-C2命名为轻链(LC)。

“C1足”和“C2足”：在本发明的上下文中，“C1足”定义为C1结构域的区，其具有将FVIII分子/FVIII变体非共价锚定于阴离子膜的能力，阴离子膜包含例如血小板上发现的磷脂酰-L-丝氨酸。在图1中，以正面和背面方向示出FVIII (pdb登录码3cdz)的x射线晶体结构的表面模型。标示了A1、A2、A3、C1和C2结构域的位置。赖氨酸和精氨酸残基为黑色，显示其广泛的分布。C1足在图2所示的FVIII模型中以白色显示。更具体地，下述C1氨基酸可能锚定于磷脂膜，与例如血小板结合有关，并因此为C1足的一部分：2029-2035+2043-2069+2090-2100+2130-2136+2156-2163。本发明的发明人已出乎意料地显示，2065、2090和2092残基中每个的突变将导致具有减少的LRP结合的生物活性FVIII变体 – 尤其当这些残基被但不限于谷氨酰胺或丙氨酸残基取代时，取决于该残基的表面可接近区域。

在本发明的上下文中，“C2足”定义为C2结构域的区，其可能具有将FVIII分子/FVIII变体锚定于阴离子膜的能力，阴离子膜包含例如血小板上发现的磷脂酰-L-丝氨酸。C2足在图2所示的FVIII模型中以白色显示。更具体地，下述C2氨基酸锚定于磷脂层，与例如血小板结合有关，并因此为C2足的一部分：2195-2227+2248-2258+2287-2291+2313-2320。本发明的发明人已显示，C2足中表面暴露的赖氨酸或精氨酸残基中一个的突变(R2215或K2249)将导致具有减少的LRP结合的生物活性FVIII变体 – 尤其当这些残基被但不限于谷氨酰胺残基或丙氨酸残基取代时，取决于该残基的表面可接近性。发明人此外显示，包含C1足的取代和C2足的取代两者的FVIII变体呈现减少的LRP结合以及维持的FVIII:C活性。

FVIII C1和/或C2足的表面可接近的带电荷残基/带正电荷残基/赖氨酸或精氨酸残基：可接近的表面积(ASA)是易接近溶剂的生物分子的表面积或者生物分子表面的一部分(例如单一氨基酸侧链)。ASA通常以平方埃(分子生物学中测量的标准单位)引用。ASA由Lee和Richards在1971年首次描述并有时被称为Lee-Richards分子表面[B. Lee 和 F.M. Richards, "The Interpretation of Protein Structures: Estimation of Static Accessibility(蛋白质结构的阐明：静态可接近性的估计)" J. Mol. Biol. 55, 379-400 (1971)]。使用来源于例如x射线结构的原子坐标，可用来自Accelrys Inc.的计算机程序Quanta 2005计算表面可接近性。氨基酸侧链的相对表面可接近性是对单个氨基酸测定的实际表面可接近面积除以最大可接近的表面积。从具有pdb登录码3cdz的FVIII的x射线晶体结构计算ASA。如果相对表面可接近性小于20%，那么将该残基突变为谷氨酰胺以便防止蛋白表面的局部坍塌。可因此选择C1和/或C2足的带电荷表面可接近的氨基酸残基(优选带正电荷的氨基酸残基、优选赖氨酸和/或精氨酸残基)用于氨基酸取代，以便得到具有减少的细胞摄取和任选亦减少的LRP结合/LRP介导的清除的FVIII变体。

本文使用的“因子VIII”或“FVIII”指，为内在凝血途径的成员并对血液凝固必需的人血浆糖蛋白。“天然FVIII”是如在SEQ ID NO: 1 (氨基酸1-2332)中所示的全长人FVIII分子。在SEQ ID NO: 1中B-结构域跨越氨基酸741-1648。

SEQ ID NO: 1 (wt人FVIII):

Figure 2011800549583100002DEST_PATH_IMAGE001

Figure 2011800549583100002DEST_PATH_IMAGE003

本发明的FVIII分子/变体可为B结构域缺失的或B结构域截短的FVIII分子，其中残余结构域密切对应于如在SEQ ID NO: 1的氨基酸编号1-740和1649-2332中所示的序列。然而，本发明的B结构域截短的分子可与如在SEQ ID NO: 1中所示的序列稍不同，意指残余结构域(即3个A结构域和2个C结构域)可与如在SEQ ID NO: 1 (氨基酸1-740 和 1649-2332)中所示的氨基酸序列稍(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸)不同，因为突变可被导入以便例如降低vWF结合能力。此外，在C1和/或C2足中导入1或2个氨基酸取代以便改变FVIII对LPR的结合能力。然而，本发明的FVIII变体可另外包含分子表面上其他地方的赖氨酸取代以便进一步改变LRP结合。亦可导入另外的氨基酸取代、缺失或添加以便调节本发明FVIII变体的性质。最后，可在本发明的FVIII变体中导入氨基酸取代以便增加分子的分子内稳定性。

本发明的FVIII分子具有FVIII活性(亦称为FVIII:C或FVIII:C活性)，意指在凝血级联中以功能上类似或等价于FVIII的方式起作用，通过在活化的血小板上与FIXa相互作用来诱导FXa形成，并支持血凝块形成的能力。通过本领域中公知的技术(例如在显色测定中测量FX激活、使用FVIII缺乏的血浆的凝块分析、凝血酶产生测定、凝血弹性描记法等)，可体外评估该活性。本发明的FVIII分子具有的FVIII活性是天然人FVIII活性的至少约10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%和100%或甚至超过100%。

FVIII的分子内稳定性 (内在稳定性)：

本发明FVIII变体的“内在稳定性”可有时被称为“稳定性”、“物理稳定性”、“固有稳定性”、“结构稳定性”、“化学稳定性”、“内在稳定性”、“体外稳定性”、“热力学稳定性”、“热稳定性”、“折叠稳定性”等，并以复杂方式取决于环境条件。这些术语的共同主题在于，它们指多肽的体外稳定性，且该体外稳定性可视为使折叠构象的相对小的整体稳定的多肽中力的总和。FVIII体内稳定性与体外稳定性之间有显著的不同，因为FVIII体内经受大量的清除机制。至今不可能获得延长的体内循环半寿期与具有改善的体外稳定性的FVIII变体。可通过例如插入稳定的二硫键、插入可形成分子内疏水相互作用的另外的疏水氨基酸、插入将形成静电相互作用的正和负氨基酸等，改善本发明FVIII变体的体外稳定性。

本领域已知FVIII与多种侧链的缀合是用于获得延长的FVIII循环半寿期的方法。之前已证明，通过例如缀合FVIII分子，循环半寿期可增加大约2倍，即至约24小时。wt FVIII的内在稳定性，如37℃由TAP/水蛭素抗凝血浆中的半寿期所确定，为约30小时，其符合关于FVIII变体所报道的最长循环半寿期。

然而，在将C1和/或C2足赖氨酸或精氨酸取代与例如增加FVIII的体外稳定性和/或例如将FVIII变体与侧链缀合结合时，可能有出乎意料的协同效应。可用本发明的分子获得的另外的出乎意料的协同效应是，所产生的FVIII变体可另外拥有显著增加的特异性活性，得到更有效的分子。

B结构域截短/缺失的FVIII分子：FVIII中的B-结构域跨越SEQ ID NO: 1中的氨基酸741-1648。将B-结构域在若干不同位点上切割，在循环的血浆FVIII分子中产生大的异质性。高度糖基化的B-结构域的确切功能未知。所知道的是该结构域在凝血级联中对FVIII活性是非必要的。重组FVIII因此经常以B结构域缺失/截短的变体的形式产生。

将内源性全长FVIII合成为单链前体分子。分泌之前，将前体切割为重链和轻链。可从两种不同的策略产生重组B结构域缺失的FVIII。将无B-结构域的重链和轻链单独合成为两条不同的多肽链(两条链策略)，或将B-结构域缺失的FVIII合成为单一前体多肽链(单一链策略)，其可以与全长FVIII前体相同的方式被切割为重链和轻链。

在由单一链策略制备的B结构域缺失的FVIII前体多肽中，通常通过接头分开重链和轻链部分。为了使在B结构域缺失的FVIII中导入免疫原性表位的风险最小化，接头的序列优选来源于FVIII B结构域。作为最低限度，接头必须包含将B结构域缺失的FVIII前体多肽切割为重链和轻链的蛋白酶的识别位点。在全长FVIII的B结构域中，氨基酸1644-1648组成该识别位点。在B结构域缺失的FVIII活化时导致接头移除的凝血酶位点位于重链中。因此，接头的尺寸和氨基酸序列不太可能影响通过凝血酶活化将其从残余FVIII分子中移除。B结构域的缺失对于产生FVIII是有利的。然而，可在接头中包含B结构域部分而不降低生产能力。B结构域对生产能力的负面效应不能归因于B结构域的任何特定尺寸或序列。

根据优选的实施方案，截短的B结构域仅包含1个潜在的O-糖基化位点和一个或多个优选通过接头与该O-糖基化位点共价缀合的侧基/部分。

本发明B结构域截短的分子中的O-连接寡糖可与O-糖基化位点连接，O-糖基化位点是通过重组方法和/或通过截短B结构域产生新O-糖基化位点而人工产生的。截短的O-糖基化FVIII B结构域的一个实例是：SFSQNSRHPSQNPPVLKRHQR (SEQ ID NO: 2)。可通过设计B结构域截短的FVIII氨基酸序列并随后使氨基酸序列经受预测截短的B结构域中O-糖基化位点可能性的计算机模拟分析，制备这样的分子。可在合适的宿主细胞中合成具有这样的糖基化位点的可能性相对高的分子，然后分析糖基化模式并随后选择在截短的B-结构域中具有O-连接糖基化的分子。

FVIII分子亦包含许多N-连接寡糖，且这些寡糖中每一个可潜在充当用于连接半寿期延长侧基/部分的锚。

在wt FVIII分子中B结构域的最大长度为约907个氨基酸。本发明的分子中截短的B结构域的长度可变化于约10-约800个氨基酸，例如约10个氨基酸-约700个氨基酸，例如约12-500个氨基酸、12-400个氨基酸、12-300个氨基酸、12-200个氨基酸、15-100个氨基酸、15-75个氨基酸、15-50个氨基酸、15-45个氨基酸、20-45个氨基酸、20-40个氨基酸或20-30个氨基酸。截短的B-结构域可包含重链和/或轻链的片段和/或未在wt FVIII分子中发现的人工导入的序列。术语“B-结构域截短的”和“B-结构域缺失的”可在本文中交换使用。

改变的循环半寿期：本发明的分子相比于野生型FVIII分子可具有改变的体内循环半寿期，优选具有增加的循环半寿期。循环半寿期优选增加至少10%、优选至少15%、优选至少20%、优选至少25%、优选至少30%、优选至少35%、优选至少40%、优选至少45%、优选至少50%、优选至少55%、优选至少60%、优选至少65%、优选至少70%、优选至少75%、优选至少80%、优选至少85%、优选至少90%、优选至少95%、优选至少100%、更优选至少125%、更优选至少150%、更优选至少175%、更优选至少200%和最优选至少250%或300%。更更优选地，这样的分子具有增加至少400%、500%、600%或甚至700%的循环半寿期。可使用用于测量体内循环半寿期的下述方法：将FVIII静脉内给予FVIII缺乏的小鼠，例如在Taconic M&B饲养的具有c57bl/6背景的FVIII外显子16敲除(KO)小鼠，或者vWF缺乏的小鼠，例如在Charles River, Germany饲养的具有混合的SV129和c57bl/6背景的vWF外显子4 + 5 KO小鼠。vWF-KO小鼠具有13%的正常FVIII:C，而FVIII-KO小鼠具有不可检测的FVIII:C。在尾静脉让小鼠接受rFVIII的单次静脉内注射(280 IU/kg)。给药后使用非涂层毛细玻璃管在多达64小时的时间点上从眼眶丛取血。从各小鼠取3个样品，并在各时间点上收集2-4个样品。将血液用柠檬酸钠立即稳定化并将其在4倍体积缓冲液(50 mM Tris, 150 mM NaCl, 1 % BSA, pH 7.3, 具有防腐剂)中稀释，然后以4000 × g离心5分钟。将获自稀释血液的血浆在干冰上冷冻并在-80℃保存。基本上如实施例3中所述，在显色测定中测定FVIII:C。FVIII抗原可由ELISA测量，例如来自Diagnostica Stago的Asserachrom^? VIIIC:Ag。可使用winnonlin pro版本4.1软件，通过例如非区室化方法(NCA)进行药代动力学分析。

抗体：术语“抗体”本文指，来源于种系免疫球蛋白序列、能够与抗原或其部分特异性结合的蛋白。该术语包括任何同种型(即IgA、IgE、IgG、IgM和/或IgY)的全长抗体及其任何单链。抗体所结合的抗原上的位点被称为表位。

全长抗体通常包含至少4条多肽链：即通过二硫键相互连接的2条重(H)链和2条轻(L)链。抗体可被分割为抗原结合Fab片段和与多种Fc受体结合的Fc结构域。“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域在单一的多肽链中存在。

FVIII的免疫原性：患重度A型血友病的患者具有少于1%的FVIII，其免疫系统因此可对作为外源性抗原给予的治疗性FVIII反应，尤其连同大出血后的高强度治疗。抗FVIII的中和抗体(抑制剂)通常定位于A2结构域和轻链(尤其C2结构域)内的特定区(J Thromb Haemost 2004; 2:1082 -1095; Blood 2007; 110: 4234 -4242)。通过树突细胞和巨噬细胞的摄取被认为是将FVIII呈递给免疫系统的最初步骤(J Thromb Haemost 2009; 7: 1816-1823)。已表明巨噬细胞甘露糖受体涉及通过这些抗原呈递细胞的FVIII摄取(Proc Natl Acad Sci USA 2007; 104: 8965-8970)，而LRP似乎不涉及(Haematologica 2008; 93: 83-89)。抑制剂随后发生是T细胞依赖的免疫反应。已鉴定单一CD4+ T细胞表位并确认其在跨越C1结构域的氨基酸2098-2112的肽内，而跨越完整A1-A2-A3-C1-C2结构域的其他15聚体肽没有被确认为阳性(J Thromb Haemost 2005; 3: 991-1000)。肽的两个氨基酸(即M2104和L2107)突变导致T细胞增殖减少。在另一研究中，分析了A2、C1和C2结构域内的T细胞表位，并发现C2中的氨基酸残基R2220、F2196、N2198、M2199、L2200和R2215对于引起T细胞反应特别重要(WO 2011/060372)。因为FVIII-R484A/R489A/P492A在A型血友病小鼠模型中比wt FVIII诱导更低水平的抑制性抗FVIII抗体，所以A2结构域中的B细胞表位同样可在产生免疫反应中具有作用(Blood 2004; 104: 704 -710)。由此可见，不同的研究者已鉴定了涉及对FVIII免疫反应的FVIII中的不同表位，但对在FVIII中哪里导入取代以便产生较少免疫原性的FVIII分子没有共同的意见。虽然是否任何这些模型能预测人临床是未知的，但是通常在携带天然鼠(Thromb Haemost 1999; 81: 240-244)或(部分)人MHC II类库(Haemophilia 2010; 16 增刊 5: 47-53)的A型血友病小鼠模型中，在对人FVIII已诱导耐受的动物模型(Haemophilia 2010; 16 增刊 5: 47-53)中，或在人T细胞反应测定(Thromb Haemost 2000; 84: 643-652; WO 2011/060372)中评估FVIII的免疫原性。

FVIII的细胞摄取/LRP介导的清除：本发明的FVIII变体优选具有减少的细胞摄取。减少的细胞摄取可与延长的体内循环半寿期相关。可使用实施例7中公开的测定来测量细胞摄取。通过例如肝细胞表面上的LRP表达细胞进行FVIII的内吞作用，LRP和LRP家族成员已涉及FVIII清除。在小鼠中输注LRP拮抗剂RAP(受体相关蛋白)完全抑制了BALB/c小鼠最初阶段的FVIII清除，并延长了¹²⁵I-FVIII的半寿期3.3倍(J Biol Chem 1999; 274: 37685-37692)。在条件性LRP缺乏小鼠中，观察到FVIII的血浆水平增加(Blood 2003; 101: 3933-3939)，在联合的LRP和LDLR(低密度脂蛋白受体)缺乏的小鼠中，证明了诱导的FVIII的平均滞留时间增加了4.8倍(Blood 2005; 106: 906-912)。虽然这些出版物证明LRP和LRP家族成员在体内清除FVIII的作用，但是FVIII中负责与LRP相互作用的精确位置仍不清楚。之前已在A2中鉴定了包含氨基酸484-509的LRP结合位点(J Biol Chem 1999; 274: 37685-37692; Biochemistry 2006; 45: 1829-1840; Blood Coagul Fibronolysis 2008; 19: 543-555)。然而，与该区结合的mAb413仅影响了LRP与分离的A2的结合，A2中最可能作为LRP位点的不完整FVIII仅暴露在激活的FVIII (FVIIIa)中(J Thromb Heamost 2006; 4: 1487-1493)。另外，氨基酸376-556内具有单一或多个丙氨酸取代的FVIII显示的LRP结合与该区中无取代的FVIII是可比较的，在具有突变的FVIII分子的小鼠中，血浆滞留时间相对于野生型FVIII的半寿期未增加(摘要P-T-035, ISTH 2007)。已表明LRP结合位点存在于FVIII的轻链中(J Biol Chem 1999; 274: 23734-23739, WO 00/28021)，并基于抗体以及涵盖该区的合成肽的抑制作用和其中FVIII的该区已被FV的相应序列替换的FVIII–FV嵌合体的LRP结合缺失，鉴定了A3结构域中涉及Glu1811-Lys1818的位点(J Biol Chem 2003; 278: 9370-9377)。该区紧密靠近因子IXa相互作用位点或与其重叠，并因此该位点内的突变可影响FVIII的辅因子活性。另外，基于抗C2 mAb ESH4抑制FVIII的LRP结合的能力，已表明了C2结构域中的位点(J Biol Chem 1999; 274: 23734-23739)。已表明了FVIII的C2结构域内的ESH4的若干表位。氨基酸2248-2285内的ESH4的表位记录于J Biol Chem 1997; 272: 18007-18014)，而2173-2222后来鉴定为是ESH4与FVIII的结合所需(Thromb Haemost 2003; 89: 795-802)。在抗体的数据表(American Diagnostica)和J Mol Recognit 2009; 22: 301-306中，记录了FVIII的2303-2322内的表位。因此，用于定位FVIII上ESH4的表位的可得数据是冲突的，且不足够详细以允许预测LRP结合所必需的单独氨基酸。另外，甚至在高浓度的C2 (500 nM)下，仅观察到与LRP的中度缔合(J Biol Chem 1999; 274: 23734-23739)，表明C2中LRP位点的亲和力是低的，并使得是否该位点在完整FVIII中起任何主要作用是不清楚的。主要的磷脂结合位点存在于FVIIIa的C2结构域。因为跨越C2结构域的合成肽有抑制FVIII与固定化磷脂酰丝氨酸结合的能力，所以最初鉴定了该位点(Blood 1990; 75: 1999-2004)。通过该方式，表明残基2303-2332介导磷脂结合。另外，单克隆抗体ESH-8降低了FVIIIa与包含磷脂酰-L-丝氨酸的磷脂溶媒的亲和力(Blood 1995; 86: 1811-1819; J Biol Chem 1998; 273: 27918-27926)。ESH8的表位包括氨基酸2248-2285 (Blood 1995; 86: 1811-1819)。然而，在较后的出版物中，ESH8和由氨基酸2248-2285组成的肽不能抑制FVIIIa与激活的血小板的结合，而ESH4抗体和涵盖氨基酸2303-2332的肽抑制了FVIIIa与激活的血小板的结合(Biochemistry 2005; 44: 13858-13865)。

因此，虽然本领域中已长期推测具有减少的LRP结合的FVIII变体可潜在具有增加的体内循环半寿期，但是至今尚未在FVIII的C1和C2结构域中鉴定导致延长的循环半寿期的特异性LRP结合位点。

LRP结合基序被认为涉及各自对接到“酸性项链”中的具有约20 ?距离的成对赖氨酸残基(Mol Cell 2006; 22: 277-286)。因为氨基酸侧链的灵活性、FVIII结构的灵活性等，LRP结合位点之间的距离可然而稍偏离20 ? (例如至少15 ?)。同样地，两个LRP结合位点之间的距离亦可为约40 ?、60 ?或甚至80 ?。精氨酸可取代赖氨酸，因为精氨酸的侧链比赖氨酸的侧链更庞大，但可不匹配酸性项链，从而减少LRP结合。FVIII包含大量的潜在LRP结合基序，即本发明的发明人已确定了140个表面暴露的赖氨酸或精氨酸(图1和表1)。由此可见，本领域技术人员将不能鉴定具有实质性降低的LRP结合的具有1、2、3或仅有限个数量取代的FVIII变体。另外，本领域技术人员可预期，大量的赖氨酸和/或精氨酸残基应该被突变以便显著降低FVIII的LRP结合和LRP介导的清除。为了降低LRP结合，大量的赖氨酸和/或精氨酸取代将最可能导致具有较少或无生物学活性的分子和/或不能以足够的量表达的分子。这通过表1示出的若干FVIII突变体来例示。然而，本发明的发明人已出乎意料地显示，C1或C2足的表面可接近的赖氨酸或精氨酸残基的取代，或者在FVIII的C1和C2足都具有取代，导致具有显著降低的LRP结合同时保留完全活性的FVIII变体。

通过抗原呈递细胞例如树突细胞和巨噬细胞摄取FVIII绕过LRP受体家族(Haematologica 2008; 93: 83-98)。而与高甘露糖聚糖结合的巨噬细胞甘露糖受涉及通过这些细胞摄取FVIII (Proc Natl Acad Sci USA 2007; 104: 8965-8970)。然而，本发明的发明人已显示，导致与LRP结合减少的FVIII突变亦在树突细胞和巨噬细胞中显示减少的摄取。在对人FVIII形成抗体的鼠模型中，FVIII的这些取代出乎意料地导致较低水平的总抗FVIII抗体以及中和抗体(抑制剂)，如在通常用于在血友病患者中监测抑制剂发生的Bethesda测定中测量。因此可推测，具有减少的细胞摄取的FVIII变体是否可具有关于发生抑制剂风险较低的治疗益处。

适合调节LRP结合/细胞摄取的FVIII突变：

本领域已知，KM33抗体具有抑制FVIII与LRP结合的能力(J Biol Chem 2003; 278: 9370-9377 和 WO 03/093313)。给药后15和30分钟，与接受仅FVIII的对照小鼠相比，向vWF缺乏小鼠共给予KM33 scFv与FVIII导致较高水平的FVIII活性(WO 03/093313)。因为KM33结合K2092-S2094区(Blood 2009; 114: 3938-3946 和摘要 P-M-040, 在ISTH呈现, 2007)，已表明K2092可能组成一个潜在LRP结合位点的一部分。该位点可另外包含K2065(摘要 O-M-041 在ISTH呈现, 2007)。这些单取代都影响LRP结合但不影响与因子IXa相互作用(摘要O-M-041, ISTH, 2007)。然而，这些氨基酸残基的仅2个或更多个(多达约10个)用丙氨酸取代可显著减少LRP结合和/或细胞摄取是未表明的。

包含K2092A取代和/或F2093A取代的FVIII变体公开于Blood 2009; 114: 3938-3946。发现这些突变在低磷脂酰-L-丝氨酸水平例如4%时，对包含4%磷脂酰-L-丝氨酸的膜亲和力降低3-10倍，且因子X酶活性降低超过95%。

考虑到潜在LRP结合位点的大的冗余和可进行仅一些表面暴露的赖氨酸(或精氨酸)残基的氨基酸取代而不失去生物学活性和/或显著降低FVIII产率的事实，因此至今不可提供导致显著减少的LRP结合的具有一个、二个或一些氨基酸取代的生物活性FVIII变体。然而，本发明的发明人的确达成选择的确保留生物学活性以及显示显著降低的LRP结合的FVIII的C1和/或C2足的氨基酸取代(表1和2)。因为这些位点紧密靠近磷脂结合位点，C1足的LRP位点内的取代与C2足的位点内的取代的组合可导致对LRP结合有更大作用的FVIII分子且这些FVIII分子同时保持FVIII:C是无法预期的。

根据本发明，具有调节的LRP结合/细胞摄取的FVIII变体的实例包括：

Figure 2011800549583100002DEST_PATH_IMAGE005

。

侧链/侧基/部分：可通过翻译后修饰或以融合蛋白的形式将本发明的FVIII变体与(半寿期延长)侧基/部分共价缀合。因此可进行FVIII的一种或多种下述侧基修饰：烷基化、酰基化、酯形成、二硫化物或酰胺形成等。其包括PEG化的FVIII、半胱氨酸-PEG化的FVIII及其变体。本发明的FVIII变体亦可与生物相容性的脂肪酸及其衍生物、亲水聚合物(羟乙基淀粉、聚乙二醇、透明质酸、肝素糖(heparosan)聚合物、基于磷酸胆碱的聚合物、柔性聚合物(fleximer)、葡聚糖、聚唾液酸)、多肽(抗体、抗体的抗原结合片段、Fc结构域、转铁蛋白、白蛋白、弹性蛋白样肽(MacEwan SR, Chilkoti A. Biopolymers. 2010；94:60)、XTEN聚合物(Schellenberger V 等 Nat Biotechnol. 2009；27:1186)、PAS化或HAP化(Schlapschy M 等 Protein Eng Des Sel. 2007 ；20 :273)、白蛋白结合肽(Dennis MS 等 J Biol Chem. 2002, 277:35035))等缀合。

本发明的FVIII可为一种或多种半寿期延长疏水侧基/部分所酰化 – 任选经由接头。在本发明的上下文中具有-(CH₂)₁₂-部分的化合物是可能的白蛋白结合剂。由于这样的侧基可能够与白蛋白形成非共价复合体，有时疏水侧基可被称为“白蛋白结合剂”，由于酰化的FVIII变体和白蛋白的复合体仅缓慢分解来释放FVIII变体，从而促进酰化的FVIII变体在血流中的循环。使用化学法以及基本上按照如WO03031464中公开的方法的酶促“糖酰化”法，可酰化FVIII。酶促法具有避免使用任何有机溶剂以及通常为非常位点特异的优点。

术语“PEG化的FVIII”意指与PEG分子缀合的FVIII。应该理解，PEG分子可与FVIII的任何部分(包括任何氨基酸残基或碳水化合物部分)连接。术语“半胱氨酸-PEG化的FVIII”意指具有与FVIII中导入的半胱氨酸的巯基缀合的PEG分子的FVIII。

PEG是合适的聚合物分子，因为它相比于多糖(例如葡聚糖)仅具有很少的能够交联的反应基。特别地，单官能团PEG，例如甲氧基聚乙二醇 (mPEG)，是令人感兴趣的，因为其偶联化学相对简单(仅一个反应基可用于与多肽上的连接基团缀合)。因此，消除了交联的风险，所产生的多肽缀合物更加均质并且聚合物分子与多肽的反应较容易控制。

为了实现聚合物分子与多肽的共价连接，以活化形式提供聚合物分子的羟基末端基团，即具有反应官能团。PEG化可针对与多肽上所有可得的连接基团(即这种连接基团暴露在多肽表面)的缀合，或可针对一个或多个特定连接基团，例如N端氨基 (美国专利号5,985,265)、N-和/或O-连接聚糖等。此外，可以一步法或逐步法实现缀合(例如如WO 99/55377中所述)。用于将侧基/部分与O-和/或N-连接聚糖偶联的酶促方法公开于WO03031464。

融合蛋白：融合蛋白/嵌合蛋白，是通过将两个以上最初编码单独蛋白的基因连接而产生的蛋白。该融合基因的翻译产生具有来源于各最初蛋白的功能性质的单一多肽。本发明的FVIII变体的侧链可因此为与FVIII融合的多肽的形式。本发明的FVIII变体可因此与可赋予FVIII延长的半寿期的肽(例如抗体和“Fc融合衍生物”或“Fc融合蛋白”)融合。

Fc融合蛋白在本文中意在涵盖与可来源于任何抗体同种型的Fc结构域融合的FVIII，然而，由于IgG抗体的相对长的循环半寿期，通常将优选IgG Fc结构域。此外，为了调节特定效应子功能(例如补体结合和/或与特定Fc受体结合)，可修饰Fc结构域。FVIII与具有与FcRn受体结合的能力的Fc结构域的融合，将通常得到与wt FVIII蛋白的半寿期相比延长循环半寿期的融合蛋白。在IgG Fc结构域的位置234、235和237中的突变将通常导致与FcγRI 受体(亦可能FcγRIIa和FcγRIII受体)的结合降低。这些突变不改变与FcRn受体的结合，FcRn受体通过内吞再循环途径促进长的循环半寿期。优选地，本发明融合蛋白的修饰的IgG Fc结构域包含一种或多种下述突变，突变将分别导致与特定Fc受体的亲和力降低(L234A、L235E和G237A)和C1q介导的补体结合降低(A330S和P331S)。

von Willebrand因子 (vWF)：vWF是存在于血浆中的大的单体/多聚体糖蛋白，并在内皮(在怀布尔-帕拉德体中)、巨核细胞(血小板的α-颗粒)和内皮下结缔组织中组成性产生。它的主要功能是与其他蛋白(特别是FVIII)结合，且它在血小板与伤口部位粘附中重要。

当在循环中无活性时，FVIII与vWF结合；当不与vWF结合时，FVIII迅速降解或被清除。由此可见，降低或废除FVIII的vWF结合能力可被认为是获得具有延长循环半寿期的FVIII变体的高度不合意的方法。然而如果该分子与保护性半寿期延长侧基/部分缀合，那么可通过位点定向诱变来降低或废除vWF。

在FVIII中负责与vWF结合的区是如EP0319315中公开的跨越残基1670-1684的区。设想涉及该区的FVIII点突变体和/或缺失突变体将改变与vWF结合的能力。根据本发明，特别优选的点突变的实例包括含有一种或多种下述点突变的变体：Y1680F、Y1680R、Y1680N-E1682T和Y1680C。

糖蛋白：术语“糖蛋白”旨在涵盖包含与“骨架”氨基酸序列的一个或多个氨基酸残基连接的一个或多个寡糖(聚糖)的肽、寡肽和多肽。聚糖可为N-连接的或O-连接的。

术语“末端唾液酸”，或可互换的，“末端神经氨酸”因此旨在涵盖作为聚糖或寡糖链的末端糖残基连接的唾液酸残基，即各触角(antenna)的末端糖为通过α2->3或α2->6键与半乳糖连接的N-乙酰神经氨酸。

术语“半乳糖或其衍生物”意指半乳糖残基，例如天然D-半乳糖或其衍生物，例如N-乙酰半乳糖胺残基。

术语“末端半乳糖或其衍生物”意指作为聚糖或寡糖链的末端糖残基连接的半乳糖或其衍生物，例如各触角的末端糖为半乳糖或N-乙酰半乳糖胺。

术语“脱唾液酸糖蛋白”旨在包括其中一个或多个末端唾液酸残基已被移除的糖蛋白，例如通过用唾液酸酶处理或通过化学处理，暴露来自半乳糖或N-乙酰半乳糖胺的底“层”的至少一个半乳糖或N-乙酰半乳糖胺残基(“暴露的半乳糖残基”)。

通常，可将不是野生型FVIII部分的N-连接聚糖导入本发明的FVIII分子中，即通过导入氨基酸突变以便获得N-X-S/T基序。本发明的FVIII分子包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10或更多个N-连接聚糖。N-连接聚糖的结构为高甘露糖或复合物形式。高甘露糖聚糖包含聚糖的非还原端上的末端甘露糖残基。复合物N聚糖包含非还原端上的末端唾液酸、半乳糖或N-乙酰葡糖胺。可因此使用重组技术将N-连接的糖基化位点插入到本发明的FVIII变体中。

唾液酸转移酶：唾液酸转移酶是将唾液酸转移到初生寡糖上的酶。各唾液酸转移酶对特定的糖核苷酸供体底物有特异性。唾液酸转移酶将唾液酸加到糖脂(神经节苷脂)的末端半乳糖上，或加到糖蛋白的N-或O-连接聚糖上。唾液酸转移酶适用于侧基/部分与FVIII分子上存在的聚糖酶促缀合。

药物组合物：药物组合物在本文中优选意在涵盖含有适合于胃肠外给药的本发明的FVIII分子的组合物，例如即用型无菌水性组合物或可在例如水或水性缓冲液中复溶的干燥无菌组合物。本发明的药物组合物可包含各种药学上可接受的赋形剂、稳定剂等。

这种组合物中的另外成分可包括润湿剂、乳化剂、抗氧化剂、填充剂、张度调节剂、螯合剂、金属离子、含油溶媒、蛋白(例如人血清白蛋白、明胶或蛋白质)和两性离子(例如氨基酸，例如甜菜碱、牛磺酸、精氨酸、甘氨酸、赖氨酸和组氨酸)。当然这种另外成分不应该有害地影响本发明药物制剂的总体稳定性。可凭借注射器(任选笔样注射器)通过皮下、肌内、腹膜内或静脉内注射来进行胃肠外给药。备选地，可凭借输注泵进行胃肠外给药。

为了保证分子在折叠和翻译后修饰(例如糖基化、磺化(sulfatation)等)期间被合适地加工，用于产生本发明的重组FVIII蛋白的合适宿主细胞优选为哺乳动物来源。在实践本发明时，细胞为哺乳动物细胞，更优选为建立的哺乳动物细胞系，包括但不限于CHO、COS-1、幼仓鼠肾 (BHK)和HEK293细胞系。优选的BHK细胞系是tk- ts13 BHK细胞系，在下文中称为BHK570细胞。优选的CHO细胞系是CHO K1细胞系以及细胞系CHO-DXB11 和CHO-DG44。其他合适的细胞系包括但不限于，大鼠Hep I、大鼠Hep II、TCMK、NCTC 1469、DUKX细胞 (CHO细胞系)和DG44 (CHO细胞系)。同样有用的是3T3细胞、Namalwa细胞、骨髓瘤和骨髓瘤与其他细胞的融合物。目前优选的细胞是HEK293、COS、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、幼仓鼠肾(BHK)和骨髓瘤细胞，尤其是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。

本文使用的术语“治疗”指任何有需要的人或其他动物受试者的医学治疗。预期所述受试者已经历医生进行的身体检查，医生已给出试验性或明确的诊断，该诊断表明使用所述特定治疗对所述人或其他动物受试者的健康有益。根据受试者健康的现状，所述治疗的时机和目的可因个体而异。因此，所述治疗可为预防的、缓和的、针对症状的和/或治愈的。

在第一方面，本发明因此涉及一种具有FVIII活性的重组FVIII变体，其中所述变体包含FVIII C1足和/或C2足的2-10 (备选2-8、备选2-7、备选2-6、备选2-5、备选2-4，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10)个表面可接近的带正电荷氨基酸(例如赖氨酸和/或精氨酸残基)的取代，其中所述表面可接近的带正电荷残基/赖氨酸或精氨酸残基被但不限于丙氨酸或谷氨酰胺取代，和其中该取代导致LRP结合减少并优选亦导致细胞摄取降低。在一个实施方案中，表面可接近的带电荷氨基酸选自赖氨酸、精氨酸和组氨酸。优选地，所述变体另外具有减少的LRP结合。优选地，所述变体另外具有减少的免疫原性和/或降低的清除。更优选地，所述变体具有降低的细胞摄取、减少的LRP结合和减少的免疫原性以及降低的清除。根据一个具体的实施方案，一个或多个精氨酸残基可取代一个或多个赖氨酸残基。精氨酸的“庞大”侧链可能不能合适对接到LRP酸性项链中，从而导致LRP结合减少。在一个实施方案中，所述FVIII变体另外包含例如R2159N突变和/或引起另外的糖基化位点形成的其他突变，其中所述糖基化位点的聚糖赋予降低的与KM33抗体结合的能力。

在第二方面，本发明涉及一种重组FVIII变体，其中所述变体包含K2092A取代和F2093A取代，其中所述变体与半寿期延长部分缀合。半寿期延长部分可为例如一种或多种PEG部分、一种或多种PSA部分、一种或多种HES部分、一种或多种脂肪酸/脂肪酸衍生物、Fc结构域或者这些的任何组合(例如一种或多种PEG部分与一种或多种PSA部分组合)。在一个实施方案中，所述FVIII变体另外包含R2159N突变和/或引起另外的糖基化位点形成的其他突变，其中所述糖基化位点的聚糖赋予降低的与KM33抗体结合的能力。

在第三方面，本发明涉及一种具有FVIII活性的重组FVIII变体，其中所述变体包含引起另外的糖基化位点的突变，其中所述糖基化位点的聚糖赋予降低的与KM33抗体结合的能力。优选地，结合KM33抗体的能力降低导致减少的细胞摄取和/或减少的LRP结合。包含赋予变体降低的与KM33抗体结合的能力的另外的糖基化位点的该类FVIII变体的一个实例是包含R2159N突变的FVIII变体。

在一个实施方案中，本发明的FVIII变体包含FVIII C1足和/或C2足的2-10 (备选2-9、备选2-8、备选2-7、备选2-6、备选2-5、备选2-4，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10)个表面可接近的带正电荷氨基酸的取代，其中所述表面可接近的带电荷氨基酸残基被丙氨酸或谷氨酰胺取代，和其中该取代导致所述FVIII变体的细胞摄取减少。

在一个实施方案中，本发明的FVIII变体另外包含F2093A突变。

根据一个实施方案，本发明的FVIII变体包含C1足的至少2个表面可接近的带正电荷氨基酸残基的取代。在另一实施方案中，本发明的FVIII变体包含C2足的至少2个表面可接近的带正电荷氨基酸残基的取代。在另一实施方案中，本发明的FVIII变体包含C1足的至少1个表面可接近的带正电荷氨基酸残基的取代和C2足的至少1个表面可接近的带电荷氨基酸残基的取代。

根据另一实施方案，本发明的FVIII变体包含表面可接近的带正电荷氨基酸残基的取代对，其中取代对之间的距离是至少15 ?。

在另一实施方案中，本发明的FVIII变体包含K2092取代。优选地，2092赖氨酸残基被丙氨酸残基取代。备选地，2092赖氨酸残基被谷氨酰胺残基取代。

在另一实施方案中，本发明的FVIII变体包含所述K2092取代和R2215取代。优选地，2092赖氨酸残基被丙氨酸残基取代。备选地，2092赖氨酸残基被谷氨酰胺残基取代。优选地，2215精氨酸残基被丙氨酸残基取代。备选地，2215精氨酸残基被谷氨酰胺残基取代。

在另一实施方案中，本发明的FVIII变体，所述K2092取代与K2249取代组合。优选地，2092赖氨酸残基被丙氨酸残基取代。备选地，2092赖氨酸残基被谷氨酰胺残基取代。优选地，2249赖氨酸残基被丙氨酸残基取代。备选地，2249赖氨酸残基被谷氨酰胺残基取代。

在另一实施方案中，本发明的FVIII变体包含R2090取代。优选地，2090精氨酸残基被丙氨酸残基取代。备选地，2092精氨酸残基被谷氨酰胺残基取代。

在另一实施方案中，本发明的FVIII变体包含K2065取代。优选地，2065赖氨酸残基被丙氨酸残基取代。备选地，2065赖氨酸残基被谷氨酰胺残基取代。

在另一实施方案中，本发明的FVIII变体包含所述K2065取代和R2215取代。优选地，2065赖氨酸残基被丙氨酸残基取代。备选地，2065赖氨酸残基被谷氨酰胺残基取代。优选地，2215精氨酸残基被丙氨酸残基取代。备选地，2215精氨酸残基被谷氨酰胺残基取代。

在另一实施方案中，本发明的FVIII变体包含所述K2065取代和K2249取代。优选地，2065赖氨酸残基被丙氨酸残基取代。备选地，2065赖氨酸残基被谷氨酰胺残基取代。优选地，2249赖氨酸残基被丙氨酸残基取代。备选地，2249赖氨酸残基被谷氨酰胺残基取代。

根据第一个实施方案，本发明的FVIII变体包含C2足的赖氨酸或精氨酸取代，其中所述取代选自以下的一个或多个氨基酸：R2215、R2220、K2249和K2320。

根据第二个实施方案，本发明的FVIII变体包含C1足的赖氨酸或精氨酸取代，其中所述取代选自以下的一个或多个氨基酸：K2065、R2090和K2092。

在第二方面，本发明涉及一种具有FVIII活性的重组FVIII变体，其中所述变体包含C1足的F2093A取代，和其中该取代导致细胞结合和/或细胞摄取减少和/或LRP结合降低。

在一个实施方案中，本发明的FVIII变体是与半寿期延长侧基/部分缀合的FVIII变体。在另一实施方案中，侧基可通过聚糖(例如N-连接聚糖或O-连接聚糖)与FVIII缀合。在一个优选的实施方案中，使用如公开于例如WO03031464的酶促方法将侧基与FVIII聚糖缀合。在另一优选实施方案中，可使用重组方法将N-和/或O-连接聚糖导入/加入本发明的FVIII变体中。在另一实施方案中，本发明的FVIII变体是融合蛋白，例如FVIII:Fc融合蛋白。

在另一实施方案中，本发明的FVIII变体另外包含已在所述FVIII变体中导入以便增加该变体体外稳定性的氨基酸改变。在一个优选的实施方案中，已导入二硫桥以便增加本发明FVIII变体的体外稳定性。根据另一实施方案，本发明的所述FVIII变体包含一个或多个稳定化二硫桥。所述稳定化硫桥优选共价连接本发明FVIII变体的两个结构域。

在另一实施方案中，本发明的FVIII变体是B结构域截短的变体。在另一实施方案中，本发明的FVIII变体包含半寿期延长侧基/部分，该侧基优选与位于截短的B-结构域中的O-聚糖连接，其中在所述FVIII变体激活时，所述半寿期延长部分被移除。根据一个优选的实施方案，该变体包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8和SEQ ID NO: 9。

在另一实施方案中，本发明的FVIII变体包含选自以下的半寿期延长侧基/部分：PEG基团、Fc结构域、多肽和疏水侧基/部分。在一个优选的实施方案中，侧基为与所述FVIII变体融合的融合配偶体的形式。在一个优选的实施方案中，Fc结构域是具有降低的效应子功能的IgG Fc结构域，优选包含下述氨基酸取代：L234A、L235E、G237A、A330S和P331S。在一个实施方案中，可使用公开于例如WO03031464的“糖PEG化”酶促方法将侧基与本发明的FVIII变体缀合。在另一实施方案中，可通过自由导入的半胱氨酸氨基酸残基将侧基加入本发明的FVIII变体中。

在另一实施方案中，本发明的重组FVIII变体包含下述取代：K2092A和F2093A。该变体优选与一个或多个半寿期延长部分(例如PEG、HES、聚唾液酸(PSA)和脂肪酸/脂肪酸衍生物、HAS)缀合。

在另一实施方案中，本发明的重组FVIII变体包含下述取代：R2090A、K2092A和F2093A。

在另一实施方案中，本发明的重组FVIII变体包含下述取代：K2065A、K2092A、F2093A和R2215A。

在另一实施方案中，本发明的重组FVIII变体包含与至少一个选自以下的取代组合的K2092A和F2093A取代：R2215A、K2065A和R2090A。

在另一实施方案中，本发明的变体包含至少一个由FVIII抗体结合的表面暴露的氨基酸的取代，该抗体在与FVIII结合时具有降低细胞摄取的能力。

在另一实施方案中，本发明的变体是B结构域截短的变体，其中B结构域的序列如SEQ ID NO: 2所示。

在另一实施方案中，本发明的重组FVIII变体包含至少一个由至少一种FVIII抗体结合的表面暴露的氨基酸的取代，该抗体在与FVIII结合时具有降低细胞摄取的能力。该类抗体的实例包括KM33 (J Biol Chem 2003; 278: 9370-9377 和 WO 03/093313)、ESH4 (J Biol Chem 1997)、CLB-CAg117 Blood 1998; 91: 2347-2352)、4F30和4F161抗体。

第二方面涉及编码本发明FVIII变体的DNA分子以及包含这样的DNA分子的表达载体和宿主细胞。

第三方面涉及制备本发明FVIII变体的方法。这样的方法包括：在合适的条件下孵育合适的宿主细胞并随后分离所述FVIII变体。可另外优选使用酶促方法将重组产生的变体与例如侧链缀合。

第四方面涉及包含本发明FVIII变体的药物组合物。第五方面涉及包含含有本发明FVIII变体的药物组合物的药盒。该药盒优选包含：包含含有本发明FVIII变体的干燥组分的容器以及含有用于复溶FVIII变体的缓冲液的容器。

第六方面涉及本发明的FVIII变体或者本发明的药物组合物用于治疗血友病(优选A型血友病)的用途。本发明另外涉及本发明的FVIII变体用于制备用于治疗血友病(优选A型血友病)的药物中的用途。

最后方面涉及一种治疗血友病的方法，其包括：向有需要的人给予治疗有效量的本发明的FVIII变体或者药物制剂。

实施例

实施例1：FVIII变体的产生

在编码具有21个氨基酸B结构域接头的FVIII的表达构建体的重链C-末端插入编码cMyc标签的片段(Haemophilia 2010; 16: 349-48)。该FVIII-cMyc2的表达水平和活性与未加标签的FVIII类似。将FVIII-cMyc2用作变体的模板以及实施例3-5中所述测定的对照。将另外的限制性位点加入FVIII-cMyc2表达构建体中以容易在变体间交换结构域。A1结构域侧翼为SalI和PshAI/MfeI，A2侧翼为PshAI/MfeI和AvrII/NruI，A3侧翼为AgeI/MluI和BstZ17I/BstAPI，C1侧翼为BstZ17I/BstAPI和SwaI/SphI和C2侧翼为SwaI/SphI和SfiI。暴露的碱性氨基酸(赖氨酸或精氨酸)的位点定向诱变由Geneart AG (Regensburg, Germany)进行。

将对LRP1具有降低亲和力的突变体特别定位到C1和C2结构域的足(参见图2以及表1和2)。通过将R2215A、R2220Q、K2249A和R2320Q的520 bp SphI/SfiI片段转移到C1突变体K2065A、R2090A和K2092A中，克隆C1和C2突变体的组合(表2)。

实施例2：FVIII变体的表达

根据制造商的推荐，使用HKB11细胞(Cho M-S 等 J Biomed Sci 2002; 9: 631-63)和293fectin (Invitrogen)进行无血清转染。在补充50 U mL^-1盘尼西林和50 ug mL^-1链霉素的市售Freestyle 293表达培养基(Invitrogen #. 12338-018)中培养HKB11悬浮细胞。在摇床中将细胞作为悬浮细胞培养并在37℃、在5% CO₂和95%相对湿度下孵育细胞。在密度为3x10⁵细胞 mL^-1时接种细胞并每3-4天传代细胞。通过使用用于自动细胞计数的图像分析软件的Cedex (Innovatis)分析，评价活和总细胞浓度。活细胞通过其排除台盼蓝染料的能力被突出显示。转染后96小时收获细胞并通过温和离心分离细胞沉淀。然后，将细胞沉淀在包含0.5 M NaCl的Freestyle 293表达培养基中重悬。温和离心后，收获包含FVIII的上清液并将其在-80℃保存直至另外的分析。

实施例3：在显色测定中测量的FVIII:C

如下使用Coatest SP试剂(Chromogenix)，在显色FVIII测定中评价rFVIII化合物的FVIII活性(FVIII:C)：将FVIII样品和FVIII标准品(人校准血浆, Chromogenix)在Coatest测定缓冲液(50 mM Tris、150 mM NaCl、1 % BSA，pH 7.3，具有防腐剂)中稀释。将50 μl预稀释100倍、400倍、1600倍和6400倍的样品(培养上清液或纯化的FVIII变体)、标准品和缓冲液阴性对照一式两份加入到96孔Spectramax微量滴定板中。将来自Coatest SP试剂盒的因子IXa/因子X试剂、磷脂试剂和CaCl₂以5:1:3 (体积：体积：体积)混合并将75 μl该混合物加入孔中。在室温孵育15分钟后，加入50 μl的因子Xa底物S-2765/凝血酶抑制剂I-2581混合物，将反应在室温孵育5分钟，然后加入25 μL 1 M 柠檬酸，pH 3。在Envision板读数仪(PerkinElmer)上测量405 nm的吸光度，其中620 nm的吸光度用作参考波长。从所有样品中减去阴性对照值，并通过针对FVIII浓度绘制的标准品吸光度值的线性回归，制作校正曲线。通过将样品的活性除以由ELISA确定的蛋白浓度，计算比活性(实施例4)。通过将FVIII变体的比活性除以FVIII模板的比活性，计算相对于FVIII-cMyc2模板的活性。表1中的数据显示不同FVIII变体之间的FVIII:C活性变化大。表2中的数据显示，在所选择的FVIII变体中FVIII:C活性是维持的。

实施例4：在ELISA中测量的总FVIII抗原

在来自Affinity Biologicals (# F8C-EIA)的ELISA中如下评价FVIII变体的量：将微量滴定板(Nunc)用100 μL/孔PBS (0.10 M 磷酸钠; 0.145 M NaCl, pH 7.2)中的包被抗体包被。将板密封并在4℃孵育过夜。将板在洗涤缓冲液(0.01 M磷酸钠, 0.145 M NaCl, 0.05 % Tween 20, pH 7.2)中洗涤5×，并将该板在洗涤缓冲液中室温封闭30分钟。将样品在测定缓冲液(0.1 M Hepes; 0.1 M NaCl; 10 g/L BSA; 0.1% Tween 20, pH 7.2)中稀释，并将10 μL稀释的样品(或校准品/稀释的对照)转移到各孔中。向板中加入检测抗体(100 μL)，并在摇床上室温孵育1?小时。洗涤板，加入100 μL底物(TMB单组分底物, Kem-en-Tec)，并在摇床上孵育直至显影足够的颜色。通过加入100 μL终止缓冲液(4M H₃PO₄)来停止反应。在Envision板读数仪(PerkinElmer)上测量450 nm的吸光度，其中620 nm的吸光度用作参考波长。

实施例5：在ELISA中的LRP结合

如下进一步评价FVIII变体与LRP结合的能力：将所有样品在无NaCl的缓冲液(0.1 M Hepes; 10 g/L BSA; 0.1 % Tween 20, pH 7.2)中稀释40倍和80倍。将标准品(FVIII-cMyc2)稀释至3000、1000、333、111、37、12.3、4.12和0 ng/mL。将微量滴定板用PBS中的LRP (1 ug/mL, BioMac, Leipzig, Germany)包被(100 μL/孔)，密封微量滴定板，并在4℃孵育至少72小时。将板在无NaCl的缓冲液中洗涤5×，并在缓冲液中封闭至少15分钟。将标准品/稀释的样品(50 μL/孔)和缓冲液(150 μL/孔)加入板中，并在湿室中室温孵育过夜。洗涤板，加入100 μL/孔的1 μg/mL生物素化抗FVIII A2抗体(BDD-FVIII-1F5*生物素, 使用标准技术自制)，并在摇床上室温孵育1小时。将板洗涤5×，加入缓冲液中1:20000稀释的100 μL/孔链霉亲和素*HRP (KPL, Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc.)，并将板在摇床上室温孵育1小时。将板洗涤5×，加入100 μL/孔TMB单底物(Kem-en-Tec)，并将板在摇床上孵育直至获得足够的颜色。用100 μL/孔4M H₃PO₄终止反应，然后在Envision板读数仪(PerkinElmer)上测量450 nm的吸光度，其中620 nm的吸光度用作参考波长。通过将变体的LRP结合除以由ELISA测定的蛋白浓度，计算比LRP结合(实施例4)。通过将变体的比LRP结合除以FVIII-cMyc2模板的比LRP结合，计算相对于FVIII-cMyc2模板的LRP结合。表1显示其中表面暴露的赖氨酸或精氨酸残基被突变的FVIII变体的表达水平、FVIII:C活性和LRP结合。对于一些FVIII变体，由于表达水平低，活性和LRP结合不能被检测。这些在表中标记为“低浓度(low conc)”。其中表达水平足够高以允许分析LRP结合的大多数FVIII变体显示的LRP结合接近于无取代的FVIII对照“FVIII模板”的LRP结合。一些FVIII变体例如K523A和K1972Q显示减少的LRP结合，同时活性降低。然而，在C1和C2结构域具有取代的一些FVIII变体(即K2065A、R2090A、K2092A、R2215A、R2220Q和K2249A)维持活性(相对于FVIII对照，>0.78)的同时具有降低的LRP结合(相对于FVIII对照，< 0.53)。这些突变都位于上文所述的C1足和C2足中。当C1结构域的该区内的突变与C2结构域的突变组合时(表2)，对于其中包含R2215A的双突变，观察到LRP结合进一步降低。同样R2090A-K2249A双突变体显示的LRP结合比单突变所见的LRP结合降低更大。对于其中表达水平低于≈350 ng/ml的一些突变，使用所述的测定不能分析LRP结合。通过在测定中施用一系列浓度(多达18 nM)，进一步分析所选择的纯化的FVIII变体的LRP结合，该FVIII变体包括与F2093A组合的赖氨酸和精氨酸取代，并在Prism版本5.01软件中使用一个位点总结合的公式，通过结合曲线的非线性回归计算K_d值。表3显示相对于无插入突变的FVIII，K_d的增加倍数。K_d倍数增加越高，LRP结合降低的越多。数据显示，如果C1 (K2065, R2090, K2092, F2093)和C2足(R2215, R2220和K2249)的两个或更多个(即多达4个)氨基酸残基被取代，那么观察到LRP结合的实质性降低。

表1. FVIII单突变体的LRP结合和活性

Figure 2011800549583100002DEST_PATH_IMAGE009

Figure 2011800549583100002DEST_PATH_IMAGE011

*) n.d. 代表不可检测的数据，因为K496被包括在生物素化检测抗FVIII A2抗体BDD-FVIII-1F5*生物素的表位中(实施例5)。因此在所使用的测定中K496A的LRP结合不能被检测。

表2. 所选择的具有减少的LRP结合的FVIII单和双突变体

Figure 2011800549583100002DEST_PATH_IMAGE013

表3: 在ELISA中通过滴定确定的相对于wt FVIII的LRP结合

实施例6：通过表面等离振子共振(SPR)分析的LRP结合研究

使用BIAcore^TM3000生物传感器系统(Biacore AB, Uppsala, Sweden)，进行SPR分析。使用如供应商规定的胺偶联试剂盒，将全长LRP (BioMac, Leipzig, Germany)通过伯氨基与激活的CM5-传感器芯片的葡聚糖表面共价偶联(10 fmol/mm²)。除了抗-FVIII抗体CLB-CAg 117已被如(Br J Haematol 2008; 142: 644-652)所述构建到全长IgG单克隆抗体VK34中的单链抗体片段VK34 (Blood 2000; 96: 540-545)代替外，如(Blood 2009; 114: 3938-3945)所述，构建并表达FVIII衍生物FVIII-YFP、FVIII-YFP-K2092A、FVIII-YFP-F2093A和FVIII-YFP-K2092A-F2093A。将FVIII装载到50 mM 咪唑(pH 6.7)、50 mM CaCl₂、0.8 M NaCl中的VK34 Sepharose柱上。装载后，随后将柱用50 mM 咪唑(pH 6.7)、50 mM CaCl₂、0.8 M NaCl和50 mM 咪唑(pH 6.4)、40 mM CaCl₂、5% (v/v)乙二醇缓冲液洗涤。接着，以50 mM 咪唑(pH 6.4)、40 mM CaCl₂、55% (v/v)乙二醇从VK34 Sepharose柱洗脱FVIII。将包含FVIII的流分在50 mM Tris (pH 8.0)、100 mM NaCl、5 mM CaCl₀ 10% (v/v)甘油中稀释并吸附于Q Sepharose FF ( Amersham Biosciences, Belgium)。随后，将Q Sepharose柱用50 mM Tris (pH 8.0)、100 mM NaCl、5 mM CaCl₀ 10% (v/v)甘油洗涤。以50 mM Tris (pH 7.4)、5 mM CaCl₂、0.8 M NaCl、50% (v/v)甘油从Q Sepharose柱洗脱FVII，并将其在-20℃储存。纯化的FVIII变体维持了全部活性，如通过活性(FVIII Coatest法, Chromogenix, Milan, Italy)与抗原(FVIII ELISA, 参见Blood 2009; 114: 3938-3945)比为0.92-1.03所评估。将FVIII衍生物(60 nM)通过固定化LRP，并在360秒的缔合期间记录校正过非特异性结合的结合响应，以共振单位(RU)计。表4显示，与无取代的FVIII-YFP相比，FVIII-K2092A的LRP结合减少了大约100 RU，然而FVIII-F2093A的结合仅稍减少(17 RU)。然而，当组合C1足的两个取代时，观察到LRP结合的实质性减少(大约200 RU)。

表4：通过SPR测量的FVIII-YFP和变体的LRP结合

实施例7：FVIII轻链变体的LRP结合

使用如制造商所示的合适引物，通过Quick Change mutagenesis^TM (Stratagene, La Jolla, CA, USA)，将K2065R、K2065A、K2092R和K2092A点突变以及K2065R-K2092R和K2065A-K2092A双突变导入FVIII轻链中。根据制造商的推荐，使用FreeStyle^TM 293-F 细胞 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA, # R790-07)和293fectin (Invitrogen)，进行FVIII轻链变体的无血清转染。在市售Freestyle 293表达培养基(Invitrogen #. 12338-018)中培养FreeStyle^TM 293-F细胞悬浮细胞。在摇床中将细胞作为悬浮细胞培养并在37℃、在8% CO₂和95%相对湿度下孵育细胞。在密度为3x10⁵细胞 mL^-1下接种细胞且每3-4天传代细胞。转染后120小时收获细胞并通过温和离心分离细胞沉淀。然后，将细胞沉淀在包含0.55 M NaCl的Freestyle 293表达培养基中重悬。温和离心后，收获包含FVIII轻链的上清液并将其在-20℃保存直至另外的分析。如(J Biol Chem. 2003; 278:9370-7)所述，将LRP簇II在幼仓鼠肾(BHK)细胞中表达并纯化。使用BIAcore3000生物传感器 (Biacore AB, Uppsala, Sweden)，通过SPR分析评估LRP簇II与FVIII轻链变体K2065A、K2092A、K2065A-K2092A、K2065R、K2092R和K2065R-K2092R的缔合和解离。使用根据制造商说明书的胺偶联方法，将抗-C2抗体CLB-EL14 IgG4 (Br J Haematol 2008; 142:644-652)固定到CM5传感器芯片上至密度为27 fmol/mm²。随后，将FVIII轻链变体K2065A、K2092A、K2065A-K2092A、K2065R、K2092R和K2065R-K2092R以17 fmol/mm²的密度与抗-C2抗体结合。在25℃以20μL/min的流速将不同浓度(0.2-200 nM)的LRP簇II通过缓冲液中的FVIII轻链变体K2065A、K2092A、K2065A-K2092A、K2065R、K2092R和K2065R-K2092R，该缓冲液包含150 mM NaCl、5 mM CaCl₂、0.005% (v/v) Tween 20和20 mM Hepes (pH 7.4)。在各浓度的LRP簇II后使用包含1M NaCl的相同缓冲液，使传感器芯片表面再生3次。在240秒的缔合期间记录与FVIII轻链变体K2065A、K2092A、K2065A-K2092A、K2065R、K2092R和K2065R-K2092R的结合，并校正非特异性结合。在单相指数缔合模型中拟合缔合期间的结合数据。绘制平衡时的响应作为LRP簇II浓度的函数。通过使用标准双曲线的非线性回归拟合平衡时的响应以获得K_D值(GraphPad Prism 4 软件, San Diego, CA, USA)。表5显示，与在位置K2065或K2092上携带C1结构域的1个赖氨酸置换的FVIII轻链变体相比，LRP簇II与在位置K2065和K2092上携带C1结构域的2个赖氨酸取代的FVIII轻链变体的结合更加受损。

表5. 由SPR测量的FVIII轻链C1变体对LRP簇II的亲和力

Figure 2011800549583100002DEST_PATH_IMAGE017

实施例8：FVIII的细胞摄取

多种细胞表达LRP和相关的内吞受体。这些细胞包括人成胶质细胞瘤细胞系U87 MG细胞，其表达高水平的LRP是本领域已知的(Cancer Res 2000; 60: 2300-2303)。这些细胞尤其用于研究LRP介导的LRP结合配体例如FVIII的细胞摄取。U87 MG细胞获自ATCC (HTB-14)。在37℃、5% CO₂下，在补充10%热灭活FCS的EMEM上，将细胞在24孔板中培养48小时。将细胞用包含10 mM HEPES (pH 7.4)、135 mM NaCl、10 mM KCl、5 mM CaCl₂、2 mM MgSO₄的缓冲液洗涤，并在37℃用40 nM FVIII-YFP、FVIII-YFP-K2092A、FVIII-YFP-F2093A和FVIII-YFP-K2092A-F2093A (如实施例6所述制备的变体)孵育15分钟。将细胞随后用相同的HEPES缓冲液和TBS (20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl)分别洗涤。使用用补充10%热灭活FCS的EMEM中和的胰蛋白酶收集细胞，用TBS洗涤并在TBS + 0.5% (w/v) BSA中重悬。通过流式细胞术分析确定FVIII的摄取。对于细胞结合研究，将细胞在4℃用10 mM HEPES (pH 7.4)、135 mM NaCl、10 mM KCl、5 mM CaCl₂、2 mM MgSO₄孵育15分钟。接着，将细胞在4℃用40 nM FVIII-YFP、FVIII-YFP-K2092A、FVIII-YFP-F2093A和FVIII-YFP-K2092A-F2093A孵育45分钟。将细胞随后用冰冷TBS洗涤，接着用包含0.5% (w/v) BSA的冰冷TBS洗涤。刮下细胞并将其在TBS + 0.5% (w/v) BSA中重悬。使用荧光激活细胞分选仪(Becton Dickinson LSR II流式细胞仪)测量FVIII结合和摄取。在分析期间通过消除具有不同于U87MG细胞的那些特性的前和侧离散值的事件，降低噪声。使用FacsDiva版本5.0.3 (Becton Dickinson)，收集流式细胞术数据，并将该数据下载到程序FlowJo用于分析。表6显示，在FVIII-YFP-K2092A、FVIII-YFP-F2093A和FVIII-YFP-K2092A-F2093A存在时，4℃(细胞结合)和37℃(细胞摄取)时U87 MG细胞的平均荧光强度。数据显示，与无突变的FVIII-YFP相比，通过LRP表达细胞的FVIII-YFP-K2092A、FVIII-YFP-F2093A和FVIII-YFP-K2092A-F2093A的细胞结合和摄取降低。

表6. 通过LRP表达细胞的FVIII-YFP及其变体的结合和摄取

实施例9. FVIII C1双和三突变体的维持的比活性

如实施例6所述，制备FVIII变体FVIII-R2090A、FVIII-K2092A-F2093A和FVIII-R2090A-K2092A-F2093A。在如实施例6所述的显色FVIII测定中测量FVIII活性。使用Bradford法(Anal Biochem 1976; 72: 248-254)测量蛋白浓度。纯化的蛋白的性质在表7中列出。通过将活性除以蛋白浓度或抗原计算比活性。具有K2092A-F2093A和R2090A-K2092A-F2093A突变的FVIII维持了活性。

表7. FVIII-K2092A-F2093A和FVIII-R2090A-K2092A-F2093A的活性

Figure 2011800549583100002DEST_PATH_IMAGE019

实施例10. FVIII C1双和三突变体的细胞摄取

在U87MG细胞中分析无YFP(黄色荧光蛋白)融合配偶体的FVIII-K2092A-F2093A和FVIII-R2090A-K2092A-F2093A突变体的内吞作用(参见实施例8)。将细胞在37℃用10 mM HEPES (pH 7.4)、135 mM NaCl、10 mM KCl、5 mM CaCl₂、2 mM MgSO₄孵育15分钟。接着，将细胞用不同量的野生型FVIII、FVIII-K2092A-F2093A或FVIII-R2090A-K2092A-F2093A孵育45分钟。将细胞随后用冰冷TBS (50 mM Tris-HCl pH 7.6, 150 mM NaCl)洗涤，刮下，在冰冷TBS中重悬，并用冰冷TBS洗涤1次。随后，将细胞用1%新鲜溶解的超纯无甲醇对甲醛(Polysciences, Eppelheim, Germany)固定，并在0.05%皂苷存在时，在包含0.5% HSA的TBS中，用FITC-缀合的单克隆抗-FVIII抗体CLB-CAg117孵育。通过使用LSRII (BD Bioscineces, Uppsala, Sweden)的流式细胞术，确定平均荧光强度。结果在表8中概述。FVIII以剂量依赖的方式被U87MG细胞内吞。FVIII-K2092A-F2093A的摄取严重受损。FVIII-R2090A-K2092A-F2093A摄取的评估揭示，当与FVIII-K2092A-F2093A的摄取相比时，该变体的摄取甚至降低的更多。这些结果显示，在LRP表达细胞中，R2090、K2092和F2093的置换导致具有降低的摄取的FVIII分子。

表8. FVIII-K2092A-F2093A和FVIII-R2090A-K2092A-F2093A在U87MG细胞中的摄取

¹) 不存在FVIII时获得的平均荧光强度为737。

实施例11：FVIII C1和C2双突变体的细胞摄取

在37℃、5% CO₂下，将胶原包被的24孔板(Blood 2002; 99:457-462)用补充10%热灭活FCS的DMEM-F12中的U87MG细胞接种。培养细胞至汇合，用包含10 mM HEPES (pH 7.4)、135 mM NaCl、10 mM KCl、5 mM CaCl₂、2 mM MgSO₄的缓冲液洗涤，并在37℃用40 nM FVIII-K2065A、FVIII-K2249A、FVIII-K2065A-K2249A、FVIII-K2092A、FVIII-R2215A或FVIII-K2092A-R2215A孵育30分钟(参见实施例1和2)。通过在补充0.5% BSA的TBS (20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl)中刮下来收集细胞。重悬细胞并在0.4%超纯无甲醇对甲醛(Polysciences, Eppelheim, Germany)中室温固定15分钟。将固定的细胞用在TBS、1% BSA、0.3%皂苷中500倍稀释的小鼠抗-cMyc抗体9E10 (Sigma, M4439)室温孵育60分钟。将细胞用TBS、0.5% BSA洗涤，并随后用在TBS、1% BSA、0.3%皂苷中200倍稀释的二抗Alexa Flour 488山羊抗-小鼠抗体(Invitrogen, A-11001)室温孵育45分钟。洗涤细胞，在TBS、0.5% BSA中重悬细胞，并如实施例8所述，使用荧光激活细胞分选仪(Becton Dickinson LSR II流式细胞仪)分析细胞。表9显示细胞的平均荧光强度。与WT FVIII相比，单取代显示降低的摄取。然而对于携带C1和C2结构域两者中的取代的变体，在细胞摄取中观察到最强的缺陷。

表9. C1结构域和/或C2结构域具有取代的FVIII变体(40 nM)的细胞摄取

Figure 2011800549583100002DEST_PATH_IMAGE021

实施例12. 通过树突细胞的FVIII的细胞摄取

树突细胞介导FVIII的摄取，然后将其呈递至免疫系统并潜在引起免疫反应(Blood 2007; 109: 610-612, J Thromb Haemost 2009; 7: 1816-1823)。树突细胞表达LRP以及其他内吞受体。使用人单核细胞来源的树突细胞、人单核细胞来源的巨噬细胞和鼠骨髓来源的树突细胞，进一步研究了FVIII变体的细胞摄取。如之前所述(Vaccine 2007; 25: 7145-52)，使用CD14微珠、磁细胞分离器和Elutra^TM细胞分离系统，从来自血浆分离置换法样品的外周血单核细胞中分离单核细胞。单核细胞在补充100 U/ml盘尼西林、100 μg/ml链霉素、1000 U/ml人重组GM-CSF和800 U/ml人重组IL-4的CellGro DC培养基中分化为树突细胞。细胞培养4-6天后，通过确定细胞表面标志物CD14、CD80、CD83和CD86来评价细胞的未成熟表型。为了通过流式细胞术监测FVIII变体的摄取，将大约2x10⁵的未成熟DC首先用无血清培养基洗涤1次，并在120 μl的无血清Cell-Gro DC培养基中用FVIII 37℃孵育30分钟。FVIII摄取后，将细胞用冰冷TBS洗涤，用1%新鲜制备的对甲醛固定，并在存在或不存在0.05%皂苷下，在包含0.5%人血清白蛋白的TBS中用FITC缀合的单克隆抗-FVIII抗体CLB-CAg117孵育。通过使用LSRII (BD Biosciences, Uppsala, Sweden)的流式细胞术，确定阳性细胞的平均荧光强度和百分比。表10描述使用纯的野生型FVIII、FVIII-K2092A-F2093A和FVIII-R2090A-K2092A-F2093A的摄取实验结果。结果显示，通过人树突细胞的野生型FVIII的摄取为剂量依赖的。变体FVIII-K2092A-F2093A显示通过树突细胞的摄取强烈降低，而FVIII-R2090A-K2092A-F2093A揭示其通过树突细胞的摄取甚至更显著的减少。这些结果显示，R2090、K2092和F2093的置换强烈降低通过树突细胞的FVIII摄取。

表10. wt FVIII、FVIII-K2092A-F2093A和FVIII-R2090A-K2092A-F2093A在人单核细胞来源的树突细胞中的摄取

¹) 不存在FVIII时获得的平均荧光强度为1635。

实施例13. FVIII在巨噬细胞中的细胞摄取

巨噬细胞亦能够在肝和脾中摄取FVIII以及呈递FVIII至免疫系统(Blood 2008; 112: 1704-1712, J Thromb Haemost 2009; 7: 1816-1823)，因此进一步使用人单核细胞来源的巨噬细胞评价FVIII变体的摄取。如实施例10所述分离单核细胞，并通过在补充10% FCS、100 U/ml盘尼西林、100 μg/ml链霉素和50 ng/ml重组人M-CSF 的RPMI 1640培养基中孵育5天将单核细胞分化为巨噬细胞。为了通过流式细胞术监测FVIII变体的摄取，将大约2x10⁵的巨噬细胞首先用无血清培养基洗涤1次，并在120 μl的无血清Cell-Gro DC培养基中用15 nM FVIII 37℃孵育30分钟。FVIII摄取后，将细胞用冰冷TBS洗涤，用1%新鲜制备的对甲醛固定，并在存在或不存在0.05%皂苷下，在包含0.5%人血清白蛋白的TBS中用FITC缀合的单克隆抗-FVIII抗体CLB-CAg117孵育。通过使用LSRII (BD Biosciences, Uppsala, Sweden)的流式细胞术，确定阳性细胞的平均荧光强度和百分比。表11描述使用野生型FVIII、FVIII-R2090A、FVIII-K2092A-F2093A和FVIII-R2090A-K2092A-F2093A的摄取实验结果。这些结果揭示，FVIII-R2090A的摄取稍降低，而对FVIII-K2092A-F2093A观察到摄取的强烈下降。对FVIII-R2090A-K2092A-F2093A观察到摄取的甚至更显著的降低。这些结果显示R2090、K2092和F2093的置换降低亦通过巨噬细胞的FVIII摄取。

表11. wt FVIII、FVIII-K2092A-F2093A和FVIII-R2090A-K2092A-F2093A (15 nM)在人单核细胞来源的巨噬细胞中的摄取

Figure 2011800549583100002DEST_PATH_IMAGE023

¹) 值是至少3组实验的平均值和SD。

实施例14. 通过鼠骨髓来源的树突细胞的FVIII的细胞摄取

随后使用鼠骨髓来源的树突细胞进行FVIII变体的摄取。通过用补充2% FCS的PBS冲洗来自血友病E17 KO小鼠的股骨来分离骨髓细胞。将骨髓悬液在Tris-NH₄Cl中室温孵育2分钟以裂解红细胞。最后，将细胞以1x10⁶细胞/ml重悬(包含20 ng/ml小鼠重组GM-CSF)，并在补充2.5 mM HEPES、55 mM 2-巯基乙醇、100 U/ml盘尼西林、100 μg/ml链霉素、5 mM谷氨酰胺和10% FCS的RPMI 1640培养基中培养7-9天。在第7-9天测量CD11c、CD11b、CD80、CD86和Gr-1的表达。如上文对于人单核细胞来源的树突细胞和巨噬细胞所述，研究FVIII的摄取。FVIII摄取实验的结果在表12中呈现。结果显示，与野生型FVIII相比，FVIII-R2090A以稍降低的水平被内吞，而FVIII-K2092A-F2093A的内吞是更加严重受损的。当与FVIII-K2092A-F2093A相比时，VIII-R2090A-K2092A-F2093A的内吞是更加严重受损的。这些结果显示，R2090、K2092和F2093的取代降低亦通过鼠骨髓来源的树突细胞的FVIII摄取。

表12. wt FVIII、FVIII-R2090A、FVIII-K2092A-F2093A和FVIII-R2090A-K2092A-F2093A (15 nM)在鼠骨髓来源的树突细胞中的摄取

¹) 值是至少3组实验的平均值和SD。

总之，在实施例8和10-14中报道的结果教导如何确定FVIII中有助于相互作用表面的残基，FVIII通过多种LRP表达细胞(包括人树突细胞和巨噬细胞以及鼠树突细胞)介导其内吞。

实施例15：抗FVIII C1和C2抗体阻断FVIII细胞摄取

作为确定有助于FVIII细胞摄取的残基的备选方法，使用U87MG细胞(参见实施例8)、原代大鼠肝细胞和人单核细胞来源的巨噬细胞，在FVIII细胞结合研究中施用一组具有FVIII所有结构域内的表位的抗体。抗体ESH-2、ESH-4、ESH-5和ESH-8 (Thromb Haemost 1986; 55: 40-46)从American Diagnostica市售获得。KM33描述于J Biol Chem 2003; 278: 9370-9377和WO 03/093313。CLB-CAg117描述于Blood 1998; 91: 2347-2352。使用用于制备单克隆抗体的标准技术，在用FVIII免疫小鼠后，自制剩余的抗体。使用自制或者购买自Biopredic International (Rennes, France)的新鲜分离的原代大鼠肝细胞。简言之，开始用Hepes缓冲液(25 mM hepes, 0.38 mM Na2HPO4,0.35 mM KH2PO4, 5.36 mM KCl, 0.11 M NaCl, 22 mM 葡萄糖, pH7.4)灌注后，将麻醉的Spraque Dawley大鼠打开，系住腔静脉并夹住的同时将门静脉插管。将组织用hepes缓冲液中的120 mg胶原酶(Sigma C-5138)消化，并随后用hepes缓冲液中的5 mM CaCl2冲洗。剥去肝周围的囊组织以释放细胞到洗涤缓冲液(具有L-谷氨酰胺和补充1 % BSA、0.1 mM氢化可的松半琥珀酸酯(Sigma)和1 nM胰岛素(Sigma)的15 mM hepes (Gibco)的D-MEM/F12)中。将细胞以50 x g离心，并丢弃上清液。将细胞沉淀在补充2 mM L-谷氨酰胺、100 UI/mL胰岛素、100 μg/mL链霉素和5 μM 氢化可的松半琥珀酸酯的William’s E培养基(Biopredic International, Rennes, France)中重悬。将肝细胞以2.5 ×10⁵细胞/孔的密度在24孔组织培养板中接种总计48小时。根据制造商的说明书，使用磁性抗-CD14珠(Miltenyi)和MACS柱 (Miltenyi)，通过磁分离来分离单核细胞。将单核细胞(0.5 ×10⁶细胞/ml)在T-75组织培养瓶中接种，并加入3.3 ng/ml M-CSF (R&D Systems)。细胞培养3天后加入另外的3.3 ng/ml M-CSF。6天后用PBS洗涤巨噬细胞，并用具有5% FCS的PBS中的2.5 mM EDTA在4℃孵育10-20分钟。将细胞以3.5 ×10⁵细胞/孔的密度在48孔组织培养板中接种并孵育过夜。将U87细胞和巨噬细胞用缓冲液A (100 mM HEPES, 150 mM NaCl, 4 KCl, 11 mM 葡萄糖, pH 7.4)小心洗涤，并用缓冲液B (补充5 mM CaCl₂和1 mg/ml BSA的缓冲液A)孵育15分钟。将抗FVIII抗体(终浓度10 μg/ml)加入¹²⁵I-FVIII (终浓度1 nM)中并孵育10分钟，然后加入细胞并在4℃孵育过夜。将细胞随后用冰冷缓冲液B洗涤2次并用200 mM NaOH, 1% SDS, 10 mM EDTA裂解。对于原代大鼠肝细胞使用类似的方案，除了使用培养基代替缓冲液外。在γ-计数器(Cobra)中计数裂解物中的¹²⁵I。将不存在抗FVIII抗体时结合的¹²⁵I设为100%。表13显示抗FVIII抗体对¹²⁵I-FVIII与U87MG细胞、巨噬细胞和肝细胞结合的作用。数据显示，仅抗C1抗体KM33和4F30以及一些抗C2抗体(即ESH-4、4F161和CLB-CAg117)抑制FVIII与细胞的结合。显著地，抗体组对所有3种分析的细胞类型具有类似的作用，表明FVIII上相同的表位涉及细胞摄取，而不管细胞类型。

表13. 通过抗C1和抗C2抗体抑制FVIII细胞结合

¹) 通过蛋白质印迹确定自制抗体表位的结构域定位。对于KM33，表位已部分被描述(Blood 2009; 114: 3938-3946, J Thromb Haemost 2007; 5 增刊2: 摘要P-M-040)。关于ESH抗体的潜在表位的数据描述于来自American Diagnostica的数据表和J Biol Chem 1997; 272: 18007-18014, Thromb Haemost 2003; 89: 795-802, J Mol Recognit 2009; 22: 301-306, Blood 1995; 86: 1811-1819, Biochemistry 2005; 44: 13858-13865 (参见发明的说明书)。

²) U87 MG细胞和巨噬细胞的数据是n=3或更多的平均值和标准偏差，而对于肝细胞n=1-3，n/a =未分析。

实施例163：抗FVIII C1和C2抗体延长FVIII的体内半寿期

使用来自表面等离振子共振实验的K_d值，并假设测试物质在体内稀释20倍，将如(Haemophilia 2010, 16; 349-359)所述制备的FVIII与抗C1和/或抗C2抗体的scFv或fab片段以保证FVIII体内≥98%最初饱和度的量混合。该20倍的稀释是基于当单独给予、小鼠的估计重量为28.6 g和测试物质的体积为0.1 ml时对FVIII获得的70 ml/kg的分布体积。将FVIII单独(280 IU/kg)或与抗体的混合物静脉内给予VWF-缺乏的小鼠(n=6/组)。t=0.08、1、2、3、4和5小时，从眼眶丛取血。从各小鼠取3个样品，并在各时间点上收集3个样品。将血液用柠檬酸钠立即稳定化并将其在4倍体积缓冲液(50 mM Tris, 150 mM NaCl, 1 % BSA, pH 7.3, 具有防腐剂)中稀释，然后以4000 × g离心5分钟。将血浆在干冰上冷冻并在-80℃保存，然后分析FVIII抗原。使用非区室化方法(Phoenix WinNonlin Pro 6.1)，将平均值用于估算药代动力学参数。所得到的PK值在表14中示出。虽然FVIII单独在VWF-缺乏的小鼠中具有相对快的清除，但是阻断C1或C2导致减少的清除、延长的半寿期(T?)和平均滞留时间。与加入仅1个抗体相比，同时阻断C1中的表位和C2中的表位导致进一步减少的清除以及延长的T?和平均滞留时间。这显示抗体KM33和4F161遮蔽涉及细胞摄取的FVIII的表位，并藉此延长FVIII的半寿期。

表14. 在VWF-缺乏的小鼠中用抗C1和/或抗C2抗体片段共给予的FVIII的药代动力学

实施例17：阻断细胞摄取和延长体内清除的FVIII C1和C2抗体的表位

通过氢交换质谱(HX-MS)来作图实施例13中所述的阻断细胞摄取的抗体表位。HX-MS技术利用蛋白的氢交换(HX)，可容易被质谱(MS)跟踪。通过用包含氘的水性溶剂替换包含氢的水性溶剂，在蛋白的给定位点上掺入氘原子将引起1 Da质量的增加。在交换反应的猝灭样品中通过质谱可监测作为时间的函数的该质量增加。所得到的肽的质量增加后，可通过在猝灭条件下进行胃蛋白酶消化将氘标记信息亚定位到蛋白的区中。HX-MS的一个用途是通过在蛋白-蛋白复合物形成时鉴定氢交换降低的区来探测涉及分子相互作用的位点。通常，因为溶剂的空间排斥，所以结合界面将由氢交换中的显著降低来揭示。可通过在存在和不存在各自的结合配偶体时简单地通过测量作为时间的函数的掺入到任一蛋白成员中的氘总量的HX-MS来检测蛋白-蛋白复合物形成。HX-MS技术使用天然组分(即蛋白和抗体或Fab片段)并在溶液中进行。因此HX-MS提供模拟体内条件的可能性(Mass Spectrom. Rev. 25, 158 (2006)。在分析之前将FVIII (Haemophilia 2010, 16; 349-359)以及抗体KM33和4F30 (参见实施例14)缓冲液交换为20 mM咪唑, 10 mM CaCl₂, 150 mM NaCl, pH 7.3。通过LeapShell软件(Leap Technologies Inc.)操作的Leap机器人(H/D-x PAL; Leap Technologies Inc.)自动操作HX实验，其进行氘交换反应的开始、反应时间控制、猝灭反应、在UPLC系统上注射和消化时间控制。Leap机器人配置两个温度控制堆，其分别维持在20℃用于缓冲液储存和HX反应以及维持在2℃用于蛋白储存和猝灭反应。Leap机器人另外包括保持胃蛋白酶柱、预柱和分析柱的冷却的Trio VS单元(Leap Technologies Inc.)、LC管和1℃的转换阀。已将转换阀从HPLC升级为Microbore UHPLC转换阀(Cheminert, VICI AG)。对于联机胃蛋白酶消化，装载100 μL包含0.15 pmol FVIII的猝灭样品，并使用200 μL/min的等度流速(0.1%甲酸:CH3OH 95:5)，通过Poroszyme?固定化胃蛋白酶柱(2.1 × 30 mm, Applied Biosystems)。俘获得到的肽并将其在VanGuard预柱BEH C18 1.7 μm (2.1 × 5 mm, Waters Inc.)上脱盐。随后，转换阀以放置与分析柱、UPLC-BEH C18 1.7 μm (2.1 × 100 mm, Waters Inc.)联机的预柱，并使用从AQUITY UPLC系统(Waters Inc.)以150 μL/min递送的9分钟梯度的15?40% B来分离肽。流动相由以下组成：A: 0.1%甲酸和B: CH₃CN中的0.1%甲酸。使用Q-Tof Premier MS (Waters Inc.)，以阳离子模式获得ESI MS数据和提升能(MS^E)实验。将亮氨酸-脑啡肽用作锁定质量([M+H]⁺离子，m/z 556.2771)，并以连续模式收集数据。使用MS^E法(Waters Inc.)，在单独的实验中鉴定胃蛋白酶解肽。使用Biopharma-Lynx 1.2 (版本017)处理MS^E数据。使HX-MS原始数据文件经受连续锁定质量校正。使用HX-Express (版本β; J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2006; 17: 1700)进行数据分析(即氘化肽的质心确定和绘制交换曲线)。

通过在不存在或存在相应的氘化缓冲液(即在D₂O中制备的20 mM咪唑、10 mM CaCl₂、150 mM NaCl，终98% D₂O，pH 7.3 (未校正的值))中的4F30或KM33时制备浓度为30 μM的FVIII溶液来开始酰胺氢/氘交换(HX)。所有HX反应在20℃进行，并在不存在或存在过量FVIII mAb (4.5 uM)时包含3 μM FVIII以保证FVIII与抗体的饱和。在范围为10秒-2小时46分40秒(10.000秒)的合适时间间隔上，通过等体积的冰冷猝灭缓冲液1.35 TCEP (三(2-羧乙基)-膦盐酸盐(Calbiochem?, EMD Chemicals inc.))来猝灭HX反应的等分试样，导致终pH为2.6 (未校正的值)。

FVIII的胃蛋白酶消化的肽图包括653肽(＞20 离子得分)，其涵盖82%的N8序列。

在存在和不存在KM33时，在4个时间点(即10 s、100 s、1,000 s和10,000 s)上监测653肽(涵盖82%的FVIII原始序列)的氘掺入率(HX时间-过程) (图3A、4、5)。

在存在或不存在KM33时观察的交换模式可分为两组：一组肽显示不受4F30和KM33结合影响的交换模式(图4 [氨基酸2062-2073和2163-2168]])，其包含99.2%的肽。与之相反，另一组FVIII胃蛋白酶解肽在用4F30和KM33时显示保护免受交换(图4)，其包含0.8%的胃蛋白酶解肽。例如，在100s用D₂O交换，在4F30和KM33结合时，在氨基酸2148-2161的区中大约1个酰胺被保护免受交换(图4)。在KM33结合时显示保护的区包括涵盖残基氨基酸2075-2095、2077-2095、2078-2095和2148-2161的4个胃蛋白酶解肽。因此，发现4F30和KM33的表位在线性序列氨基酸2075-2095和2148-2161内(使用成熟编号)。4F30和KM33对FVIII的表位作图揭示两个配体具有相同的表位。虽然之前已描述K2092-S2094涉及KM33的表位(参见表13中的参考文献)，但是残留部分的表位未鉴定。

实施例18. FVIII-R2159N中导入聚糖阻断与抗-C1结构域抗体(KM33)的结合，其延长FVIII细胞摄取和体内半寿期。

在C1结构域区2157-SIRST-2161通过天冬酰胺置换R2159在涉及KM33表位的位置2159上(参见实施例17)导入N-连接糖基化的共有序列(即N-X-S/T，参见第22页)。使用wt FVIII的DNA作为模板，使用QuickChange诱变来构建FVIII-R2159N (Blood 2009; 133:3102-3109)。如(Plos One 2011; 6(8):e24163. doi:10.1371/journal. pone.0024163)所述表达FVIII-R2159N和wt FVIII。通过SDS-PAGE确认FVIII轻链中另外的N-连接聚糖的导入，其中观察到FVIII轻链的迁移率降低。如实施例3所述在显色FVIII测定中测量FVIII活性。使用CLB-EL14 IgG4 (Br J Haematol 2008; 142:644-652)作为俘获抗体、过氧化物酶标记的CLB-CAg69 (Biochem J 1989; 263: 187–94)作为检测抗体和来自40个供体的人合并血浆作为标准品，在ELISA中测量FVIII抗原。使用BIAcore 3000生物传感器(Biacore AB, Uppsala, Sweden)，通过SPR分析来评估抗体KM33 (参见实施例15)与wt FVIII和FVIII-R2159N的缔合。根据制造商的说明书，使用胺偶联法，将抗-C2抗体CLB-EL14 IgG4固定在CM5传感器芯片上至密度为33 fmol/mm²。随后，将FVIII-R2159N或wt FVIII与EL14 IgG4结合至密度为3 fmol/mm²。在25℃以20μL/min的流速将KM33 (100 nM)通过缓冲液中的FVIII-R2159N或wt FVIII，该缓冲液包含150 mM NaCl、5 mM CaCl₂、0.005% (v/v) Tween 20和20 mM Hepes (pH 7.4)。在240秒的缔合期间记录结合响应并校正非特异性结合。表15显示缔合235秒后的结合响应以及wt FVIII和FVIII-R2159N的活性和抗原浓度。结果显示，导入的聚糖完全废除FVIII与KM33的结合，而通过导入聚糖FVIII的活性未受损。因为KM33与FVIII结合降低细胞摄取并延长体内半寿期，所以显示废除的KM33结合的FVIII-R2159N将可能也显示降低的细胞摄取和延长的体内半寿期。

表15. wt FVIII和FVIII-R2159N的活性和KM33结合

Figure 2011800549583100002DEST_PATH_IMAGE027

实施例19：FVIII K2062A-F2093A的肝清除延长

在灌注的肝模型中评价FVIII-K2092A-F2093F的肝清除(Thromb Haemost 2010; 104, 243-251)。简言之，将麻醉的Spraque Dawley大鼠的肝通过门静脉和腔静脉插管，并用Krebs-Henseleit碳酸氢盐缓冲液(115 mM NaCl, 25 mM NaHCO₃, 5.9 mM KCl, 1.2 mM MgSO₄, 1.2 mM, KH₂PO4, 2.5 mM CaCl₂)以25 ml/min灌注。进入肝之前，将灌注液流经用氧气:二氧化碳混合物(95:5)饱和的纤维透析器(Gambro? Scandidact Hemophan? Fiber Dialyzer 100HG, Secon, Dransfeld, Germany)。将FVIII (Haemo-philia 2010, 16; 349-359)或FVIII-K2092A-F2093A加入缓冲液中并混合，然后在0-80分钟的时间点上从再循环灌注液中取得样品。通过如实施例3中所述的显色测定分析灌注液的FVIII:C。与野生型FVIII的T?相比，FVIII-K2092A-F2093A的T?延长(表16)，表明与无C1取代的FVIII相比，FVIII-K2092A-F2093A的肝清除减少。

表16. FVIII和FVIII-K2092A-F2093A在灌注的大鼠肝中的清除

¹) 数据是n=3组实验的平均值和标准偏差

实施例20. FVIII-K2092A-F2093A的体内半寿期延长

在VWF-缺乏的小鼠中进一步评价K2093A-F2093A突变体的体内药代动力学。野生型FVIII (Haemophilia 2010, 16; 349-359)和FVIII-K2092A-F2093A是在如WO09108806所述的B-结构域中的O-连接聚糖上具体40K-PEG化的。如实施例16所述，将wt FVIII、K2092-F2093A以及PEG化FVIII (40K-PEG-FVIII)和突变体(40K-PEG-K2092A-F2093A)以280 IU/kg的剂量给予VWF-缺乏的小鼠(n= 3-6/组)。在3个时间点上(即对于FVIII和K2092-F2093A，在给药后t = 0.5、1.25和2小时，对于PEG化蛋白，给药后4、7和24小时)从各小鼠取血液样品，并如实施例3所述分析FVIII:C。对于PEG化以及未PEG化的FVIII蛋白，C1突变K2092A-F20963A导致T?近似加倍(表17)，因此确认FVIII中K2092-F2093的取代导致体内半寿期延长。

表17. K2092-F2093A突变对体内半寿期的影响

Figure 2011800549583100002DEST_PATH_IMAGE029

实施例18：FVIII-R2090A-K2092A-F2093A的T细胞反应降低

FVIII与抗原呈递细胞的相互作用在FVIII特异性CD4+ T细胞的形成中提供关键的步骤是公知的，FVIII特异性CD4+ T细胞随后刺激产生针对FVIII的抗体。如下分析用野生型FVIII (wt FVIII)和FVIII-R2090A-K2092A-F2093A注射的小鼠的脾细胞的CD4⁺ T细胞反应：将组内每周注射FVIII后收集的脾合并。移除红细胞，并通过使用用抗-小鼠CD8抗体Lyt 1.2 (eBioscience)包被的珠的磁珠分离来耗尽CD8+细胞。在增加的FVIII浓度(0, 0.1, 0.5或1 μg/ml)存在时产生抗原特异性T细胞增殖或在伴刀豆球蛋白A (1 μg/ml)存在时产生非特异性增殖，在圆底96孔板中在补充100 U/ml盘尼西林、100 mg/ml链霉素(全部来自BioWhittaker; Walkersville, Maryland)和55 μM β-巯基乙醇(Sigma-Aldrich, Irvine, UK)的X-VIVO 15培养基中培养残留的CD8^–细胞72或96小时。通过最后18-20小时加入1 μCi/孔的[³H]胸苷 (ICN Pharmaceuticals, Irvine, CA)来测定增殖。表18示出的结果以每分钟的计数(CPM)值(平均值± SD)或作为刺激指数(SI：用抗原孵育的细胞的CPM除以用培养基单独孵育的细胞的CPM)表示。当与wt FVIII比较时，在体外用FVIII再刺激时用FVIII-R2090-K2092A-F2093A注射小鼠导致脾CD4⁺ T细胞的增殖显著降低，表明抗原呈递细胞中FVIII-R2090A-K2092A-F2093A的降低的摄取转变为小鼠中CD4+ T细胞反应的降低。

表18：来源于用5次静脉内注射的FVIII WT和FVIII-R2090A-K2092A-F2093A处理的来源于小鼠的脾细胞的CD4+ T细胞反应

实施例22：在接受FVIII-R2090A-K2092A-F2093A的小鼠中抗体水平降低

在A型血友病的抑制剂形成的鼠模型中另外评估通过抗原呈递细胞对FVIII变体的摄取降低对这些变体的免疫原性的影响。将野生型FVIII和FVIII-R2090A-K2092A-F2093A在无菌PBS中稀释至10 μg/ml，并将100 μl (1 μg)的剂量每周5次静脉内(i.v.)给予雄性FVIII外显子17 KO小鼠(n=8)。最后注射后1周，杀死动物并收集血液样品。通过测量小鼠血浆抑制FVIII活性的能力的酶联免疫吸附测定(ELISA)和Bethesda测定来确定来自处理的FVIII-KO小鼠的血浆样品中抗-FVIII抗体的存在情况。对于ELISA，将包含50 mM NaHCO₃ pH 9.8的缓冲液中的血浆来源的FVIII (5 μg/ml)固定在微量滴定孔中。将板用PBS中的2%明胶封闭。在50 mM Tris, 150 mM NaCl, 2% BSA, pH 7.4中制备小鼠血浆稀释液。将小鼠单克隆抗-FVIII抗体CLB-CAg9用作标准品。将抗-FVIII抗体用山羊抗-小鼠IgG-HRP检测。鼠血浆中的抗-FVIII抗体的浓度以任意单位(AU)显示，其中1 AU对应于由1 μg的CLB-CAg9获得的信号。基本上如(Thromb Diath Haemorrh 1975; 34: 612)所述进行Bethesda测定。使用非参数的Mann-Whitney U-检验来分析数据。每周5次注射FVIII和FVIII-R2090A-K2092A-F2093A后在小鼠血浆中观察到的抗体效价显示在表19中。结果显示，输注FVIII导致针对FVIII的抗体形成。在用FVIII-R2090A-K2092A-F2093A处理的小鼠中观察到抗体效价的显著降低(p<0.05)。同样反映中和抗FVIII抗体存在情况的Bethesda效价是显著降低的(p< 0.05)。这些发现显示，抗原呈递细胞中FVIII-R2090A-K2092A-F2093A的降低的摄取和降低的T细胞反应在A型血友病的抑制剂发生的鼠模型中转变为抑制剂效价的降低。总之，这些结果显示，通过抗原呈递细胞导致其内吞降低的FVIII的具体修饰是降低FVIII体内免疫原性的有效方法。我们的结果因此表明，显示降低的细胞摄取的FVIII变体在患A型血友病的患者中携带降低的抑制剂发生风险。

表19：用5次静脉内注射的FVIII和FVIII-R2090A-K2092A-F2093A处理的小鼠的血浆中的抗体效价

Figure 2011800549583100002DEST_PATH_IMAGE031

¹) 结果是来自8只动物的数据的平均值± SEM。