PT96208B

PT96208B - Processo de obtencao de uma sequencia de adn codificando um derivado recombinante do factor viii humano, de um vector e de celula recombinante e de preparacao do referido derivado.

Info

Publication number: PT96208B
Application number: PT96208A
Authority: PT
Inventors: Anneli B Almstedt; Eva Maria Hellstroem; Kerstin Larsson; Peter Lind; Helena Inga Sandberg; Jack Spira; Mona Sydow-Backman
Original assignee: Pharmacia & Upjohn Ab
Priority date: 1989-12-15
Filing date: 1990-12-14
Publication date: 1998-05-29
Also published as: ES2119769T5; EP1293513A3; DK0506757T3; AU7039391A; WO1991009122A1; FI104260B; CA2071875C; NZ236276A; FI922745A0; JP2644084B2; NO922325D0; HU211504A9; EP0506757A1; DE69032600T3; NO309041B1; AU645539B2; DE19975066I2; LU90457I2; ES2189897T3; DE69032600D1

Description

MEMÕRIA DESCRITIVA

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presente invento refere-se a uma sequência de ADN codificando um derivado recombinante do factor VIII humano biologicamente activo, a um vector de expressão recombinante contendo tal sequência de ADN, a células hospedeiras transformadas com o dito vector de expressão recombinante e a um processo para a produção do derivado recombinante do factor VIII humano. 0 invento abrange também o derivado do factor VIII humano compreendendo dois polipéptidos ligados por uma ponte de ião metálico.

Antecedentes do invento

A hemofilia clássica, ou hemofilia A, é a alteração da coagulação hereditária mais frequente. É resultado de uma deficiência do factor da coagulação sanguínea VIII, ligada ao cromossoma X. Afecta quase exclusivamente os machos, e a incidência é de um ou dois indivíduos por 10 000 homens. 0 defeito no cromossoma X é transmitido por fêmeas portadoras que não são hemofílicas» Dependendo do tipo de mutação no cromossoma X, o factor VIII está ausente ou disfuncionante, o que leva a uma coagulação sanguínea retardada. A manifestação clínica da hemofilia A, é uma tendência anormal para a hemorragia e, antes da introdução do tratamento com concentrados de factor VIII, o tempo médio de vida de uma pessoa com hemofilia A grave, era inferior a 20 anos. A utilização de concentrados de factor VIII de plasma, melhorou consideravelmente a situação dos doentes com hemofilia. 0 tempo de vida médio aumentou extensivamente, e a maior parte tem a possibilidade de viver mais ou menos normalmente. No entanto, tem havido certos problemas com os concentrados e com a sua utilização. Os mais graves têm sido a transmissão de vírus. Até agora, os vírus causadores da SIDA, hepatite B, e hepatite não A não B, atingiram gravemente a população hemofílica. Introduziram-se, recentemente, diferentes processos de inactivação dos vírus no processo de produção de muitos concentrados comerciais. Há, também, novos concentrados de factor VIII altamente purificado a aparecer no mercado, que se espera sejam muito mais seguros em comparação com os concentrados mais antigos, no que respeita ao risco de transmissão de vírus. Não se

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-3pode, contudo, garantir a ausência de virus. Além disso, os concentrados são bastante dispendiosos porque o material de plasma em bruto é dispendioso devido ao fornecimento limitado,

É provável que um recombinante do factor VIII resolva uma larga gama dos problemas associados ao uso de concentrados de factor VIII derivados do plasma. Tendo em vista a necessidade de um factor VIII recombinante para o tratamento da hemofília A, presentemente estão a trabalhar no desenvolvimento de tal produto, um par de grupos. 0 desenvolvimento de um factor VIII recombinante tem, contudo, encontrado algumas dificuldades. Um dos maiores problemas é a produção do factor VIII recombinante com rendimentos suficientemente elevados. A maior parte do trabalho de desenvolvimento feito tem sido realizado usando um gene de ADNc que codifica a molécula de factor VIII recombinante de comprimento completo.

Este invento descreve um ADNc do factor VIII deleccionado que codifica um derivado de factor VIII recombinante, correspondendo, no que se refere a peso molecular e a outras características bioquímicas, a uma forma de factor VIII plasmática previamente descrita, presente em quantidades consideráveis nos concentrados comerciais (Anderson, L-0 et al (1986), Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83, 2979-2983), 0 nível de expressão obtido na expressão desta molécula numa cultura de células animais, mostrou ser consideravelmente superior ao obtido quando se usa o ADNc de factor VIII de comprimento completo, para expressar o factor VIII, É provável que o novo ADNc de factor VIII deleccionado produza rendimentos de factor VIII recombinante suficientemente elevados para ser usado num processo individual para a preparação farmacêutica de factor VIII recombinante.

Definições utilizadas

Nas secções seguintes, a nomenclatura dos diferentes domínios estruturais do factor VIII de comprimento completo e cadeia simples com 2332 aminoácidos é semelhante à definida por Vehar, GA, e colab. (1984), Nature 312, 337-342. Assim, os domínios Al e A2 estão contidos na cadeia pesada do factor VIII,

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com desde aproximadamente 200 kDa (aminoácidos 1 a 1648) a aproximadamente 90 kDa (aminoácidos 1 a 740). Os domínios A3, Cl e C2 estão contidos na cadeia leve do factor VIII, com aproximadamente 80 kDa (aminoácidos 1649 até 2332). 0 domínio B constitui a região média, altamente glicosada, do factor VIII de cadeia simples, de comprimento completo ou a parte do terminal C, da forma da cadeia pesada do factor VIII com 200 kDa (aminoácidos

741 até 1648). 0 termo derivado do factor VIII por delecção é definido como uma ou mais cadeias polipeptídicas possuindo .do actividade' factor VIII=C derivadas do polipéptido de factor VIII de comprimento completo por delecção de um ou mais aminoácidos. 0 termo factor VIII:QD é definido como uma cadeia polipeptídica derivada do factor VIII de comprimento completo sem os aminoácidos 745 até 1562. 0 termo factor VIII:RE é definido como uma cadeia polipeptídica derivada do factor VIII de comprimento completo sem os aminoácidos 741 até 1648. □ termo factor

VIII:SQ é definido como uma cadeia polipeptídica derivada do factor VIII de comprimento completo sem os aminoácidos 743 até 1636.

Arte Anterior factor VIII, no plasma fresco preparado na presença de inibidores das proteases, tem-se apresentado como tendo um peso molecular de 280 kDa e de ser composto de duas cadeias peptídicas com pesos moleculares de 200 kDa e 80 kDa, respectivamente (Andersson, L-0 e col. (1986) Proc. Natl., Acad. Sei. USA 83, 2979-2983). Estas cadeias são mantidas juntas por partes de iões metálicos. Encontraram-se formas da molécula do factor VIII mais ou menos degradadas proteoliticamente, como fragmentos activos em material de factor VIII purificado a partir de concentrados comerciais (Andersson, L-0 e col. 1986; Andersson, e col. (1985) EP 0197901). As formas fragmentadas do factor VIII, possuindo pesos moleculares de 260 kDa até 170 kDa, consistiam numa cadeia pesada com um peso molecular variando de 180 kDa até 90 kDa (possuindo todas as variantes o N-terminal idêntico) em combinação com a cadeia leve de 80 kDa. A região N-terminal das cadeias pesadas é idêntica à da cadeia linear do factor VIII

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-5obtida a partir dos dados da sequência nucleótida do ÃDNc do factor VIII (Wood, W.I., e col, (1984) Nature 312, 330-336, Vehar, G.A., e col. (1984) Nature 312, 337-342).

ft forma activa mais pequena, com peso molecular de 170 kDa, contendo uma cadeia de 90 kDa e uma cadeia de 80 kDa, poderia ser activada com trombina da mesma maneira que as formas moleculares mais elevadas, Ela, representa assim, uma forma inactivada. Tem mostrado, também, ter uma actividade biológica completa in vivo, como testado em cães hemofílicos (Brinkhous, K.M. e col. (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82, 8752-8756). Assim, a eficácia hemostática era a mesma que para as formas de elevado peso molecular do factor VIII. Além disso, havia a indicação de que a forma de 170 kDa tinha um tempo de sobrevivência in vivo 50¾ mais longo, em comparação com as formas de peso molecular mais elevado.

facto de que a parte, central,fortemente glicosada, da cadeia polipeptidica do factor VIII que está entre os aminoácidos Arg-739 e Glu—1649 não ser, aparentemente, necessária para a actividade biológica completa, tem levado diversos investigadores a tentar produzir derivados de recombinantes do factor VIII sem esta região. Conseguiu-se isto, rejeitando uma porção do ADNô codificando a porção central fortemente glicosada do factor VIII, quer totalmente, quer parcialmente.

Por exemplo, J, J. Toole, e col., descrevem a construção e expressão de factor VIII sem os aminoácidos 982 até 1562, e 760 até 1639, respectivamente (Proc. Natl, Acad. Sei. USA (1986) 83, 5939-5942). D.L. Eaton e col. descrevem a construção e expressão de factor VIII sem os aminoácidos 797 até 1562 (Biochemistry (1986) 25, 8343-8347). R. J. Kaufman descreve a expressão do factor VIII sem os aminoácidos 741 até 1646 (Pedido PCT N2. W0 87/04187). N. Sarver e col. descrevem a construção e expressão de factor VIII sem os aminoácidos 747 até 1560 (ADN (1987) 6, 553-564). M. Pasek descreve a construção e expressão de factor VIII sem os aminoácidos 745 até 1562, e sem os aminoácidos 741 até 1648, respectivamente (pedido PCT N2. 88/00831). K-D Langner

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-6descreve a construção e expressão de factor VIII sem os aminoácidos 816 até 1598, e sem os aminoácidos 741 até 1689, respectivamente (Behring Inst. Mitt., (1988) N°. 82, 16-25, EP 295-597). P. Meulien, e col., descrevem a construção e expressão de factor VIII sem os aminoácidos 868 até 1562 e sem os aminoácidos 771 até 1666, respectivamente (Protein Engineering (1988) 2(4), 301-306, EP 0 303 540 Al). Quando se exprimem estas formas deleccionadas de ADNo de factor VIII em células de mamíferos, o nível de produção é, tipicamente 10 vezes superior em comparação com factor VIU de comprimento completo.

Além disso, têm sido feitas tentativas para exprimir as cadeias de 90 kDa e de 80 kDa separadamente de dois derivados .ADNõ diferentes na mesma célula (Burke, R.L. e col. (1986), J. Biol. Chem. 261, 12574-12578, Pavirani, A. e col. (1987) Biochem. Biophys. Res. Comm., 145, 234-240). Contudo, neste sistema, a reconstituição in vivo parece ter eficácia limitada em termos de actividade d© factor VIII:C recuperada.

Descrição do Invento presente invento trata de processos para a produção de proteínas consistindo de uma ou mais cadeias polipeptídicas possuindo actividade do factor VIII-C. Mais especificamente, o presente invento proporciona uma sequência de < ADNc© modificada, derivada do ADNãdo factor VIII de comprimento completo, o qual, aquando da expressão em células animais dá origem ao elevado nivel de produção de uma protéina com actividade//factor VIII:C, consistindo, essencialmente, de duas cadeias polipeptídicas com peso molecular de 90 kDa e de 80 kDa, respectivamente.

Consequentemente, o presente invento proporciona uma sequência de ADN codificando um derivado de combinante do factor VIII humano, biologicamente activo, compreendendo um primeiro segmento de ADN codificando a cadeia de 90 kDa do factor VIII humano e, um segundo segmento de ADN codificando a cadeia de 80 kDa do factor VIII humano, estando os ditos segmentos interligados por um segmento de ADN ligante, codificando um péptido ligante de cerca de 4 a cerca de 100 resíduos aminoácidos do domínio B do factor

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-7VIII humano, sendo pelo menos 4 dos ditos resíduos aminoácidos provenientes do terminal C do dito domínio»

É preferível que o dito ligante codifique pelo menos 4 resíduos aminoácidos originários do terminal C do domínio B do factor VIII humano» Numa concretização preferida do invento, o dito gene ligante codifica até cerca de 20 resíduos aminoácidos do domínio B do factor VIII humano.

Numa concretização particularmente preferida do invento, a dita sequência de ADN contém um ligante codificando uma sequência aminoácida compreendendo 12 aminoácidos originários do domínio B do factor VIII humano.

Como um exemplo preferido, o dito ligante pode codificar pelo menos 7 resíduos aminoácidos do domínio B do factor VIII humano, originando pelo menos 7 resíduos aminoácidos do terminal C e originando pelo menos 2 resíduos aminoácidos do terminal N do dito domínio»

Numa concretização específica do presente invento, a sequência de ADN contém um ligante codifiçando 12 resíduos aminoácidos originários do terminal C e 2 resíduos aminoácidos· originários do terminal N do domínio 8 do factor VIII humano» invento refere-se, também, a um vector de expressão recombinante, contendo uma unidade de transcrição, compreendendo a sequência de ADN como acima descrita e, além disso, um promotor e uma sequência sinal de poliadenilação» invento cobre também células hospedeiras de origem animal, transformadas com o vector de expressão recombinante como acima definido»

Adicionalmente, o invento proporciona um processo para a manufactura de um derivado recombinante do factor VIII humano, biologicamente activo, como acima descrito, compreendendo o dito processo a cultura de uma linha de células animais, transformada com um vector de expressão recombinante, como acima definido, num meio nutritivo, permitindo a expressão e secreção de derivado do factor VIII humano, composto do domínio de 90 kDa e, ligado a ele

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-8por ligação iónica metálica, o domínio de 80 kDa, derivado expresso, recuperado do meio de cultura.

sendo, então, o

Finalmente, o invento proporciona um derivado do factor VIII humano compreendendo o domínio de 90 kDa e, ligado a ele, opcionalmente por meio do péptido ligante ou de uma sua parte, por uma ligação iónica metálica, o domínio de 80 kDa do factor VIII humano.

Para obter uma proteína com actividade do factor VIII:C, consistindo nas duas cadeias polipeptídicas acima, a cadeia polipeptídica isolada criada durante a tradução in vivo tem de ser clivada quer por transformação pós-tradução na célula produtora, quer por transformação proteolítica in vitro, ou ambos. Como a proteína com actividade do factor VIII, constituída pelas duas cadeias polipeptídicas com peso molecular de 200 kDa e 80 kDa, pode ser isolada do plasma humano, presume-se que existe um local apropriado de clivagem para transformar enzimas, de acordo com o acima descrito no produto de tradução primário do factor VIII de comprimento completo, de cadeia linear. Muito provavelmente, existe um importante local de transformação in vivo, localizado no lado do terminal carboxi de Arg-1648. Durante a maturação, a clivagem no Arg-1648 dá origem a uma protéina de factor VIII constituída por duas cadeias de pesos moleculares de 200 kDa e 80 kDa. Como o Arg-1648 parece estar localizado numa fronteira entre domínios estruturais na molécula do factor VIII, constitui um alvo estericamente acessível para a enzima ou enzimas de transformação. Compreensivelmente existe outro local de transformação no Arg-740, que dará origem à conversão da cadeia de 200 kDa numa cadeia de 90 kDa, in vitro, criando assim a forma de 90 kDa e de 80 kDa do factor VIII, presente em concentrados de factor VIII derivados de plasma humano comercial. Verificou-se, de acordo com o presente invento, que para produzir um derivado do factor VIII de delecção, que possa ser processado quer in vivo quer in vitro, ou ambos, numa proteína de duas cadeias constituída de cadeias polipeptídicas de 90 kDa e 80 kDa, as sequências aminoácidas que rodeiam o Arg-740 e Arg-1648 têm de ser conservadas para preservar os requisitos estruturais para uma

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-9clivagem correcta. Mais especificamente, por exemplo, se os aminoácidos 743 até 1636 do polipéptido do factor VIII de comprimento completo forem deleccionados, obtém-se uma nova cadeia polipeptídica onde há 14 aminoácidos ligando Arg-740 e Arg-1648. Destes 14 aminoácidos, a sequência dos cinco amino-terminais corresponde directamente aos cinco aminoácidos depois de Árg-740 no factor VIII de comprimento completo. Além disso, a sequência dos 12 aminoácidos carboxi-terminais do fragmento de 14 aminoácidos acima, corresponde directamente aos 12 aminoácidos precedendo Glu-1649 no factor VIII de comprimento completo, criando assim uma sobreposição de 3 aminoácidos entre as regiões N- e C-terminal do domínio B.

Para produzir uma proteína do factor VIII?SQ em elevado nível, constituída por duas cadeias polipeptídicas, de acordo com o acima descrito, o ADNc que codifica este derivado do factor VIII de delecção é associado numa unidade transcripcional eficaz juntamente com elementos reguladores adequados num vector de clonação, que pode ser propagado na E. coli de acordo com processos conhecidos dos entendidos na arte. Os elementos reguladores transcripcionais eficazes podem derivar do ADN cromossónico de células eucarióticas. Por exemplo, podem-se usar combinações promotor-aumentador a partir de genes fortemente e constitutivamente transcritos, de preferência metalotionêínq., beta-actína ou GRP78. Além disso, os elementos reguladores de transcrição eficazes podem ser derivados de vírus tendo como seus hospedeiros naturais, células eucarióticas. Podem-se usar, por exemplo, combinações promotor-aumentador derivadas de virus residindo em hospedeiros animais, ocorrendo de preferência, o aumentador ê promotor na porção terminal longa do vírus do sarcoma Rous, vírus símio 40, o promotor tardio major do adenovírus, e o promotor precoce imediato do citamegalovírus humano. Para obter quantidades elevadas estáveis de ARNm transcrito a partir do ADNc do factor VIII?SQ, a unidade transcripcional deve conter, na sua parte 3’-proximal, uma região de ADN codificando uma sequência de terminação-poliadenilação transcripcional. Esta sequência deriva, de preferência, da região transcripcional precoce do vírus Sámío

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-1040 ou do gene beta-globina do coelho.

ADNc do factor VIII:S0, englobado numa unidade de transcrição eficaz, é então introduzido num organismo hospedeiro adequado para expressão da proteína do factor VIII-SQ» Este organismo deve, de preferência, ser uma linha celular animal de origem vertebrada, de forma a assegurar uma mistura correcta, formação de ligações dissulféto e secreção, bem como outras modificações pós-transcripcionais. Constituem exemplos deste último a glicosação ligada à asparagina, O-sulfatação da tirosina, e transformação proteolítica da cadeia polipeptídica linear em formação, a qual é essencial para a formação da proteína do factor VIII de duas cadeias de 90 kDa e de 80 kDa. São exemplos de linhas celulares que podem ser usadas, células-COS de macaco, células-L de rato, células-C127 de rato, células BHK-21 de hamster e, de preferência, células CHO.

ft unidade de transcrição codificando o ADNc do factor VIII:S0, pode ser introduzida numa linha celular animal de diversas formas» Um exemplo consiste em criar recombinantes entre a unidade de transcrição acima e vectores baseados em diferentes vírus animais. Constituem exemplos destes, vectores baseados no virus vaccinia, no vírus SV40 e, de preferência, vírus do papiloma bovino.

ft unidade de transcrição codificando o ADNc do factor VIII:SQ, pode também ser introduzida numa linha celular animal juntamente com outro gene recombinante que pode funcionar como um marcador de selecção dominante nestas células, para facilitar o isolamento de clones de células específicos que integrá^an o adn recombinante no genoma. Constituem exemplos deste tipo genes marcadores de selecção dominantes, a Tn5 aminoglicosido fosfotransferase (resistência ã Geneticina, G418), e a puromicina acetiltransferase (resistência à puromicina). ft unidade de transcrição codificando um tal gene marcador de selecção pode estar ou no mesmo vector ou no que codifica a unidade do factor VIII:S0. Pode também estar codificado num vector separado que é simultaneamente introduzido e integrado no genoma da célula

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hospedeira, resultando, frequentemente, numa ligação física apertada entre as diferentes unidades de transcrição»

Outros tipos de genes marcadores de selecção dominantes, que podem ser usados juntamente com o ADNc do factor VIII:SQ, são baseados em diversas unidades de transcrição codificando di-hidrofolato redutase (dhfr.). Após a introdução deste tipo de gene em células sem acticidade-dhfr endógena, de preferência células-CHO (DUKX-B11, DG-44), permitirá a estas crescerem em meio sem nucleósidos. Um exemplo de tal meio é o de Ham F12 sem hipoxantina, timidina e glicina» Estes genes dhfr podem ser usados em associação com a unidade transcripcional do factor VIII=SQ em células-CHO do tipo acima descrito, quer ligadas ao mesmo vector quer em dois vectores diferentes, criando, assim linhas celulares dhfr-positivas, produzindo proteína do factor VIII:SQ recombinante.

Se as linhas celulares acima forem cultivadas na presença do metotrexato citotóxico inibidor de dhfr, surgirão novas linhas celulares resistentes ao metotrexato. Estas novas linhas celulares podem produzir proteína do factor VIII=SQ recombinante a uma velocidade aumentada, devido ao número amplificado de unidades transcripcionais do factor VIII:SQ e ligadas a dhfr. Quando se propagam estas linhas celulares em concentrações cada vez maiores de metotrexato (1-10000 nM) podem-se obter novas linhas celulares que produzem a proteína do factor VIII:SQ a uma velocidade muito elevada.

As linhas celulares acima produzindo proteína do factor VIII= SQ podem ser cultivadas em grande escala, quer em cultura de suspensão quer sobre diversos suportes sólidos» São exemplos destes suportes, microtransportadores baseados em matrizes de dextrano ou de colagénio, ou suportes sólidos sob a forma de fibras ocas ou diversos materiais cerâmicos. Quando cultivados em cultura de suspensão ou em microtransportadores, pode-se efectuar a cultura das linhas celulares acima como uma cultura em lotes ou como uma cultura de perfusão com produção contínua de meio condicionado, durante largos períodos de tempo» Assim, de acordo

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-12com o presente invento, as linhas celulares acima estão bem adequadas para o desenvolvimento de um processo industrial para a produção de factor VIII:SQ recombinante, que corresponde à cadeia de dois polipéptidos de factor VIII autêntica (90 kDa e 80 kDa) que pode ser isolada do plasma humano.

fi proteína do factor VIII:SQ recombinante, que se acumula no meio de células CHO do tipo acima, pode ser concentrada e purificada por uma série de processos bioquímicos, incluindo processos que utilizam diferenças de tamanho, de carga, de solubilidade, de hidrofobicidade, de afinidade específica, etc., entre o factor VIII=S0 recombinante e outras substâncias no meio condicionado.

Um exemplo de tal purificação é a adsorção da proteína do factor VIII:S0 recombinante para um anticorpo monoclonal que está imobilizado num suporte sólido, Após a ctessorção, a proteína do factor VIII=SQ pode ser ainda purificada por uma variedade de técnicas cromatograficas baseadas nas propriedades acima.

fi proteína descrita neste invento com actividade do factor VIII, pode ser formulada em preparações farmacêuticas para uso terapêutico, fi proteína do factor VIII:SQ recombinante produzida, pode ser dissolvida em soluções tampão aquosas fisiologicamente compatíveis, convencionais, às quais se podem adicionar, opcionalmente, adjuvantes farmacêuticos para, proporcionar preparações farmacêuticas.

presente invento será descrito, ainda, mais detalhadamente, nos seus seguintes exemplos não-limitativos, fi descrição das concretizações específicas do invento serão efectuadas em conjunto com os desenhos anexos, nos quais:

a Figura 1 é uma representação esquemática da relação entre factor VIII de comprimento completo e factor VIII:SQ. Mostra-se a estrutura primária da região entre o C-terminal da cadeia de 90 kDa e o N-terminal da cadeia de 80 kDa. fi seta vertical indica a ligação peptidíca que é clivada para dar o produto de duas cadeiasϊ a Figura 2 é uma ilustração do plasmídeo pKGE436, contendo o

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ADNc do factor VIII:S0, sob controlo transcripcional do promotor do citomegalovirus humano;

a Figura 3 é uma ilustração do plasmídeo pKGE327 contendo o ADNc da di-rhidrofolato redutase de rato, sob controlo transcripcional da repetição terminal longa do vírus do tumor mamário do rato;

a Figura 4 é uma ilustração da imunomancha de factor VIII:SQ recombinante após electroforese em gel de poliacrilamida, na presença de doúcxdl-sulfato·. ds sódio;

a Figura 5 mostra um esquema sobre alterações Jila actividade do factor VIII de factor VIII:S0 recombinante após a incubação com trombina; e a Figura 6 ilustra alterações nos padrões de SDS-PAGE e de imunomancha de factor VIII:SQ recombinante, após incubação com ct-trombina humana.

EXEMPLO 1

Construiu-se um derivado de delecção do ADNc do factor VIII que codifica uma cadeia polipeptídica isenta da maior parte do domínio B, mas contendo partes dás sequências terminal amino e terminal carboxi do domínio B, que são essenciais para a transformação proteolitica in vivo do produto de tradução primário em duas cadeias polipeptídicas.

Mutagenese do ADNc do factor VIII

Introduziu-se, no vector bacteriófago M13mpl9 (Yamisch-Perron, C. e col. (1985) Gene 33, 103-119), de acordo com os processos usados na arte, um fragmento de restrição Kpnl-PstI de 894 pares de bases obtido a partir do ADNc do derivado de delecção do factor VIII:0D (M. Pasek, pedido PCT N2. W088/0031), codificando os aminoácidos Leu 587 até Ala 1702. Usou-se o clone fago recombinante resultante como uma fonte para a preparação de ADN de cadeia simples usado·¹ como templato para mutagénese oligonucleótida dirigida (Nakamaye, K. e Eckstein, F. (1986) Nucleic Acids Res. 14, 9679-9698). Anelaram-se 10 ug de ADN vector de cadeia simples circular purificado a 8 pmoles de um

ÍÓ' i

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oligonucleótido 5’-fosforilado, com a seguinte sequência:

J.

5’-GCAATTGAACCAAGAAGCTTCTCTCAGAATCCACCAGTCTTGAAACGC-3’

A segunda cadeia de ADN circular foi sintetizada no templato resultante pela adição de todos os quatro desoxinucleótidos, dCTPaS, 12 unidades de fragmento Klenow da polimerase I do ADN, e 12 unidades de ligase de ADN T4, Após incubação durante a noite a 16°C, a mistura reaccional resultante foi enriquecida em ADN de cadeia dupla, filtrando-a através de nitrocelulose na presença de 500 mM de NaCl. Um quinto do ADN dé cadeia dupla purificado, foi cortada (nicked)₍por incubação com 5 unidades da enzima de restrição Ncil, tratado com 50 unidades de Exonuclease III ao ponto da cadeia do templato do ADN do fago será parcialmente removida, o duplexo parcial resultante foi reconvertido em ADN de cadeia dupla pelo tratamento com 3 unidades de ADN polimerase I, e 2 unidades de ligase-ADN T4 na presença de todos os quatro trifosfatos de desoxinucleótidos a 16°C, durante 3 horas. Um quarto da mistura resultante foi usada para transformar 300 μ.1 de E. coli TG1. Dos clones fago resultantes da mutagénese, dez foram submetidos a sequenciação dideoxi (Sanger, F. e col. 1977, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74, 5463-5467). Um dos clones fago resultante apresentou a sequência nucleotiddm esperada, indicando que se tinha removido um segmento de 228 pares de bases, que corresponde aos aminoácidos Asp 1563 até Ser 1637 do factor VIII:QD. Isto cria um novo fragmento Kpnl-PstI de 666 pares de bases do ADNc do factor VIII, dentro do vector M13mpl9 codificando uma fusão entre Phe 742 e Ser 1637 da proteína do factor VIII (factor VIII=SQ).

Construção de um vector de Expressão··de Mamífero Codificando o factor VIII=SQ

Isolou-se o fragmento KpJ2l-PsfI de 666 pares de bases codificando a fusão do factor VIII:SB, de acordo com o acima descrito, a partir da forma replicativa de cadeia dupla do ADN do fago M13mpl9 ε introduziu-se no vector pKGE431. Este vector consiste .‘-.num fragmento Kpnl-Sphl de 2046 pares de bases do ADNc do factor VIII:RE (M. Pasek, pedido PCT N2. W088/00831, N2. de

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-15entrada no ATCC 53517) codificando os aminoácidos Leu 587 até Met 2176 da proteína do factor VIII^RE no pUC19. Para acomodar o fragmento Kpnl-PstI de 666 pares de bases do factor VIII:SQ, da forma desejada, o ADN do pKGE431 teve de ser aberto por digestão completa de Kpnl e digestão parcial de PstI. 0 fragmento do pKGE431, no qual PstI clivou numa posição correspondendo a Ala 1702 na proteína do factor VIII:RE foi isolado e ligado ao fragmento Kpnl-PstI acima do ADNc do factor VIII:SQ, criando o vector pKGE432. Este último vector foi digerido com Kpnl e com Apal ε, o fragmento Kpnl-Apal, de 1700 pares de bases, correspondente, codificando Leu 587 até Ala 2047 da proteína do factor VIII=S0, foi ligada ao fragmento grande do vector pKGE347 que tinha sido digerido com Kpnl e com Apal. 0 vector pKGE347, que é baseado no vector clonante da E. coli pBR327, consiste no aumentadoE ’ ./promotor do citomegalovirus humano codificados num segmento de ADN de 741 pares de bases (posições de nucleótidos - 671 a +71, Boshart, M. e col. (1985) Cell 41, 521-530) a montante do ADNc do factor VIII:QD com o intrão e sequência de poliadenilação do antigénio t SV40 na porção proximal 3’. 0 vector resultante (pKGE436), que está descrito na Figura 2, contém o ADNc completo do factor VIII:SQ, e é idêntico ao pKGE347, com excepção para o derivado de delecção diferente do factor VIII que está codificado.

EXEMPLO 2

Transfecção de Células de Ovário de Hamster Chinês

Numa placa de cultura de células, com 10 centímetros de diâmetros, semearam-se 0,5 milhões de células de ovário de Hamster Chinês, deficientes em di-hidrofolato redutase (CHO-DG44, obtido de Dr. L.A. Chasin, Columbia University, Nova Iorque), em Meio Eagles Modificado de Dulbecco/Fl2 de Ham (1=1) suplementado com soro fetal de vitelo a 10%, e incubaram-se durante, a noite a 37°C numa incubadora com dióxido de carbono a 5%. No dia seguinte as células foram lavadas com meio fresco e transfectadas, subsequentemente, pelo método do fosfato de cálcio com 10 ug de uma mistura 1:1 do vector de expressão pKGE436 do factor VIII:SS e o vector pKGE327 da di-hidrofolato redutase, de

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acordo com os processos da arte. 0 vector pKGE327 contém uma unidade de transcrição consistindo na repetição to terminal langa do vírus do tumor mamário do rato, a montante do ADNc da di-hidrofolato redutase de rato com o antigénio t SV40 e a sequência de poliadenilação na parte proximal 3’, clonada no vector pML2 no sentido dos ponteiros do relógio (Figura 3). No terceiro dia o meio foi removido, as células foram lavadas e divididas em novas placas de cultura de células. No quarto dia, iniciou-se a selecção de células positivas para a di-hidrofolato redutase, substituindo o meio com o meio de cultura de células acima sem hipoxantina, glicina e timidina e suplementado com soro fetal de vitelo a 10%, rigorosamente dialisado. 0 meio foi mudado duas vezes por semana e, aproximadamente duas semanas depois, foi possível recolher as colónias de células positivas em relação à di-hidrofolato redutase. Estas colónias foram ainda cultivadas em frascos de cultura de células de 7,3 cm^ e, após atingirem a sub-confluência, o meio foi substituído com meio fresco contendo soro fetal de vitelo a 3%. A actividade do factor VIII:C no meio de cultura foi testada, após um período de 24 horas, usando o processo do substrato sintético (Coatest factor VIII:C, KABI). Os resultados estão apresentados no Quadro 1 abaixo.

QUADRO 1

Linhas celulares CHQ-DG44 produzindo FVIII SQ

Linha celular Ensaio Linha celular Ensaio

N2.	Coatest (mU/ml)	N2,	Coatest (mU/ml)
; = 1	10	208^13	107
2	73	14	167
3	147	15	253
4	27	16	253
5	107	17	313
6	80	18	307
7	73	19	27
8	87	20	287
9	93	21	393
10	33	22	467
11	47	23	107
12	147	24	180

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-17—

Amplificação do Gene de linhas celulares CH0-DG44 produzindo factor VIII:SQ

A linha celular CH0-DG44, 208:22 no Quadro 1, produzindo 467 mU/ml/dia de factor VIII=SQ, foi escolhida para posterior amplificação do gene por selecção e cultura em metotrexato. Após várias semanas de cultura em 20 nM de metotrexato a linha celular 208:22 deu origem a diversos novos clones de células resistentes. Estes clones foram recolhidos individualmente e depois expandidos como culturas separadas como acima descrito. Ensaiou-se a produtividade do factor VIII:C no meio destes clones como no Exemplo 1. Q resultado está apresentado no Quadro 2.

QUADRO 2

Linhas celulares amplifiçadas produzindo factor VIII:SQ derivadas da linha celular CHO-DG44 208:22

Linha celular NÔ.	Ensaio Coatest fmU/ml)	Linha celular N2.	Ensaio Coatest fmU/ml)
208:22:1	1040	208:22:13	1070
2	690	14	860
3	660	15	930
4	720	16	680
5	800	17	790
6	940	18	750
7	1100	19	960
8	260	20	80
9	900	21	1130
10	660	22	920
11	720	23	950
12	870	24	1010

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Purificação e Concretização Bioquímica do factor VIII=SQ

I

Examinou-se o factor VIJI= SQ produzido pela linha celular CH0-DG44 208=22 em relação às características bioquímicas. Efectuou-se uma purificação parcial do material do factor VIII do meio de cultura antes do estudo. Isto isacluiu uma etapa de cromatografia de imunoafinidade com o uso de uma matriz contendo anticorpos monoclonais dirigidos contra o factor VIII, seguido por uma etapa de cromatografia de permuta iónica. A actividade específica do material de factor VIII purificado obtido estava dentro da gama de 3000-4000 XU/A2S0> ^{e a} razão actividade do factor VÃLJL/antigénio do factor VIII era próximo de 1 (a actividade foi medida com Coatest (KABI), e o antigénio foi determinado por um ensaio Elisa, com o uso de anticorpos monoclonais dirigidos contra a cadeia de 80 kDa). 0 material de factor VIII= S0 purificado foi submetido a electroforese em SDS-gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) e a análise de mancha Western. Efectuou-se o SDS-PAGE de acordo com Laemmli (1970) Nature 227, 680-685. Usaram-se anticorpos antifactor VIII humano policlonais de coelho para a análise em mancha Western, e a análise foi essencialmente efectuada como descrito por Towbin, H. e col. (1979) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 76, 4350-4354» Os resultados obtidos estão apresentados na Fig. 4, Banda 1= factor VIII plasmático contendo uma cadeia leve de 80 kDa e cadeias pesadas variando de 200 kDa a 90 kDa. As bandas 2 e 3= factor VIII=SQ recombinante contendo uma cadeia de 80 kDa e uma cadeia de 90 kDa. Os materiais originam de dois lotes diferentes de factor VIII=S0 purificado, como acima descrito. A análise mostrou assim a presença de duas bandas principais no material de factor VIII= = SQ; uma a 90 kDa e outra banda dupla a 80 kDa. Enconfraram-se as duas bandas na mesma posição no gel com os péptidos de 90 kDa e 80 kDa a representar o complexo mais pequeno, biologicamente activo, do factor VIII plasmático. Encontrou-se também no material do factor VIII=80, uma quantidade pequena de uma banda de 170 kDa (< de 5¾ do material total) representando, provavelmente o produto de tradução primária não clivadà. Além disso, a determinação da sequência terminal N, da proteína do factor VIII=

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=SQ com degradação automática de Edman, indicou que os terminais N das cadeias de 90 kDa e de 80 kDa eram idênticas às do factor VIII de 90 kDa mais de 80 kDa derivado do plasma. Este resultado mostrou assim que a transformação proteolítica in vivo, do produto de tradução primária em duas cadeias polipeptídicas, tinha sido eficaz.

factor VIII=SQ pôde ser activado pela trombina humana de uma forma dependente da dose» Foi seguido, subsequentemente, pela inactivação» Na Figura 5 apresenta-se a curva de alterações da actividade obtida quando se adicionou 0,1 íí de trombina por 1 IU de factor VIII:SQ purificado. Usou-se um método de coagulação numa etapa (Mikaelsson, M. e col. (1983) Blood 62, 1006-1015) para o ensaio imediato de amostras da mistura reaccional» Obteve-se, dentro de um minuto, uma activação quinze vezes superior, que foi seguida de inactivação. Adicionou-se dodecil^ sulfato de sódio a 0,02 g/ml para interromper a reacção em amostras para análise» Efectuou-se electroforese em poliacrilamida e análise em mancha Western com policlonais de coelho contra factor VIII humano, em amostras retiradas em intervalos de tempo durante a reacção (Figura 6)» A electroforese e a imunomancha foram efectuadas como descrito em relação à Figura 4.

SDS-gel de anticorpos

Os resultados obtidos mostraram uma alteração molecular dos péptidos do factor VIII idêntica ã do factor VIII plasmático durante a incubação com trombina» Assim, o péptido de 90 kDa foi clivado pela trombina e formou-se um péptido de 50 kDa mais um de 40 kDa. 0 péptido de 80 kDa foi clivado e formou-se um péptido de 70 kDa. A banda fraca que se vê a 170 kDa na amostra do factor VIII=SQ desapareceu durante o primeiro minuto de incubação com a trombina e, formaram-se, aparentemente, péptidos idênticos aos formados a partir do complexo 90 kDa-80 kDa» Os estudos com a trombina mostraram que o factor VIII=SQ se comporta como o factor VIII plasmático na interacçao com esta enzima. Este facto é considerado essencial para a actividade biológica in vivo.

A interacçao do factor VIII:SQ com o factor de von Willbrand a cromatografia de exclusão por jbaram-se dez (10) IU de factor m Willbrand humano purificado a

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2909468/TB/LG ~20 humano foi estudada com o uso dí tamanhos em Sepharose CL-6B» Ino VIII:SQ com 30 U de factor de vo

37⁰C,· durante 20 minutos» A mistura da incubação foi então aplicada sobre uma coluna compactada com Sepharose CL-6B» Todo o material com actividade do factor VIII foi eluído no volume desocupado, com factor von Willebrand» Quando se aplicou o factor VIIIsSQ, sem qualquer adição de factor von Willebrand, à coluna, só houve eluição de material com actividade do factor VIII nas fracções mais internas, numa posição onde se eluiu também a forma 90 kDa-80 kDa do factor VIII plasmãtico» Isto mostra que o factor VIII:SQ tem capacidade para se ligar ao factor von Willebrand, o que constitui uma propriedade necessária para uma boa sobrevivência in.......vivo (Brinkhous, K»M» e col» (1985) Proc» Natl»

Acad» Sei» USA 82, 8752-8756)»

ADN do factor VIII:SQ do presente invento foi depositado no Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen em 13 de Dezembro de 1989, e foi-lhe atribuído o número de depósito DSM 5693»

Exemplo.....4

Estudo do efeito hemoestãtico e da sobrevivência in_______vivo com o factor VIII SQ efeito hemoestátíco e da sobrevivência ín______vivo com o factor

VIII SQ foram estudados em dois cães hemofílicos» Fizeram-se comparações com concentrados de factor VIII plasmãtico comercial com elevada pureza, Octonativ M (Kabi Pharmacia)» Cada cão recebeu, em primeiro lugar, factor VIII SQ e dois dias mais tarde o Octonativ M» Os resultados obtidos mostraram que o factor VIII SQ tem um efeito hemoestãtico bom, como determinado por um teste do tempo de hemorragia da unha do dedo da pata, modificado (Giles, A»R», Tínlin, S» © Greenwood, R» (1982) Blood 60, 727-730)» 0 tempo de hemorragia secundária nos cães hemofílicos foi uma préinfusão > 15 minutos» Tanto a infusão de factor VIII SQ como a de Octonativ N normalizaram o tempo de hemorragia para < 5 minutos»

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Adicionalmente, as curvas de eliminação da actividade do factor VIII obtida com os dois tipos de material foram quase idênticas (figuras 7 e 8). Não se verificaram diferenças significativas na semi-vida. No caso do factor VIII SQ, verificaram-se recuperações de 119% e de 84%, e no caso do factor VIII plasmãtíco de 74% e 57%„ A elevada recuperação obtida com o factor VIII SQ é devida provavelmente ao facto da actividade do factor VIII no produto de factor VIII SQ puro ter sido subestimada.(Sabe-se, de estudos feitos com concentrados de factor plasmático puro, que se podem obter valores de actividade demasiadamente baixos, com um nível reduzido, ou ausência, do factor de von Willebrand). Os parâmetros farmacológicos obtidos são apresentados na Tabela 1.

Tabela 1 Estudo de cães hemofílicos

Cão 8-99 Cão S-100 Cão S-99 Cão S-100 Rec-EVIII Rec.EVIII Octonatív M Octonativ M

Dose (IV/Kg) 137

Volume de distribuição (litros) 71

Clearance (litros/h) 8

111 130

120

108

134

8,4 11,9 13,1

Semi-vida (horas)

6,2

7,1

7,2

Claims

REIVINDICAÇÕES

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ÍTT·

1 - Processo de obtenção de uma sequência de ADN codificando um derivado recombinante do factor VIII humano, biologicamente activo, caracterizado por compreender a interligação de um primeiro segmento de ADN codificando a cadeia de 90 kDa do factor VIII humano e de um segundo segmento de ADN codificando a cadeia de 80 kDa do factor VIII humano, por meio de um segmento de ADN ligante, codificando um péptido ligante de 4 a cerca de 100 resíduos de aminoácido do domínio B do factor VIII humano, provindo, pelo menos 4 dos ditos resíduos de aminoácido, do terminal C do dito domínio»
2 - Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o dito ligante codificar, pelo menos, 4 resíduos de aminoácido provenientes do terminal C do domínio B do factor VIII humano»
3 - Processo, de acordo oom a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por o dito gene de ligante codificar até cerca de 20 resíduos de aminoácido do domínio B do factor VIII humano»
4 - Processo, de acordo com a reivindicação 1, 2 ou 3, caracterizado por o dito ligante codificar uma sequência de aminoácido, compreendendo 12 aminoácidos provenientes do domínio B do factor VIII humano»
5 - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado por o dito ligante codificar pelo menos 7 resíduos de aminoácido do domínio B do factor VIII humano, provindo, pelo menos, 4 resíduos de aminoácido do terminal C e, pelo menos, 2 resíduos de aminoácido do terminal N do dito domínio»
6 - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado por o dito ligante codificar 12 resíduos de aminoácido provenientes do terminal C e 2 resíduos de

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-23” aminoácido provenientes do terminal N do domínio B do factor VIII humano,.
7 ~ Processo de obtenção de um vector de expressão recombínante, caracterizado por se transformar um vector inserindo nele uma unidade de transcrição compreendendo a sequência de AON, preparada de acordo com as reivindicações 1 a 5, um promotor e uma sequência sinalizadora de poliadenilação.
8 - Processo de obtenção de uma célula hospedeira, de origem animal, transformada, caracterizado por se transformar uma célula hospedeira, de origem animal, com o vector de expressão recornbinarite preparado de acordo com a reivindicação 7..
9 ~ Processo para a produção de um derivado recombinante do factor VIII humano, biologicamente activo, expresso pela sequência de ADN de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado por se cultivar uma linha de células animais transformadas com um vector de expressão recombinante de acordo com a reivindicação 7, num meio nutriente que permita a expressão e secreção de derivado do factor VIII humano composto por dois polipéptidos com pesos moleculares de 90 kDa e 80 kDa, respeotivamente, ligados entre si por uma ponte de ião metálico, e recuperar o dito derivado do meio de cultura»