TW202115127A - 治療血友病及低骨質密度之方法及組成物 - Google Patents
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Abstract
本文揭示了用包含凝血因子和Fc結構域的嵌合蛋白治療患有血友病和低骨質密度(BMD)的個體的方法。在某些實施例中,所述嵌合蛋白是rFVIIIFc。在某些實施例中,待治療的個體患有A型血友病。
Description
本文揭示了用包含凝血因子和Fc結構域的嵌合蛋白治療患有血友病和低骨質密度(BMD)的個體的方法。在某些實施例中,所述嵌合蛋白是rFVIIIFc。在某些實施例中,待治療的個體患有A型血友病。相 關 申請案
本申請案要求2019年6月19日提交的美國臨時申請案號62/863,831和2020年1月31日提交的美國臨時申請案號62/968,785的優先權之權益,這兩個申請案係藉由引用以其整體併入本文。序列表
本申請案含有已經以ASCII格式電子提交並且藉由引用以其整體特此併入的序列表。所述ASCII副本創建於2020年6月16日,名稱為706564_SA9-503PC_ST25.txt,大小為46,080位元組。
血友病是由編碼凝血因子的基因缺陷引起的一群出血性病症,並且影響10,000個男性初生者中的1-2個。Graw等人,
Nat. Rev. Genet. 6(6): 488-501 (2005)。A型血友病的特徵是不存在功能性內源性凝血因子VIII(FVIII)。患有嚴重A型血友病的患者不僅遭受創傷性出血控制不佳,而且還遭受自發出血至關節中。當前治療血友病的護理標準是靜脈內因子替代療法,其目的是預防嚴重的威脅生命和肢體的出血,包括復發性關節出血(關節積血),這可能導致肥大性滑膜炎和軟骨降解(血友病性關節病)。Manco-Johnson等人, NEJM 357(6):535-4 (2007)。數十年來,最佳預防措施減少但未消除關節出血。Manco-Johnson等人, Blood 129(17):2368-2374 (2017)。
與一般人群相比,血友病患者的骨質密度(BMD)降低和骨質疏鬆症的風險更高。Gerstner等人, Haemophilia, 15(2):559-65 (2009)。根據一項研究,27%的血友病患者患有骨質疏鬆症,並且43%骨密度低。同上。越來越多的全球BMD觀察表明,血友病患者的BMD通常低於對照病例,或者低於基於年齡對一般人群的預期。儘管存在這種聯繫,但血友病患者中BMD降低的機制目前尚不清楚。
血友病患者的腰椎和髖部BMD的顯著降低始於兒童期。需要針對血友病患者的改進的治療選擇,其防止關節出血並使BMD隨時間推移的損失最小化。
本文尤其提供了用於治療患有血友病和低BMD的個體之方法和組成物。本揭示文本的某些態樣涉及治療患有A型血友病和低骨質密度(BMD)的個體的方法,所述方法包括選擇患有A型血友病和低BMD的個體,並且投予個體治療有效量的包含重組因子VIII(FVIII)蛋白和Fc結構域的嵌合蛋白(rFVIIIFc),其中所述嵌合蛋白的投予在個體中抑制BMD的降低。在一些實施例中,Fc結構域是免疫球蛋白G1(IgG1)的Fc結構域。在一些實施例中,Fc結構域是人IgG1的Fc結構域。在一些實施例中,嵌合蛋白是rFVIIIFc。本揭示文本的一些態樣涉及包含重組FVIII蛋白和Fc結構域的嵌合蛋白,其用於治療患有A型血友病和低骨質密度(BMD)的個體。
在一些實施例中,所述個體患有輕度A型血友病。在一些實施例中,所述個體患有中度A型血友病。在一些實施例中,所述個體患有重度A型血友病。
在一些實施例中,rFVIIIFc包含與根據SEQ ID NO: 1的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列。在一些實施例中,rFVIIIFc包含根據SEQ ID NO: 1的胺基酸序列。
在一些實施例中,嵌合蛋白的FVIII部分包含與根據SEQ ID NO: 2的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列。在一些實施例中,嵌合蛋白的FVIII部分包含根據SEQ ID NO: 2的胺基酸序列。
在一些實施例中,rFVIIIFc包含與SEQ ID NO: 5至少95%相同的胺基酸序列。在一些實施例中,rFVIIIFc包含與SEQ ID NO: 5相同的胺基酸序列。
在一些實施例中,嵌合蛋白包含第一多肽鏈和第二多肽鏈,所述第一多肽鏈包含與SEQ ID NO: 5至少95%相同的胺基酸序列,並且所述第二多肽鏈包含與SEQ ID NO: 4至少95%相同的胺基酸序列。在一些實施例中,嵌合蛋白包含第一多肽鏈和第二多肽鏈,所述第一多肽鏈包含與SEQ ID NO: 5相同的胺基酸序列,並且所述第二多肽鏈包含與SEQ ID NO: 4相同的胺基酸序列。在一些實施例中,嵌合蛋白包含第一多肽鏈和第二多肽鏈,所述第一多肽鏈的胺基酸序列與SEQ ID NO: 5相同,並且所述第二多肽鏈的胺基酸序列與SEQ ID NO: 4相同。在一些實施例中,第一多肽鏈藉由雙硫鍵與第二多肽鏈共價結合。在一些實施例中,嵌合蛋白包含藉由兩個雙硫鍵與第二多肽鏈共價結合的第一多肽鏈。在一些實施例中,嵌合蛋白包含藉由Fc結構域的鉸鏈區中的兩個雙硫鍵與第二多肽鏈共價結合的第一多肽鏈。在一些實施例中,嵌合蛋白是efmoroctocog alfa。在一些實施例中,efmoroctocog alfa以商品名ELOCTA®或ELOCTATE®出售或是其生物相似物。
在一些實施例中,嵌合蛋白包含藉由Fc結構域的鉸鏈區中的兩個雙硫鍵與第二多肽鏈共價結合的第一多肽鏈,其中第一多肽鏈包含第一多肽鏈和第二多肽鏈,所述第一多肽鏈的胺基酸序列與SEQ ID NO: 5相同並且包含Y346、Y718、Y719、Y723、Y770和Y786處的硫酸化酪胺酸,N41、N239、N916、N1224和N1515處的N-醣基化位點,所述第二多肽鏈的胺基酸序列與SEQ ID NO: 4相同並且包含N77處的N-醣基化位點。
在一些實施例中,所述方法包括投予個體有效量的醫藥組成物,所述醫藥組成物包含 (i) 嵌合多肽,其包含FVIII蛋白和Fc結構域,和 (ii) 至少一種醫藥上可接受的賦形劑,其中嵌合多肽的FVIII蛋白的約1%至約40%是單鏈FVIII,並且嵌合多肽的FVIII蛋白的約60%至約99%是經加工的FVIII,其中單鏈FVIII蛋白在單條多肽鏈上包含FVIII重鏈和FVIII輕鏈,並且經加工的FVIII蛋白在兩條多肽鏈上包含FVIII重鏈和FVIII輕鏈。
在一些實施例中,嵌合蛋白已由人細胞產生。在一些實施例中,所述人細胞是人胚胎腎293(HEK293)細胞。在一些實施例中,所述人細胞是HEK293F細胞。
在一些實施例中,以每3-5天25-65 IU/kg的劑量投予rFVIIIFc。在一些實施例中,以每3天25-65 IU/kg的劑量投予重組FVIII蛋白。在一些實施例中,以每4天25-65 IU/kg的劑量投予重組FVIII蛋白。在一些實施例中,以每5天25-65 IU/kg的劑量投予重組FVIII蛋白。
在一些實施例中,個體是50歲或更大。在某些實施例中,個體小於50歲。
在一些實施例中,藉由X射線測量個體中的BMD。在一些實施例中,藉由雙X射線吸收法(DXA)測量個體中的BMD。
在一些實施例中,具有低BMD的個體患有骨質減少和/或骨質疏鬆症。在一些實施例中,具有低BMD的個體患有骨質減少。在一些實施例中,具有低BMD的個體患有骨質疏鬆症。在一些實施例中,個體中的BMD由T得分確定。在一些實施例中,如果個體的T得分小於-1.0,則確定所述個體具有低BMD。在一些實施例中,如果個體的T得分在-1.0至-2.4之間,則確所述定個體具有低BMD和骨質減少。在一些實施例中,如果個體的T得分小於或等於-2.5,則確定所述個體具有低BMD和骨質疏鬆症。
在一些實施例中,個體中的BMD由Z得分確定。在一些實施例中,如果個體的Z得分小於-2.0,則確定所述個體具有低BMD。
在一些實施例中,基於骨形成、骨吸收和/或骨損失的一種或多種生物標記的水準,預測個體具有低BMD。在一些實施例中,從個體的周邊血液或尿液評估生物標記(例如,用測定法測量蛋白質的水準或量)。在一些實施例中,在是周邊血液或源自周邊血液(如血清或血漿)的生物學樣品中測量一種或多種生物標記的水準。在一些實施例中,骨形成的一種或多種生物標記包括骨特異性鹼性磷酸酶、1型前膠原N末端前肽(P1NP)、1型前膠原C末端前肽(P1CP)和/或骨鈣蛋白。在一些實施例中,骨吸收的一種或多種生物標記包括血清中的總鹼性磷酸酶、核因子κB的受體活化因子(RANKL)、骨保護素(OPG)、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)、羥離胺酸、羥脯胺酸,去氧吡啶啉(DPD)、吡啶啉(PYD)、骨唾液蛋白、組織蛋白酶K、抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRAP5b)、基質金屬蛋白酶9(MMP9)和/或1型膠原的C末端和N末端交聯的端肽(分別為CTX-1和NTX-1)。
在一些實施例中,個體沒有維生素D缺乏症。在一些實施例中,個體先前已用不含Fc部分的因子VIII進行治療。
本揭示文本的某些態樣係關於治療患有A型血友病和增加的骨折風險的個體的方法,所述方法包括選擇患有血友病和增加的骨折風險的個體,並且投予個體治療有效量之包含重組FVIII蛋白和Fc結構域的嵌合蛋白,其中所述嵌合蛋白的投予降低了個體中骨折的風險。本揭示文本的一些態樣涉及包含重組FVIII蛋白和Fc結構域的嵌合蛋白,其用於治療患有A型血友病和增加的骨折風險的個體。
在一些實施例中,藉由骨折風險評估工具(FRAX)來確定個體中骨折的風險。在一些實施例中,藉由評估低BMD風險因素來確定個體中骨折的風險。在一些實施例中,低BMD風險因素包括關節病、身體活動減少、HIV或HCV感染、維生素D缺乏症、低身體質量指數(BMI)和/或低性腺功能症。
本揭示文本的某些態樣係關於治療患有A型血友病和骨折的個體的方法,所述方法包括選擇患有血友病和骨折的個體,並且投予個體治療有效量之包含重組FVIII蛋白和Fc結構域的嵌合蛋白。本揭示文本的一些態樣係關於包含重組FVIII蛋白和Fc結構域的嵌合蛋白,其用於治療患有A型血友病和骨折的個體。
本揭示文本的某些態樣係關於在個體中減少骨質密度(BMD)損失率的方法,所述方法包括選擇具有低BMD的個體;並且投予個體治療有效量之包含凝血因子和Fc結構域的嵌合蛋白,使得所述嵌合蛋白的投予在個體中降低BMD損失率。本揭示文本的一些態樣係關於包含重組FVIII蛋白和Fc結構域的嵌合蛋白(rFVIIIFc),其用於治療患有A型血友病的個體並降低個體中的BMD損失率。
本揭示文本的某些態樣係關於在患有A型血友病的個體中增加骨質密度(BMD)並預防性治療出血事件的方法,所述方法包括:(i) 鑑定正在接受用不含Fc部分的FVIII蛋白治療A型血友病的個體,其中所述個體在治療期間具有足夠的血液凝固,並且其中所述個體具有低BMD;(ii) 停止用不含Fc部分的FVIII蛋白進行治療,並投予個體治療有效量之包含重組FVIII蛋白和Fc結構域的嵌合蛋白(rFVIIIFc),其中所述嵌合蛋白的投予在個體中增加BMD並預防性治療出血事件。
本揭示文本的某些態樣係關於在患有A型血友病的個體中增加骨質密度(BMD)並預防性治療出血事件的方法,所述方法包括:(i) 鑑定正在接受用非因子替代蛋白治療A型血友病的個體,其中所述個體在治療期間具有足夠的血液凝固,並且其中所述個體具有低BMD;(ii) 停止用非因子替代蛋白進行治療,並投予個體治療有效量之包含重組FVIII蛋白和Fc結構域的嵌合蛋白(rFVIIIFc),其中所述嵌合蛋白的投予在個體中增加BMD並預防性治療出血事件。
本揭示文本的某些態樣係關於在個體中增加骨質密度(BMD)並預防性治療出血事件的方法,所述方法包括投予個體治療有效量之包含重組FVIII蛋白和Fc結構域的嵌合蛋白(rFVIIIFc),其中所述個體已被鑑定為患有A型血友病和低BMD,並且其中所述嵌合蛋白的投予在個體中增加BMD並預防性治療出血事件。
本揭示文本的某些態樣係關於在個體中降低骨折風險並預防性治療出血事件的方法,所述方法包括投予個體治療有效量之包含重組FVIII蛋白和Fc結構域的嵌合蛋白(rFVIIIFc),其中所述個體已被鑑定為患有A型血友病和增加的骨折風險,並且其中所述嵌合蛋白的投予在個體中降低骨折風險並預防性治療出血事件。
本揭示文本的某些態樣係關於在個體中降低骨質密度(BMD)損失率並預防性治療出血事件的方法,所述方法包括投予個體治療有效量之包含重組FVIII蛋白和Fc結構域的嵌合蛋白(rFVIIIFc),其中所述個體已被鑑定為患有A型血友病和BMD損失,並且其中所述嵌合蛋白的投予在個體中降低BMD損失率並預防性治療出血事件。
本揭示文本的某些態樣係關於在患有A型血友病並且正在接受用不含Fc部分的FVIII蛋白治療的個體中增加骨質密度(BMD)並預防性治療出血事件的方法,所述方法包括停止用不含Fc部分的FVIII蛋白進行治療,並投予個體治療有效量之包含重組FVIII蛋白和Fc結構域的嵌合蛋白(rFVIIIFc),其中所述個體已被鑑定為具有低BMD並且在用不含Fc部分的FVIII蛋白治療期間具有足夠的血液凝固,並且其中所述嵌合蛋白的投予在個體中增加BMD並預防性治療出血事件。
本揭示文本的某些態樣係關於在患有A型血友病並且正在接受用非因子替代蛋白治療的個體中增加骨質密度(BMD)並預防性治療出血事件的方法,所述方法包括停止用非因子替代蛋白進行治療,並且投予個體治療有效量之包含重組FVIII蛋白和Fc結構域的嵌合蛋白(rFVIIIFc),其中所述個體已被鑑定為具有低BMD並且在用非因子替代蛋白治療期間具有足夠的血液凝固,並且其中所述嵌合蛋白的投予在個體中增加BMD並預防性治療出血事件。
在一些實施例中,個體先前已使用不含Fc部分的因子VIII蛋白進行治療以減少與A型血友病相關的出血。
在一些實施例中,不含Fc部分的因子VIII蛋白是未融合至Fc結構域的聚乙二醇化FVIII。
在一些實施例中,不含Fc部分的因子VIII蛋白是未融合至Fc結構域的單鏈FVIII。
在一些實施例中,不含Fc部分的因子VIII蛋白是重組FVIII,其不包含在人體中延長其半衰期的部分。
在一些實施例中,不含Fc部分的因子VIII蛋白是血液來源的FVIII或血漿來源的FVIII。
在一些實施例中,不含Fc部分的因子VIII蛋白是damoctocog alfa pegol、turoctocog alfa pegol、turoctocog alfa、lonoctocog alfa、simoctocog alfa、rurioctocog alfa pegol或octocog alfa。
在一些實施例中,個體先前已使用非因子替代蛋白進行治療以減少與A型血友病相關的出血。
在一些實施例中,非因子替代蛋白是艾美賽珠單抗(emicizumab)。
在一些實施例中,所述艾美賽珠單抗是艾美賽珠單抗-kxwh。
在一些實施例中,個體在用不含Fc部分的因子VIII蛋白或非因子替代蛋白治療期間具有足夠的血液凝固。
在一些實施例中,個體在尚未檢測到出血的骨部位和/或關節處具有低BMD。
根據每個前述態樣和實施例,在某些實施例中,個體患有輕度A型血友病。可替代地,根據每個前述態樣和實施例,在某些實施例中,個體患有中度A型血友病。可替代地,根據每個前述態樣和實施例,在某些實施例中,個體患有重度A型血友病。
本揭示文本係關於用於治療具有低骨質密度(BMD)的個體的方法。在一個態樣中,本文揭示治療患有血友病和低BMD的個體的方法。本揭示文本的某些態樣係關於治療患有A型血友病和低BMD的個體的方法,其包括選擇患有A型血友病和低BMD的個體,並且投予個體治療有效量之包含凝血因子和Fc結構域的嵌合蛋白。本文還揭示用嵌合蛋白治療患有A型血友病的個體的方法,其中所述嵌合蛋白的投予在個體中抑制BMD的降低。在某些實施例中,嵌合蛋白包含FVIII和Fc區。在某些實施例中,嵌合蛋白由FVIII和Fc區組成。在各種實施例中,嵌合蛋白是rFVIIIFc。1. 定 義
除非另外定義,否則本文所用的所有技術和科學術語均具有與本揭示文本所屬技術的熟習此項技術者通常所理解相同的含義。例如,The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 第5版, 2013, Academic Press;和Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology, 第2版 (rev.), 2006, Oxford University Press為熟習此項技術者提供了本揭示文本中所使用的許多術語的通用詞典。
除非上下文另外清楚地說明,否則單數形式“一個/一種(a)”、“一個/一種(an)”以及“所述(the)”包括多個指代物。術語“一個/一種(a)”(或“一個/一種(an)”)以及術語“一個/一種或多個/多種”和“至少一個/至少一種”可以在本文中互換使用。在某些態樣,術語“一個/一種(a)”或“一個/一種(an)”意指“單一的”。在其他態樣,術語“一個/一種(a)”或“一個/一種(an)”包括“兩個/兩種或更多個/更多種”或“多個/多種”。此外,本文使用的“和/或”被視為兩個指定特徵或組分中的每一個與或不與另一特徵或組分一起的特定揭示。因此,如在本文的短語如“A和/或B”中使用的術語“和/或”旨在包括“A和B”、“A或B”、“A”(單獨的)和“B”(單獨的)。同樣地,如在短語如“A、B和/或C”中使用的術語“和/或”旨在涵蓋以下態樣中的每一個:A、B和C;A、B或C;A或C;A或B;B或C;A和C;A和B;B和C;A(單獨的);B(單獨的);以及C(單獨的)。
在說明書和申請專利範圍通篇中與數值結合使用的術語“約”表示熟習此項技術者熟知和可接受的精確度區間。通常,在本文的申請專利範圍、發明內容和具體實施方式中,這種精確度區間為± 10%。在一些實施例中,當用於提及具體列舉的數值時,“約”意指所述值可以與所列舉值相差不多於10%。在一些實施例中,當用於提及具體列舉的數值時,“約”意指所述值可以與所列舉值相差不多於1%。例如,如本文所用,表述“約100”揭示包括99和101以及它們之間的所有值(例如,99.1、99.2、99.3、99.4等)的實施例。
單位、前綴和符號以其國際單位制(SI)認可的形式表示。數值範圍包括限定所述範圍的數位。在列舉值的範圍的情況下,應理解,在該範圍所列舉的上限與下限之間的每個中間整數值及其每個分數,以及此類值之間的每個子範圍也被明確揭示。任何範圍的上限和下限可獨立地包括在所述範圍中或從所述範圍中排除,並且其中包括任一個限值、不包括任一限值或包括兩個限值的每個範圍也包含在本揭示文本中。在明確列舉值的情況下,應理解,與列舉值大約相同數量或量的值也在本揭示文本的範圍內。在揭示組合的情況下,該組合的要素的每個子組合也被明確揭示,並且在本揭示文本的範圍內。相反,當不同的要素或要素組被單獨公開時,它們的組合也被揭示。當揭示文本的任何要素被公開為具有多個替代方案時,其中每個替代方案被單獨排除或者以與其他替代方案的任何組合排除的該揭示文本的例子也特此被揭示;揭示文本的多於一個要素可以具有此類排除,並且具有此類排除的要素的所有組合特此被揭示。
如此項技術中已知,藉由將一個多肽的胺基酸序列與第二多肽的序列進行比較來確定兩個多肽之間的“序列同一性”。當本文討論時,任何特定多肽是否與另一多肽至少約50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%相同,可以使用此項技術中已知的方法和電腦程式/軟體來確定,如但不限於BESTFIT程式(Wisconsin Sequence Analysis Package,Unix的版本8,Genetics Computer Group,University Research Park,575 Science Drive,麥迪森市,威斯康辛州53711)。BESTFIT使用Smith和Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981)的局部同源性演算法,找到兩個序列之間的最佳同源性片段。當使用BESTFIT或任何其他序列比對程式來確定特定序列是否與根據本揭示文本的參考序列例如95%相同時,當然設置參數,使得在參考多肽序列的全長上計算同一性百分比,並且允許參考序列中胺基酸總數的高達5%的同源性空位。適用於確定序列同一性和序列相似性百分比的演算法的其他非限制性例子是BLAST和BLAST 2.0演算法,其分別描述於Altschul等人, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997)和Altschul等人, J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)中。BLAST和BLAST 2.0可以以本文所述參數用於確定核酸和蛋白質的序列同一性百分比。如此項技術中已知,用於進行BLAST分析的軟體是可藉由國家生物技術資訊中心(NCBI)公開獲得的。這種演算法涉及首先藉由鑑定詢問序列中長度W的短字碼來鑑定高評分序列對(HSP),所述短字碼在與資料庫序列中相同長度的字碼比對時,匹配或符合一定的正值閾值得分T。T被稱為相鄰字碼得分閾值(Altschul等人, 同上)。這些初始相鄰字碼命中作為種子用於活化搜索以發現含有它們的較長HSP。所述字碼命中沿每個序列在兩個方向上延伸,持續至累積比對得分無法增加為止。對於核苷酸序列,累積得分是使用參數M(一對匹配殘基的獎勵得分;始終> 0)和N(失配殘基的罰分;始終< 0)來計算的。對於胺基酸序列,使用評分矩陣來計算累積得分。在出現以下情況時,停止每個方向上字碼命中的延伸:累積比對得分從其最大獲得值下降量X時;由於一個或多個負評分殘基比對的積累,累積得分降至零或更低;或者到達任一序列的末端。BLAST演算法參數W、T和X決定了比對的靈敏度和速度。在某些實施例中,使用NCBI BLASTN或BLASTP程式來比對序列。在某些實施例中,BLASTN或BLASTP程式使用NCBI使用的預設值。在某些實施例中,BLASTN程式(用於核苷酸序列)使用以下作為預設值:字長(W)為28;期望閾值(E)為10;查詢範圍內的最大匹配設置為0;匹配/失配得分為1、-2;線性空位罰分;使用低複雜度區域的篩檢程式;和唯一使用的查閱資料表的遮罩。在某些實施例中,BLASTP程式(用於胺基酸序列)使用以下作為預設值:字長(W)為3;期望閾值(E)為10;查詢範圍內的最大匹配設置為0;BLOSUM62矩陣(參見Henikoff和Henikoff, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89: 10915 (1992));存在的空位罰分:11,以及延伸:1;和條件組合分數矩陣調整。2. 嵌合蛋白
“融合”或“嵌合”多肽或蛋白包含與第二胺基酸序列連接的第一胺基酸序列,所述第一胺基酸序列與所述第二胺基酸序列在自然界中並非天然地連接。可以使通常存在於單獨蛋白質中的胺基酸序列在融合多肽中聚在一起,或者可以將通常存在於相同蛋白質中的胺基酸序列以新排列置於融合多肽中,例如,因子VIII結構域與Ig Fc結構域的融合。融合蛋白是例如藉由化學合成或藉由產生和翻譯其中以所需關係編碼肽區域的多核苷酸來產生。嵌合多肽還可以包含藉由共價非肽鍵或非共價鍵與第一胺基酸序列締合的第二胺基酸序列。在某些實施例中,嵌合蛋白是包含FVIII蛋白和Fc區的嵌合蛋白。例如,嵌合蛋白可以包含融合至Fc二聚體的多肽鏈之一的一種FVIII蛋白。在一些實施例中,嵌合蛋白包含直接融合至Fc二聚體的多肽鏈之一的N末端的一種FVIII蛋白。在一些實施例中,FVIII蛋白是融合至Fc二聚體的唯一蛋白。在一些實施例中,嵌合蛋白包含直接融合至Fc二聚體的多肽鏈之一的C末端的一種FVIII蛋白。在一些實施例中,嵌合蛋白包含重組B結構域缺失的人FVIII(BDD-rFVIII)融合至人IgG1的二聚Fc結構域的一條多肽鏈的單分子或由其組成,沒有插入連接子序列。參見例如,美國專利號9,050,318和9,241,978,其藉由引用以其整體特此併入本文。在各種實施例中,嵌合蛋白是rFVIIIFc。在各種實施例中,rFVIIIFc是稱為ELOCTA®
或ELOCTATE®
的rFVIIIFc。rFVIIIFc詳細揭露於例如美國專利申請案公開號2018/0360982 A1以及美國專利號9,050,318和9,241,978中,所述文獻引用以其整體併入本文。
在一些實施例中,rFVIIIFc包含根據SEQ ID NO: 1的胺基酸序列。在一些實施例中,rFVIIIFc包含根據SEQ ID NO: 1的胺基酸1-1665的胺基酸序列。在一些實施例中,rFVIIIFc包含根據SEQ ID NO: 5的胺基酸序列。在一些實施例中,嵌合多肽的FVIII部分包含與根據SEQ ID NO: 2的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列,並且嵌合多肽的Fc部分包含與根據SEQ ID NO: 5的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列。在一些實施例中,嵌合多肽的FVIII部分包含與SEQ ID NO: 2相同的胺基酸序列,並且嵌合多肽的Fc部分包含與SEQ ID NO: 5相同的胺基酸序列。
在一些實施例中,嵌合多肽包含第一多肽鏈和第二多肽鏈,其中所述第一多肽鏈包含FVIII部分和第一Fc部分,並且其中所述第二多肽鏈包含第二Fc部分。在一些實施例中,第二多肽由第二Fc部分組成。在一些實施例中,第一Fc部分具有與第二Fc部分相同的胺基酸序列。在一些實施例中,第一多肽鏈包含FVIII部分和Fc部分,其中所述FVIII部分融合至Fc部分的N末端。在一些實施例中,第一多肽鏈包含FVIII部分和Fc部分,其中所述FVIII部分融合至Fc部分的C末端。
在一些實施例中,嵌合多肽包含第一多肽鏈和第二多肽鏈,其中所述第一多肽鏈包含FVIII部分和第一Fc部分,並且其中所述第二多肽鏈包含第二Fc部分,其中所述第一Fc部分和所述第二Fc部分藉由共價鍵彼此締合。在一些實施例中,第一多肽鏈藉由雙硫鍵與第二多肽鏈共價結合。在一些實施例中,第一多肽鏈藉由Fc部分的鉸鏈區中的兩個雙硫鍵與第二多肽鏈共價結合。
在一些實施例中,嵌合多肽包含第一多肽鏈和第二多肽鏈,其中所述第一多肽鏈包含FVIII部分和第一Fc部分,並且其中所述第二多肽鏈包含第二Fc部分,其中所述FVIII部分包含與根據SEQ ID NO: 2的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列,並且嵌合多肽的Fc部分包含與根據SEQ ID NO: 5的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列,並且其中所述第二Fc部分包含與根據SEQ ID NO: 5的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列。
在一些實施例中,嵌合蛋白是efmoroctocog alfa。
在一些實施例中,嵌合蛋白包含第一多肽鏈和第二多肽鏈,所述第一多肽鏈包含與根據SEQ ID NO: 5的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列,並且所述第二多肽鏈包含與根據SEQ ID NO: 4的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列。在一些實施例中,嵌合蛋白包含第一多肽鏈和第二多肽鏈,所述第一多肽鏈包含與SEQ ID NO: 5相同的胺基酸序列,並且所述第二多肽鏈包含與SEQ ID NO: 4相同的胺基酸序列。在一些實施例中,嵌合蛋白不包含VWF或其片段、變異體或突變體。
哺乳動物細胞分泌的某些蛋白質與分泌信號肽締合,一旦開始將生長中的蛋白質鏈穿過糙面內質網輸出,就從成熟蛋白質裂解所述分泌信號肽。一般技術者知道,信號肽通常融合至多肽的N末端,並且通常從完整或“全長”多肽裂解以產生多肽的分泌或“成熟”形式。在某些實施例中,天然信號肽或所述序列的功能衍生物保留引導與其可操作地締合的多肽分泌的能力。可替代地,可以使用異源哺乳動物信號肽,例如人組織型纖溶酶原活化物(TPA)或小鼠β-葡糖醛酸糖苷酶信號肽,或其功能衍生物。
在一些實施例中,嵌合蛋白已由一個或多個哺乳動物細胞產生。在一些實施例中,嵌合蛋白已由一個或多個人細胞產生。在一些實施例中,嵌合蛋白已由人胚胎腎293(HEK293)細胞產生。
除非另外指定,否則如本文所用的“因子VIII”(在本申請案通篇中縮寫為“FVIII”)意指在凝血中具有其正常作用的功能性FVIII多肽。因此,術語FVIII包括功能性變異體多肽。“FVIII蛋白”可與“FVIII多肽”或“FVIII”互換使用。FVIII功能的例子包括但不限於活化凝血的能力、作為因子IX的輔因子作用的能力、或在Ca2+
和磷脂存在下與因子IX形成因子X酶(tenase)複合物的能力,然後所述複合物將因子X轉化為活化形式Xa。在某些實施例中,FVIII蛋白可以是人、非人靈長類、豬、犬、大鼠或鼠FVIII蛋白。在某些實施例中,FVIII蛋白是人FVIII蛋白。在某些實施例中,FVIII蛋白源自人FVIII蛋白。可能源自人FVIII蛋白的FVIII蛋白的非限制性例子揭示於本文中,並包括FVIII B結構域部分或全部缺失的FVIII蛋白,以及在FVIII B結構域中具有突變使得FVIII蛋白不被凝血酶裂解或具有與回應野生型FVIII蛋白相比減少的凝血酶裂解的FVIII蛋白。另外,來自人和其他物種的FVIII之間的比較已鑑定出可能為功能所需的保守殘基(Cameron等人, Thromb. Haemost. 79:317-22 (1998);US 6,251,632)。全長多肽和多核苷酸序列是已知的,許多功能片段、突變體和經修飾形式也是已知的。多個FVIII胺基酸和核苷酸序列揭露於例如以下文獻中:美國公開號2015/0158929 A1、2014/0308280 A1和2014/0370035 A1以及國際公開號WO 2015/106052 A1,所述文獻各自藉由引用以其整體併入本文。在各種實施例中,FVIII蛋白是人FVIII蛋白或其功能變異體。FVIII多肽包括例如全長FVIII、在N末端處缺少Met的全長FVIII、成熟FVIII(缺少信號序列)、在N末端處具有另外的Met的成熟FVIII和/或完全或部分缺失B結構域的FVIII。FVIII變異體包括B結構域缺失,其為部分或完全缺失。
在一些實施例中,本揭示文本的嵌合蛋白或組成物的FVIII包含B結構域缺失的FVIII。如本文所用,FVIII的“B結構域”與此項技術中已知的依據內部胺基酸序列同一性和凝血酶的蛋白質水解裂解位點定義的B結構域相同例如,成熟人FVIII的殘基Ser741-Arg1648。其他人FVIII結構域是相對於成熟人FVIII,藉由以下胺基酸殘基來定義:成熟FVIII的A1,殘基Ala1-Arg372;A2,殘基Ser373-Arg740;A3,殘基Ser1690-Ile2032;C1,殘基Arg2033-Asn2172;C2,殘基Ser2173-Tyr2332。除非另外指示,否則在不提及任何SEQ ID編號的情況下,本文中使用的序列殘基編號對應於不含信號肽序列(19個胺基酸)的FVIII序列。A3-C1-C2序列(也稱為FVIII重鏈)包括殘基Ser1690-Tyr2332。其餘序列(殘基Glu1649-Arg1689)通常被稱為FVIII輕鏈活化肽,或簡稱為FVIII輕鏈。例如豬、小鼠和犬FVIII的所有結構域(包括B結構域)的邊界的位置也是此項技術中已知的。在某些實施例中,FVIII的B結構域缺失(“B結構域缺失的FVIII”或“BDD FVIII”)。BDD FVIII的例子是REFACTO®(重組BDD FVIII)。
在一些實施例中,B結構域缺失的FVIII可以具有以下文獻中揭露的全部或部分缺失:美國專利6,316,226、6,346,513、7,041,635、5,789,203、6,060,447、5,595,886、6,228,620、5,972,885、6,048,720、5,543,502、5,610,278、5,171,844、5,112,950、4,868,112、6,458,563或國際公開號WO 2015106052 A1(PCT/US2015/010738)。在一些實施例中,B結構域缺失的FVIII具有大部分B結構域的缺失,但仍含有B結構域的胺基末端序列,所述胺基末端序列是將初級翻譯產物在體內蛋白質水解加工為兩條多肽鏈所必需的,如WO 91/09122中所揭露。在一些實施例中,B結構域缺失的FVIII構建為具有胺基酸747-1638的缺失,即實際上完全缺失B結構域。Hoeben R.C.等人J. Biol. Chem.
265 (13): 7318-7323 (1990)。B結構域缺失的因子VIII還可以含有FVIII的胺基酸771-1666或胺基酸868-1562的缺失。Meulien P.等人Protein Eng.
2(4): 301-6 (1988)。可能是某些實施例的一部分的另外的B結構域缺失包括:胺基酸982至1562或760至1639(Toole等人, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A
. (1986) 83, 5939-5942)、797至1562(Eaton等人Biochemistry
(1986) 25:8343-8347)、741至1646(Kaufman(PCT公開的申請案號WO 87/04187))、747-1560(Sarver等人, DNA
(1987) 6:553-564)、741至1648(Pasek(PCT申請案號88/00831))或816至1598或741至1648(Lagner(Behring Inst. Mitt. (1988) No 82:16-25, EP 295597))的缺失。
在一些實施例中,BDD FVIII包括含有B結構域的片段的FVIII多肽,所述片段保留一個或多個N連接醣基化位點,例如對應於全長FVIII序列的胺基酸序列的殘基757、784、828、900、963或任選地943。B結構域片段的例子包括B結構域的226個胺基酸或163個胺基酸,如以下文獻中所揭露:Miao, H.Z.等人, Blood
103(a): 3412-3419 (2004),Kasuda, A等人, J
.Thromb. Haemost
. 6: 1352-1359 (2008)和Pipe, S.W.等人, J. Thromb. Haemost
. 9: 2235-2242 (2011)(即,保留B結構域的前226個胺基酸或163個胺基酸)。在某些實施例中,BDD FVIII還包含在殘基309處的點突變(從Phe至Ser)以改良BDD FVIII蛋白的表現。參見Miao, H.Z.等人, Blood 103(a): 3412-3419 (2004)。在各種實施例中,BDD FVIII包括含有B結構域的一部分,但是不含一個或多個弗林蛋白酶(furin)裂解位點(例如,Arg1313和Arg 1648)的FVIII多肽。參見Pipe, S.W.等人, J. Thromb. Haemost
. 9: 2235-2242 (2011)。在一些實施例中,BDD FVIII包含含有對應於成熟全長FVIII的胺基酸765至1652中的缺失的單鏈FVIII(也稱為rFVIII-SingleChain和AFSTYLA®)。參見美國專利號7,041,635。可以在任何FVIII序列中產生前述每一種缺失。
許多功能性FVIII變異體是此項技術中已知的。另外,已經在血友病患者體內鑑定出FVIII中的數百種非功能性突變,並且已確定,這些突變對FVIII功能的影響更多歸因於其在FVIII的三維結構內的位置而不是突變的性質(Cutler等人, Hum. Mutat. 19:274-8 (2002)),其藉由引用以其整體併入本文。另外,來自人和其他物種的FVIII之間的比較已鑑定出可能為功能所需的保守殘基(Cameron等人, Thromb. Haemost. 79:317-22 (1998);US 6,251,632,其各自藉由引用以其整體併入本文)。
因子VIII蛋白可以以活性形式作為“經加工的”FVIII或“單鏈”FVIII存在。此類類型的經加工形式和單鏈形式在美國專利公開號2018/0360982 A1中討論,其藉由引用以其整體併入本文。
在一些實施例中,具有因子VIII活性的嵌合多肽包含因子VIII蛋白和第二部分,其中因子VIII蛋白是包含兩條鏈的經加工的因子VIII,第一鏈包含重鏈,並且第二鏈包含輕鏈,其中所述第一鏈和所述第二鏈藉由金屬鍵締合。例如,嵌合多肽的至少約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%或約99%包含作為經加工的因子VIII的因子VIII部分,同時嵌合多肽的其餘部分包含未經加工的因子VIII部分(即單鏈FVIII)。
在一些實施例中,本揭示文本包括具有因子VIII活性的嵌合多肽,其中因子VIII部分是單鏈因子VIII。在一些實施例中,單鏈因子VIII可以含有完整的細胞內加工位點。在一些實施例中,嵌合多肽的因子VIII部分的至少約1%、約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%或約40%是單鏈因子VIII。在另一個實施例中,嵌合多肽的至少約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約95%或約99%包含作為單鏈因子VIII的因子VIII部分,嵌合多肽的其餘部分包含作為經加工的因子VIII的因子VIII部分。在另一個態樣中,單鏈FVIII(scFVIII)不含有細胞內加工位點。例如,scFVIII包含對應於全長因子VIII中的精胺酸1645的胺基酸位置處的取代或突變、對應於精胺酸1648的胺基酸位置處的取代或突變,或對應於精胺酸1645和精胺酸1648的胺基酸位置處的取代或突變。在一些實施例中,在對應於精胺酸1645的胺基酸位置處取代的胺基酸是與在對應於精胺酸1648的胺基酸位置處取代的胺基酸不同的胺基酸。在某些實施例中,取代或突變是從精胺酸到丙胺酸的取代。
在一些實施例中,當藉由顯色測定在體外測量因子VIII活性時,包含單鏈因子VIII的嵌合多肽具有與由兩個Fc部分和經加工的因子VIII(融合至所述兩個Fc部分之一)組成的嵌合多肽相當的水準的因子VIII活性。在一些實施例中,包含單鏈因子VIII的嵌合多肽具有與由兩個Fc部分和經加工的因子VIII(融合至所述兩個Fc部分之一)組成的嵌合多肽相當的體內因子VIII活性。在一些實施例中,包含單鏈因子VIII的嵌合多肽具有與由兩個Fc部分和經加工的因子VIII(融合至所述兩個Fc部分之一)組成的嵌合多肽相當的因子Xa生成率。在某些實施例中,藉由活化的蛋白C使嵌合多肽中的單鏈因子VIII失活,失活的水準與由兩個Fc部分和經加工的因子VIII組成的嵌合多肽中經加工的因子VIII相當。在某些實施例中,嵌合多肽中的單鏈因子VIII具有與由兩個Fc部分和經加工的因子VIII組成的嵌合多肽中的經加工的因子VIII相當的因子IXa相互作用率。在一些實施例中,嵌合多肽中的單鏈因子VIII結合血管性血友病因子的水準與由兩個Fc部分和經加工的因子VIII組成的嵌合多肽中的經加工的因子VIII相當。
本揭示文本包括包含具有因子VIII活性的嵌合多肽的組成物,其中所述多肽的至少約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或約100%包含作為單鏈因子VIII的因子VIII部分和第二部分,其中所述單鏈因子VIII與根據SEQ ID NO: 2的胺基酸序列至少90%、95%、99%相同或相同。在一些實施例中,第二部分可以是Fc。在一些實施例中,所述多肽呈包含第二多肽的雜合體形式,其中所述第二多肽基本上由Fc組成。在一些實施例中,所述多肽的半衰期比由因子VIII組成的多肽長至少1.5至6倍、1.5至5倍、1.5至4倍、1.5至3倍或1.5至2倍。3. 骨質密度
如本文所用,“骨質密度”或“BMD”定義為在特定骨區域中測量的骨礦物質含量。骨骼是具有相對高更新率的動態組織。骨代謝的特徵在於分別由成骨細胞和破骨細胞介導的骨形成與骨吸收之間的平衡。這些骨重塑細胞之間的相互作用是由細胞因子、生長因子和其他蛋白質介導的。
如本文所用,“骨質疏鬆症”是指廣泛認可的疾病,其中骨的密度和品質降低。如本文所用,術語“骨質疏鬆症”涵蓋所有形式的骨質疏鬆症,包括原發性骨質疏鬆症和繼發性骨質疏鬆症兩者。骨質疏鬆症的特徵是BMD嚴重降低,使患者易患骨折和另外的病態。骨質疏鬆症受多種因素的影響,最主要的是年齡、性別和其他疾病的存在。活性氧(ROS)也在破骨細胞形成過程中的細胞內信號傳導中起作用(Domazetovic等人, Clin Cases Miner Bone Metab 2017)。在某些血友病群體中,維生素D缺乏症或維生素D不足也與低BMD相關(Kempton等人, Haemophilia 2015, 21, 568-577)。在一些實施例中,骨質疏鬆症是原發性骨質疏鬆症。在某些實施例中,骨質疏鬆症是繼發性骨質疏鬆症。在各個實施例中,骨質疏鬆症與A型血友病相關。在一些實施例中,骨質疏鬆症是A型血友病的結果或被懷疑是A型血友病的結果。
骨質疏鬆症是最常見的炎性骨質流失病症之一,由免疫系統主動介導(Srivastava RK等人, Front Immunol 2018)。轉錄因子核因子E2相關因子2(NRF2)藉由抗氧化酶上調對破骨細胞形成進行負調節,這種機制被RANKL主動抑制(Kanzaki等人, J Biol Chem 2013)。同樣,NRF2調節的酶血紅素加氧酶-1(HO-1)似乎抑制小鼠中的破骨細胞形成(Florczyk-Soluch等人, Sci Reports 2018)。
在某些實施例中,個體患有維生素D缺乏症。在一些實施例中,認為20奈克/毫升至50 ng/mL的維生素D水準對於健康人是足夠的。在一些實施例中,通常認為低於12 ng/mL的維生素D水準指示維生素D缺乏症。在一些實施例中,維生素D缺乏症是指維生素D水準低於約12 ng/mL。在某些實施例中,個體未患維生素D缺乏症。在一些實施例中,不考慮和/或未知個體的維生素D攝入和/或水準。在一些實施例中,個體中的維生素D水準是未知的。
骨形成的示例性生物標記是骨特異性鹼性磷酸酶、1型前膠原N末端前肽(P1NP)、1型前膠原C末端前肽(P1CP)和骨鈣蛋白。骨吸收的示例性生物標記是血清中的總鹼性磷酸酶、核因子κB的受體活化因子(RANKL)、骨保護素(OPG)、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)、羥離胺酸、羥脯胺酸,去氧吡啶啉(DPD)、吡啶啉(PYD)、骨唾液蛋白、組織蛋白酶K、抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRAP5b)、基質金屬蛋白酶9(MMP9)和1型膠原的C末端和N末端交聯的端肽(分別為CTX-1和NTX-1)。骨形成抑制劑的示例性生物標記是Dickkopf-1(DDK-1)的血清水準和硬化蛋白的血清水準(Rodriguez-Merchan和Valentino, Blood Rev 2019;Kuo和Chen, Biomarker Res 2017)。
在各種實施例中,可以從個體的周邊血液評估骨形成、骨吸收和/或骨損失的一種或多種生物標記。在各種實施例中,可以從個體的尿液評估骨形成、骨吸收和/或骨損失的一種或多種生物標記。在各種實施例中,可以從個體的周邊血液或尿液樣品評估骨形成、骨吸收和/或骨損失的一種或多種生物標記。
例如,可以使用幾種不同測定法中的任一種來實現從周邊血液評估生物標記水準。可以用於確定生物標記水準的測定法的非限制性例子包括高效液相層析法(HPLC)、酶聯免疫吸附測定法(ELISA)、酶免疫測定法、放射免疫測定法和化學發光免疫測定法。在一些實施例中,還可以使用化學分析儀來確定個體樣品中生物標記的水準,所述化學分析儀包括標準的Technico自動分析儀、Roche COBAS Integra 800、Olympus AU 5200分析儀。
在一些實施例中,生物標記是羥脯胺酸。在一些實施例中,從周邊血液評估羥脯胺酸。在一些實施例中,從個體的尿液評估羥脯胺酸。在一些實施例中,從周邊血液或尿液評估羥脯胺酸,並藉由Bergman和Loxley方法(Bergman和Loxley, Analytical Chemistry,
1963)進行分析。
破骨細胞是大型的多核細胞,並且是體內唯一具有骨吸收活性(分解骨組織的能力)的細胞。破骨細胞來源於造血前體(包括單核細胞),需要兩種最小分化因子:RANKL(核因子κB受體活化因子配體)和M-CSF(巨噬細胞集落刺激因子)(Kanzaki H.等人, J Biol Chem 2013)。單核細胞是一種祖細胞,其可以根據所接受的刺激因子分化為巨噬細胞、樹突狀細胞和破骨細胞。
一項最近的研究顯示,與Fc結構域連接的重組FVIII(rFVIIIFc)而不是單獨的重組FVIII,使人單核細胞來源的巨噬細胞偏向M2/Mox樣巨噬細胞調節表型。Kis-Toth等人, Blood Adv., 2(21): 2904-2916 (2018)。然而,目前尚不清楚對血友病中BMD損失機制的詳細瞭解。
在某些實施例中,本文揭示的方法用於治療具有增加的骨折風險的個體。與健康個體相比,血友病患者更容易發生骨折。在一項研究中發現,重度血友病患者罹患骨折的可能性比中度和輕度血友病患者高44%。Gay等人, Br J Haematology. 170:584–593 (2015)。在一些實施例中,個體患有重度血友病。在某些實施例中,個體患有中度血友病。在各個實施例中,個體患有輕度血友病。
如本文所用,術語“骨折風險”定義為基於已知風險因素的骨折可能性的增加。基於已知風險因素的骨折風險可以由臨床醫生和/或藉由標準化工具(如FRAX骨折風險評估工具)來確定。BMD可以被視為骨折風險的風險因素。通常,隨著BMD的降低,骨折的風險會增加。
如本文所用,FRAX是指由謝菲爾德大學開發的骨折風險評估工具。通常參見Kanis, J. A.等人Osteoporosis Int'l. 21.2: 407-413 (2010)。FRAX計算出髖部或骨質疏鬆性骨折的10年概率。FRAX基於年齡、性別、體重、身高、骨折史、髖部骨折家族史、吸煙狀況、糖皮質激素的使用、類風濕關節炎的存在與否、繼發性骨質疏鬆症、酒精攝入和骨質密度來計算骨折風險。一年骨折風險等於十年骨折風險的輸出的10%(即60%的十年骨折風險等於6%的一年骨折風險)。
在某些實施例中,在特定事件(包括出血事件或骨折)之後確定血友病患者的BMD。BMD可以例如藉由雙X射線吸收法(DXA)或雙能量X射線吸收法(DEXA)進行測試。BMD可以測量為克/平方釐米(g/cm2
)。為了分析群體中的BMD,可以將BMD與健康年輕成人的平均“T得分”進行比較。此T得分是患者與一組健康的同性普通年輕成人之間的平均BMD差異,以標準差(SD)來測量。例如,T得分為-1.0或更高(更小負數)可以被認為是正常的。低於-1.0的T得分(更大負數)可以指示骨質減少。低於-2.5的T得分可以被認為指示骨質疏鬆症。BMD測試可以測量髖部或腰椎處的骨質密度。BMD測試還可以測量前臂、手腕、手指或腳後跟處的骨質密度。BMD也可以與平均“Z得分”進行比較。此Z得分是患者與一組健康的、年齡和性別匹配的對照之間的平均BMD差異,以標準差來測量。Z得分可以用於診斷繼發性骨質疏鬆症。低於-2.0的Z得分可以指示低骨質密度。關於包括T得分和Z得分在內的骨密度測定法的其他細節,參見Cummings等人, JAMA 288(15):1889-1897 (2002),其全部內容藉由引用併入本文。
在某些實施例中,T得分用於評估至少20歲的個體的BMD。在某些實施例中,T得分用於評估至少30歲的個體的BMD。在某些實施例中,T得分用於評估至少40歲的個體的BMD。在某些實施例中,T得分用於評估至少50歲的個體的BMD。
在某些實施例中,Z得分用於評估小於30歲的個體的BMD。在某些實施例中,Z得分用於評估小於20歲的個體的BMD。
在一些實施例中,患有A型血友病和低BMD的個體的骨密度比年輕成人均值低1至2.5個標準差之間。在一些實施例中,患有A型血友病和低BMD的個體的骨密度比年輕成人均值低2.5個標準差或更多。在一些實施例中,個體的骨密度小於相同年齡和性別的個體的平均骨密度。在一些實施例中,個體的骨密度比相同年齡和性別的個體的平均骨密度小至少5%、6%、7%、8%、9%或10%。在一些實施例中,個體的骨密度比相同年齡和性別的個體的平均骨密度小至少10%。在一些實施例中,在腰椎處測量BMD。在一些實施例中,在髖部處測量BMD。在一些實施例中,在手臂處測量BMD。在一些實施例中,在腿部處測量BMD。在一些實施例中,在膝蓋處測量BMD。在一些實施例中,在手腕處測量BMD。在一些實施例中,在手指處測量BMD。在一些實施例中,在腳後跟處測量BMD。在一些實施例中,與未患A型血友病的對應個體(或對應個體的群體)相比,具有低BMD的個體在特定部位處具有低10%或15%的BMD。
在一些實施例中,可以使用風險因素將個體鑑定為具有低BMD。低BMD的風險因素包括年齡、性別、種族、血友病性關節病、身體活動減少、慢性病毒感染(例如HIV或HCV)、維生素D缺乏症、低身體質量指數(BMI)和/或低性腺功能症。參見Kempton CL等人Haemophilia 21(5):568-77 (2015)。可以根據此項技術中已知的當前公認的臨床指南和實踐來評價其他風險因素。
如果確定個體具有低BMD,則本文揭示的方法可以用於抑制個體中BMD的降低和/或防止個體中BMD的進一步降低。如果個體當前正在用另一種FVIII替代療法或另一種A型血友病療法進行治療,則可以考慮將治療計畫變為本文揭示的方法,以便抑制個體中BMD的降低和/或防止個體中BMD隨時間推移進一步降低。
如本文揭示的實例中所詳述,將rFVIIIFc投予人巨噬細胞的處理有效地在體外抑制單核細胞來源的破骨細胞的形成和功能。這一發現表明,使用rFVIIIFc的替代療法可能對A型血友病患者的骨骼健康具有潛在的免疫調節益處。雖然確切的機制仍是未知的,並且不受任何科學理論的束縛,但rFVIIIFc可以藉由將血友病患者的免疫環境朝著抗氧化、致耐受性和較少骨質疏鬆的狀態促進,來防止A型血友病患者中BMD的降低。4. 血友病
血友病的三種主要形式為A型血友病(因子VIII缺乏)、血友病B(因子IX缺乏或“克裡斯馬斯病(Christmas disease)”)和血友病C(因子XI缺乏,輕度出血傾向)。其他止血病症包括例如血管性血友病(von Willebrand disease)、因子XI缺乏(PTA缺乏)、因子XII缺乏、纖維蛋白原、凝血酶原、因子V、因子VII、因子X或因子XIII的缺乏或結構異常、GPIb缺陷或缺乏的巨血小板症候群(Bernard-Soulier syndrome)。GPIb(血管性血友病因子(VWF)的受體)可能有缺陷並導致初期凝塊形成(初期止血)不足和出血傾向增加,以及Glanzman和Naegeli的血小板無力(Glanzmann血小板無力症)。在肝功能衰竭(急性和慢性形式)中,肝臟的凝血因子產生不足;這可能增加出血風險。如本文所用,血友病可以按類別分級。例如,可以將其分類為“輕度”、“中度”或“重度”。A型血友病具有三個嚴重程度的等級,是依據FVIII血漿水準定義的:1%(與正常相比)或更低(“重度”)、2%至5%(“中度”)和6%至30%(輕度)。White等人Thromb. Haemost. 85:560 (2001)。
如本文所用,“治療(treat)”、治療(treatment)”、“治療(treating)”是指例如疾病或病症的嚴重程度的降低;病程持續時間的減少;與疾病或病症相關的一種或多種症狀的改善;向患有疾病或病症的個體提供有益作用,但不一定治癒所述疾病或病症;或者預防與疾病或病症相關的一種或多種症狀。在一個態樣中,本文揭示的方法是治療患有A型血友病的個體的方法。在某些實施例中,例如與用rFVIII替代治療的對應個體相比,治療包括減少或預防個體中出血事件的可能性,以及改善個體中的BMD或減慢BMD的降低。在某些實施例中,例如與用rFVIII替代治療的對應個體相比,治療包括降低個體中出血事件的風險以及降低個體中骨折的風險。在某些實施例中,例如與用rFVIII替代治療的對應個體相比,治療包括降低個體中出血事件的嚴重程度以及改善個體中的BMD或減慢BMD的降低。在某些實施例中,例如與用rFVIII替代治療的對應個體相比,治療包括降低個體中出血事件的嚴重程度以及降低個體中骨折的風險。在一些實施例中,治療包括預防性治療。在一些實施例中,治療包括按照需要時治療。
目前可使用幾種針對A型血友病的治療選擇,包括常規的FVIII替代(例如ADVATE®/octocog alfa、AFSTYLA®/lonoctocog alfa NUWIQ®/simoctocog alfa)和延長半衰期FVIII替代療法(例如ELOCTATE®/efmoroctocog alfa、ESPEROCT®/turoctocog alfa pegol和ADYNOVATE®/rurioctocog alfa pegol)。現在也可以使用其他非替代療法,如艾美賽珠單抗。對於綜述,參見Peters和Harris, Nat Rev Drug Disc.(2018);Weyand和Pipe, Blood, 133(5): 389-398 (2019)。尚不知道如octocog alfa、lonoctocog alfa、simoctocog alfa、turoctocog alfa和rurioctocog alfa pegol的治療對BMD和骨質疏鬆症的影響。
本文提供的資料表明,使用rFVIIIFc進行治療可以藉由抑制BMD隨時間推移的損失而為A型血友病患者提供另外的骨保護益處。僅使用rFVIII進行治療未觀察到這些骨健康益處,表明這些益處是rFVIIIFc獨有的,最可能是由於嵌合蛋白上存在Fc結構域所致。因此,對於具有低BMD、骨質疏鬆症和/或增加的骨折風險的A型血友病個體來說,rFVIIIFc可能是優秀的治療選擇。此外,由於BMD降低是一種進行性疾病,並且在患有A型血友病的個體中在年輕時就開始,因此對於處於發展或具有低BMD的風險中的任何A型血友病個體來說,rFVIIIFc可能是優秀的治療選擇。
在各種實施例中,患有A型血友病的個體使用rFVIIIFc以外的治療時具有足夠的凝血,但具有低BMD、骨質疏鬆症和/或增加的骨折風險。在一些實施例中,患有A型血友病的個體使用包含rFVIII和半衰期延長部分(如白蛋白或聚乙二醇)的融合蛋白時具有足夠的凝血,但具有低BMD、骨質疏鬆症和/或增加的骨折風險。在一些實施例中,患有A型血友病的個體使用rFVIII時具有足夠的凝血,但具有低BMD、骨質疏鬆症和/或增加的骨折風險。在某些實施例中,患有A型血友病的個體使用促凝血雙特異性抗體(例如,結合因子IX和因子X的雙特異性抗體,如艾美賽珠單抗或艾美賽珠單抗-kxwh)時具有足夠的凝血,但具有低BMD、骨質疏鬆症和/或增加的骨折風險。在一些實施例中,個體患有骨質減少。在一些實施例中,個體患有骨質疏鬆症。在一些實施例中,個體具有增加的骨折風險。
在各種實施例中,患有A型血友病的個體中足夠的凝血是劑量之間至少1%、2%、3%、4%或至少5%的FVIII活性。例如,在一些實施例中,劑量之間的FVIII活性不會降低至劑量之間小於1%、2%、3%、4%或5%。在某些實施例中,用活化部分促凝血酶原激酶時間(aPTT)測定法測量FVIII活性。在各種實施例中,患有A型血友病的個體中足夠的凝血是等於或小於5次出血的年化出血率(ABR)。在各種實施例中,患有A型血友病的個體中足夠的凝血是等於或小於4次出血的ABR。在各種實施例中,患有A型血友病的個體中足夠的凝血是等於或小於3次出血的ABR。在各種實施例中,患有A型血友病的個體中足夠的凝血是等於或小於2次出血的ABR。在各種實施例中,患有A型血友病的個體中足夠的凝血是等於或小於1次出血的ABR。在某些實施例中,用顯色測定測量FVIII活性。在各種實施例中,患有A型血友病的個體中足夠的凝血是小於5次出血的年化出血率(ABR)。在各種實施例中,患有A型血友病的個體中足夠的凝血是小於4次出血的ABR。在各種實施例中,患有A型血友病的個體中足夠的凝血是小於3次出血的ABR。在各種實施例中,患有A型血友病的個體中足夠的凝血是小於2次出血的ABR。在各種實施例中,患有A型血友病的個體中足夠的凝血是小於1次出血的ABR。
如本文所用,術語“預防性治療”是指投予用於治療血友病的療法,其中這種治療旨在預防血友病的一種或多種症狀(例如出血事件,例如一種或多種自發性出血事件和/或關節損傷)或降低其嚴重程度。參見Jimenez-Yuste等人, Blood Transfus. 12(3):314-19 (2014)。為了預防此類症狀(例如,出血事件和關節疾病的進展)或降低其嚴重程度,A型血友病患者可以接受定期輸注凝血因子作為預防性治療方案的一部分。這種預防性治療的基礎是以下觀察結果:與患有嚴重血友病的患者相比,凝血因子水準(例如FVIII水準)為1%或更高的血友病患者很少經歷自發性出血事件,並且具有更少的血友病相關共病。參見例如,Coppola A等人, Semin. Thromb. Hemost. 38(1): 79-94 (2012)。治療這些血友病患者的衛生保健從業者推測,藉由定期輸液將因子水準保持在1%左右可能會降低血友病症狀(包括出血事件和關節損傷)的風險。參見同前。隨後的研究已經在接受使用凝血因子的預防性治療的兒科血友病患者中證實了這些益處,從而使預防性治療成為患有重度血友病的人的目標。參見 同前。
“預防性”治療還可以指向個體預先投予本文所述的組成物(例如嵌合多肽),以便控制、管理、預防A型血友病的一種或多種症狀(例如,出血事件)降低其發生率或嚴重程度。使用凝血因子(例如,FVIII)的預防性治療是對患有重度A型血友病的個體的護理標準。參見例如,Oldenburg, Blood 125:2038-44 (2015)。在一些實施例中,預防性治療是指向有需要的個體投予本文揭示的組成物以降低A型血友病的一種或多種症狀的發生率。預防性治療可以包括投予多劑量。預防性治療中使用的多劑量通常以特定的投予間隔投予。在某些實施例中,年化出血率可以降低至小於或等於10、小於或等於9、小於或等於8、小於或等於7、小於或等於6、小於或等於5、小於或等於4、小於或等於3、小於或等於2或者小於或等於1。在某些實施例中,年化出血率可以降低至小於10、小於9、小於8、小於7、小於6、小於5、小於4、小於3、小於2或小於1。
術語“按照需要時(on-demand)治療”或“間歇治療”是指回應於A型血友病的症狀(例如,出血事件)或在可能引起出血的活動之前“按照需要時”投予嵌合分子。在一個態樣中,可以在出血開始時(如在損傷後)或在預期要出血時(如在手術前),投予個體按照需要時治療。在一個態樣中,可以在增加出血風險的活動(如接觸運動)之前投予按照需要時治療。在一些實施例中,按照需要時治療作為單劑量投予。在一些實施例中,按照需要時治療作為第一劑量和隨後的一個或多個另外的劑量投予。當按照需要時投予嵌合多肽時,可以在第一劑量後至少約12小時、至少約24小時、至少約36小時、至少約48小時、至少約60小時、至少約72小時、至少約84小時、至少約96小時、至少約108小時或至少約120小時投予所述一個或多個另外的劑量。然而,應注意,與按照需要時治療相關的投予間隔與用於預防性治療的投予間隔是不同的。
如本文所用,術語“劑量”是指將組成物單次投予個體。單劑量可以全部一次(例如,作為推注)投予,或在一段時間內(例如藉由靜脈內輸注)投予。術語“多劑量”意指多於一個劑量,例如多於一次投予。當提及多於一種組成物的共投予時,可以將一定劑量的組成物A與一定劑量的組成物B同時投予。可替代地,可以在一定劑量的組成物B之前或之後投予一定劑量的組成物A。在一些實施例中,將組成物A和組成物B組合成單一配製物。
在某些實施例中,“劑量”是指嵌合蛋白的治療有效量。在某些實施例中,劑量是指rFVIIIFc的治療有效量。在某些實施例中,rFVIIIFc的治療有效量為約10 IU/Kg至約300 IU/kg。在一些實施例中,rFVIIIFc的治療有效量為約20 IU/Kg至約300 IU/kg。在一些實施例中,rFVIIIFc的治療有效量為約20 IU/kg至約250 IU/kg、約20 IU/kg至約200 IU/kg、約20 IU/kg至約190 IU/kg、約20 IU/kg至約180 IU/kg、約20 IU/kg至約170 IU/kg、約20 IU/kg至約160 IU/kg、約20 IU/kg至約150 IU/kg、約20 IU/kg至約140 IU/kg、約20 IU/kg至約130 IU/kg、約20 IU/kg至約120 IU/kg、約20 IU/kg至約110 IU/kg、約20 IU/kg至約100 IU/kg、約20 IU/kg至約90 IU/kg、約20 IU/kg至約80 IU/kg、約20 IU/kg至約70 IU/kg、約20 IU/kg至約60 IU/kg、約25 IU/kg至約100 IU/kg、約25 IU/kg至約90 IU/kg、約25 IU/kg至約80 IU/kg、約25 IU/kg至約70 IU/kg、約25 IU/kg至約65 IU/kg。在一個實施例中,rFVIIIFc的治療有效量為約20 IU/kg至約100 IU/kg。在一些實施例中,rFVIIIFc的治療有效量為約25 IU/kg至約65 IU/kg。在一些實施例中,rFVIIIFc的治療有效量為約20 IU/kg至約100 IU/kg、約30 IU/kg至約100 IU/kg、約40 IU/kg至約100 IU/kg、約50 IU/kg至約100 IU/kg、約60 IU/kg至約100 IU/kg、約70 IU/kg至約100 IU/kg、約80 IU/kg至約100 IU/kg、約90 IU/kg至約100 IU/kg、約20 IU/kg至約90 IU/kg、約20 IU/kg至約80 IU/kg、約20 IU/kg至約70 IU/kg、約20 IU/kg至約60 IU/kg、約20 IU/kg至約50 IU/kg、約20 IU/kg至約40 IU/kg或約20 IU/kg至約30 IU/kg。
在其他實施例中,rFVIIIFc的治療有效量為約10 IU/kg、約15 IU/kg、約20 IU/kg、約25 IU/kg、約30 IU/kg、約35 IU/kg、約40 IU/kg、約45 IU/kg、約50 IU/kg、約55 IU/kg、約60 IU/kg、約65 IU/kg、約70 IU/kg、約75 IU/kg、約80 IU/kg、約85 IU/kg、約90 IU/kg、約95 IU/kg、約100 IU/kg、約105 IU/kg、約110 IU/kg、約115 IU/kg、約120 IU/kg、約125 IU/kg、約130 IU/kg、約135 IU/kg、約140 IU/kg、約145 IU/kg、約150 IU/kg、約155 IU/kg、約160 IU/kg、約165 IU/kg、約170 IU/kg、約175 IU/kg、約180 IU/kg、約185 IU/kg、約190 IU/kg、約195 IU/kg、約200 IU/kg、約225 IU/kg、約250 IU/kg、約275 IU/kg或約300 IU/kg。在一個實施例中,rFVIIIFc的治療有效量為約50 IU/kg。在另一個實施例中,rFVIIIFc的治療有效量為約100 IU/kg。在另一個實施例中,rFVIIIFc的治療有效量為約200 IU/kg。
如本文所用,術語“間隔”或“投予間隔”是指在投予個體的組成物A的第一劑量與同一組成物的隨後劑量之間經過的時間量。投予間隔可以是指在第一劑量與第二劑量之間經過的時間,或者投予間隔可以是指在多劑量之間經過的時間量。
如本文所用的術語“投予頻率”是指每個特定投予間隔投予的劑量數。例如,投予頻率可以寫為一週一次、每兩週一次等。因此,也可以將7天的投予間隔寫為7天中一次或每週一次或一週一次的投予間隔。
在一些實施例中,嵌合蛋白是rFVIIIFc,並以約兩天、約三天、約四天、約五天、約六天、約七天、約八天、約九天、約十天、約11天、約12天、約13天、約14天、約15天、約16天、約17天、約18天、約19天、約20天、約21天、約22天、約23天或約24天的投予間隔投予個體。在一些實施例中,以約25天、約26天、約27天、約28天、約29天、約30天、約45天或約60天的投予間隔向人投予rFVIIIFc。
在一些實施例中,以約1至約14天、約1至約13天、約1至約12天、約1至約11天、約1至約10天、約1至約9天、約1至約8天、約1至約7天、約1至約6天、約1至約5天、約1至約4天、約1至約3天、約1至約2天、約2至約14天、約3至約14天、約4至約14天、約5至約14天、約6至約14天、約7至約14天、約8至約14天、約9至約14天、約10至約14天、約11至約14天、約12至約14天、約13至約14天或約5至約10天的投予間隔投予rFVIIIFc。在其他實施例中,以約1至約21天、約1至約20天、約1至約19天、約1至約18天、約1至約17天、約1至約16天、約1至約15天、約1至約14天、約1至約13天、約1至約12天、約1至約11天、約1至約10天、約1至約9天、約1至約8天、約1至約7天、約1至約6天、約1至約5天、約1至約4天、約1至約3天、約1至約2天、約2至約21天、約3至約21天、約4至約21天、約5至約21天、約6至約21天、約7至約21天、約8至約21天、約9至約21天、約10至約21天、約11至約21天、約12至約21天、約13至約21天、約14至約21天、約15至約21天、約16至約21天、約17至約21天、約18至約21天、約19至約21天、約20至約21天、約5至約10天、約10至約15天、約15至約20天的投予間隔投予rFVIIIFc。在一些實施例中,以約2至約6天的投予間隔投予rFVIIIFc。在一些實施例中,以約3至約5天的投予間隔投予rFVIIIFc。
在各種實施例中,rFVIIIFc的治療有效量為25-65 IU/kg(25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、62、64或65 IU/kg),並且投予間隔為每3-5、3-6、3-7、3、4、5、6、7或8天或更多天一次,或每週三次,或每週不超過三次。在一些實施例中,rFVIIIFc的治療有效量為65 IU/kg,並且投予間隔為每週一次或每6-7天一次。只要有必要,可以重複投予劑量(例如,至少10、20、28、30、40、50、52或57周,至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10年)。在各種實施例中,rFVIIIFc的治療有效量為約25-65 IU/kg,並且投予間隔為每3-5天一次。5. 方法 方法
本揭示文本的一態樣是治療患有血友病和低BMD的個體的方法。所述方法包括選擇患有A型血友病和低BMD的個體,並且投予個體治療有效量之包含重組FVIII蛋白和Fc結構域的嵌合蛋白(rFVIIIFc),其中所述嵌合蛋白的投予在個體中抑制BMD的降低。在一些實施例中,Fc結構域是IgG1。在一些實施例中,Fc結構域是人IgG1的Fc結構域。在一些實施例中,嵌合蛋白是rFVIIIFc。
類似地,本揭示文本的一個態樣是包含重組FVIII蛋白和Fc結構域的嵌合蛋白,用於治療患有A型血友病和低BMD的個體。
在某些實施例中,嵌合蛋白包含與根據SEQ ID NO: 1的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列。在某些實施例中,嵌合蛋白包含與根據SEQ ID NO: 1的胺基酸序列至少99%相同的胺基酸序列。在某些實施例中,嵌合蛋白包含與SEQ ID NO: 1 100%相同的胺基酸序列。
在某些實施例中,嵌合蛋白包含與根據SEQ ID NO: 2的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列。在某些實施例中,嵌合蛋白包含與根據SEQ ID NO: 2的胺基酸序列至少99%相同的胺基酸序列。在某些實施例中,嵌合蛋白包含與SEQ ID NO: 2 100%相同的胺基酸序列。
在某些實施例中,嵌合蛋白包含與SEQ ID NO: 5 100%相同的胺基酸序列。
在某些實施例中,以每3-5天25-65 IU/kg的劑量投予嵌合蛋白。
在某些實施例中,藉由雙X射線吸收法(DXA)測量個體中的BMD。
在某些實施例中,個體是50歲或更大。
在某些實施例中,個體小於50歲。
在某些實施例中,個體中的BMD由T得分確定。在某些實施例中,個體中的BMD由T得分確定。在某些實施例中,個體是50歲或更大,並且個體中的BMD由T得分確定。
在某些實施例中,如果個體的T得分小於-1.0,則確定所述個體具有低BMD。在某些實施例中,如果個體的T得分在-1.0至-2.4之間,則確所述定個體具有低BMD和骨質減少。在某些實施例中,如果個體的T得分小於-2.5,則確定所述個體具有低BMD和骨質疏鬆症。
在某些實施例中,個體中的BMD由Z得分確定。在某些實施例中,個體小於50歲,並且個體中的BMD由Z得分確定。
在某些實施例中,如果個體的Z得分小於-2.0,則確定所述個體具有低BMD。
在某些實施例中,基於骨形成、骨吸收和/或骨損失的一種或多種生物標記的水準,預測個體具有低BMD。
在某些實施例中,從個體的周邊血液或尿液評估生物標記。
在某些實施例中,骨形成的一種或多種生物標記選自骨特異性鹼性磷酸酶、1型前膠原N末端前肽(P1NP)、1型前膠原C末端前肽(P1CP)、骨鈣蛋白及其任何組合。
在某些實施例中,骨吸收的一種或多種生物標記選自血清中的總鹼性磷酸酶、核因子κB的受體活化因子(RANKL)、骨保護素(OPG)、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)、羥離胺酸、羥脯胺酸,去氧吡啶啉(DPD)、吡啶啉(PYD)、骨唾液蛋白、組織蛋白酶K、抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRAP5b)、基質金屬蛋白酶9(MMP9)、1型膠原的C末端交聯的端肽(CTX-1)、1型膠原的N末端交聯的端肽(NTX-1)及其任何組合。
本揭示文本的一態樣是治療患有A型血友病和增加的骨折風險的個體的方法。所述方法包括:(i) 選擇患有A型血友病和增加的骨折風險的個體,並且 (ii) 投予個體治療有效量之包含重組FVIII蛋白和Fc結構域的嵌合蛋白,其中所述嵌合蛋白的投予在個體中降低骨折風險。
在某些實施例中,嵌合蛋白包含與根據SEQ ID NO: 1的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列。在某些實施例中,嵌合蛋白包含與根據SEQ ID NO: 1的胺基酸序列至少99%相同的胺基酸序列。在某些實施例中,嵌合蛋白包含與SEQ ID NO: 1 100%相同的胺基酸序列。
在某些實施例中,嵌合蛋白包含與根據SEQ ID NO: 2的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列。在某些實施例中,嵌合蛋白包含與根據SEQ ID NO: 2的胺基酸序列至少99%相同的胺基酸序列。在某些實施例中,嵌合蛋白包含與SEQ ID NO: 2 100%相同的胺基酸序列。
在某些實施例中,嵌合蛋白包含與根據SEQ ID NO: 5的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列。在某些實施例中,嵌合蛋白包含與根據SEQ ID NO: 5的胺基酸序列至少99%相同的胺基酸序列。在某些實施例中,嵌合蛋白包含與SEQ ID NO: 5 100%相同的胺基酸序列。
在某些實施例中,以每3-5天25-65 IU/kg的劑量投予嵌合蛋白。
在某些實施例中,藉由骨折風險評估工具(FRAX)來確定個體中骨折的風險。
在某些實施例中,藉由評估低BMD風險因素來確定個體中骨折的風險。在某些實施例中,低BMD風險因素選自關節病、身體活動減少、HIV或HCV感染、維生素D缺乏症、低身體質量指數(BMI)、低性腺功能症及其任何組合。
本揭示文本的一態樣是在個體中減少骨質密度(BMD)損失率的方法。所述方法包括:(i) 選擇具有低BMD的個體;並且 (ii) 投予個體治療有效量的包含凝血因子和Fc結構域的嵌合蛋白,使得所述嵌合蛋白的投予在個體中減少BMD損失率。
在某些實施例中,嵌合蛋白包含與根據SEQ ID NO: 1的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列。在某些實施例中,嵌合蛋白包含與根據SEQ ID NO: 1的胺基酸序列至少99%相同的胺基酸序列。在某些實施例中,嵌合蛋白包含與SEQ ID NO: 1 100%相同的胺基酸序列。
在某些實施例中,嵌合蛋白包含與根據SEQ ID NO: 2的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列。在某些實施例中,嵌合蛋白包含與根據SEQ ID NO: 2的胺基酸序列至少99%相同的胺基酸序列。在某些實施例中,嵌合蛋白包含與SEQ ID NO: 2 100%相同的胺基酸序列。
在某些實施例中,嵌合蛋白包含與根據SEQ ID NO: 5的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列。在某些實施例中,嵌合蛋白包含與根據SEQ ID NO: 5的胺基酸序列至少99%相同的胺基酸序列。在某些實施例中,嵌合蛋白包含與SEQ ID NO: 5 100%相同的胺基酸序列。
在某些實施例中,以每3-5天25-65 IU/kg的劑量投予嵌合蛋白。
本揭示文本的一態樣是治療患有血友病和骨折的個體的方法。所述方法包括選擇患有血友病和骨折的個體,並且投予個體治療有效量之包含重組FVIII蛋白和Fc結構域的嵌合蛋白。
在某些實施例中,嵌合蛋白包含與根據SEQ ID NO: 1的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列。在某些實施例中,嵌合蛋白包含與根據SEQ ID NO: 1的胺基酸序列至少99%相同的胺基酸序列。在某些實施例中,嵌合蛋白包含與SEQ ID NO: 1 100%相同的胺基酸序列。
在某些實施例中,嵌合蛋白包含與根據SEQ ID NO: 2的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列。在某些實施例中,嵌合蛋白包含與根據SEQ ID NO: 2的胺基酸序列至少99%相同的胺基酸序列。在某些實施例中,嵌合蛋白包含與SEQ ID NO: 2 100%相同的胺基酸序列。
在某些實施例中,嵌合蛋白包含與根據SEQ ID NO: 5的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列。在某些實施例中,嵌合蛋白包含與根據SEQ ID NO: 5的胺基酸序列至少99%相同的胺基酸序列。在某些實施例中,嵌合蛋白包含與SEQ ID NO: 5 100%相同的胺基酸序列。
根據本揭示文本的每個前述態樣和實施例,在一些實施例中,個體患有輕度A型血友病。
根據本揭示文本的每個前述態樣和實施例,在一些實施例中,個體患有中度A型血友病。
根據本揭示文本的每個前述態樣和實施例,在一些實施例中,個體患有重度A型血友病。
根據本揭示文本的每個前述態樣和實施例,在一些實施例中,個體是人。
本揭示文本的某些態樣係關於在患有A型血友病的個體中增加骨質密度(BMD)並預防性治療出血事件的方法,所述方法包括:(i) 鑑定正在接受用不含Fc部分的FVIII蛋白治療A型血友病的個體,其中所述個體在治療期間具有足夠的血液凝固,並且其中所述個體具有低BMD;並且 (ii) 停止用不含Fc部分的FVIII蛋白進行治療,並投予個體治療有效量之包含重組FVIII蛋白和Fc結構域的嵌合蛋白(rFVIIIFc),其中所述嵌合蛋白的投予在個體中增加BMD並預防性治療出血事件。
本揭示文本的某些態樣係關於在患有A型血友病的個體中增加骨質密度(BMD)並預防性治療出血事件的方法,所述方法包括:(i) 鑑定正在接受用非因子替代蛋白治療A型血友病的個體,其中所述個體在治療期間具有足夠的血液凝固,並且其中所述個體具有低BMD;以及 (ii) 停止用非因子替代蛋白進行治療,並投予個體治療有效量之包含重組FVIII蛋白和Fc結構域的嵌合蛋白(rFVIIIFc),其中所述嵌合蛋白的投予在個體中增加BMD並預防性治療出血事件。
本揭示文本的某些態樣係關於在個體中增加骨質密度(BMD)並預防性治療出血事件的方法,所述方法包括投予個體治療有效量的包含重組FVIII蛋白和Fc結構域的嵌合蛋白(rFVIIIFc),其中所述個體已被鑑定為患有A型血友病和低BMD,並且其中所述嵌合蛋白的投予在個體中增加BMD並預防性治療出血事件。
本揭示文本的某些態樣涉及在個體中降低骨折風險並預防性治療出血事件的方法,所述方法包括投予個體治療有效量之包含重組FVIII蛋白和Fc結構域的嵌合蛋白(rFVIIIFc),其中所述個體已被鑑定為患有A型血友病和增加的骨折風險,並且其中所述嵌合蛋白的投予在個體中降低骨折風險並預防性治療出血事件。
本揭示文本的某些態樣涉及在個體中降低骨質密度(BMD)損失率並預防性治療出血事件的方法,所述方法包括投予個體治療有效量之包含重組FVIII蛋白和Fc結構域的嵌合蛋白(rFVIIIFc),其中所述個體已被鑑定為患有A型血友病和BMD損失,並且其中所述嵌合蛋白的投予在個體中降低BMD損失率並預防性治療出血事件。
本揭示文本的某些態樣涉及在患有A型血友病並且正在接受用不含Fc部分的FVIII蛋白治療的個體中增加骨質密度(BMD)並預防性治療出血事件的方法,所述方法包括停止用不含Fc部分的FVIII蛋白進行治療,並投予個體治療有效量之包含重組FVIII蛋白和Fc結構域的嵌合蛋白(rFVIIIFc),其中所述個體已被鑑定為具有低BMD並且在用不含Fc部分的FVIII蛋白治療期間具有足夠的血液凝固,並且其中所述嵌合蛋白的投予在個體中增加BMD並預防性治療出血事件。
本揭示文本的某些態樣涉及在患有A型血友病並且正在接受用非因子替代蛋白治療的個體中增加骨質密度(BMD)並預防性治療出血事件的方法,所述方法包括停止用非因子替代蛋白進行治療,並且投予個體治療有效量之包含重組FVIII蛋白和Fc結構域的嵌合蛋白(rFVIIIFc),其中所述個體已被鑑定為具有低BMD並且在用非因子替代蛋白治療期間具有足夠的血液凝固,並且其中所述嵌合蛋白的投予在個體中增加BMD並預防性治療出血事件。
在一些實施例中,個體先前已使用不含Fc部分的因子VIII蛋白進行治療以減少與A型血友病相關的出血。
在一些實施例中,不含Fc部分的因子VIII蛋白是未融合至Fc結構域的聚乙二醇化FVIII。不含Fc部分的聚乙二醇化因子VIII分子的例子包括但不限於ADYNOVATE®、ESPEROCT®和JIVI®。
在一些實施例中,不含Fc部分的因子VIII蛋白是未融合至Fc結構域的單鏈FVIII。不含Fc部分的單鏈因子VIII分子的例子包括但不限於AFSTYLA®。
在一些實施例中,不含Fc部分的因子VIII蛋白是重組FVIII,其不包含在人體中延長其半衰期的部分。不包含在人體中延長半衰期的部分的因子VIII分子的例子包括但不限於ADVATE®、XYNTHA®、NOVOEIGHt®和KOVALTRY®。
在一些實施例中,不含Fc部分的因子VIII蛋白是血液來源的FVIII或血漿來源的FVIII。
在一些實施例中,不含Fc部分的因子VIII蛋白是damoctocog alfa pegol、turoctocog alfa pegol、turoctocog alfa、lonoctocog alfa、simoctocog alfa、rurioctocog alfa pegol或octocog alfa。
在一些實施例中,個體先前已使用非因子替代蛋白進行了治療以減少與A型血友病相關的出血。
在一些實施例中,非因子替代蛋白是艾美賽珠單抗。
在一些實施例中,所述艾美賽珠單抗是艾美賽珠單抗-kxwh。
在一些實施例中,個體在用不含Fc部分的因子VIII蛋白或非因子替代蛋白治療期間具有足夠的血液凝固。
在一些實施例中,個體在尚未檢測到出血的骨部位和/或關節處具有低BMD。6. 配製物
如本文所用,“投予(Administer)”或“投予(administering)”是指向個體遞送本文所述的組成物,例如嵌合蛋白。可以使用此項技術中已知的方法將組成物例如嵌合蛋白投予個體。特別地,所述組成物可以靜脈內、皮下、肌內、皮內,或藉由任何黏膜表面,例如口服、舌下、頰、鼻、直腸、陰道或藉由肺途徑投予。在一些實施例中,所述投予是靜脈內的。在一些實施例中,所述投予是皮下的。在一些實施例中,所述投予是自我投予。在一些實施例中,父母將組成物投予孩子。在一些實施例中,由醫療保健從業者如內科醫生、醫師或護士將組成物投予個體。
如本文所用的術語“腸胃外”包括皮下、皮內、血管內(例如靜脈內)、肌內、脊柱、顱內、鞘內、眼內、眼周、眶內、滑膜內和腹膜內注射或輸注,以及任何類似的注射或輸注技術。組成物還可以是例如懸浮液、乳液、緩釋配製物、乳膏、凝膠或粉末。組成物可以用傳統的黏合劑和載劑(如甘油三酯)配製成栓劑。
在一個例子中,醫藥配製物是液體配製物,例如緩衝的等滲水溶液。在一個例子中,醫藥組成物具有生理pH或接近生理的pH。在一個例子中,水性配製物具有生理或接近生理的滲透壓和鹽度。在一個例子中,水性配製物可以含有氯化鈉和/或乙酸鈉。
在一些實施例中,用於本發明方法之包含FVIII和Fc區的嵌合蛋白被配製成包含以下的醫藥組成物:(a) 嵌合多肽;(b) 一種或多種選自蔗糖、海藻糖、棉子糖、精胺酸或其混合物的穩定劑;(c) 氯化鈉(NaCl);(d) L-組胺酸;(e) 氯化鈣;和 (f) 聚山梨酯20或聚山梨酯80。在某些實施例中,所述醫藥組成物包含:(a) 50 IU/ml至2500 IU/ml的嵌合多肽;(b) 10 mg/ml至25 mg/ml的蔗糖;(c) 8.8 mg/ml至14.6 mg/ml氯化鈉(NaCl);(d) 0.75 mg/ml至2.25 mg/ml L-組胺酸;(e) 0.75 mg/ml至1.5 mg/ml二水合氯化鈣;和 (f) 0.08 mg/ml至0.25 mg/ml聚山梨酯20或聚山梨酯80。在一些實例中,用於本揭示文本的方法中的醫藥組成物是凍幹的。
本揭示文本還提供了醫藥套組的組分。這樣的套組包括一個或多個容器和任選的附件。如本文提供的套組有助於向有需要的個體投予有效量的嵌合蛋白(例如,rFVIIIFc)。在某些實施例中,所述套組有助於藉由靜脈內輸注投予嵌合蛋白(例如,rFVIIIFc)。在某些實施例中,所述套組有助於藉由靜脈內輸注自我投予嵌合蛋白(例如,rFVIIIFc)。
在一些實施例中,本揭示文本提供包含以下的醫藥套組:包含凍幹粉末或餅狀物的第一容器,其中所述粉末或餅狀物包含:(i) 嵌合蛋白(例如,rFVIIIFc),(ii) 蔗糖(和/或海藻糖、棉子糖或精胺酸);(iii) NaCl;(iv) L-組胺酸;(v) 二水合氯化鈣;和 (vi) 聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80;和第二容器,所述第二容器包含待與第一容器的凍幹粉末組合的稀釋劑,例如注射用無菌水。在一些實施例中,提供足夠的稀釋劑以產生約3 ml的具有如本文揭示的所希望特性的嵌合蛋白(例如,rFVIIIFc)配製物。在一些實施例中,第二容器是與柱塞相連的預填充注射器,以允許將稀釋劑添加到第一容器中,重構第一容器的內容物,並將其轉移回到注射器中。在一些實施例中,所述套組還提供用於將注射器附接到第一容器之適配器(adaptor)。在一些實施例中,所述套組還提供針頭和輸液管,其將被附接到含有重構的FVIII多肽(例如,rFVIIIFc)配製物的注射器以允許IV輸注所述配製物。
在一些實施例中,提供的嵌合蛋白(例如,rFVIIIFc)的總量為約200 IU至約6000 IU,例如,約250 IU、約500 IU、約750 IU、約1000 IU、約1500 IU、約2000 IU、約3000 IU、約4000 IU、約5000 IU或約6000 IU。
本文所用的凝血因子或嵌合蛋白中的FVIII部分具有FVIII活性。FVIII活性可以藉由此項技術中任何已知方法來測量。多種測試可用於評估凝血系統的功能:活化部分促凝血酶原激酶時間(aPTT)測試、顯色測定、ROTEM測定、凝血酶原時間(PT)測試(也用於確定INR)、纖維蛋白原測試(通常藉由Clauss法進行)、血小板計數、血小板功能測試(通常藉由PFA-100進行)、TCT、出血時間、混合測試(如果將患者的血漿與正常血漿混合,是否矯正異常)、凝血因子測定、抗磷脂抗體、D-二聚體、遺傳測試(例如,因子V Leiden、凝血酶原突變G20210A)、稀釋羅素蛇毒(Russell's viper venom)毒液時間(dRVVT)、雜項血小板功能測試、凝血彈性描記法(TEG或Sonoclot)、凝血彈性測量法(TEM®,例如ROTEM®)或優球蛋白溶解時間(ELT)。
aPTT測試是測量“固有”(也稱為接觸活化路徑)和常見凝血路徑二者的功效的表現指示物。這個測試一般用於測量市售重組凝血因子(例如,FVIII)的凝血活性。其與測量外在路徑的凝血酶原時間(PT)結合使用。
ROTEM分析提供關於止血的整體動力學的資訊:凝血時間、凝塊形成、凝塊穩定性和溶解。凝血彈性測量法中的不同參數依賴於血漿凝結系統的活性、血小板功能、纖維蛋白溶解或影響這些相互作用的許多因素。這個分析可以提供次級止血的全面見解。
顯色測定機制是基於血液凝結級聯的原理,其中在活化的因子IX、磷脂和鈣離子存在下,活化的FVIII加速將因子X轉化為因子Xa。因子Xa活性是藉由水解對因子Xa具有特異性的對硝基苯胺(pNA)底物來評估。在405 nm下測量的對硝基苯胺的初始釋放速率與因子Xa活性成正比,並且因此與樣品中的FVIII活性成正比。
顯色測定得到了國際血栓形成與止血學會(ISTH)的科學標準化委員會(SSC)的FVIII和因子IX小組委員會的推薦。從1994以來,顯色測定也已經是歐洲藥典中用於為FVIII濃縮物效力賦值的參考方法。因此,在一個實施例中,包含FVIII的嵌合蛋白具有與包含成熟FVIII或BDD FVIII的嵌合蛋白(例如,ADVATE®、REFACTO®或ELOCTATE®)相當的FVIII活性。
在某些實施例中,以單劑量投予有效量或有效劑量。在一些實施例中,全天中以兩次或更多次劑量投予有效量或有效劑量。
現已詳細描述本揭示文本,藉由參考以下實例將更明確地瞭解本揭示文本,所述實例是僅出於說明目的包括於此並且不旨在限制本揭示文本。本文提及的所有專利、出版物和文章均明確且具體地藉由引用併入本文。實例
本揭示文本尤其提供用於治療患有A型血友病和低BMD的個體的組成物、化合物、套組和方法,並且不受任何特定科學理論的限制。實例 1 :重組因子 VIII Fc 融合蛋白( rFVIIIFc )體外負調節炎性破骨細胞形成
在重度A型血友病(HemA)患者中觀察到的骨質密度降低表明,FVIII活性的不存在和相關的出血事件對骨穩態具有深遠的影響。
不受任何科學理論的束縛,假設這些患者中的促炎環境可能導致單核細胞/巨噬細胞來源的破骨細胞形成和隨後的骨侵蝕加劇,類似於在關節炎相關性骨質疏鬆症的情況下報導的事件。研究了rFVIII與rFVIIIFc處理對單核細胞來源的破骨細胞形成的影響,以確定rFVIIIFc是否藉由上調抗氧化劑NRF2路徑來抑制促炎性破骨細胞形成。
為了驗證這一假設,從周邊血液單核細胞(PBMC)分離人單核細胞,並將其在未經處理或者存在hIgG1、rFVIII或rFVIIIFc的情況下與rhM-CSF和rhRANKL一起培養,以實現破骨細胞形成。藉由Q-PCR測量由所述處理觸發的基因表現變化。藉由抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色和觀察多核化來跟蹤破骨細胞表型。使用骨吸收測定法檢查處理的破骨細胞的功能。
使用RNeasy微型套組(加利福尼亞州瓦倫西亞的Qiagen)從巨噬細胞分離總RNA,並使用SuperScript III Vilo套組(Thermo Fisher Scientific)進行逆轉錄。使用來自Thermo Fisher Scientific的Taqman基因表現測定法進行定量即時聚合酶鏈反應(PCR)測定,並在7500 Fast儀器上運行。使用比較循環閾值方法相對於內源對照基因36B4對轉錄物進行定量。
人單核細胞來源的巨噬細胞是從自健康人供體周邊血液單核細胞分離的CD14+
單核細胞產生的。
將純化的CD14+
單核細胞在補充有青黴素、鏈黴素和10%胎牛血清的RPMI 1640 Glutamax培養基(Thermo Fisher Scientific)中平板培養。除非另有說明,否則用人IgG1、B結構域缺失的rFVIII、rFVIIIFc(各25 nM)或媒劑(PBS)在7天培養期的持續時間中處理單核細胞。在初步實驗中確定處理濃度。在一些實驗中還使用不能結合FcγR的rFVIIIFc分子的突變體形式rFVIIIFc N297A來確定Fc部分的作用。Krishnamoorthy S等人Cell Immunol. 2016; 301:30-39。所述研究設計的示意圖在圖 1
中示出。結 果
將CD14+
單核細胞或者在單獨的M-CSF存在下培養7天,或者在第0天用4個處理組之一處理,並在M-CSF和RANKL存在下培養7天(圖 2
)。然後藉由TRAP染色觀察每個處理組的細胞的形態特徵(圖 3
)。未經RANKL處理的對照細胞展現出不同的巨噬細胞形態(圖 3A
)。用媒劑(圖 3B
)、單獨的IgG1(圖 3C
)或單獨的rFVIII(圖 3D
)處理並用M-CSF和RANKL培養的細胞展現出破骨細胞特徵性的大型多核細胞體。用rFVIIIFc處理的細胞(圖 3E
)仍然很小並含有單個核,表明rFVIIIFc處理抑制了多核破骨細胞的形成。
為了檢查治療時機對破骨細胞形成的影響,在第-1天用四種處理之一處理CD14+
單核細胞。在處理24小時後,除去培養基,將細胞離心並用DPBS洗滌一次,並重懸於含有M-CSF和RANKL的培養基中並重新平板培養(圖 4
)。在第-1天用媒劑(圖 5A
)、單獨的IgG1(圖 5B
)或單獨的rFVIII(圖 5C
)處理,在第0天洗淨,用M-CSF和RANKL培養並藉由TRAP染色檢查的CD14+
單核細胞分化為破骨細胞形態特徵性的大型多核細胞。用rFVIIIFc相似地處理(圖 5D
)並藉由TRAP染色檢查的CD14+
單核細胞未分化為破骨細胞,因為觀察到極少的特徵性大型多核細胞,這表明僅一天的單核細胞的rFVIIIFc處理明顯抑制7天分化後體外的破骨細胞形成。這在生理上與FVIII和單核細胞的血液循環特性相關,因為預期rFVIIIFc僅與血液循環中的單核細胞相互作用。rFVIIIFc處理對完全分化的單核細胞來源的破骨細胞未顯示可檢測的作用(資料未顯示)。總結
在rFVIIIFc的存在下,單核細胞來源的破骨細胞發育顯著受損。根據形態學觀察,用rFVIIIFc處理單核細胞僅一天就足以抑制破骨細胞的形成。實例 2 : rFVIIIFc 在 體 外抑制破骨 細 胞的骨吸收活性
由於rFVIIIFc能夠抑制破骨細胞形成,因此我們接下來檢查了rFVIIIFc對破骨細胞的骨吸收活性的影響。將CD14+
單核細胞在第0天用媒劑、單獨的IgG1、單獨的rFVIII或rFVIIIFc處理,並在M-CSF和RANKL存在下培養3天。在第3天,將單核細胞在牛皮質骨切片上重新平板培養,並在M-CSF和RANKL存在下共培養7-10天。在7-10天的共培養期後,除去單核細胞來源的細胞,並藉由甲苯胺藍染色檢查骨切片(圖 6
)。與媒劑(圖 7A
)、IgG1(圖 7B
)或rFVIII(圖 7C
)處理的單核細胞共培養的骨切片顯示出清晰的骨吸收(圖 7A 、 圖 7B 、 圖 7C
;圓圈區域),表明來源於此處理池的破骨細胞仍然能夠活躍地分解骨骼。當與三個對照組相比時,與rFVIIIFc處理的單核細胞共培養的骨切片(圖 7D
)顯示出明顯更少的骨吸收(圖 7D
,圓圈區域),表明在第0天對單核細胞的rFVIIIFc處理明顯抑制分化7-10天後細胞的骨吸收活性。總結
對用破骨細胞分化因子(M-CSF和RANKL)培養的單核細胞的rFVIIIFc處理導致經處理細胞的骨吸收活性降低。實例 3 : rFVIIIFc 對 破骨 細 胞形成中的基因表現和功能的影 響
接下來,我們研究了藉由rFVIIIFc降低的破骨細胞活性和形態是否與破骨細胞相關基因的減少相對應。將CD14+
單核細胞在第0天用媒劑、單獨的IgG1、單獨的rFVIII或rFVIIIFc處理,並在M-CSF和RANKL存在下培養7天。然後收穫細胞,提取RNA,並藉由定量即時PCR對基因表現水準進行定量(圖 8
)。然後在媒劑處理(圖 9
,黑色條)、IgG1處理(圖 9
,深灰色條)、rFVIII處理(圖 9
,淺灰色條)和rFVIIIFc處理(圖 9
,白色條)的細胞中測量破骨細胞相關基因,並針對媒劑處理組的表現水準歸一化。分析了破骨細胞分化的標記(圖 9
,RANK、NFATC1)和骨吸收活性的標記(圖 9
,CATK、TRAP、MMP9)。對於所分析的任何基因,在媒劑、IgG1或rFVIII處理組之間均未觀察到顯著變化。然而,當與其他處理組相比時,對於破骨細胞分化的標記(RANK、NFATC1)和活性的標記(CATK、TRAP、MMP9)二者,在rFVIIIFc處理的細胞中均觀察到基因表現顯著下降。參見圖 9
,白色條。
接下來,我們研究了在上述4個處理組中在破骨細胞形成過程中NRF2相關基因的反應。已知NRF2在調節破骨細胞形成過程中被下調的抗氧化路徑方面發揮作用(Kanzaki J Biol Chem)。NRF2控制冷凍保護酶(如GCLC和NQO1)的表現。將CD14+
單核細胞在第0天用媒劑、單獨的IgG1、單獨的rFVIII或rFVIIIFc處理,並在M-CSF和RANKL存在下培養7天。然後收穫細胞,提取RNA,並藉由定量即時PCR對基因表現水準進行定量(圖 10
)。當與媒劑處理的細胞(圖 11A
,黑色條)相比時,在用單獨的IgG1(圖 11A
,深灰色條)或單獨的rFVIII(圖 11A
,淺灰色條)處理的單核細胞中,NRF2控制的基因NQO1和GCLC的表現沒有顯著改變。然而,與媒劑處理組相比,用rFVIIIFc處理的單核細胞展現出NQO1和GCLC兩者的表現顯著增加。參見圖 11A
,白色條。
接下來,我們研究媒劑(圖 11B
,黑色條)、單獨的IgG1(圖 11B
,深灰色條)、單獨的rFVIII(圖 11B
,淺灰色條)或rFVIIIFc處理(圖 11B
,白色條)的單核細胞中的NQO1還原酶活性。與媒劑處理組相比,單獨的IgG1或rFVIII均未展現出特異性NQO1活性的顯著增加(圖 11B
)。然而,在rFVIIIFc處理的細胞中,特異性NQO1活性顯著增加,表明此重要路徑的調節可能在rFVIIIFc介導的對破骨細胞形成的抑制中發揮作用。總結
經rFVIIIFc處理的細胞的基因和蛋白質表現顯示出抗氧化劑NRF2路徑的上調以及已知在破骨細胞形成和骨吸收中起作用的破骨細胞特異性標記和基因的下調。相反,與未處理的、單獨的IgG1或rFVIII處理的細胞相比,在rFVIIIFc處理的破骨細胞中觀察到冷凍保護酶(NQO1、GCLC)的增加。實例 4 : rFVIIIFc 的 Fc 部分在 對 破骨 細 胞形成的抑制方面的作用
接下來,我們研究了rFVIIIFc的Fc部分在對破骨細胞形成的抑制方面的作用。將CD14+
單核細胞在第0天用媒劑、單獨的IgG1、單獨的rFVIII、rFVIIIFc和rFVIIIFc-N297A(不能結合FcγR)處理,並在M-CSF和RANKL存在下培養7天。然後收穫細胞,提取RNA,並藉由定量即時PCR對基因表現水準進行定量(圖 12
)。測量破骨細胞分化標記(RANK、NFATC1)和活性標記(CATK、TRAP),並針對媒劑處理組歸一化(圖 13
,黑色條)。與媒劑處理組相比,單獨的IgG1(圖 13
,深灰色條)或單獨的rFVIII(圖 13
,淺灰色條)處理的細胞均未顯示出基因表現的任何顯著變化。rFVIIIFc處理的細胞(圖 13
,白色條)展現出所有破骨細胞相關標記的顯著降低。當在rFVIIIFc-N297A處理的組中消除了FcγR結合時,未觀察到這種降低(圖 13
,斜線條)。總結
rFVIIIFc對單核細胞來源的破骨細胞形成和破骨細胞特異性基因表現的抑制作用需要Fc結構域和FcγR相互作用。實例 5 :用 rFVIIIFc 處 理的 單 核 細 胞的 劑 量依 賴 性分化
我們研究了rFVIIIFc劑量對MCSF/RANKL分化的單核細胞的免疫表型的影響。將CD14+
單核細胞在第0天用一定劑量(75 nM、42 nM、24 nM、13 nM、7.5 nM、4.2 nM、2.4 nM、1.3 nM、0.7 nM或0 nM)rFVIII + IgG1(圖 14A- 圖 14B
)或rFVIIIFc(圖 15A- 圖 15B
)處理,並在M-CSF和RANKL存在下培養7天。然後收穫細胞,用螢光單株抗體染色,並藉由流式細胞儀進行採集。用針對CD14(單核細胞/巨噬細胞標記)和CD51/61(破骨細胞標記)以及其他單核/巨噬細胞標記CD16、CD32、CD64、CD163、CD33、CD35、CD44、CD11b和CD172ab的螢光抗體對細胞進行染色。破骨細胞的特徵是CD51/61高細胞連同CD14的低表現。總結
用rFVIII + IgG1進行處理僅展現對破骨細胞形成的抑制的微小作用,因為51.6%用75nM劑量的rFVIII + IgG1處理的細胞分化為破骨細胞(CD51/61高
/CD14低
;圖 14A
),相比之下,61.9%用0.7nM的rFVIII + IgG1處理的細胞或58.6%用媒劑處理的細胞轉化為破骨細胞(圖 14B
)。相反,用rFVIIIFc進行處理展示出對破骨細胞形成的明顯抑制。僅1.44%用75 nM rFVIIIFc處理的細胞分化為破骨細胞(圖 15A
),相比之下,62.6%僅用0.7 nM rFVIIIFc處理的細胞或58.5%用媒劑處理的細胞轉化為破骨細胞(圖 15B
)。另外,較高劑量的rFVIIIFc處理揭示在經處理的細胞中獨特的(CD51/61陰 性
CD14低
)免疫表型(圖 15A
)。當針對媒劑對照歸一化時,關於對用rFVIIIFc處理的細胞的破骨細胞形成的抑制作用,觀察到平均IC50為7.49 nM(± 0.66 nM,n = 3)(圖 16
)。實例 6 : Fcγ 受 體 介 導 的 對 破骨 細 胞形成的抑制
接下來,我們研究了Fcγ受體在抑制來自用rFVIIIFc處理的單核細胞的破骨細胞形成方面的作用。在第一個實驗中,將CD14+
單核細胞在第0天用媒劑(圖 17A 、 圖 21A
)、rFVIIIFc(圖 17B 、 圖 21B
)、rFVIII + IgG1(圖 17C 、 圖 21C
)或rFVIIIFc-N297A(圖 17D 、 圖 21D
;不能結合FcγR)處理,並在M-CSF和RANKL存在下培養7天。然後收穫細胞,用螢光單株抗體染色,並藉由流式細胞術進行採集。用針對CD16(單核細胞/巨噬細胞標記)和CD51/61(破骨細胞標記)的螢光抗體對細胞進行染色。在第二個實驗中,在第0天,首先將CD14+
單核細胞用針對FcγR1(抗CD64抗體Fab,圖 18
)、FcγR2(抗CD32抗體,圖 19
)或FcγR3(抗CD16抗體,圖 20
)的阻斷抗體或每種相應的同種型對照抗體處理,然後用rFVIIIFc或rFVIII處理,並且然後在M-CSF和RANKL存在下進一步培養7天。然後收穫細胞,用螢光單株抗體染色,並藉由流式細胞儀進行採集。用針對CD16(單核細胞/巨噬細胞標記)和CD51/61(破骨細胞標記)的螢光抗體對細胞進行染色。總結
39.5%的媒劑處理的細胞(圖 17A
;37.4% 圖 21A
)和用rFVIII + IgG1處理的細胞(圖17C ; 39.6% 圖 21C
)二者的特徵為CD51/61高
破骨細胞,而僅5.54%用rFVIIIFc處理的細胞(圖 17B
;5.57% 圖 21B
)的特徵為CD51/61高
破骨細胞。藉由N297(rFVIIIFc-N297A)的突變消除Fc結構域與Fcγ受體之間的相互作用導致破骨細胞形成的部分挽救(圖 17D 、 圖 21D
)。
47.2%用rFVIII和阻斷FcγR1相互作用的抗體Fab處理的細胞(抗CD64抗體,圖 18A ; 47.1% 圖 22A
)的特徵為破骨細胞,相比之下,2.73%用rFVIIIFc和抗CD64抗體Fab處理的細胞的特徵為破骨細胞(圖 18B ; 3.02% 圖 22B
)。此模式在用Fab對照抗體處理的細胞(rFVIII + 對照,圖 18C 、 圖 22C
;rFVIIIFc + 對照,圖 18D 、 圖 22D
)中持續存在。此模式表明,rFVIIIFc對破骨細胞形成的抑制不可能藉由與單獨的FcγR1的相互作用來介導。
39.2%用rFVIII和阻斷FcγR2相互作用的抗體處理的細胞(抗CD32抗體,圖 19A ; 39.1% 圖 23A
)的特徵為破骨細胞,相比之下,17.0%用rFVIIIFc和抗CD32抗體處理的細胞的特徵為破骨細胞(圖 19B 和 圖 23B
)。藉由同種型對照(rFVIII + 對照,圖 19C 和 圖 23C
;rFVIIIFc + 對照,圖 19D 和 圖 23D
)的處理消除了破骨細胞形成的這種挽救。在與FcγR2的相互作用被阻斷後的這種部分挽救表明,對破骨細胞形成的抑制可能受rFVIIIFc與FcγR2的相互作用的控制。
24.9%用rFVIII和阻斷FcγR3相互作用的抗體處理的細胞(抗CD16抗體,圖 20A ; 24.8% 圖 24A
)的特徵為破骨細胞,相比之下,4.11%用rFVIIIFc和抗CD16抗體處理的細胞的特徵為破骨細胞(圖 20B ; 4.03% 圖 24A
)。當用同種型對照抗體(rFVIII + 對照,圖 20C 和 圖 24C
;rFVIIIFc + 對照,圖 20D 和 圖 24D
)處理細胞時,此模式持續存在。不受任何科學理論的束縛,此模式表明,rFVIIIFc對破骨細胞形成的抑制不可能藉由與單獨的FcγR3的相互作用來介導。實例 7 : FVIII 輕鏈 在 Fcγ 受 體 介 導 的 對 破骨 細 胞形成的抑制方面的作用
我們研究了FVIII的C1和C2結構域在抑制來自用rFVIIIFc處理的單核細胞的破骨細胞形成方面的作用。在第0天,將CD14+
單核細胞用rFVIII(圖 25A
)或單獨的靶向FVIII的A2結構域(GMA8017,圖 25B
)、FVIII的A3結構域(GMA8010,圖 25C
)或FVIII的C2結構域(GMA8006;圖 25D ;
GMA8026,圖 25E
)的每種單株抗體處理,然後在M-CSF和RANKL存在下培養7天,並且然後針對破骨細胞形成進行視覺化。在第0天,還將CD14+
單核細胞用rFVIIIFc(圖 25F
)或者在靶向FVIII的A2結構域(GMA8017,圖 25G
)、FVIII的A3結構域(GMA8010,圖 25H
)或FVIII的C2結構域(GMA8006;圖 25I ;
GMA8026,圖 25J
)的每種單株抗體存在下的rFVIIIFc處理,然後在M-CSF和RANKL存在下培養7天,並且然後針對破骨細胞形成進行視覺化。在培養7天後,單獨用rFVIII或抗體處理的單核細胞(圖 25A- 圖 25E
)顯示出特徵性的破骨細胞形態。如先前實例中所討論,當用rFVIIIFc處理單核細胞時(圖25F),在第7天有效抑制了破骨細胞形態的發展。在阻斷FVIII的A2結構域(圖25G)或FVIII的A3結構域(圖25H)的抗體的存在下用rFVIIIFc處理的單核細胞也有效地抑制了破骨細胞形態的發展。然而,對破骨細胞形成的rFVIIIFc依賴性抑制在靶向FVIII的C2結構域的抗體的存在下發生了逆轉(圖 25I 、 圖 25J
)。在培養7天後,用rFVIIIFc和C2靶向抗體處理的單核細胞(圖 25I 、 圖 25J
)同時展現出與對照相似的特徵性破骨細胞形態。
我們還研究了當與血管性血友病因子(VWF)結合時,用rFVIII或rFVIIIFc處理的單核細胞中的破骨細胞形成。當在第0天單獨用VWF處理CD14+單核細胞時(圖 26A
),在M-CSF和RANKL存在下培養7天後,72.3%的細胞的特徵為破骨細胞。當在第0天在存在VWF(圖26B)或不存在VWF(圖26C)的情況下用rFVIII處理CD14+單核細胞時,在用M-CSF和RANKL培養7天後,大多數細胞(69.6%和73.3%)的特徵類似地為破骨細胞。它們共同證實,添加VWF對rFVIII處理沒有效果。當在第0天用單獨的rFVIIIFc處理CD14+單核細胞時,在第7天小得多的比例(14.2%)的細胞(圖 26E
)的特徵為破骨細胞,這與先前討論的對破骨細胞形成的抑制一致。然而,當用rFVIIIFc和VWF兩者處理細胞時,這種抑制被部分逆轉(圖 26D
),因為增加比例(45.7%)的細胞的特徵為破骨細胞。實例 8 : rFVIIIFc 的 Fc 部分在 對 破骨 細 胞形成的抑制方面的作用的 總結
為了研究rFVIIIFc的Fc部分在對破骨細胞形成的抑制方面的作用,用不同濃度的rFVIIIFc或rFVIII加上人IgG處理原代人血單核細胞,然後體外培養以進行破骨細胞分化。使用多種髓系標記進行免疫表型分析並區分分化的單核細胞和破骨細胞。使用阻斷每種類型的FcγR的抗體或抗FVIII抗體和結合各種FVIII結構域的血管性血友病因子(VWF),探測Fc或FVIII結構域在介導rFVIIIFc與單核細胞的相互作用中的參與。
不受任何科學理論的束縛,結果表明,從rFVIIIFc處理的單核細胞分化的細胞在表型上不同於破骨細胞,並且在很大程度上仍是單核細胞。對於調節這種表型的rFVIIIFc與單核細胞之間的相互作用,Fc結構域最有效地接合細胞表面上的FcγR2;FVIII的C1和C2結構域被標記為與單核細胞相互作用所需,這也藉由VWF複合的rFVIIIFc的免疫調節作用喪失而得到證明。
不受任何科學理論的束縛,這些資料表明了rFVIIIFc與單核細胞相互作用的“雙接觸點”模型。FVIII部分藉由C1和C2結構域與單核細胞相互作用,並且並行地,Fc結構域主要接合同一細胞上的FcγR2,隨後降低單核細胞分化為破骨細胞的潛力。因此,rFVIIIFc可能具有與rFVIII不同的生物學活性,所述生物學活性可以減少患者的關節骨侵蝕和骨質損失。序列
表1.例示性序列
SEQ ID NO: 1 rFVIIIFc 胺基酸序列 | ATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSVVYKKTLFVEFTDHLFNIAKPRPPWMGLLGPTIQAEVYDTVVITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDDKVFPGGSHTYVWQVLKENGPMASDPLCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTQTLHKFILLFAVFDEGKSWHSETKNSLMQDRDAASARAWPKMHTVNGYVNRSLPGLIGCHRKSVYWHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHRQASLEISPITFLTAQTLLMDLGQFLLFCHISSHQHDGMEAYVKVDSCPEEPQLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDVVRFDDDNSPSFIQIRSVAKKHPKTWVHYIAAEEEDWDYAPLVLAPDDRSYKSQYLNNGPQRIGRKYKKVRFMAYTDETFKTREAIQHESGILGPLLYGEVGDTLLIIFKNQASRPYNIYPHGITDVRPLYSRRLPKGVKHLKDFPILPGEIFKYKWTVTVEDGPTKSDPRCLTRYYSSFVNMERDLASGLIGPLLICYKESVDQRGNQIMSDKRNVILFSVFDENRSWYLTENIQRFLPNPAGVQLEDPEFQASNIMHSINGYVFDSLQLSVCLHEVAYWYILSIGAQTDFLSVFFSGYTFKHKMVYEDTLTLFPFSGETVFMSMENPGLWILGCHNSDFRNRGMTALLKVSSCDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFSQNPPVLKRHQREITRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKEDFDIYDEDENQSPRSFQKKTRHYFIAAVERLWDYGMSSSPHVLRNRAQSGSVPQFKKVVFQEFTDGSFTQPLYRGELNEHLGLLGPYIRAEVEDNIMVTFRNQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETKTYFWKVQHHMAPTKDEFDCKAWAYFSDVDLEKDVHSGLIGPLLVCHTNTLNPAHGRQVTVQEFALFFTIFDETKSWYFTENMERNCRAPCNIQMEDPTFKENYRFHAINGYIMDTLPGLVMAQDQRIRWYLLSMGSNENIHSIHFSGHVFTVRKKEEYKMALYNLYPGVFETVEMLPSKAGIWRVECLIGEHLHAGMSTLFLVYSNKCQTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQWAPKLARLHYSGSINAWSTKEPFSWIKVDLLAPMIIHGIKTQGARQKFSSLYISQFIIMYSLDGKKWQTYRGNSTGTLMVFFGNVDSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLRMELMGCDLNSCSMPLGMESKAISDAQITASSYFTNMFATWSPSKARLHLQGRSNAWRPQVNNPKEWLQVDFQKTMKVTGVTTQGVKSLLTSMYVKEFLISSSQDGHQWTLFFQNGKVKVFQGNQDSFTPVVNSLDPPLLTRYLRIHPQSWVHQIALRMEVLGCEAQDLYDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK |
SEQ ID NO: 2 rFVIIIFc的FVIII部分 | ATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSVVYKKTLFVEFTDHLFNIAKPRPPWMGLLGPTIQAEVYDTVVITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDDKVFPGGSHTYVWQVLKENGPMASDPLCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTQTLHKFILLFAVFDEGKSWHSETKNSLMQDRDAASARAWPKMHTVNGYVNRSLPGLIGCHRKSVYWHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHRQASLEISPITFLTAQTLLMDLGQFLLFCHISSHQHDGMEAYVKVDSCPEEPQLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDVVRFDDDNSPSFIQIRSVAKKHPKTWVHYIAAEEEDWDYAPLVLAPDDRSYKSQYLNNGPQRIGRKYKKVRFMAYTDETFKTREAIQHESGILGPLLYGEVGDTLLIIFKNQASRPYNIYPHGITDVRPLYSRRLPKGVKHLKDFPILPGEIFKYKWTVTVEDGPTKSDPRCLTRYYSSFVNMERDLASGLIGPLLICYKESVDQRGNQIMSDKRNVILFSVFDENRSWYLTENIQRFLPNPAGVQLEDPEFQASNIMHSINGYVFDSLQLSVCLHEVAYWYILSIGAQTDFLSVFFSGYTFKHKMVYEDTLTLFPFSGETVFMSMENPGLWILGCHNSDFRNRGMTALLKVSSCDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFSQNPPVLKRHQREITRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKEDFDIYDEDENQSPRSFQKKTRHYFIAAVERLWDYGMSSSPHVLRNRAQSGSVPQFKKVVFQEFTDGSFTQPLYRGELNEHLGLLGPYIRAEVEDNIMVTFRNQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETKTYFWKVQHHMAPTKDEFDCKAWAYFSDVDLEKDVHSGLIGPLLVCHTNTLNPAHGRQVTVQEFALFFTIFDETKSWYFTENMERNCRAPCNIQMEDPTFKENYRFHAINGYIMDTLPGLVMAQDQRIRWYLLSMGSNENIHSIHFSGHVFTVRKKEEYKMALYNLYPGVFETVEMLPSKAGIWRVECLIGEHLHAGMSTLFLVYSNKCQTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQWAPKLARLHYSGSINAWSTKEPFSWIKVDLLAPMIIHGIKTQGARQKFSSLYISQFIIMYSLDGKKWQTYRGNSTGTLMVFFGNVDSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLRMELMGCDLNSCSMPLGMESKAISDAQITASSYFTNMFATWSPSKARLHLQGRSNAWRPQVNNPKEWLQVDFQKTMKVTGVTTQGVKSLLTSMYVKEFLISSSQDGHQWTLFFQNGKVKVFQGNQDSFTPVVNSLDPPLLTRYLRIHPQSWVHQIALRMEVLGCEAQDLY |
SEQ ID NO: 3 Fc區,包括rFVIIIFc和本文揭示的某些多肽序列的Fc區,所述多肽序列包含未藉由肽鍵融合至FVIII或任何其他蛋白質的Fc | DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK |
SEQ ID NO: 4 經加工的Fc區(不具有C末端離胺酸),包括rFVIIIFc和本文揭示的某些多肽序列的經加工的Fc區,所述多肽序列包含未藉由肽鍵融合至FVIII或任何其他蛋白質的Fc | DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG |
SEQ ID NO: 5 rFVIIIFc 具有經加工的Fc區(不具有C末端離胺酸)的胺基酸序列 | ATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSVVYKKTLFVEFTDHLFNIAKPRPPWMGLLGPTIQAEVYDTVVITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDDKVFPGGSHTYVWQVLKENGPMASDPLCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTQTLHKFILLFAVFDEGKSWHSETKNSLMQDRDAASARAWPKMHTVNGYVNRSLPGLIGCHRKSVYWHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHRQASLEISPITFLTAQTLLMDLGQFLLFCHISSHQHDGMEAYVKVDSCPEEPQLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDVVRFDDDNSPSFIQIRSVAKKHPKTWVHYIAAEEEDWDYAPLVLAPDDRSYKSQYLNNGPQRIGRKYKKVRFMAYTDETFKTREAIQHESGILGPLLYGEVGDTLLIIFKNQASRPYNIYPHGITDVRPLYSRRLPKGVKHLKDFPILPGEIFKYKWTVTVEDGPTKSDPRCLTRYYSSFVNMERDLASGLIGPLLICYKESVDQRGNQIMSDKRNVILFSVFDENRSWYLTENIQRFLPNPAGVQLEDPEFQASNIMHSINGYVFDSLQLSVCLHEVAYWYILSIGAQTDFLSVFFSGYTFKHKMVYEDTLTLFPFSGETVFMSMENPGLWILGCHNSDFRNRGMTALLKVSSCDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFSQNPPVLKRHQREITRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKEDFDIYDEDENQSPRSFQKKTRHYFIAAVERLWDYGMSSSPHVLRNRAQSGSVPQFKKVVFQEFTDGSFTQPLYRGELNEHLGLLGPYIRAEVEDNIMVTFRNQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETKTYFWKVQHHMAPTKDEFDCKAWAYFSDVDLEKDVHSGLIGPLLVCHTNTLNPAHGRQVTVQEFALFFTIFDETKSWYFTENMERNCRAPCNIQMEDPTFKENYRFHAINGYIMDTLPGLVMAQDQRIRWYLLSMGSNENIHSIHFSGHVFTVRKKEEYKMALYNLYPGVFETVEMLPSKAGIWRVECLIGEHLHAGMSTLFLVYSNKCQTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQWAPKLARLHYSGSINAWSTKEPFSWIKVDLLAPMIIHGIKTQGARQKFSSLYISQFIIMYSLDGKKWQTYRGNSTGTLMVFFGNVDSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLRMELMGCDLNSCSMPLGMESKAISDAQITASSYFTNMFATWSPSKARLHLQGRSNAWRPQVNNPKEWLQVDFQKTMKVTGVTTQGVKSLLTSMYVKEFLISSSQDGHQWTLFFQNGKVKVFQGNQDSFTPVVNSLDPPLLTRYLRIHPQSWVHQIALRMEVLGCEAQDLYDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG |
無
圖 1A- 圖 1B
是實驗性體外模型的示意圖,所述模型使用單核細胞來源的細胞類型藉由抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色來檢查巨噬細胞和破骨細胞形態,檢查破骨細胞骨吸收活性、基因表現譜分析、破骨細胞特異性基因和抗氧化路徑相關基因。圖 1A
是顯示藉由在7天內以50ng/ml單獨投予M-CSF將CD14+
單核細胞分化為單核細胞來源的巨噬細胞的方案之示意圖。圖 1B
是顯示藉由在7天內投予50ng/ml的M-CSF和100ng/ml的RANKL將CD14+
單核細胞分化為單核細胞來源的破骨細胞的方案之示意圖。
圖 2A- 圖 2B
是使用單核細胞來源的細胞類型檢查抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色的實驗性體外模型的示意圖。圖 2A
是顯示藉由在7天內以50ng/ml單獨投予巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)而分化為單核細胞來源的巨噬細胞的CD14+
單核細胞對照組的示意圖,並檢查TRAP染色。圖 2B
是顯示藉由在7天內投予50ng/ml的M-CSF和100ng/ml的RANKL而分化為單核細胞來源的破骨細胞並在第0天用媒劑、IgG1(25nM)、rFVIII(25nM)或rFVIIIFc(25nM)處理的CD14+
單核細胞的測試組的示意圖。
圖 3A- 圖 3E
是單核細胞來源的巨噬細胞(圖 3A
)和單核細胞來源的破骨細胞( 圖 3B- 圖 3E
)中TRAP染色的視覺描繪。圖 3B
是用媒劑處理的單核細胞來源的破骨細胞中TRAP染色的視覺描繪。圖 3C
是單獨用IgG1處理的單核細胞來源的破骨細胞中TRAP染色的視覺描繪。圖 3D
是單獨用重組因子VIII(rFVIII)處理的單核細胞來源的破骨細胞中TRAP染色的視覺描繪。圖 3E
是用rFVIIIFc處理的單核細胞來源的破骨細胞中TRAP染色的視覺描繪。
圖 4
是確定破骨細胞形成的洗脫實驗的示意圖,其中在分化為單核細胞來源的破骨細胞之前用以下4種處理之一將CD14+
單核細胞處理一天:媒劑處理、單獨的IgG1、rFVIII或rFVIIIFc。在第7天分析細胞的形態。
圖 5A- 圖 5D
是當在分化前用媒劑(圖 5A
)、IgG1(圖 5B
)、rFVIII(圖 5C
)或rFVIIIFc(圖 5D
)處理一天時,分化後7天的單核細胞來源的破骨細胞形態的視覺描繪。
圖 6
是骨吸收實驗的示意圖,其中將CD14+
單核細胞用M-CSF和RANKL以及4種處理範例之一處理三天(媒劑、IgG1、rFVIII或rFVIIIFc),之後將單核細胞平板培養至牛皮質骨切片上並再培養7-10天,然後用甲苯胺藍染色以確定骨吸收。
圖 7A- 圖 7D
是與單核細胞來源的破骨細胞一起培養的骨切片的視覺描繪,所述破骨細胞先前用媒劑(圖 7A
)、單獨的IgG1(圖7B)、rFVIII(圖 7C
)或rFVIIIFc(圖 7D
)處理。
圖 8
是藉由以下方式確定單核細胞來源的破骨細胞中的基因表現的實驗的示意圖:在第0天用媒劑、單獨的IgG1、rFVIII或rFVIIIFc處理CD14+
單核細胞,藉由添加M-CSF和RANKL持續7天使其分化為單核細胞來源的破骨細胞,並測量目的基因的表現。
圖 9
是在第0天用媒劑(黑色條)、IgG1(深灰色條)、rFVIII(淺灰色條)或rFVIIIFc(白色條)處理並在處理後第7天分化為單核細胞來源的破骨細胞的CD14+
單核細胞的基因表現的圖形表示。藉由定量聚合酶鏈反應(qPCR)測量分化標記(RANK、NFATC1)和骨吸收活性標記(CATK、TRAP、MMP9),並針對未處理組歸一化。ns =不顯著;**** p < .005;n = 6-10。
圖 10
是藉由以下方式確定單核細胞來源的破骨細胞中的基因表現和酶活性的實驗的示意圖:在第0天用媒劑、單獨的IgG1、rFVIII或rFVIIIFc處理CD14+
單核細胞,藉由添加M-CSF和RANKL持續7天使其分化為單核細胞來源的破骨細胞,並在第7天測量酶活性和目的基因的表現。
圖 11A- 圖 11B
是在第0天用媒劑(黑色條)、IgG1(深灰色條)、rFVIII(淺灰色條)或rFVIIIFc(白色條)處理並在處理後第7天分化為單核細胞來源的破骨細胞的CD14+
單核細胞的基因表現(圖 11A
)和酶活性(圖 11B
)的圖形表示。圖 11A
描繪了藉由qPCR測量抗氧化路徑相關基因(NQO1、GCLC)並針對媒劑處理組歸一化。圖 11B
描繪了測量特異性NQO1還原酶活性,並針對媒劑處理組歸一化。ns =不顯著;**** p < .005;n = 10(圖 11A
);n = 3(圖 11B )。
圖 12
是藉由以下方式確定破骨細胞中的基因表現和酶活性的實驗的示意圖:在第0天用媒劑、單獨的IgG1、rFVIII、rFVIIIFc或rFVIIIFc-N297A處理CD14+
單核細胞,藉由添加M-CSF和RANKL持續7天分化為單核細胞來源的破骨細胞,並測量破骨細胞相關基因的基因表現。
圖 13
是在第0天用媒劑(黑色條)、IgG1(深灰色條)、rFVIII(淺灰色條)、rFVIIIFc(白色條)或rFVIIIFc-N297A(陰影線條)處理並在處理後第7天分化為單核細胞來源的破骨細胞的CD14+
單核細胞的基因表現的圖形表示。藉由qPCR測量RANK、NFATC1、CATK和TRAP水準。ns =不顯著;**** p < .005;* p < .0.05;n = 5。
圖 14A- 圖 14B
是一系列顯示免疫表型的密度圖,所述免疫表型如在用不同劑量的rFVIII + IgG1處理的單核細胞中藉由螢光活化流式細胞術獲取,並針對CD14和CD51/61的表面表現加以分析。圖 14A
顯示了rFVIII + IgG1的劑量從75 nM降低至7.5 nM。圖 14B
顯示了rFVIII + IgG1的劑量從4.2 nM降低至0 nM(媒劑對照)。
圖 15A- 圖 15B
是一系列顯示免疫表型的密度圖,所述免疫表型如在用不同劑量的rFVIIIFc處理的單核細胞中藉由螢光活化流式細胞術獲取,並針對CD14和CD51/61的表面表現加以分析。圖 15A
顯示了rFVIIIFc的劑量從75 nM降低至7.5 nM。圖 15B
顯示了rFVIIIFc的劑量從4.2 nM降低至0 nM(媒劑對照)。
圖 16
是與媒劑對照相比的破骨細胞百分比的圖形表示,所述破骨細胞在用不同劑量的rFVIII + IgG1(帶圓圈的線)或rFVIIIFc(帶方形的線)處理後藉由流式細胞術表徵為CD51/61高
細胞。
圖 17A- 圖 17D
是一系列顯示免疫表型的密度圖,所述免疫表型如在用媒劑(圖 17A
)、rFVIIIFc(圖 17B
)、rFVIII + IgG1(圖 17C
)或rFVIIIFc-N297A(圖 17D
)處理的單核細胞中藉由螢光活化流式細胞術獲取,並針對CD16和CD51/61的表面表現加以分析。
圖 18A- 圖 18D
是一系列顯示免疫表型的密度圖,所述免疫表型如在存在FcγR1阻斷抗體的抗原結合片段(Fab)(圖 18A- 圖 18B
)或未特異性結合FcγR1的同種型對照Fab(圖 18C- 圖 18D )
的情況下,在用rFVIIIFc或rFVIII處理的單核細胞中藉由螢光活化流式細胞術獲取,並針對CD16和CD51/61的表面表現加以分析。
圖 19A- 圖 19D
是一系列顯示免疫表型的密度圖,所述免疫表型如在存在FcγR2阻斷抗體(圖 19A- 圖 19B
)或未特異性結合FcγR2的同種型對照抗體(圖 19C- 圖 19D )
的情況下,在用rFVIIIFc或rFVIII處理的單核細胞中藉由螢光活化流式細胞術獲取,並針對CD16和CD51/61的表面表現加以分析。
圖 20A- 圖 20D
是一系列顯示免疫表型的密度圖,所述免疫表型如在存在FcγR3阻斷抗體(圖 20A- 圖 20B
)或未特異性結合FcγR3的同種型對照抗體(圖 20C- 圖 20D )
的情況下,在用rFVIIIFc或rFVIII處理的單核細胞中藉由螢光活化流式細胞術獲取,並針對CD16和CD51/61的表面表現加以分析。
圖 21A- 圖 21D
是對應於圖17的一系列顯示免疫表型的長條圖,所述免疫表型如在用媒劑(圖 21A
)、rFVIIIFc(圖 21B
)、rFVIII + IgG1(圖 21C
)或rFVIIIFc-N297A(圖 21D
)處理的單核細胞中藉由螢光活化流式細胞術獲取,並針對CD51/61的表面表現加以分析。y軸表示流事件(flow event),其按最大計數(100%)的百分比進行縮放,藉由分析軟體FlowJo計算。
圖 22A- 圖 22D
是對應於圖18的一系列顯示免疫表型的長條圖,所述免疫表型如在存在FcγR1阻斷抗體的抗原結合片段(Fab)(圖 22A- 圖 22B
)或未特異性結合FcγR1的同種型對照Fab(圖 22C- 圖 22D )
的情況下,在用rFVIIIFc或rFVIII處理的單核細胞中藉由螢光活化流式細胞術獲取,並針對CD51/61的表面表現加以分析。y軸表示流事件,其按最大計數(100%)的百分比進行縮放,藉由分析軟體FlowJo計算。
圖 23A- 圖 23D
是對應於圖19的一系列顯示免疫表型的長條圖,所述免疫表型如在存在FcγR2阻斷抗體(圖 23A- 圖 23B
)或未特異性結合FcγR2的同種型對照抗體(圖 23C- 圖 23D )
的情況下,在用rFVIIIFc或rFVIII處理的單核細胞中藉由螢光活化流式細胞術獲取,並針對CD51/61的表面表現加以分析。y軸表示流事件,其按最大計數(100%)的百分比進行縮放,藉由分析軟體FlowJo計算。
圖 24A- 圖 24D
是對應於圖20的一系列顯示免疫表型的長條圖,所述免疫表型如在存在FcγR3阻斷抗體(圖 24A- 圖 24B
)或未特異性結合FcγR3的同種型對照(圖 24C- 圖 24D )
的情況下,在用rFVIIIFc或rFVIII處理的單核細胞中藉由螢光活化流式細胞術獲取,並針對CD51/61的表面表現加以分析。y軸表示流事件,其按最大計數(100%)的百分比進行縮放,藉由分析軟體FlowJo計算。
圖 25A- 圖 25J
是在存在rFVIII(圖 25A- 圖 25E
)或rFVIIIFc(圖 25F- 圖 25J
)的情況下,在存在阻斷FVIII的A2區的抗體(GMA8017;圖 25B
和圖 25G
)、阻斷FVIII的A3區的抗體(GMA8010;圖 25C
和圖 25H
)的情況下,或者在存在阻斷C2區的抗體(GMA8006;圖 25D
和圖 25I
;GMA8026;圖 25E
和圖 25J
)的情況下,單核細胞和單核細胞來源的破骨細胞的視覺描述。圖 26A- 圖 26E
是一系列顯示免疫表型的長條圖,所述免疫表型如在用單獨的rFVIII(圖 26A
)或單獨的rFVIIIFc(圖 26B
)處理或在存在血管性血友病因子(VWF;圖 26C- 圖 26E
)的情況下用rFVIII或rFVIIIFc處理的單核細胞中,藉由螢光活化流式細胞術獲取,並針對CD51/61的表面表現加以分析。y軸表示流事件,其按最大計數(100%)的百分比進行縮放,藉由分析軟體FlowJo計算。
無
Claims (56)
- 一種治療患有A型血友病及低骨質密度(BMD)的個體的方法,該方法包括: (i) 選擇患有A型血友病及低BMD的個體,並且 (ii) 投予該個體治療有效量之包含重組FVIII蛋白和Fc結構域的嵌合蛋白(rFVIIIFc); 其中該嵌合蛋白的投予在該個體中抑制BMD的降低。
- 如請求項1所述的方法,其中該嵌合蛋白包含與根據SEQ ID NO: 1的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列。
- 如請求項1所述的方法,其中該嵌合蛋白包含與根據SEQ ID NO: 2的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列。
- 如請求項1所述的方法,其中該嵌合蛋白包含根據SEQ ID NO: 1的胺基酸序列。
- 如請求項1所述的方法,其中該嵌合蛋白包含與根據SEQ ID NO: 5的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列。
- 如請求項1所述的方法,其中該嵌合蛋白包含根據SEQ ID NO: 5的胺基酸序列。
- 如請求項1所述的方法,其中該嵌合蛋白包含第一多肽鏈和第二多肽鏈,該第一多肽鏈包含與根據SEQ ID NO: 5的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列,並且該第二多肽鏈包含與根據SEQ ID NO: 4的胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列。
- 如請求項1所述的方法,其中該嵌合蛋白包含第一多肽鏈和第二多肽鏈,該第一多肽鏈包含根據SEQ ID NO: 5的胺基酸序列,並且該第二多肽鏈包含根據SEQ ID NO: 4的胺基酸序列。
- 如請求項8所述的方法,其中該第一多肽鏈藉由雙硫鍵與該第二多肽鏈共價結合。
- 如請求項9所述的方法,其中該第一多肽鏈藉由該Fc結構域的鉸鏈區中的兩個雙硫鍵與該第二多肽鏈共價結合。
- 如請求項1或10所述的方法,其中該嵌合蛋白是efmoroctocog alfa。
- 如請求項1至11中任一項所述的方法,其中該嵌合蛋白已由人細胞產生。
- 如請求項12所述的方法,其中該人細胞是人胚胎腎293(HEK293)細胞。
- 如請求項1至13中任一項所述的方法,其中以每3-5天25-65 IU/kg的劑量投予該嵌合蛋白。
- 如請求項1至14中任一項所述的方法,其中該Fc結構域是人免疫球蛋白G1(IgG1)的Fc結構域。
- 如請求項1至15中任一項所述的方法,其中藉由雙X射線吸收法(DXA)測量該個體中的BMD。
- 如請求項1至16中任一項所述的方法,其中該個體的年齡是50歲或更大。
- 如請求項1至17中任一項所述的方法,其中該個體中的BMD由T得分確定。
- 如請求項18所述的方法,其中如果該個體的T得分小於-1.0,則確定該個體具有低BMD。
- 如請求項18所述的方法,其中如果該個體的T得分在-1.0至-2.4之間,則確定該個體具有低BMD和骨質減少。
- 如請求項18所述的方法,其中如果該個體的T得分小於-2.5,則確定該個體具有低BMD和骨質疏鬆症。
- 如請求項1至16中任一項所述的方法,其中該個體小於50歲。
- 如請求項22所述的方法,其中該個體中的BMD由Z得分確定。
- 如請求項23所述的方法,其中如果該個體的Z得分小於-2.0,則確定該個體具有低BMD。
- 如請求項1至24中任一項所述的方法,其中基於骨形成、骨吸收和/或骨損失的一種或多種生物標記的水準,預測該個體具有低BMD。
- 如請求項25所述的方法,其中從該個體的周邊血液或尿液評估該生物標記。
- 如請求項26所述的方法,其中骨形成的該一種或多種生物標記包括骨特異性鹼性磷酸酶、1型前膠原N末端前肽(P1NP)、1型前膠原C末端前肽(P1CP)和/或骨鈣蛋白。
- 如請求項26所述的方法,其中骨吸收的該一種或多種生物標記包括血清中的總鹼性磷酸酶、核因子κB的受體活化因子(RANKL)、骨保護素(OPG)、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)、羥離胺酸、羥脯胺酸,去氧吡啶啉(DPD)、吡啶啉(PYD)、骨唾液蛋白、組織蛋白酶K、抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRAP5b)、基質金屬蛋白酶9(MMP9)和/或1型膠原的C和/或N末端交聯的端肽(CTX-1和NTX-1)。
- 如請求項1-28中任一項所述的方法,其中該個體未患維生素D缺乏症。
- 如請求項1-29中任一項所述的方法,其中該個體先前已用不含Fc部分的因子VIII治療。
- 一種治療患有A型血友病和增加的骨折風險之個體的方法,該方法包括: (i) 選擇患有A型血友病和增加的骨折風險之個體,並且 (ii) 投予該個體治療有效量之包含重組FVIII蛋白和Fc結構域的嵌合蛋白(rFVIIIFc); 其中該嵌合蛋白的投予在該個體中降低骨折風險。
- 如請求項31所述的方法,其中藉由骨折風險評估工具(FRAX)來確定該個體中的骨折風險。
- 如請求項32所述的方法,其中藉由評估低BMD風險因素來確定該個體中的骨折風險。
- 如請求項33所述的方法,其中該低BMD風險因素包括關節病、身體活動減少、HIV或HCV感染、維生素D缺乏症、低身體質量指數(BMI)和/或低性腺功能症。
- 一種在個體中減少骨質密度(BMD)損失率的方法,該方法包括: (i) 選擇具有低BMD的個體;並且 (ii) 投予該個體治療有效量之包含凝血因子和Fc結構域的嵌合蛋白(rFVIIIFc), 使得該嵌合蛋白的投予在該個體中減少BMD損失率。
- 如請求項1至35中任一項所述的方法,其中該個體患有輕度A型血友病。
- 如請求項1至35中任一項所述的方法,其中該個體患有中度A型血友病。
- 如請求項1至35中任一項所述的方法,其中該個體患有重度A型血友病。
- 一種在患有A型血友病的個體中增加骨質密度(BMD)並預防性治療出血事件的方法,該方法包括: (i) 鑑定正在接受用不含Fc部分的FVIII蛋白治療A型血友病的個體,其中該個體在該治療期間具有足夠的血液凝固,並且其中該個體具有低BMD;並且 (ii) 停止用該不含Fc部分的FVIII蛋白進行治療,並投予該個體治療有效量之包含重組FVIII蛋白和Fc結構域的嵌合蛋白(rFVIIIFc), 其中該嵌合蛋白的投予在該個體中增加BMD並預防性治療出血事件。
- 一種在患有A型血友病的個體中增加骨質密度(BMD)並預防性治療出血事件的方法,該方法包括: (i) 鑑定正在接受用非因子替代蛋白治療A型血友病的個體,其中該個體在該治療期間具有足夠的血液凝固,並且其中該個體具有低BMD;並且 (ii) 停止用所述非因子替代蛋白進行治療,並投予該個體治療有效量之包含重組FVIII蛋白和Fc結構域的嵌合蛋白(rFVIIIFc), 其中該嵌合蛋白的投予在該個體中增加BMD並預防性治療出血事件。
- 一種在個體中增加骨質密度(BMD)並預防性治療出血事件的方法,該方法包括投予該個體治療有效量之包含重組FVIII蛋白和Fc結構域的嵌合蛋白(rFVIIIFc),其中所述個體已被鑑定為患有A型血友病和低BMD,並且其中該嵌合蛋白的投予在該個體中增加BMD並預防性治療出血事件。
- 一種在個體中降低骨折風險並預防性治療出血事件的方法,該方法包括投予該個體治療有效量之包含重組FVIII蛋白和Fc結構域的嵌合蛋白(rFVIIIFc),其中該個體已被鑑定為患有A型血友病和增加的骨折風險,並且其中該嵌合蛋白的投予在該個體中降低骨折風險並預防性治療出血事件。
- 一種在個體中降低骨質密度(BMD)損失率並預防性治療出血事件的方法,該方法包括投予所述個體治療有效量之包含重組FVIII蛋白和Fc結構域的嵌合蛋白(rFVIIIFc),其中該個體已被鑑定為患有A型血友病和BMD損失,並且其中該嵌合蛋白的投予在該個體中降低BMD損失率並預防性治療出血事件。
- 一種在患有A型血友病並且正在接受用不含Fc部分的FVIII蛋白治療的個體中增加骨質密度(BMD)並預防性治療出血事件的方法,該方法包括停止用所述不含Fc部分的FVIII蛋白進行治療,並投予所述個體治療有效量之包含重組FVIII蛋白和Fc結構域的嵌合蛋白(rFVIIIFc),其中該個體已被鑑定為具有低BMD並且在用該不含Fc部分的FVIII蛋白治療期間具有足夠的血液凝固,並且其中該嵌合蛋白的投予在該個體中增加BMD並預防性治療出血事件。
- 一種在患有A型血友病並且正在接受用非因子替代蛋白治療的個體中增加骨質密度(BMD)並預防性治療出血事件的方法,該方法包括停止用該非因子替代蛋白進行治療,並且投予該個體治療有效量之包含重組FVIII蛋白和Fc結構域的嵌合蛋白(rFVIIIFc),其中該個體已被鑑定為具有低BMD並且在用該非因子替代蛋白治療期間具有足夠的血液凝固,並且其中該嵌合蛋白的投予在該個體中增加BMD並預防性治療出血事件。
- 如請求項1-45中任一項所述的方法,其中該個體先前已使用不含Fc部分的因子VIII蛋白進行治療以減少與A型血友病相關的出血。
- 如請求項39、44或46中任一項所述的方法,其中該不含Fc部分的因子VIII蛋白是未融合至Fc結構域的聚乙二醇化FVIII。
- 如請求項39、44或46中任一項所述的方法,其中該不含Fc部分的因子VIII蛋白是未融合至Fc結構域的單鏈FVIII。
- 如請求項39、44或46中任一項所述的方法,其中該不含Fc部分的因子VIII蛋白是重組FVIII,其不包含在人體中延長其半衰期的部分。
- 如請求項39、44或46中任一項所述的方法,其中該不含Fc部分的因子VIII蛋白是血液來源的FVIII或血漿來源的FVIII。
- 如請求項39、44或46中任一項所述的方法,其中該不含Fc部分的因子VIII蛋白是damoctocog alfa pegol、turoctocog alfa pegol、turoctocog alfa、lonoctocog alfa、simoctocog alfa、rurioctocog alfa pegol或octocog alfa。
- 如請求項1-51中任一項所述的方法,其中該個體先前已使用非因子替代蛋白進行治療以減少與A型血友病相關的出血。
- 如請求項52所述的方法,其中所述非因子替代蛋白是艾美賽珠單抗(emicizumab)。
- 如請求項53所述的方法,其中所述艾美賽珠單抗是艾美賽珠單抗-kxwh。
- 如請求項30或36-54中任一項所述的方法,其中該個體在用該不含Fc部分的因子VIII蛋白或該非因子替代蛋白治療期間具有足夠的血液凝固。
- 如請求項1-55中任一項所述的方法,其中該個體在尚未檢測到出血的骨部位和/或關節處具有低BMD。
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