JP2022513332A

JP2022513332A - プロテインｓレベルの決定方法

Info

Publication number: JP2022513332A
Application number: JP2021543568A
Authority: JP
Inventors: ビヨルンダールベク，
Original assignee: スロムボシスアンドコアグラシヨンアーべー
Priority date: 2018-10-04
Filing date: 2019-10-03
Publication date: 2022-02-07
Also published as: CN112840032A; US20210318338A1; WO2020070237A1; EP3861127A1

Abstract

本発明は、サンプル中の機能性プロテインＳレベルを評価するためのインビトロ方法を提供する。本発明はまた、サンプル中の機能性プロテインＳレベルの決定に使用するためのキットを提供する。また、機能性プロテインＳレベルの決定に基づく治療方法と、それに続く治療薬の投与を提供する。【選択図】図１

Description

本発明は、サンプル中のプロテインＳレベルを決定するための、具体的には、機能性プロテインＳレベルを決定するためのインビトロアッセイに関する。

プロテインＳは、複数の機能を有するビタミンＫ依存性の血漿タンパク質である［１、２］。ヒト血漿では、それは遊離タンパク質（約３０％）としておよび補体調節剤Ｃ４ｂ結合タンパク質（Ｃ４ＢＰ）との複合体（約７０％）としての２つの形態で循環する［１、２］。遊離プロテインＳは、２つの異なる抗凝固タンパク質である、活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）および組織因子経路阻害剤アルファ（ＴＦＰＩα）の補因子として機能する［３～５］。抗凝固剤としてのプロテインＳの生理学的重要性は、ヘテロ接合性プロテインＳ欠乏症を有する個体に影響を与える静脈血栓症のリスクの増加によって実証される［６］。劇的な凝固亢進状態は、ホモ接合性プロテインＳ欠乏症を有する幼児のまれな症例に記載されている。プロテインＳノックアウトマウスは、このノックアウトが胚の致死性をもたらすため、プロテインＳの決定的な重要性をさらに実証する［７、８］。興味深いことに、プロテインＳノックアウトを血友病Ａ（ＦＶＩＩＩのノックアウト）またはＢ（ＦＩＸのノックアウト）と組み合わせることは、プロテインＳノックアウトの致死性は制御されない凝固亢進によるものであると実証する明白な血栓性または出血性表現型を有しないマウスをもたらす［９、１０］。

ＡＰＣはプロテインＳとともに、活性化第Ｖ因子（ＦＶａ）および活性化第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩａ）の活性を調節し、それらはそれぞれ、酵素第Ｘａ因子（ＦＸａ）および第ＩＸａ因子（ＦＩＸａ）の補因子である［１１、１２］。負に帯電したリン脂質の表面上で、ＦＸａおよびＦＶａはプロトロンビンをトロンビンに活性化するプロトロンビナーゼ複合体を形成するが、ＦＩＸａおよびＦＶＩＩＩａはＦＸをＦＸａに活性化するテナーゼ複合体を創出する。テナーゼおよびプロトロンビナーゼ複合体は、凝固の増殖段階における重要な成分であり、ＡＰＣはプロテインＳとともに、この段階の活性を調節する重要な抗凝固タンパク質である。

プロテインＳは、ＦＸａ活性の調節においてＴＦＰＩαの補因子として機能することも同定されている［５、１３～１６］。ＴＦＰＩαは、ＦＶＩＩおよびＦＶＩＩａ（ＦＶＩＩの活性化形態）の両方が存在する血液にＴＦが暴露されるとき、血管損傷時に形成される組織因子－第ＶＩＩａ因子（ＴＦ／ＦＶＩＩａ）複合体を阻害するため、凝固の外因性経路の重要な調節剤である［１７～１９］。ＴＦ／ＦＶＩＩａはＦＩＸおよびＦＸの両方を活性化し、凝固反応を開始させる。ＴＦＰＩαは新たに活性化されたＦＸａに結合して阻害し、続いてＴＦＰＩα／ＦＸａ複合体がＴＦ／ＦＶＩＩａに結合して阻害する。負に帯電したリン脂質の存在下では、ＴＦＰＩαによるＦＸａの阻害率がプロテインＳの存在によって増強される。ＴＦＰＩαは３つのＫｕｎｉｔｚドメインを含有するＫｕｎｉｔｚ型プロテアーゼ阻害剤であり、１番目はＦＶＩＩａに結合して阻害し、２番目はＦＸａに結合して阻害し、３番目はプロテインＳに結合する［１７～１９］。

最近、凝固因子Ｖ（ＦＶ）のスプライス変異体が同定され、そこには中央に位置する大きな活性化ドメインであるＢドメインから７０２個のアミノ酸残基（残基７５６～１４５８）が削除されている［２０］。Ｂドメインは、７０９、１０１８、および１５４５位でトロンビンまたはＦＸａを介した切断によってＦＶからＦＶａへの活性化中に切断されるため、ＦＶ－短スプライス変異体は、トロンビンまたはＦＸａによる切断後に凝固促進剤として完全に活性である。しかしながら、重要なことに、Ｂドメインの切断は、Ｂドメインの残りのＣ末端部分（残基１４５８～１５４５）に位置するＴＦＰＩαの負に帯電した高親和性結合部位の露出をもたらす。ＴＦＰＩα分子では、ＦＶ－短の結合部位は、３番目のＫｕｎｉｔｚドメインの後に続く、高度に正に帯電したＣ末端伸長部に位置する［２１～２４］。血漿中に存在するＴＦＰＩα（約０．２ｎＭ）は、下位ｎＭレベルで血漿中に存在するＦＶ－短との高親和性複合体（Ｋｄ＜１ｎＭ）、または約２０ｎＭで存在する全長ＦＶとの低親和性（Ｋｄ＞１０ｎＭ）相互作用のいずれかで循環する。ＴＦＰＩαのＦＶ－短および全長ＦＶへの結合は、ＴＦＰＩαが比較的低分子量（４０ｋＤａ）であるため、さもなければ尿中で失われるため、ＴＦＰＩαを循環中に維持するために重要である［２０］。

最近、ＴＦＰＩαおよびＦＶ－短の間の相互作用が、ＴＦＰＩαを循環中に維持するために重要であるだけでなく、ＦＸａの阻害剤としてのＴＦＰＩαの機能にもまた影響を与えることが示されている［３、２５］。ＦＶ－短自体はＴＦＰＩαの活性を弱く刺激するだけであるが、プロテインＳのＴＦＰＩα－補因子活性を強くサポートする。結果は、ＦＶ－短およびプロテインＳが相乗的なＴＦＰＩα補因子として作用することを示唆する。精製された成分を有するモデル系である、ＦＶ－短（わずか数ｎＭ）および負に帯電したリン脂質小胞の存在下では、プロテインＳは非常に効率的であり、わずか数ｎＭで最大のＴＦＰＩα補因子活性をもたらす［２５］。対照的に、ＦＶ－短の不在下では、最大で１００ｎＭまでのプロテインＳでも同等に効率的なＴＦＰＩα補因子活性は得られない。

遺伝性または後天性プロテインＳ欠乏症は、静脈血栓症の危険因子であり、プロテインＳの分析は、静脈血栓塞栓症（ＶＴＥ）を有する患者の実験室評価の一部である［２］。プロテインＳのＡＰＣ補因子機能に関する抗体に基づくアッセイおよびテストは市販されており、そのようなアッセイでは、ＶＴＥを有する患者の数パーセントがプロテインＳ欠乏症であると同定される。減少したタンパク質を同定するために、遊離プロテインＳのアッセイが最も高い予測値を有することが実証されている［２６］。

プロテインＳレベルを決定するための、特に機能性プロテインＳのレベルを決定するための新しい、改善された方法を同定する必要性が、依然として存在する。

したがって、本発明は、当該技術分野における上記で同定された欠陥および不利な点のうちの１つ以上を単独でまたは任意の組み合わせで軽減、改善または排除しようとし、添付の特許請求の範囲による方法を提供することによって少なくとも上述の問題を解決する。

本発明の第１の態様は、サンプル中の機能性プロテインＳレベルを決定するためのインビトロ方法を提供し、方法は、
（ａ）対象から得られたサンプルを、ＴＦＰＩαおよび、ＦＶ－短、もしくはＦＶ－短変異体、または機能的に同等なＦＶ変異体のうちの１つ以上と接触させるステップと、
（ｂ）サンプルをＦＸａと接触させるステップと、
（ｃ）サンプル中のＦＸａ活性のレベルを測定するステップと、を含み、
ＦＸａ活性のレベルは、サンプル中の機能性プロテインＳのレベルを示す。

一実施形態では、方法は、上記のステップ（ａ）～（ｃ）からなる。

本発明はまた、サンプル中の遊離（または非Ｃ４ＢＰ複合体化）プロテインＳレベルを決定するためのインビトロ方法を提供し、方法は、
（ａ）対象から得られたサンプルをＴＦＰＩαおよび、ＦＶ－短、もしくはＦＶ－短変異体、または機能的に同等なＦＶ－変異体のうちの１つ以上と接触させるステップと、
（ｂ）サンプルをＦＸａと接触させるステップと、
（ｃ）サンプル中のＦＸａ活性のレベルを測定するステップと、を含み、
ＦＸａ活性のレベルは、サンプル中の遊離（または非Ｃ４ＢＰ複合体化）プロテインＳのレベルを示す。

「ＦＶ」とは、少なくとも部分的に活性化された形態のＦＶ（ＦＶａ）を含む凝固因子Ｖを意味し、ただし、ＴＦＰＩα相乗的補因子活性が保持されるように、ＦＶが活性化されることを条件とする。ＴＦＰＩαの相乗的補因子活性は、ＢドメインのＣ末端が露出している部分的に活性化された形態で保持される。完全に活性化されたＦＶａでは、Ｂドメイン全体が切断されるため、ＦＶａはＴＦＰＩαとの相互作用も補因子活性も有しない。ヒトＦＶの配列を、以下の配列番号１に与える。

配列番号１は、成熟した循環一本鎖ＦＶの全長配列である。配列の最初のイタリック体のセクションは、重鎖（残基１～７０９）に対応する部分であり、配列の最後の通常のフォント（太字、イタリック体、または下線なし）のセクションは軽鎖（残基１５４６～２１９６）である。これらの間の太字のセクションはＢドメイン（残基７１０～１５４５）である。

「ＦＶ－短」（また「ＦＶ－７５６－１４５８」）は、ＦＶの代替的スプライシング変異体を意味し、残基７５６～１４５８のＦＶの大きな活性化ドメイン（Ｂドメイン）からの７０２個のアミノ酸残基のインフレーム削除をもたらす［２０］。これは、Ｂドメインの残りのＣ末端部分の酸性領域の露出をもたらす、これはＴＦＰＩαの高親和性結合部位を構成する［２３］。

ＦＶ－短の例示的なアミノ酸配列を配列番号２として以下に与える。ＦＶ－短は、ＦＶと比較して、７０２個のアミノ酸のアミノ酸７５６～１４５８に欠失を有する［２０］。配列の最初のイタリック体のセクションは重鎖（残基１～７０９）に対応する部分であり、配列の最後の通常のフォント（太字、イタリック体、または下線なし）のセクションは軽鎖（残基１５４６～２１９６）である。これらの間のセクション（太字の配列で開始および終了）は、削除後にＢドメインの残っているものである。太字かつ下線が引かれたセクションは、７１０～７５５位に対応するが、続く太字で下線が引かれていない部分は、全長ＦＶ配列の１４５８～１５４５部分を表す。

したがって、本発明の一実施形態では、方法のＦＶ－短は、上記の配列番号２の配列を有する。

また、本明細書には、ＦＶ－短変異体も記載される。１つのＦＶ－短変異体は、ＦＶ８１０－１４９１（配列番号３）であり、ＴＦＰＩαに結合するＢドメインの酸性領域を保持しているにもかかわらず、プロテインＳとともにＴＦＰＩα補因子活性を欠く。この変異体は、２００４年にＴｏｓｏおよびＣａｍｉｒｅによる刊行物で別の文脈で最初に記載された［２９］。

配列の最初のイタリック体のセクションは、重鎖（残基１～７０９）に対応する部分であり、配列の最後の通常のフォント（太字、イタリック体、または下線なし）のセクションは軽鎖（残基１５４６～２１９６）である。これらの間のセクション（太字の配列で開始および終了）は、削除後にＢドメインの残っているものである。太字で下線が引かれたセクションは、７１０～８１０位に対応するが、続く太字かつ下線が引かれていない部分は、全長ＦＶ配列の１４９１～１５４５部分を表す。

ＦＶ－短と比較して、プロテインＳとのＴＦＰＩα相乗的補因子活性が増加した別のＦＶ－短変異体は、ＦＶ７０９－１４７６（配列番号４）であり、１９９５年にＭａｒｑｕｅｔｔｅｅｔａｌによって別の文脈で最初に記載された［２８］。

配列の最初のイタリック体のセクションは重鎖（残基１～７０９）に対応する部分であり、配列の最後の通常のフォント（太字、イタリック体、または下線なし）のセクションは軽鎖（残基１５４６～２１９６）である。これらの間のセクション（太字の配列で開始および終了）は、削除後にＢドメインの残っているものである（全長のＦＶ配列の１４７６～１５４５部分を表す）。この構築体では、Ｉｌｅ７０８がＴｈｒに変異し、Ｌｅｕ１５４４がＴｈｒに変異する。この変異体にはまた、アミノ酸７０８、７０９、および１４７７の接合部をコードするＭｌｕＩ制限酵素部位が導入されている（Ｉｌｅ７０８をＴｈｒに置き換える）。さらに、この変異体には、１５４４～１５４５位にＭｌｕＩ部位が導入されており、これはＬｅｕ１５４４をＴｈｒに置き換える点変異を導入する。これは、ＦＶ－ｃＤＮＡにＭｌｕ１部位が導入された結果である［２８］。

上記で概説したように、変異体の使用もまた、本発明の方法に含まれる。「ＦＶ－短変異体」とは、ＦＶ－短の選択的スプライシング変異体を意味し、ＴＦＰＩαに対する高い結合親和性の機能的特徴およびプロテインＳとの相乗的なＴＦＰＩα補因子活性を保持する。このような変異体の例が本明細書内に与えられる。

用語「結合活性」および「結合親和性」は、ポリペプチド分子が標的に結合する、または結合しない傾向を指すことを意図する。結合親和性は、ポリペプチドおよびその標的の解離定数（Ｋｄ）を決定することによって定量化され得る。より低いＫｄは、標的に対するより高い親和性を示す。同様に、ポリペプチドのその標的への結合の特異性は、ポリペプチドおよび別の非標的分子に関する解離定数と比較した、ポリペプチドのその標的に対する相対的解離定数（Ｋｄ）の観点で定義され得る。

この解離定数の値は、周知の方法によって直接決定することができ、例えばＣａｃｅｃｉら（Ｂｙｔｅ９：３４０－３６２，１９８４、これらの開示は参照により本明細書に援用される）に記載のものなどの方法によって、複合体混合物に対してでさえも算出することができる。例えば、ＥＬＩＳＡｓ、ウエスタンブロット、ＲＩＡ、およびフローサイトメトリー分析を含む、標的に対するリガンドの結合能力を評価するための標準的なアッセイは、当該技術分野において周知である。ポリペプチドの結合動態（例えば、結合親和性）はまた、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）システム分析などの、当該技術分野において既知の標準的なアッセイによっても評価することができる。

標的へのポリペプチドの結合が、別のポリペプチドなどのその標的の別の既知のリガンドによる標的の結合と比較される、競合的結合アッセイを実施することができる。５０％阻害が起こる濃度はＫｉとして既知である。理想的な条件下では、ＫｉはＫｄと同等である。Ｋｉ値はＫｄより小さくなることはないので、Ｋｉの測定はＫｄの上限を提供するために便利に置換することができる。

結合親和性の代替的な尺度としては、ＥＣ５０またはＩＣ５０が挙げられる。この文脈では、ＥＣ５０は、ポリペプチドが一定量の標的に結合する最大値の５０％を達成する濃度を示す。ＩＣ５０は、ポリペプチドが一定量の競合物の一定量の標的に対する結合の最大値の５０％を阻害する濃度を示す。両方の場合において、より低レベルのＥＣ５０またはＩＣ５０は、標的に対するより高い親和性を示す。その標的に対するリガンドのＥＣ５０およびＩＣ５０の値は両方とも、周知の方法、例えばＥＬＩＳＡによって決定することができる。

したがって、ＦＶ－短変異体は、好ましくは、別の非標的分子に結合するその親和性の少なくとも２倍、１０倍、５０倍、１００倍またはより大きい親和性で、ＴＦＰＩαへ結合することができる。ＴＦＰＩαへの結合は、ＦＶ－短変異体のＢドメインのＣ末端セクションを介することが理解されるであろう。

したがって、一実施形態では、「高い結合親和性」とは、ＦＶー短変異体のＫｄが１ｎＭ未満であることを意味する。

「機能的に同等なＦＶ－変異体」とは、ＦＶ－短と同等な機能を有する、すなわちこの変異体がＴＦＰＩαに対して高い親和性を有する（非変異体ＦＶと比較して）ＦＶの変異体を意味する。結合親和性は、ＦＶ－短変異体に関して上記で定義された通りである。高親和性は、ＦＶ－短について前述されたように、ＴＦＰＩαの高親和性結合部位を構成するＢドメインのＣ末端部分の酸性領域の露出に起因し得る。さらに、機能的に同等なＦＶ－変異体は、プロテインＳと相乗的なＴＦＰＩα補因子活性を有する。

全長ＦＶの変異体の例は、Ａｒｇ７０９およびまたはＡｒｇ１０１８で切断されるが、Ａｒｇ１５４５のＧｌｎへの変異のために、１５４５位で切断されないＦＶであり、これについては、本明細書で後により詳細に考察する。

上記の「変異体」には、保存的または非保存的な挿入、削除、および置換が含まれる。例えば、保存的置換とは、同じ一般的なクラス内のアミノ酸（例えば、酸性アミノ酸、塩基性アミノ酸、非極性アミノ酸、極性アミノ酸、または芳香族アミノ酸）を同じクラス内の別のアミノ酸で置換することを指す。したがって、保存的アミノ酸置換および非保存的アミノ酸置換の意味は当該技術分野で周知である。特に、ＴＦＰＩαに対する高い親和性という機能的特徴を保持する変異体が含まれる。

一実施形態では、この変異体は、配列番号２によるアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性、例えば、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列、またはそのフラグメントを有する。

２つのポリペプチド間のパーセント配列同一性は、好適なコンピュータプログラム、例えば、ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＷｉｓｃｏｎｓｉｎＧｅｎｅｔｉｃＣｏｍｐｕｔｉｎｇＧｒｏｕｐのＧＡＰプログラムを使用して決定し得、パーセント同一性は、配列が最適にアラインメントされたポリペプチドに関連して算出されることが理解されるであろう。

アライメントは、代替的に、ＣｌｕｓｔａｌＷプログラムを使用して実施され得る［３６］。使用されるパラメーターは以下の通りであり得る：ファースト・ペアワイズ・アラインメント・パラメーターズ：Ｋ－トプル（ワード）サイズ；１、ウインドウ・サイズ；５、ギャップ・ペナルティ；３、トップ・ダイアゴナルズの数；５。スコアリング方法：ｘパーセント。マルチプル・アライメント・パラメータ：ギャップ開始ペナルティ：１０、ギャップ伸長ペナルティ；０．０５。スコアリング・マトリックス：ＢＬＯＳＵＭ。

代替として、ＢＥＳＴＦＩＴプログラムを使用して、局所配列アライメントを決定し得る。

アッセイで使用するための上記のＦＶ、ＦＶ－短、または変異体は、ヒトであるか、もしくは他の種に由来するか、または人工／合成であり得る。

「ＦＸａ」（また「第Ｘａ因子」）とは、活性化された凝固因子Ｘ（ＦＸ）を意味する。方法で利用されるＦＸａは、ヒト、または別の種に由来され得る。代替として、ＦＸａは人工／合成であり得る。例示的なＦＸには、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢデータベースの受託番号Ｐ００７４２の配列に対応する配列を有するヒトＦＸ、または受託番号Ｐ００７４３を有するウシＦＸが含まれる。これらはＦＸのチモーゲン形態であり、活性酵素ＦＸａに対して活性化される必要がある。代替として、ＦＸは、別の非ヒト哺乳動物、例えばサル、ブタ、マウス、またはラットに由来し得る。

対象から得られたサンプルには、未知量の機能性プロテインＳが含有される。

プロテインＳは、複数の機能を有するビタミンＫ依存性の血漿タンパク質である。血漿中のプロテインＳは、遊離タンパク質としてもＣ４ＢＰとの複合体としても存在する。遊離プロテインＳは、凝固の調節におけるＡＰＣの補因子である。プロテインＳはまた、ＦＸａの阻害における組織因子経路阻害剤アルファ（ＴＦＰＩα）に対する補因子としても機能する。「機能性プロテインＳレベル」には、ＦＶ－短またはＦＶ－短変異体との相乗性でＴＦＰＩαの補因子として作用することができるプロテインＳのレベルの意味が含まれる。例示的なプロテインＳ配列は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ受託番号Ｐ０７２２５を有する。

「機能性プロテインＳ」には、遊離プロテインＳ、すなわち複合体中に結合されていないプロテインＳの意味もまた含まれる。Ｃ４ＢＰ複合体化プロテインＳは、ＴＦＰＩαの補因子として作用する能力もまた限られていることが以前に示唆されていた［５］。しかしながら、たとえこれが事実であるとしても、実施例によって実証されるように、本アッセイが、遊離の非Ｃ４ＢＰ結合プロテインＳ画分によって刺激されたＴＦＰＩα活性のみを検出することを、驚くべきことに本発明者らは発見した。ＡＰＣの補因子として作用するプロテインＳの能力を介して機能性プロテインＳレベルを検出することが報告されている以前のアッセイは、機能性プロテインＳレベルおよび健康対プロテインＳ欠乏症状態の間のかなりの相関を実証するが［３５］、同じ研究は、ＡＰＣよりむしろＴＦＰＩαの活性を評価したとき、相関が低く、プロテインＳ欠乏症個体から得られた値が健康な個体の値と重なっていたため、診断などの医療用途には好適でないことを実証した。しかしながら、本明細書に実証され、ＴＦＰＩα活性の測定値に基づく本アッセイは、患者の健康対プロテインＳ欠乏症状態とよく相関し、例えば医療診断に使用することができる、遊離または機能性プロテインＳレベルの測定値を提供する。

したがって、一実施形態では、本発明は、サンプル中の遊離プロテインＳレベルを決定するためのインビトロ方法を提供する。同じまたは代替の実施形態では、本発明は、サンプル中の非Ｃ４ＢＰ結合プロテインＳレベルを決定するためのインビトロ方法を提供する。

「レベル」には、プロテインＳ、例えば遊離プロテインＳ、例えば非Ｃ４ＢＰ複合体化プロテインＳの物理的量の意味が含まれる。例えば、ＦＸａ活性は通常、プロテインＳの物理的量、例えば、遊離プロテインＳの量、例えば、非Ｃ４ＢＰ複合体化プロテインＳの量とよく相関すると考えられる。しかしながら、いくつかの実施形態では、「レベル」という用語は、「活性」、例えば、このサンプル中のプロテインＳの物理的存在量というよりむしろ、プロテインＳの活性を意味することを意図する。これは、それが遊離プロテインＳ（例えば、非Ｃ４ＢＰ複合体化プロテインＳ）の物理的量というよりむしろ、プロテインＳ（例えば、遊離プロテインＳ、例えば非Ｃ４ＢＰ複合体化プロテインＳ）のプールに起因する活性の実際の量であると予想されるためであり、これは、対象が正常な機能に十分なプロテインＳ活性を有するか、またはプロテインＳ活性が欠乏するかを決定する上で重要であると考えられる。例えば、そして本明細書で考察されるように、いくつかの型のプロテインＳ欠乏症では、サンプル中に存在するプロテインＳの実際の量は正常範囲内であり得るが、例えば本発明の方法によって決定されるようなプロテインＳ（例えば、遊離プロテインＳ、例えば、非Ｃ４ＢＰ複合体化プロテインＳ）の活性は低い。いくつかの実施形態では、本発明は、関連するプロテインＳプールの全体的な活性を決定し、本発明の方法は、そのＴＦＰＩα補因子活の観点から、例えば減少したタンパク質存在量および／または減少したプロテインＳの機能にもかかわらず、プロテインＳのＴＦＰＩα補因子活性の減少をもたらすすべての型のプロテインＳ欠乏症を診断するために好適である。Ｆｖ－短の不在下、プロテインＳは、ＴＦＰＩαに対していくつかの内因性補因子を有すると考えられる。しかしながら、プロテインＳおよびＦＶ－短の組み合わせは、ＴＦＰＩαの補因子として作用するプロテインＳの能力を相乗的に強化する。本発明は、プロテインＳおよびＦＶ－短がＴＦＰＩαを相乗的に増強し、続いてＦＸａ活性を阻害する能力を検出するので、いくつかの実施形態では、プロテインＳのＴＦＰＩα補因子活性は、本明細書に記載されるように、ＦＶ－短の存在下で相乗的に増強される補因子活性である。必要に応じて、ＦＶ－短によって相乗的に増強されるプロテインＳレベルまたは活性を特異的に検出するために、当業者は、例えばＦＶ－短の不在下で本発明の方法を実施することによって、いかにして適切な制御を実施するかを理解する（すなわち、本明細書に記載のステップ（ａ））。これは、ＴＦＰＩαの補因子として作用するプロテインＳの任意の固有の能力のベースライン測定値を与え、これを次いで、ＦＶ－短の存在下でＴＦＰＩαの補因子として作用するプロテインＳの能力から差し引くことができる。しかしながら、プロテインＳの固有の活性は低いので、対象がプロテインＳ欠乏症を有するか否かを決定しようとするとき、この活性を説明することが必要であるとは一般に考えられない。

しかしながら、本発明は、プロテインＳがＡＰＣの補因子として作用する能力を検出しないため、ＡＰＣ補因子活性の機能的欠陥を検出するのには好適でない。

したがって、いくつかの実施形態では、活性とは、プロテインＳ（例えば、遊離プロテインＳ、例えば、非Ｃ４ＢＰ複合体化プロテインＳ）のＴＦＰＩα補因子活性を特異的に意味する。これらの場合、本発明の方法は、対象におけるプロテインＳ欠乏症を検出および診断する際の使用に好適であり、この欠乏症は、少なくともＴＦＰＩα補因子活性の欠乏症をもたらす（例えば、ＡＰＣ補因子活性の付随する欠乏症の有無にかかわらず）が、欠乏症がプロテインＳのＡＰＣ補因子活性のみの欠乏症であるプロテインＳ欠乏症の診断には好適でない。ＴＦＰＩα補因子活性のみのプロテインＳ欠乏症に起因する疾患は記載されないが、本発明は、［３５］に記載されるようなＡＰＣ補因子活性アッセイと組み合わせて、もしこれが必要になれば、２つの間を区別することができる。

プロテインＳの減少がＴＦＰＩα補因子活性の減少をもたらすので、当業者は、本発明の本方法を使用して、プロテインＳの存在量の全体的な減少（Ｉ型欠乏症）を検出することができ、本方法をまた使用して、タンパク質の存在量に関係なく、ＴＦＰＩα補因子活性の特異的な欠乏症を検出することができることを理解するであろう。

いくつかの実施形態では、活性は、ＴＦＰＩαの補因子として機能するプロテインＳの活性の意味を含む。

したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、プロテインＳ活性、例えば、遊離プロテインＳ活性、例えば、非Ｃ４ＢＰ複合体化プロテインＳ活性のレベルを決定するためのインビトロ方法を提供し、ここで、例えば、活性は、サンプル中のプロテインＳのＴＦＰＩα補因子活性であり、方法は、
（ａ）対象から得られたサンプルを、ＴＦＰＩαおよび、ＦＶ－短、もしくはＦＶ－短変異体、または機能的に同等なＦＶー変異体のうちの１つ以上と接触させるステップと、
（ｂ）サンプルをＦＸａと接触させるステップと、
（ｃ）サンプル中のＦＸａ活性のレベルを測定するステップと、を含み、
ＦＸａ活性のレベルは、サンプル中の遊離（または非Ｃ４ＢＰ複合体化）プロテインＳ活性のレベルを示す。

したがって、いくつかの実施形態では、全体を通して使用される「レベル」という用語は、「活性」を指すと解釈することができる。例えば、診断方法において、テストサンプル中の本発明によって決定されるプロテインＳ活性は、プロテインＳ活性の対照レベル、または１つもしくはある数の健康な対照サンプルから得られるプロテインＳ活性のレベルと比較することができる。

「ＴＦＰＩα」（「ＴＦＰＩアルファ」または「ＴＦＰＩ」とも呼ばれる）とは、組織因子経路阻害剤アルファを意味する。ＴＦＰＩαは、凝固の外因性経路の初期段階の重要な調節剤である。［１７、１９］。この経路は、血管の損傷および組織因子（ＴＦ）の血液成分への曝露に応答して活性化される。例示的なＴＦＰＩα配列は、以下の配列番号５に示されるようなＵｎｉＰｒｏｔＫ受託番号Ｐ１０６４６の配列である。

本発明の第１の態様の一実施形態では、方法のステップ（ａ）は、サンプルを、タンパク質の集合を可能にすることができる基質と接触させることをさらに含む。

「タンパク質の集合を可能にすることができる基質」は、反応に関与するタンパク質が、もし基質が存在しなかった場合よりもより容易に集合することを可能にする任意の基質を含む。したがって、基質は、流体相中の反応の反応速度と比較して、反応速度を増強するであろう。

一実施形態では、これは、例えば、もし方法におけるタンパク質が基質の表面に親和性を有するならば、方法に関与するタンパク質が基質の表面上で集合することを可能にする基質である。このような集合により、タンパク質間相互作用が可能になり、方法内の反応の効率を増加させる。

タンパク質の集合を可能にすることができる基質は、リン脂質小胞であり得る。反応中のタンパク質は、負に帯電したリン脂質膜に親和性を有し、これは反応速度を増強させる。

一実施形態では、ステップ（ａ）はまた、カルシウムまたは同等物を含む。同等物には、例えば、マグネシウムなどの他の二価カチオンが含まれる。カルシウムまたは同等物は、タンパク質を正しいコンフォメーションおよび活性に保つのに機能し、さらにそれは、タンパク質とリン脂質の相互作用にとって重要である。任意選択で、カルシウムは、０．１～３０ｍＭ、任意選択で０．１～１０ｍＭの濃度で存在する。一実施形態では、カルシウムは、１～２ｍＭの濃度で存在する。

方法のステップは、順次、すなわち、ステップ（ａ）、次にステップ（ｂ）、次にステップ（ｃ）で実施し得る。例えばステップ（ａ）の前のステップ（ｂ）など、別の順序でステップを実施し得ることもまた理解されるであろう。また、ステップのうちの任意の２つ、または３つすべてのステップは同時にあり得ることもまた理解されるであろう。例えば、一実施形態では、ステップ（ａ）およびステップ（ｂ）は同時に実施され、その後にステップ（ｃ）が続く。別の実施形態では、ステップ（ａ）、（ｂ）および（ｃ）はすべて同時に起こる。

一実施形態では、方法はさらに、
（ｄ）機能性プロテインＳに基づく標準曲線を提供するステップと、
（ｅ）ステップ（ｃ）の測定値をステップ（ｄ）の標準曲線と比較するステップと、をさらに含むか、またはこれらのステップからなる。

ステップ（ａ）、（ｂ）および（ｃ）に関しては、上記で概説したように、ステップ（ｅ）はすでに実施されているステップ（ｃ）および（ｄ）に依存するが、方法のステップは任意の順序で実施し得ることが理解されるであろう。

一実施形態では、ステップ（ｄ）の標準曲線を、健康な個体から得られた血漿サンプルを使用して生成する。これらのサンプルを、標準として使用する前にプールすることができる。それらをまた個別に分析して、機能的なプロテインＳ活性の正常範囲を決定することができる。

「健康な個体」には、既知のプロテインＳに関連する障害を有さず、プロテインＳの正常レベルを有するヒト対象が含まれる。

代替として、標準曲線は、既知量の精製プロテインＳ、または規定量のプロテインＳを含有する培地溶液を使用して生成される。

さらなる代替として、標準曲線は、プロテインＳ欠乏症血漿を使用して生成され得、任意選択で、既知量のプロテインＳで再構成され得る。

任意選択で、標準曲線をテストサンプルと同じプロトコルを使用して生成する。したがって、ステップは、同じ時間にわたり、方法の同じ濃度の基質を使用して実施される。

ステップ（ｄ）の標準曲線をステップ（ｃ）の結果と比較して、サンプル中の機能性プロテインＳのレベルが正常範囲内にあるか否かを決定することができることが理解されるであろう。

プロテインＳはＴＦＰＩの補因子であり、ＴＦＰＩ活性を増強する。ＴＦＰＩ自体はＦＸａ活性の阻害剤である。したがって、サンプル内の機能性プロテインＳのレベルまたはプロテインＳの活性およびＦＸａ活性のレベルの間には逆相関があると考えられる。本発明の一実施形態では、測定されたＦＸａ活性のレベルは、ＦＸａの阻害を示し、すなわち、行われた測定は、ＴＦＰＩによる阻害によるＦＸａ活性の喪失を示す。ＦＸａの阻害のレベルは、サンプル中の機能性プロテインＳ、例えば、サンプル中のプロテインＳ活性のレベル、例えば、遊離プロテインＳ、例えば、非Ｃ４ＢＰ複合体化プロテインＳのレベルを示す。

「ＦＸａ阻害のレベル」には、ＦＸａの活性の減少の意味が含まれる。ＦＶ－短およびプロテインＳは相乗的なＴＦＰＩα補因子として作用し、ＦＸａの阻害剤としてのＴＦＰＩαの活性をサポートするため、ＦＸａ阻害は機能性プロテインＳを示す。したがって、プロテインＳレベルまたは活性が増加すると、ＦＸａ阻害のレベルが増加する。したがって、この文脈では、プロテインＳの「機能」は、ＦＶ－短（およびＦＶ－短変異体）との相乗的なＴＦＰＩα補因子としてのものである。

本明細書に開示されるように、ＦＸａ阻害を、ある数の種々の方式で測定することができることが、当業者によって理解されよう。ＦＸａ活性のレベルを、例えば、低分子量の合成基質によって測定することができ、ＦＸがそれを切断するときに、それは発色を変化させる。基質変換の比率は、その時点でのＦＸａの実際の濃度に直接関連する。したがって、このような方法の場合、実施される読み取り値は吸光度であろう。合成基質はまた、蛍光読み取り値を使用することができる。

ＦＸａのレベルをまた、その天然基質プロトロンビンを使用して測定することができる。代替として、阻害または活性ＦＸａのいずれかに特異的である抗体または他の結合分子を使用して、活性化ＦＸａおよび阻害されたＦＸａを区別することができる。

一実施形態では、方法は、トロンビン生成アッセイ（ＴＧＡ）を含まない。当業者は、ＴＧＡという用語が何を意図しているか、およびどのアッセイがＴＧＡという用語に該当するかを理解するであろう。ＦＶ－短は、ＴＧＡ系に添加されるとき、凝血原効果を有し、ＴＦＰＩα活性に対するプロテインＳのいずれの効果とも切り離せないと考えられる。したがって、ＴＧＡは本発明の方法と両立しないと考えられる。

本発明の一実施形態では、サンプルは血漿である。任意選択で、サンプルはクエン酸血漿である。クエン酸血漿とは、カルシウムがキレート化されているため、凝固が進行することができないことを意味する。代替の実施形態では、他の凝固阻害剤を含有する血漿を使用することができる。代替サンプルの例には、ＥＤＴＡもしくはＬｉ－ヘパリンを含有する血漿、またはヒルジンもしくは低分子量合成トロンビン阻害剤などのトロンビン阻害剤が含まれる。

本発明の一実施形態では、サンプルは、高い希釈係数を有し、例えば、希釈係数は１／１０～１／２０００であり、任意選択で希釈係数は１／２５～１／８００であり、さらに任意選択の実施形態では、希釈係数は約１／５０～１／４００である。例えば、希釈係数は１／５０、１／１００、１／２００、または１／４００であり得る。１／Ｘの希釈係数とは、サンプルが１：Ｘの比率で存在することを意味し、式中、Ｘは希釈基質の濃度である。ＦＶ－短変異体ＦＶ－７０９－１４７６を方法で使用するとき、最大で約１／１０００～１／２０００までのより高い希釈係数を使用することができる。一方、欠乏症プロテインＳのサンプルでは、十分なプロテインＳ効果を達成するために、１／１０希釈などの低い希釈が必要となり得る。

本方法の１つの特定の予想外の利点は、プロテインＳおよびＦＶ－短の間の相乗的補因子活性が、アッセイを低濃度のプロテインＳを使用して操作することができることを意味することである。方法は、数ｎＭもの低いプロテインＳの濃度を検出することができるが、遊離プロテインＳの血漿濃度は約１００ｎＭである。

これは、上記のように、方法で使用される血漿サンプルの比較的高い希釈を可能とする。これは、血漿から潜在的に妨害または阻害する因子が希釈され、したがって、これらの基質／妨害因子が方法に及ぼすいずれの効果または影響の最小化または排除をもたらす。潜在的な凝固活性化をさらに最小化するために、本明細書に記載されるように、トロンビン阻害剤を使用することが可能である。

いくつかの実施形態では、希釈基質は緩衝液であり、したがって、方法のサンプルを緩衝液中に希釈する。任意選択で、バッファーは７～８のｐＫａを有し、Ｃａ^２＋と両立性である。

緩衝液の例には、ＨＮＢＳＡＣａ^２＋緩衝液およびＢＳＡ緩衝液が挙げられる。ＨＮＢＳＡＣａ２＋はＨｅｐｅｓ（例えば１０～５０ｍＭ）に基づく緩衝生理食塩水（約０．１５ＭＮａＣｌ）であり、サンプルが高度に希釈されるとき、ＢＳＡは担体タンパク質として使用されるウシ血清アルブミンである。代替の緩衝液オプションは、ＢＳＡおよびＣａ^２＋を有するｐＨ約７．４のＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝生理食塩水である。本発明の方法で使用することができる他の例の緩衝液には、ＭＯＰＳ、Ｔｒｉｚｍａ、ＴＥＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅが挙げられる。緩衝製剤の例は、生理食塩水およびＣａ^２＋およびＢＳＡまたは同等なタンパク質担体、例えば、オボアルブミン、ゼラチン、ヒトアルブミン、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）変異体またはタンパク質吸着を最小化する類似物を含む。

したがって、一実施形態では、本発明の方法は、低レベル（または活性）のプロテインＳ、例えば低レベル（または活性）の機能性プロテインＳ、例えば低レベル（または活性）の遊離プロテインＳ、例えば低レベル（または活性）の非Ｃ４ＢＰ複合体化プロテインＳを検出することができる。物理的存在量の観点から、サンプル中の低レベルのプロテインＳとは、希釈サンプル中の０．１～５ｎＭの範囲、および任意選択で希釈サンプル中のプロテインＳのレベルは３ｎＭ未満であり得る。

未希釈のサンプルでは、存在するプロテインＳのレベルは１０～１０００ｎＭであり得、例えば、プロテインＳのレベルは未希釈のサンプル中約１００ｎＭであり得る。ヒト血漿サンプルでは、稀な場合、遊離プロテインＳは最大で２００～３００ｎＭまでであり得る。上記で概説したように、未希釈サンプルは、０．１～５ｎＭのプロテインＳ範囲を与えるように希釈すべきである。

本発明の一実施形態では、方法は、サンプルをＣ４ＢＰと接触させることをさらに含む。任意選択で、これは方法のステップ（ａ）で実施される。

Ｃ４ＢＰとは、補体調節剤Ｃ４ｂ結合タンパク質を意味する。血漿中では、Ｃ４ＢＰは、プロテインＳとの複合体として循環し、血漿中の約３０％のプロテインＳが遊離プロテインＳとして存在し、残りはＣ４ＢＰに結合する。アッセイ／方法に添加されたＣ４ＢＰは、プロテインＳから解離して、Ｃ４ＢＰのベータ鎖のプロテインＳ結合部位を露出させる。これにより、方法におけるプロテインＳへのＣ４ＢＰの結合が可能になる。

Ｃ４ＢＰは２つの型のサブユニットで構成されており、７つのアルファ鎖がジスルフィド架橋によって相互におよび単一のベータ鎖に連結される。プロテインＳ結合部位はベータ鎖上にある。例示的なアルファ鎖遺伝子は、受託番号Ｐ０４００３を有するが、例示的なベータ鎖受託番号は、Ｐ２０８５１である。

本発明の一実施形態では、ステップ（ｂ）は、サンプルを、ＦＸａの存在下で測定可能なシグナルを放出することができる成分と接触させることをさらに含む。当業者は、そのような成分を使用して、ＦＸａ活性レベル、任意選択でＦＸａ阻害を測定することができることを理解するであろう。

一実施形態では、ＦＸａの存在下で放出される測定可能なシグナルは、蛍光または発色である。

例えば、測定可能な成分は、低分子量の合成基質であり得、それはＦＸａがそれを切断するときに発色を変え、すなわち、基質は発色性基質である。このような基質は「Ｆｘａ基質」とも呼ばれる。基質変換の比率は、その時点でのＦＸａの実際の濃度に直接関連する。別の実施形態では、合成基質はまた、蛍光読み取り値を使用することができる。これらの基質は、小ペプチドに付着される発色または蛍光基であり得る。ＦＸａはペプチドを切断し、発色または蛍光基を遊離させ、結果として生じる発色または蛍光を測定する。基がまだ付着されているとき、発色または蛍光は発生しない。

ＦＸａのレベルはまた、他の基質、例えば天然基質プロトロンビンで測定することができる。

代替の実施形態では、阻害または活性ＦＸａのいずれかに特異的である抗体または他の結合分子を使用して、活性および阻害されたＦＸａの間を区別することができる。

本発明の一実施形態では、測定可能な成分は、式：Ｚ－Ｄ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－ｐＮＡ・２ＨＣｌを有する化合物であるＳ２７６５である。

代替として、測定可能な成分は、以下からなる群から選択され得る。
（ｉ）Ｓ－２２２２（Ｂｚ－ＩＩｅ－Ｇｌｕ（γ－ＯＲ）－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－ｐＮＡ・ＨＣｌ）
（ｉｉ）ＣＨ３ＯＣＯ－Ｄ－ＣＨＡ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－ｐＮＡ－ＡｃＯＨ
（ｉｉｉ）Ｂｏｃ－Ｉｌｅ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－ＡＭＣ
（ｉｖ）Ｂｏｃ－Ｌｅｕ－ＧＬｙ－Ａｒｇ－ＡＭＣ
（ｖ）メトキシカルボニル－Ｄ－Ｎｌｅ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－ｐＮＡ
（ｖｉ）Ｔｏｓ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｌｙｓ－ｐＮＡ
（ｖｉｉ）Ｚ－Ｌｙｓ－ＳＢｚｌ・ＨＣｌ
（ｖｉｉｉ）Ｍｅｓ－Ｄ－ＬＧＲ－ＡＮＳＮ（Ｃ_２Ｈ_５）_２

任意選択で、これらの成分は酢酸塩として存在し得る。

一実施形態では、測定可能なシグナルを放出することができる成分の濃度は、０．１～２ｍＭである。好ましくは、濃度は、０．３～１ｍＭであり、より好ましくは、濃度は０．８ｍＭである。

好ましい実施形態では、成分はＳ２７６５であり、上記の濃度範囲で存在する。

本発明の一実施形態では、方法は、ステップ（ａ）および／またはステップ（ｂ）においてサンプルをトロンビン阻害剤と接触させることをさらに含む。好ましくは、トロンビン阻害剤との接触は、方法のステップ（ａ）で起こる。

「トロンビン阻害剤」とは、酵素トロンビン（第ＩＩａ因子）を阻害することができる物質を意味する。このような物質は、トロンビンを阻害することで抗凝固剤として作用する。

本明細書に開示される方法で使用するためのトロンビン阻害剤は、二価、一価、またはアロステリックトロンビン阻害剤であり得る。二価阻害剤は、トロンビンの活性部位およびエキソサイト１に結合するが、一価阻害剤は活性部位にのみ結合する。二価トロンビン阻害剤の例には、ヒルジン、ビバリルジン、レピルジン、およびデシルジンが含まれる。一価トロンビン阻害剤の例には、アルガトロバン、イノガトラン、メラガトラン、キシメラガトラン、ペファブロックおよびダビガトランが含まれる。アロステリック阻害剤には、ＤＮＡアプタマー、ベンゾフラン二量体、ベンゾフラン三量体、高分子リグニン、硫酸化β－Ｏ４リグニン（ＳｂＯ４Ｌ）が含まれる。

一実施形態では、トロンビン阻害剤は、ヒルジンまたはペファブロック（「Ｐｅｆａｂｌｏｃ」とも呼ばれる）である。

一実施形態では、方法で使用されるＦＶ－短変異体またはＦＶ－変異体は、トロンビンによる活性化に耐性である変異体である。

例えば、そのような変異体には、トロンビン切断部位がアルギニン（Ｒ）からグルタミン（Ｑ）に変異したＦＶ－短変異体およびＦＶ変異体が含まれる。特に、そのような変異体は、７０９および１５４５位の周辺で変異し、したがって、切断部位に影響を及ぼし得る。

変異体の１つの例は、ＦＶ－短ＱＱであり、それはＡｒｇ７０９位およびＡｒｇ１５４５位（全長ＦＶと同様の番号付け）の両方がＧｌｎに変異される。この変異体は、切断位置が両方とも変異しているため、トロンビン切断に耐性である［２５］。

別の例の変異体は、Ａｒｇ１５４５がＧｌｎ（Ｑ）に変異しているが、７０９位は変異しておらずＡｒｇであるＦＶ－短ＲＱ（ＦＶ－短１５４５Ｑとしても既知である）である。したがって、この変異体はＡｒｇ７０９で切断されることができるが、Ｇｌｎ１５４５では切断されない（この位置はトロンビン切断に耐性があるため）。したがって、変異体は、ＴＦＰＩα補因子機能に必要とされる酸性領域（Ｂドメインの酸性Ｃ末端部分）を保持する。別の変異体の例は、１５４５で切断することができるＦＶ－短ＱＲである。したがって、この変異体は、切断後にＴＦＰＩ補因子機能を失う。この変異体は、アッセイ前またはアッセイ中に切断されないため、アッセイでなお使用し得る。

したがって、一実施形態では、変異体ＦＶ－短を、ＦＶ－短ＱＱ、ＦＶ－短ＲＱおよびＦＶ－短ＱＲから選択する。

ＦＶ－短変異体のさらなる例には、すでに記載されたように、ＦＶ－７０９－１４７６およびＦＶ－８１０－１４９１が含まれる。

ＦＶ－７０９－１４７６と呼ばれるＦＶ－短変異体の配列を、上記の配列番号４として与える。

ＦＶ－短変異体「ＦＶ－８１０－１４９１」はアミノ酸８１１～１４９０の削除を有する。この変異体はＴＦＰＩαに結合するが、プロテインＳとの相乗的な補因子活性を有さない［２９］。これは、すべてのＦＶ－短変異体を使用して、アッセイを構築することができるわけではないことを実証する。

ＦＶ－７０９－１４７６はＦＶ－短と比較して、増加した相乗的なＴＦＰＩα－補因子活性を有するが、ＦＶ－８１０－１４９１は興味深いことに、プロテインＳとの相乗的な補因子活性をほとんどまたは全く有しない（例えば、本出願の実施例の例えば図９～１１を参照されたい。）。したがって、ＦＶ８１０－１４９１にはないが、ＦＶ－短およびＦＶ７０９－１４７６の両方に存在する配列は、ＦＶ－短およびＦＶ－７０９－１４７６の相乗的な補因子活性にとって重要であるように思われる。この配列は、全長ＦＶ（ＥＦＮＰＬＶＩＶＧＬＳＫＤＧ）の残基１４７７～１４９０に対応し、プロテインＳとの相乗的なＴＦＰＩα補因子活性に重要である。

したがって、一実施形態では、方法で使用される変異体は、ＦＶ－７０９－１４７６（配列番号４）である。

請求の範囲に記載の方法の一実施形態では、ＦＶー短変異体またはＦＶ変異体は、相乗的または増強された補因子活性を有する変異体である。「相乗的または増強された補因子」活性」とは、プロテインＳが存在しないとき、ＦＶ－短変異体またはＦＶ変異体が低いＴＦＰＩα補因子活性を示し、したがって低レベルのＦＸａ阻害を示すことを意味する。しかしながら、プロテインＳが存在するとき、ＦＶ－短変異体またはＦＶ変異体は、相乗的なＴＦＰＩα補因子としてプロテインＳと作用して、ＦＸａを不活性化し、ＦＸａ阻害のより高いレベルにつながる。したがって、存在するＦＶ－短またはＦＶ－短変異体を有しないプロテインＳは、はるかに低いＴＦＰＩα補因子活性を有し、そのはるかに高濃度のプロテインＳを効率的なＴＦＰＩα補因子活性を得るために添加しなければならない。

相乗的補因子活性を保持する変異体は、活性を保持するために酸性領域の前に十分な配列を有する。このような変異体は、ＦＶまたはＦＶ－短変異体であることができる。ＦＶ－７０９－１４７６は相乗的補因子活性を有する変異体の例であるが、ＦＶ－８１０－１４９１は相乗的補因子活性を有しない。ＦＶ－８１０－１４９１変異体と比較して、ＦＶ７０９－１４７６変異体は、ＦＶ－８１０－１４９１の酸領域が始まる１４９１部位のよりＮ末端側に１４個のアミノ酸を有する。これらの１４残基は、上記のようにＥＦＮＰＬＶＩＶＧＬＳＫＤＧ（１４７７～１４９０位）である。

したがって、一実施形態では、ＦＶー短変異体またはＦＶ変異体は、Ｂドメインの酸性Ｃ末端領域を保持する変異体である。

本発明の方法の一実施形態では、ＦＶ－変異体は、７０９および１０１８位でトロンビンによって切断することができる、および／または１５４５位でトロンビンによって切断することができない変異体である。

このような変異体の一例は、ＦＶ－１５４５Ｑと呼ばれる。これは、Ａｒｇ１５４５でＧｌｎに変異した全長のＦＶ変異体である。７０９および１０１８位のトロンビン切断部位は無傷であり、トロンビンに感受性である。切断されていない形態のこの変異体（ＦＶ－１５４５Ｑ）は、全長ＦＶに類似しており、それ自体は相乗的な補因子活性をほとんどまたは全く有しない。しかしながら、７０９および１０１８位でトロンビンにより切断した後、ＦＶは酸性領域を露出し、Ａｒｇ１５４５がＧｌｎ（Ｑ）に変異しているため、これはまだ付着している。トロンビンで切断されたＦＶ－１５４５Ｑは効率的な補因子である［３５］。

記載した本発明の一実施形態では、方法は、遊離形態のプロテインＳに特異的である。「遊離形態のプロテインＳに特異的」とは、方法が、総プロテインＳのレベルよりむしろ、遊離プロテインＳのレベルを決定することができることを意味する。これには、非Ｃ４ＢＰ複合体化Ｓタンパク質のレベルの意味が含まれる。方法は、Ｃ４ＢＰと複合体化したとき、Ｓタンパク質の特性であり得るいずれの報告されたＴＦＰＩα活性も検出しない。

一実施形態では、記載された方法は、プロテインＳ欠乏症を検出することができる。

プロテインＳ欠乏症とは、プロテインＳの正常または健康な物理的レベルを下回る、または機能性プロテインＳ活性の正常レベルを下回るという意味を含む。当業者は、何が正常または健康なレベルのＳタンパク質であると考えられるか、および何が欠乏症または不健康なレベルのＳタンパク質であると考えられるかを理解するであろう。

したがって、記載された方法は、対象がプロテインＳ欠乏症の患者であるかどうかを同定するのに好適であることが理解されるであろう。プロテインＳ欠乏症には、Ｉ型プロテインＳ欠乏症およびＩＩ型プロテインＳ欠乏症が含まれる。すなわち、いくつかの実施形態では、本発明は、対象がプロテインＳ欠乏症を有すると診断する方法を提供する。

Ｉ型プロテインＳ欠乏症は、プロテインＳレベルが減少する欠乏症である。当業者、例えば臨床医は、対象がプロテインＳ欠乏症を有すると考えられる特定の閾値を下回ることを認識している。Ｉ型は、特に低い遊離プロテインＳを有し（Ｃ４ＢＰが可能な限り多く結合するため）、これは、本発明を非常に有用にする。総プロテインＳのアッセイは、遊離プロテインＳおよび複合体化（Ｃ４ＢＰに対して）プロテインＳの両方を測定し、より低い予測値を有する。

ＩＩ型プロテインＳ欠乏症は、プロテインＳの欠陥機能によって特徴づけられる。したがって、ＩＩ型プロテインＳ欠乏症の患者は、プロテインＳの正常レベルを有するが、プロテインＳの低い機能性を有することができる。これらの場合、プロテインＳ欠乏症は、プロテインＳのＴＦＰＩα補因子活性、プロテインＳのＡＰＣ補因子活性、またはプロテインＳのＴＦＰＩα補因子活性およびプロテインＳのＡＰＣ補因子活性の両方の欠乏症であり得る。

本発明は、例えば遊離プロテインＳタンパク質の量を直接決定するよりむしろ、遊離プロテインＳ活性のレベルを決定するので、本発明は、ａ）減少した量のプロテインＳ（すなわちＩ型プロテインＳ欠乏症）、および／またはｂ）適切な量のプロテインＳタンパク質であるが、ＴＦＰＩα補因子としてのプロテインＳ活性が低いかまたは不在であるプロテインＳ欠乏症を検出することができる。したがって、方法は、Ｉ型プロテインＳ欠乏症の患者を同定することができる。方法は、欠乏症ＴＦＰＩα－補因子活性を有するＩＩ型プロテインＳ欠乏症の患者を同定することができる。方法は、ＡＰＣ補因子活性欠乏症としてのみ存在する欠乏症を検出することには好適でない。

理論上の可能性は、ＴＦＰＩαに対する低い補因子活性によって特徴づけられるＩＩ型プロテインＳ欠乏症の症例があり得るということである。したがって、一実施形態では、方法は、欠陥ＴＦＰＩα補因子活性を有するＩＩ型プロテインＳ欠乏症を同定することが可能であり得る。

ＩＩＩ型プロテインＳ欠乏症は、正常レベルの総プロテインＳによって特徴付けられるが、減少したプロテインＳ活性に随伴する低レベルの遊離プロテインＳはプロテインＳ活性の低下によって特徴づけられる。本発明は、複合体化プロテインＳではなくプロテインＳの遊離プールにのみ随伴するプロテインＳ活性を検出するので、本発明はまた、ＩＩＩ型プロテインＳ欠乏症の検出に好適である。

プロテインＳ欠乏症は、ヘテロ接合性またはホモ接合性のプロテインＳ欠乏症であり得る。ほとんどの患者はヘテロ接合性であり、重度の病気の子供たちのごくわずかな症例のみがホモ接合性の欠乏症を有すると記載されている。

一実施形態では、プロテインＳ欠乏症は後天性であり得る。後天性欠乏症は、例えば、自己抗体によって引き起こされ得る。本発明は、遊離プロテインＳのレベルまたは活性のみを検出するので、本発明は自己抗体に結合したプロテインＳの活性のレベルを検出せず、したがって抗プロテインＳ自己抗体の存在から生じるプロテインＳ欠乏症を検出するのに適切であると考えられる。後天性欠乏症はまた、例えば、肝疾患またはビタミンＫ欠乏症が原因であり得る。自己抗体によって引き起こされるプロテインＳ欠乏症状態の例は、抗体がプロテインＳとの交差反応を形成するウイルス感染の後に発生し得る状態である。プロテインＳ欠乏症について記載されているそのようなウイルス感染症の１つは、Ｖａｒｉｃｅｌｌａウイルス感染症である。エイズはまた、低プロテインＳレベルに随伴している。抗リン脂質抗体症候群（ループス抗凝固因子）はまた、後天性プロテインＳ欠乏症に随伴している。

プロテインＳの大部分は肝臓で産生されるため、肝疾患はプロテインＳ欠乏症に随伴する。正しいプロテインＳの合成にはビタミンＫが必要であるため、ビタミンＫ欠乏症はプロテインＳ欠乏症に随伴する。プロテインＳは、修飾アミノ酸であるガンマカルボキシグルタミン酸を含有するビタミンＫ依存性タンパク質である。妊娠はまた、遊離プロテインＳの減少したレベルに随伴しており、本発明の方法で妊婦からのサンプルを測定することは興味深くあり得る。

一実施形態では、対象はヒトである。

一実施形態では、対象は、ワルファリンで処置されている患者である。

一実施形態では、対象は、静脈血栓塞栓症（ＶＴＥ）を有すると診断された、またはその疑いがある患者である。代替として、対象は、ＨＩＶ感染、ＡＩＤＳ、またはプロテインＳに対する自己抗体によって引き起こされる低タンパク質レベルを有すると診断された、またはその疑いがある患者である。一実施形態では、患者は、ビタミンＫ欠乏症または肝疾患を有する。一実施形態では、対象は妊婦である。

本発明の方法の一実施形態では、ＦＶ－短もしくはＦＶ－短変異体またはＦＶ変異体の濃度は、０．５～２０ｎＭであり、任意選択で、濃度は２ｎＭである。

本発明の方法の一実施形態では、ステップ（ａ）は、３７℃で１～１５分実施され、任意選択で、時間は１０分である。好ましくは、時間は１０分未満である。

任意選択で、ステップ（ｃ）を１０～３０分実施し得、例えば、ステップ（ｃ）は約１５分間実施され得る。

本発明の一実施形態では、方法におけるＦＸａに対するＴＦＰＩアルファの比率は、約１：１である。

本発明の方法の一実施形態では、ＦＸａの濃度は、０．１～１ｎＭである。任意選択の実施形態では、ＦＸａの濃度は、０．２～０．６ｎＭである。任意選択で、ＦＸａの濃度は０．３ｎＭである。

本発明の方法の一実施形態では、ＴＦＰＩアルファの濃度は、０．１～１ｎＭである。任意選択の実施形態では、ＴＦＰＩアルファの濃度は、０．２～０．６ｎＭである。任意選択で、ＴＦＰＩアルファの濃度は０．３ｎＭである。

本発明の方法は、総プロテインＳレベルを決定するための方法と併せて実施され得ることが、当業者によって理解されるであろう。

総プロテインＳを、当業者に既知の様々なアッセイで測定することができる。このようなアッセイには、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫放射測定アッセイ（ＩＲＭＡ）、ローレル電気免疫測定法および放射免疫測定法（ＲＩＡ）などのプロテインＳに対する抗体を使用するアッセイが含まれる。総プロテインＳのアッセイの別の例は、自動機器でのラテックスに基づく凝集アッセイである。

本発明の第２の態様は、第１の態様に従って記載された方法を使用してプロテインＳ欠乏症を有する対象を同定し、この対象に治療薬を投与することを含む処置方法である。

本発明の第２の態様の一実施形態では、この対象に投与される治療薬は、抗凝固治療薬である。抗凝固療法の例は当業者に既知であり、ワルファリン、およびＦＸａ阻害剤またはトロンビン阻害剤が含まれる。

ＦＸａ阻害剤には、直接（例えば、リバロキサバン、アピキサバン、およびエドキサバン）および間接（例えば、フォンダパリヌクス）の両方のＦＸａ阻害剤が含まれる。

トロンビン阻害剤の例は、本明細書において上で概説される。

本発明の第３の態様によれば、サンプル中の機能性プロテインＳレベルを決定するためのキットが提供される。本発明のキットは、本発明による方法を実施するために必要な任意の成分を含み得る。一実施形態では、キットは、
ＴＦＰＩα、ＦＸａ、リン脂質小胞、ＦＸａ基質（例えばＳ２７６５）、およびＦＶ－短もしくはＦＶ－短変異体または機能的に同等なＦＶ－変異体から選択されるＦＶのうちの２つ以上を含む。

任意選択で、キットは、ＴＦＰＩα、ＦＸａ、リン脂質小胞およびＦＸａ基質（例えば、Ｓ２７６５）、ならびにＦＶ－短もしくはＦＶ－短変異体または機能的に同等なＦＶ－変異体のすべてを含む（本発明の第１の態様に関連する上記の通り）。

キットはまた、プロテインＳのＡＰＣ補因子活性を検出するための１つ以上の成分を含み得、例えば、抗ＴＦＰＩα抗体を含み得る。例えば、一実施形態では、キットは、抗ＴＦＰＩα抗体ならびに、ＴＦＰＩα、ＦＸａ、リン脂質小胞、ＦＸａ基質（例えば、Ｓ２７６５）、およびＦＶ－短もしくはＦＶ－短変異体または機能的に同等なＦＶ変異体から選択されるうちの任意の１つ以上のＦＶを含む。

一実施形態では、キットは、少なくとも抗ＴＦＰＩα抗体ならびに、ａ）ＦＶ－短もしくはＦＶー短変異体または機能的に同等なＦＶ変異体から選択されるＦＶ、および／またはｂ）ＦＸａを含む。

本発明の第４の態様によれば、本発明の第１の態様に従う方法を使用してサンプル中の機能性プロテインＳレベルを決定するのに好適なキットが提供される。

本発明はまた、プロテインＳ欠乏症を有する対象を処置する際に使用するための治療薬を提供し、プロテインＳ欠乏症は、本発明に従う方法、例えば本発明の第１の態様に従う方法を使用して同定される。いくつかの実施形態では、治療薬は、本明細書に記載されるように、抗凝固剤である。

本発明はまた、プロテインＳ欠乏症を処置するための薬剤を製造するための治療薬の使用を提供し、プロテインＳ欠乏症は、本発明に従う方法、例えば、本発明の第１の態様に従う方法に従って同定される。いくつかの実施形態では、治療薬は、本明細書に記載されるように抗凝固剤である。

本発明はまた、対象を、プロテインＳ欠乏症を有すると診断する方法を提供し、プロテインＳ欠乏症は、本発明の方法に従って、例えば、本発明の第１の態様による方法に従って同定される。

上で考察されたように、方法は、プロテインＳのＴＦＰＩα補因子活性を特異的に検出することができる。この観点から、プロテインＳのＡＰＣ補因子活性を検出するための別個のアッセイを実施することと組み合わせて、
ａ）両方の補因子活性が欠乏症であるか否か－そのような状況は、プロテインＳの物理的存在量が低いＩ型欠乏症、遊離プロテインＳの存在量が低いＩＩＩ型欠乏症で発生すると予想され、もしプロテインＳのＴＦＰＩα補因子活性およびＡＰＣ補因子活性の両方が欠陥性であるならば、ＩＩ型欠乏症で発生すると予想され得、または
ｂ）プロテインＳのＴＦＰＩα補因子活性またはＡＰＣ補因子活性の１つだけが影響を受けるか否か、を決定することが可能である。このような状況は、Ｉ型およびＩＩＩ型欠乏症では存在するとは予測されない。

本発明の方法のいずれも、サンプル中のプロテインＳのＡＰＣ補因子活性を決定するための方法と組み合わせて実施され得る。

したがって、本発明はまた、対象を、プロテインＳのＴＦＰＩα補因子活性、プロテインＳのＡＰＣ補因子活性、またはプロテインＳのＴＦＰＩα補因子活性およびＡＰＣ補因子活性の両方に欠乏症を有するとして診断する方法を提供し、この方法は、
ａ）プロテインＳのＴＦＰＩα補因子活性のレベルを決定することであって、この決定することは、例えば、以下のステップを含むか、またはそれらのステップからなる本明細書に記載の本発明の方法に従って実施され、
（ｉ）対象から得られたサンプルを、ＴＦＰＩαおよび、ＦＶ－短、もしくはＦＶ－短変異体、または機能的に同等なＦＶ変異体のうちの１つ以上と接触させるステップと、
（ｉｉ）サンプルをＦＸａと接触させるステップと、
（ｉｉｉ）サンプル中のＦＸａ活性のレベルを測定するステップであって、
ＦＸａ活性のレベルは、サンプル中の機能性プロテインＳのレベルを示す、測定するステップと、
ｂ）サンプル中のＡＰＣ補因子活性のレベルを決定するステップと、を含む。

両方の活性のレベルを対照レベルと比較することにより、補因子活性の一方のみまたは両方が欠乏症であるか否かを決定することができる。この情報がわかれば、欠乏症のうちの一方または両方を軽減するための好適な処置戦略を立てることができる。例えば、もし対象がプロテインＳのＴＦＰＩα補因子活性のみに欠乏症を有するならば、好適な治療戦略を立て得る。

代替として、もしプロテインＳのＡＰＣ補因子活性のみが欠乏症であるならば、好適な処置戦略を立て得る。

ＴＦＰＩα補因子活性欠乏症およびＡＰＣ補因子欠乏症の適切な治療薬は同じであり得る。

両方の補因子機能が影響を受ける場合、両方の処置オプションが適切であり得る。

（本発明の方法を使用して）ａ）プロテインＳのＴＦＰＩα補因子活性のみ、ｂ）プロテインＳのＡＰＣ補因子活性のみ、またはｃ）プロテインＳのＴＦＰＩα補因子活性およびプロテインＳのＡＰＣ補因子活性の両方に欠乏症を有すると決定された対象を、上記治療法で処置する方法がまた、本発明に包含される。

本明細書の明らかに先に公開された文献のリストまたは考察は、その文献が当該技術分野の水準の一部であるか、または共通の一般知識であることを認めるものと必ずしも解釈されるべきではない。

本発明の特定の態様を具体化する好ましい非限定的な実施例を、以下の図面を参照してここで説明する。

ＦＸａの阻害におけるＴＦＰＩαの補因子としてのプロテインＳの効果。ＦＶ－短（２ｎＭ）を、ＦＸａ（０．３ｎＭ）、２５ｕＭＰＬ（２０／２０／６０：ＰＳ／ＰＥ／ＰＣ）、ＴＦＰＩα（０．２５ｎＭ）とともに、様々な濃度のプロテインＳ（上記）または血漿の希釈液（下記）の存在下でインキュベートした。基質（Ｓ－２７６５）の変換を９００秒間モニターし、曲線の傾きが徐々に減少したことは、ＦＸａアミド分解活性の阻害を示す。ＦＸａの阻害におけるＴＦＰＩαの補因子としてのプロテインＳの特異性。方法および図１の凡例に記載されるように、ＴＦＰＩαを介したＦＸａ活性の阻害を追跡した。この実験では、正常血漿およびプロテインＳ欠乏症血漿の混合物を１／１００希釈液でテストした。この希釈液では、正常な血漿は最大のＦＸａ阻害をもたらすが、プロテインＳ欠乏症血漿は活性を有しない。正常／プロテインＳ欠乏症血漿の比率が増加すると、用量依存的な効果が観察される。ＴＦＰＩα補因子活性の喪失をもたらすＣ４ＢＰのプロテインＳへの結合。ＦＶ－短（２ｎＭ）およびプロテインＳ（５ｎＭ）の存在下でのＴＦＰＩα（０．２５ｎＭ）によるＦＸａ（０．３ｎＭ）のＴＦＰＩαを介した阻害は最大であり、低い吸光度曲線をもたらした。プロテインＳに高い親和性で結合するＣ４ＢＰの増加する濃度を添加すると、プロテインＳの補因子活性の用量依存的喪失をもたらし、３．１３ｎＭＣ４ＢＰではプロテインＳの補因子効果の多くが失われ、６．２５ｎＭでは補因子の活性は完全に遮断された。プロテインＳ欠乏症血漿はＴＦＰＩα補因子活性をほとんど含有しない。ＦＶ－短（２ｎＭ）および対照（Ｅ、Ｆ、Ｇ、およびＨ）またはプロテインＳ欠乏症個体（Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤ）のいずれかからの血漿希釈液の存在下でのＴＦＰＩα（０．２５ｎＭ）によるＦＸａの阻害を、合成基質Ｓ－２７６５でモニターした。血漿中のプロテインＳのＴＦＰＩα補因子活性の標準曲線の例。プロテインＳの供給源としての正常血漿の種々の希釈液の存在下でのＴＦＰＩαプラスＦＶ－短によるＦＸａ阻害を９００秒間モニターした。最終吸光度を使用して、１００％が１／２００希釈液、５０％が１／４００希釈液などを表す標準曲線を構築した。プロテインＳ欠乏症患者および対照の血漿中の機能性プロテインＳレベル。対照およびプロテインＳ欠乏症の個体からの血漿プロテインＳのＴＦＰＩα補因子活性のアッセイの結果は、プロテインＳ欠乏症を有する個体（左）およびプロテインＳ欠乏症を有しない個体（右）の間でプロテインＳ値の良好な分離を実証した。遊離プロテインＳの古いテストおよび新しい機能性アッセイ間の相関。新しいテストの結果を、免疫学的遊離プロテインＳアッセイで以前に決定された結果と比較した。総プロテインＳの古いテストおよび新しい機能性アッセイ間の相関。新しいテストの結果を、免疫学的総プロテインＳアッセイで以前に決定された結果と比較した。ＦＶ－短およびＦＶ－短変異体の比較を示す。ＦＶ変異体の濃度は様々であるが、プロテインＳ（３ｎＭ）、ＴＦＰＩα（０．２５ｎＭ）、およびＦＸａ（０．３ｎＭ）は一定である。ここでプロットされている値は、９００秒後に到達した吸光度である。３つの変異体による基質発達の時間曲線を示す。ＦＶ－変異体の濃度は１ｎＭであり、ＦＸａ（０．３ｎＭ）およびＴＦＰＩα（０．２５ｎＭ）は、ＦＶ－変異体の濃度と同様に一定である。プロテインＳの濃度は様々である。プロテインＳの供給源として血漿希釈液を使用するＦＶ－短およびＦＶ７０９－１４７６の比較を示す。ＦＶ－短、ＦＶ－短１５４５Ｑ、トロンビン切断型ＦＶ－短１５４５Ｑ、トロンビン切断型ＦＶ－１５４５ＱのプロテインＳ滴定をすべてＴＦＰＩαで示す。

実施例１－機能性プロテインＳのアッセイ
概要
ＦＶ－短、プロテインＳおよび負に帯電したリン脂質小胞の存在下でのＦＸａのＴＦＰＩαを介した阻害を、合成基質Ｓ２７６５によって時間でモニターした。希釈血漿をプロテインＳの供給源として使用し、血漿希釈液を使用して標準曲線を構築した。

材料および方法
患者－以前に特徴づけられた種々のプロテインＳ欠乏症家族からの個々のクエン酸血漿サンプル（ｎ＝３６）は、実験室で利用可能であった［２６］。他の遺伝性抗凝固タンパク質欠乏症を有するワルファリンで処置された４人の個体、すなわち３人のプロテインＣ欠乏症個体および１人の抗トロンビン欠乏症個体もまた利用可能であった。サンプルは、９０年代の収集時から－８０℃で保管されていた。プロテインＳ欠乏症または血栓症の病歴のない健康な家族（ｎ＝３７）のメンバーから選択されたサンプルを対照として使用した。総および遊離プロテインＳの血漿濃度の値は、公開された研究から利用可能であった。［２６］。サンプル中の遊離および総プロテインＳを決定する方法は以前に説明された［２７］。健康な個体から収集されたクエン酸血漿プールを使用して標準曲線を創出し、プール内の機能性プロテインＳ濃度を１００％に設定した。

材料－ヒトＦＸａは、ＨｅｍａｔｏｌｏｇｉｃＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ（ＨＴＩ）からのものであり、プロテインＳ欠乏症血漿はＥｍｚｙｍｅＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓからのものであった。真核細胞で発現したＴＦＰＩαは、Ｃｈｅｍｏ－Ｓｅｒｏ－ＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＪａｐａｎのＤｒＴＨａｍｕｒｏからの寄贈品であった。ＦＶ－短を、以前に記載されたように発現および精製し［２５］－ＦＶ７０９－１４７６［２８］およびＦＶ－８１０［２９］を同様の技術で発現および精製した。ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、およびホスファチジルコリン（ＰＣ）は、ＡｖａｎｔｉＰｏｌａｒＬｉｐｉｄｓからのものであった。リン脂質小胞を、以前に説明されたようにＬｉｐｏｓｏＦａｓｔ基本押出機（Ａｒｍａｔｉｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して調製した［３０］。リン脂質小胞を２日以内に使用した。合成基質Ｓ２７６５は、ＣｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘＬｔｄ，Ｍｉｌａｎ，Ｉｔａｌｙから提供された。プロテインＳが結合していないＣ４ＢＰを、説明されるように精製した［３１］。

プロテインＳを介したＴＦＰＩα－補因子活性のアッセイ－このアッセイは、以前に説明された技術［２５］を使用する、精製システムでのＴＦＰＩαによるＦＸａの阻害に基づく。このアッセイでは、ＦＶ－短（２ｎＭ最終濃度）をリン脂質（ＰＳ：ＰＥ：ＰＣの２０：２０：６０、２５ｕＭ）、ＴＦＰＩα（０．２５ｎＭ最終濃度）、プロテインＳの供給源としてＨＮＢＳＡＣａ^２＋緩衝液（２５Ｈｅｐｅｓ、０．１５ＭＮａＣｌ、５ｍＭＣａＣｌ_２ｐＨ７．７、０．５ｍｇ／ｍｌ、ウシ血清アルブミンおよび５単位／ｍｌＨｉｒｕｄｉｎを含有する）に希釈した血漿とともに３７℃で１０分間インキュベートした。反応を、Ｓ２７６５（０．８ｍＭ）およびＦＸａ（０．３ｎＭ）の添加によって開始させ、その後１５分間、ＴｅｃａｎＩｎｆｉｎｉｔｅ２００システムで４０５ｎＭの吸光度をモニターした。各実験で与えられた濃度は最終濃度である。

プロテインＳの阻害は、Ｃ４ＢＰによるＴＦＰＩα補因子として機能する。遊離およびＣ４ＢＰ結合プロテインＳの両方がＴＦＰＩα補因子として機能するかどうかを調べるために、精製したＣ４ＢＰ（０～５０ｎＭ）の増加する濃度を、５ｎＭプロテインＳを含有するＦＸａ阻害アッセイに添加した。

結果
負に帯電したリン脂質小胞、ＦＶ－短、および精製プロテインＳまたは希釈プール血漿の存在下でのＴＦＰＩαによるＦＸａの阻害を、時間内で追跡した（図１）。プロテインＳまたは血漿の不在下、吸光度曲線はほぼ線形であり、ＦＶ－短のみの存在下ではＴＦＰＩαによるＦＸａの阻害がほとんどないことを示唆した。増加する濃度のプロテインＳの添加は、ＦＸａの用量依存的阻害を与え、１．２５ｎＭプロテインＳで５０％阻害し、５ｎＭで最大阻害した。同様に、プロテインＳの代わりに希釈血漿をアッセイに含めると用量依存性阻害をもたらし、１／５０希釈で最大阻害、１／２００で約５０％阻害が観察された。アッセイにおけるプロテインＳのＴＦＰＩα－補因子効果は、ＦＶ－短の存在に依存し、ＦＶ－短を添加の不在下、プロテインＳ（最大１０ｎＭ）も血漿（最大で１／１００までの希釈）もＦＸａ阻害のいずれの刺激ももたらさなかった。

プロテインＳ欠乏症血漿の添加は、ＦＸａ阻害の刺激を与えなかったため、アッセイはプロテインＳに特異的であった（図２）。正常およびプロテインＳ欠乏症血漿の混合物を、１／１００希釈液でアッセイに含めた。正常／プロテインＳ欠乏症血漿の比率を増加させると、用量依存的に増加したＦＸａ阻害をもたらし、３：７の比率で５０％近くの阻害が観察され、これは、図１に見られる正常血漿の１／２００希釈液とほぼ同じ量のプロテインＳをアッセイに提供する。

遊離およびＣ４ＢＰ複合体化形態の両方のタンパク質がＴＦＰＩα補因子として活性であるかどうかを調べるために、増加する濃度（０～５０ｎＭ）のＣ４ＢＰを、５ｎＭプロテインＳを含有する反応液に含めた（図３）。添加されたＣ４ＢＰの不在下、ＦＸａ阻害のプロテインＳを介した刺激は最大であった。増加する濃度のＣ４ＢＰを添加すると、用量依存的に増加した吸光度をもたらし、プロテインＳＴＦＰＩα－補因子活性の遮断を示唆し、６．２５ｎＭＣ４ＢＰではプロテインＳ効果は観察されなかった。これは、プロテインＳおよびＣ４ＢＰの１：１の化学量論的複合体の形成がＴＦＰＩα－補因子活性の喪失をもたらすことを示唆する。

既知の遺伝性プロテインＳ欠乏症を有する３６人の患者のコホート、および以前の家族研究から同定された３７人の年齢および性別が適合する健康な対照を、アッセイでテストした。図４は、４人のプロテインＳ欠乏症個体および４人の健康な対照からの吸光度の読み取り値を示す。テストされるべき血漿を、プロテインＳの正常濃度からプロテインＳ欠乏症における低プロテインＳレベルの間の範囲をカバーするために、１／５０、１／１００、１／２００、および１／４００に希釈した。

プロテインＳの供給源として希釈血漿を使用するアッセイからの９００秒目の最終読み取り値を利用して、ＴＦＰＩα補因子としてのプロテインＳ活性を定量化するための標準曲線を構築した（図５）。１／２００希釈液は約５０％の阻害をもたらしたため、これを１００％に設定した。その結果、１／４００の読み取り値は５０％に対応し、１／１００の希釈液は２００％に対応した。最良の吸光度読み取り値範囲は０．１～０．２５であり、患者および対照の両方をいくつかの希釈液で分析したため、その範囲内の読み取り値を取得することが可能であった。

プロテインＳ欠乏症個体および対照のテスト結果を図６に示す。患者および対照の間に機能性プロテインＳ値の分離があった。患者および対照の平均±ＳＤ値はそれぞれ３５±２０および１２０±２５であった。患者の値は８～８３の範囲であり、対照の値は８５～１８６の範囲であった。２つのアッセイ間の相関は高く、ｒ値は０．９３、傾きは０．８２、Ｙ切片は－４．６であった。これは、アッセイが遊離形態のプロテインＳの活性を測定していることを示唆する。

機能性プロテインＳ値はまた、総プロテインＳ値とも相関した（図８）。この相関（ｒ値０．８８）は、遊離プロテインＳとの相関よりも低かった。傾きは０．４４で、Ｙ切片は４６であった。これらの結果は、相乗的なＴＦＰＩα－補因子活性が遊離形態のプロテインＳのみに随伴するという結論と一致する。

プロテインＳ欠乏症例のうち４例はワルファリンで処置された。それらの機能性プロテインＳ値の平均±ＳＤは１０．９±４％であり、８．０～１６．６％の範囲であった。これは、遊離プロテインＳアッセイの結果とよく一致する（８．９±４％、範囲３．２～１２．９）。他の遺伝性抗凝固薬欠乏症を有する４人の患者（３人のプロテインＣ欠乏症および１人の抗トロンビン欠乏症）をプロテインＳ異常のない症例に対するワルファリン処置の効果を解明するために、テストした。これらの症例の平均±ＳＤ機能性プロテインＳ値は、６３．０±２３％であり、３４．３～９８．９の範囲にあったが、平均±ＳＤ遊離プロテインＳ値は３９．５±１９．６％であり、２２．６～６７．７％の範囲にあった。これは、ＴＦＰＩα機能性テストが、遊離プロテインＳアッセイと同様に、ワルファリン処置の症例においてもプロテインＳ欠乏症を検出するのに同等に効率的であることを示唆する［２６］。

新しいテストのアッセイ内変動を評価するために、１つの正常および１つのプロテインＳ欠乏症例を９回分析した。正常な症例の平均±ＳＤは８５．４±４．３％であり、７７．２～９２．４％の範囲にあった。プロテインＳ欠乏症例の対応する値は４７．８±５．４％であり、４０．０～５３．７％の範囲にあった。したがって、プロテインＳレベルが正常なサンプルのアッセイ内変動係数は５．１％であったが、プロテインＳ欠乏症のサンプルでは１０．６％であった。

考察
ビタミンＫ依存性プロテインＳは多機能血漿タンパク質である［２］。それは、血液凝固のいくつかの反応の抗凝固調節剤として重要である。ＡＰＣに対する補因子として、それはテナーゼ（ＦＶＩＩＩａ）およびプロトロンビナーゼ（ＦＶａ）複合体における補因子の活性を制御する。さらに、それは遊離ＦＸａの調節におけるＴＦＰＩαの補因子として機能する［２、１５、３２］。プロテインＳのＴＦＰＩα補因子活性がＦＶ－短によって刺激され、ＦＶ－短およびプロテインＳが相乗的に機能するという最近の観察は、複雑さを増したが、ＴＦＰＩα補因子としての血漿プロテインＳの機能についてのアッセイを考案する機会もまた提供する［３、２５］。ここで、我々はＦＶ－短、血漿サンプルからのプロテインＳ、および負に帯電したリン脂質小胞の存在下でのＴＦＰＩαによるＦＸａの阻害率に基づくこのような機能性プロテインＳアッセイの創出および特性評価について報告する。

プロテインＳの相乗的なＴＦＰＩα－補因子活性は、プロテインＳの遊離形態に厳密に拘束された。これは、プロテインＳのＳＨＢＧ様領域、ＴＦＰＩαと相互作用することがまた既知である領域に位置するプロテインＳ上のＣ４ＢＰの結合部位と一致する［１、２、１６、３３］。プロテインＳのＡＰＣ補因子活性はまた、遊離形態のプロテインＳによって優先的に発現され、Ｇｌａドメイン、ＴＳＲ、ＥＧＦドメイン、およびＳＨＢＧ様領域を含むプロテインＳのいくつかの領域がＡＰＣ補因子活性にとって重要であることが示されてきた。ＴＦＰＩαを介したＦＸａ阻害反応は、負に帯電したリン脂質で起こるため、プロテインＳのＧｌａドメインは、プロテインＳのＴＦＰＩα補因子活性にとって重要であると予想される。これは、いくつかの非プロテインＳ欠乏症ワルファリン処置患者の低い機能性プロテインＳレベルと一致する。

Ｃ４ＢＰはプロテインＳに高い親和性で結合し、これは、例えば遺伝性プロテインＳ欠乏症におけるプロテインＳの血漿レベルの減少が、遊離プロテインＳの減少レベルに優先的に反映される理由を説明する。したがって、遊離プロテインＳのアッセイは、プロテインＳ欠乏症の診断のための総プロテインＳについてのそれらよりも優れる［２６］。しかしながら、遊離プロテインＳのためのアッセイは、機能性プロテインＳ欠乏症を検出することはできない。プロテインＳのＡＰＣ補因子活性のためのアッセイは、プロテインＳのＡＣＰ補因子活性に機能的欠陥を有する症例、いわゆるＩＩ型プロテインＳ欠乏症を検出することが示されてきた。ＴＦＰＩα補因子としてのプロテインＳの機能についてのここに記載されたアッセイは、遊離プロテインＳのレベルだけでなく、ＴＦＰＩα補因子としてのその機能的活性およびＴＦＰＩα補因子機能に欠陥があるＩＩ型症例を検出するのにも好適である。最近、ＴＦＰＩα補因子としてのプロテインＳの別の機能性アッセイが記載された［３４］。このアッセイは、プロテインＳ欠乏症および患者血漿の混合物に一定量のＴＦＰＩαを添加する、ＴＦが開始するトロンビン生成アッセイに基づく。このアッセイは、プロテインＳおよびＦＶ－短の間の相乗的なＴＦＰＩα－補因子活性を利用しないため、我々がここに記載するものとは概念的に異なっており、これは、いずれの内因性のＦＶ－短の量もアッセイには少なすぎるためである。著者らは、このアッセイがプロテインＳ欠乏症のほとんどの症例を検出したが、総および遊離プロテインＳの相関は比較的低いことを発見した。

ここで記載されるアッセイは、プロテインＳ欠乏症血漿のＴＦＰＩα補因子活性の欠如によって実証されるように、プロテインＳに特異的である。このアッセイは、低濃度（＜３ｎＭ）のプロテインＳを必要とし、正常血漿の１／１００希釈液により、２ｎＭＦＶ－短の存在下で最大のＴＦＰＩα－補因子活性が得られる。ＦＶ－短を添加しないと、このような血漿希釈液ではＴＦＰＩα－補因子活性はほとんどまたは全くない。プロテインＳ欠乏患者からの血漿中の非常に低レベルのプロテインＳを検出するには、より低い希釈係数（１／２５または１／５０）を使用することができる。以前に特徴づけられたプロテインＳ欠乏症家族からの血漿を新しいアッセイでテストし、その結果を免疫学的テストで決定された遊離および総プロテインＳの両方の濃度と比較した。新しい機能性アッセイの結果は、遊離プロテインＳ濃度とよく相関し、０．９２のｒ値であった。相関線のＹ軸切片は０に近く、線の傾きは１をわずかに下回った。総プロテインＳとの相関はわずかにより低く、ｒ値は０．８８であった。興味深いことに、Ｙ軸の切片は約４６％で、直線の傾きは０．４４であった。高い切片は、ＴＦＰＩα－補因子アッセイが遊離プロテインＳに特異的であることを示す結果と一致する。

新しい機能性テストは、プロテインＳ欠乏症を有するおよび有しない症例の間の良好な分離を有するプロテインＳ欠乏症例を正確に検出した。４つの症例では、値はより低い正常の値に非常に近かった。これらの４つの症例は、プロテインＳ欠乏症例が比較的高い遊離プロテインＳレベルを有した家族からのものであった。そのような家族の１つは以前の刊行物では家族１８と呼ばれ、境界例のうちの２つはこの家族からのものであった［２６］。他の２つの境界例は、同様の表現型を有する他の２つの家族からのものであった。

結論として、我々はここで、血漿プロテインＳのＴＦＰＩα補因子活性の新しいテストについて記載し、これは、プロテインＳおよびＦＶ－短の間の最近記載された相乗性を利用する。このテストは、遊離プロテインＳのＴＦＰＩα補因子活性に特異的であり、遺伝性プロテインＳ欠乏症を有する症例ならびに正常なプロテインＳレベルおよび活性を有する症例の間を区別する。さらに、このテストは、欠陥ＴＦＰＩα補因子活性を有するＩＩ型プロテインＳ欠乏症を検出することができるはずである。そのような患者はまだ同定されていない。

実施例２－ＦＶ変異体およびＦＶー短変異体の特性
我々が機能的活性の観点から特徴づけた、いくつかのＦＶ－短変異体がある。２つのそのような変異体は、ＦＶ－７０９－１４７６およびＦＶ－８１０－１４９１と呼ばれる（本明細書に記載されるように）。ＦＶ－７０９－１４７６はＦＶ－短（ＦＶ－７５６－１４５８とも呼ばれる）と比較して増加した相乗的なＴＦＰＩα－補因子活性を有するが、ＦＶ－８１０－１４９１は興味深いことに、プロテインＳとの相乗的な補因子活性を有しない。

これを図９に示し、ここでは、ＦＶ変異体の濃度は様々であるが、プロテインＳ（３ｎＭ）、ＴＦＰＩα（０．２５ｎＭ）、およびＦＸａ（０．３ｎＭ）の濃度は一定である。ここにプロットされている値は、９００秒後に到達した吸光度である。ＦＶ－７０９－１４７６は、ＦＶ－短よりもわずかにより効率的であるが、ＦＶ－８１０－１４９１は効率がより低い。

図１０は、３つの変異体による基質発達の時間曲線を示す。この実験では、ＦＶ－変異体の濃度は１ｎＭである。ＦＸａ（０．３ｎＭ）およびＴＦＰＩα（０．２５ｎＭ）濃度は、ＦＶ－変異体濃度と同様に一定である。プロテインＳの濃度は様々である。図１０は、添加されたプロテインＳがより強い刺激効果を有するため、ＦＶ－７０９－１４７６がいくらかより効率的であることを示す。これは、実験を通して一貫した発見である。特に注目すべきは、ＦＶ－８１０－１４９１によるプロテインＳの効果の欠如であり、この変異体がプロテインＳとの相乗効果を有しないことを示す。

図１１は、プロテインＳの供給源として血漿希釈液を使用して行われた同様の比較を示す。図１１は、９００秒の時点からの吸光度を示す。図１１は、ＦＶ－短変異体と比較してＦＶ－７０９－１４７６変異体では血漿を約２倍に希釈することができることを示しており、ＦＶ－７０９－１４７６変異体がより高い活性を有することを示す。

図１２は、変異体ＦＶ－短１５４５Ｑの活性を示す（Ａｒｇ（Ｒ）がＧｌｎ（Ｑ）で置き換えられるため、１５４５位でのトロンビン切断に耐性がある）。図１２の図解された時間経過では、この変異体はＦＶ－短に本質的に類似しており、さらに、この変異体をトロンビンとインキュベートした後も活性が残っていることが明らかである。ＦＶ－短１５４５Ｑ変異体はＡｒｇ７０９で切断されるが、Ｂドメインの酸性Ｃ末端部分はまだ付着しているため、この変異体は相乗的な補因子活性を保持する。

図１２に示される他の変異体は、またＡｒｇ１５４５からＧｌｎに変異しており、ＦＶ－１５４５Ｑと呼ばれる［３５］、全長ＦＶ変異体（図の下部、図１２の２ページ目）である。７０９および１０１８位のトロンビン切断部位は無傷であり、トロンビンに感受性がある。切断されていない形態のこの変異体（ＦＶ－１５４５Ｑ）は、全長ＦＶに類似しており、それ自体は相乗的な補因子活性を全くまたはほとんど有しない［２５］。しかしながら、トロンビンで切断した後（７０９および１０１８）、Ａｒｇ１５４５がＧｌｎ（Ｑ）に変異しているため、ＦＶはまだ付着している酸性領域を露出する。時間曲線から、トロンビンで切断されたＦＶ－１５４５Ｑが他の変異体と同等に効率的であることが明らかである。

参考文献
１．Ｄａｈｌｂａｃｋ，Ｂ．（２００７）ＴｈｅｔａｌｅｏｆｐｒｏｔｅｉｎＳａｎｄＣ４ｂ－ｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ，ａｓｔｏｒｙｏｆａｆｆｅｃｔｉｏｎ．ＴｈｒｏｍｂＨａｅｍｏｓｔ９８（１），９０－６．
２．Ｄａｈｌｂａｃｋ，Ｂ．（２０１８）ＶｉｔａｍｉｎＫ－ＤｅｐｅｎｄｅｎｔＰｒｏｔｅｉｎＳ：ＢｅｙｏｎｄｔｈｅＰｒｏｔｅｉｎＣＰａｔｈｗａｙ．ＳｅｍｉｎＴｈｒｏｍｂＨｅｍｏｓｔ４４（２），１７６－１８４．
３．Ｄａｈｌｂａｃｋ，Ｂ．（２０１７）ＮｏｖｅｌｉｎｓｉｇｈｔｓｉｎｔｏｔｈｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎｂｙｆａｃｔｏｒＶｉｓｏｆｏｒｍｓ，ｔｉｓｓｕｅｆａｃｔｏｒｐａｔｈｗａｙｉｎｈｉｂｉｔｏｒａｌｐｈａ，ａｎｄｐｒｏｔｅｉｎＳ．ＪＴｈｒｏｍｂＨａｅｍｏｓｔ１５（７），１２４１－１２５０．
４．Ｈａｃｋｅｎｇ，Ｔ．Ｍ．ｅｔａｌ．（２００９）ＲｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆＴＦＰＩｆｕｎｃｔｉｏｎｂｙｐｒｏｔｅｉｎＳ．ＪＴｈｒｏｍｂＨａｅｍｏｓｔ７Ｓｕｐｐｌ１，１６５－８．
５．Ｈａｃｋｅｎｇ，Ｔ．Ｍ．ｅｔａｌ．（２００６）ＰｒｏｔｅｉｎＳｓｔｉｍｕｌａｔｅｓｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆｔｈｅｔｉｓｓｕｅｆａｃｔｏｒｐａｔｈｗａｙｂｙｔｉｓｓｕｅｆａｃｔｏｒｐａｔｈｗａｙｉｎｈｉｂｉｔｏｒ．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ１０３（９），３１０６－１１．
６．Ｄａｈｌｂａｃｋ，Ｂ．（２００８）Ａｄｖａｎｃｅｓｉｎｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆｔｈｒｏｍｂｏｐｈｉｌｉｃｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．Ｂｌｏｏｄ１１２（１），１９－２７．
７．Ｓａｌｌｅｒ，Ｆ．ｅｔａｌ．（２００９）ＧｅｎｅｒａｔｉｏｎａｎｄｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃａｎａｌｙｓｉｓｏｆｐｒｏｔｅｉｎＳ－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔｍｉｃｅ．Ｂｌｏｏｄ１１４（１１），２３０７－１４．
８．Ｂｕｒｓｔｙｎ－Ｃｏｈｅｎ，Ｔ．ｅｔａｌ．（２００９）ＬａｃｋｏｆｐｒｏｔｅｉｎＳｉｎｍｉｃｅｃａｕｓｅｓｅｍｂｒｙｏｎｉｃｌｅｔｈａｌｃｏａｇｕｌｏｐａｔｈｙａｎｄｖａｓｃｕｌａｒｄｙｓｇｅｎｅｓｉｓ．ＪＣｌｉｎＩｎｖｅｓｔ１１９（１０），２９４２－５３．
９．Ｄａｈｌｂａｃｋ，Ｂ．（２０１８）ＴｒｅａｔｉｎｇｈｅｍｏｐｈｉｌｉａｂｙｔａｒｇｅｔｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎＳ？Ｂｌｏｏｄ１３１（１２），１２７１－１２７２．
１０．Ｐｒｉｎｃｅ，Ｒ．ｅｔａｌ．（２０１８）ＴａｒｇｅｔｉｎｇａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔｐｒｏｔｅｉｎＳｔｏｉｍｐｒｏｖｅｈｅｍｏｓｔａｓｉｓｉｎｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ．Ｂｌｏｏｄ１３１（１２），１３６０－１３７１．
１１．Ｄａｈｌｂａｃｋ，Ｂ．（２０００）Ｂｌｏｏｄｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ．Ｌａｎｃｅｔ３５５（９２１５），１６２７－３２．
１２．Ｄａｈｌｂａｃｋ，Ｂ．ａｎｄＶｉｌｌｏｕｔｒｅｉｘ，Ｂ．Ｏ．（２００５）ＲｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｂｌｏｏｄｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎｂｙｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎＣａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔｐａｔｈｗａｙ：ｎｏｖｅｌｉｎｓｉｇｈｔｓｉｎｔｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｆｕｎｃｔｉｏｎｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ．ＡｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒＴｈｒｏｍｂＶａｓｃＢｉｏｌ２５（７），１３１１－２０．
１３．Ｎｄｏｎｗｉ，Ｍ．ａｎｄＢｒｏｚｅ，Ｇ．，Ｊｒ．（２００８）ＰｒｏｔｅｉｎＳｅｎｈａｎｃｅｓｔｈｅｔｉｓｓｕｅｆａｃｔｏｒｐａｔｈｗａｙｉｎｈｉｂｉｔｏｒｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆｆａｃｔｏｒＸａｂｕｔｎｏｔｉｔｓｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆｆａｃｔｏｒＶＩＩａ－ｔｉｓｓｕｅｆａｃｔｏｒ．ＪＴｈｒｏｍｂＨａｅｍｏｓｔ６（６），１０４４－６．
１４．Ｎｄｏｎｗｉ，Ｍ．ｅｔａｌ．（２０１０）ＴｈｅＫｕｎｉｔｚ－３ｄｏｍａｉｎｏｆＴＦＰＩ－ａｌｐｈａｉｓｒｅｑｕｉｒｅｄｆｏｒｐｒｏｔｅｉｎＳ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔｏｆｆａｃｔｏｒＸａｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ．Ｂｌｏｏｄ１１６（８），１３４４－５１．
１５．Ｐｅｒａｒａｍｅｌｌｉ，Ｓ．ｅｔａｌ．（２０１２）ＴＦＰＩ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆｐｒｏｔｅｉｎＳ．ＴｈｒｏｍｂＲｅｓ１２９Ｓｕｐｐｌ２，Ｓ２３－６．
１６．Ｒｅｇｌｉｎｓｋａ－Ｍａｔｖｅｙｅｖ，Ｎ．ｅｔａｌ．（２０１４）ＴＦＰＩｃｏｆａｃｔｏｒｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆｐｒｏｔｅｉｎＳ：ｅｓｓｅｎｔｉａｌｒｏｌｅｏｆｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎＳＳＨＢＧ－ｌｉｋｅｄｏｍａｉｎ．Ｂｌｏｏｄ１２３（２５），３９７９－８７．
１７．Ｂｒｏｚｅ，Ｇ．Ｊ．，Ｊｒ．ａｎｄＧｉｒａｒｄ，Ｔ．Ｊ．（２０１２）Ｔｉｓｓｕｅｆａｃｔｏｒｐａｔｈｗａｙｉｎｈｉｂｉｔｏｒ：ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｆｕｎｃｔｉｏｎ．ＦｒｏｎｔＢｉｏｓｃｉ（ＬａｎｄｍａｒｋＥｄ）１７，２６２－８０．
１８．Ｍａｒｏｎｅｙ，Ｓ．Ａ．ａｎｄＭａｓｔ，Ａ．Ｅ．（２０１５）Ｎｅｗｉｎｓｉｇｈｔｓｉｎｔｏｔｈｅｂｉｏｌｏｇｙｏｆｔｉｓｓｕｅｆａｃｔｏｒｐａｔｈｗａｙｉｎｈｉｂｉｔｏｒ．ＪＴｈｒｏｍｂＨａｅｍｏｓｔ１３Ｓｕｐｐｌ１，Ｓ２００－７．
１９．Ｍａｓｔ，Ａ．Ｅ．（２０１６）ＴｉｓｓｕｅＦａｃｔｏｒＰａｔｈｗａｙＩｎｈｉｂｉｔｏｒ：ＭｕｌｔｉｐｌｅＡｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔＡｃｔｉｖｉｔｉｅｓｆｏｒａＳｉｎｇｌｅＰｒｏｔｅｉｎ．ＡｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒＴｈｒｏｍｂＶａｓｃＢｉｏｌ３６（１），９－１４．
２０．Ｖｉｎｃｅｎｔ，Ｌ．Ｍ．ｅｔａｌ．（２０１３）ＣｏａｇｕｌａｔｉｏｎｆａｃｔｏｒＶ（Ａ２４４０Ｇ）ｃａｕｓｅｓｅａｓｔＴｅｘａｓｂｌｅｅｄｉｎｇｄｉｓｏｒｄｅｒｖｉａＴＦＰＩａｌｐｈａ．ＪＣｌｉｎＩｎｖｅｓｔ１２３（９），３７７７－８７．
２１．Ｃａｍｉｒｅ，Ｒ．Ｍ．（２０１６）Ｒｅｔｈｉｎｋｉｎｇｅｖｅｎｔｓｉｎｔｈｅｈａｅｍｏｓｔａｔｉｃｐｒｏｃｅｓｓ：ｒｏｌｅｏｆｆａｃｔｏｒＶａｎｄＴＦＰＩ．Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ２２Ｓｕｐｐｌ５，３－８．
２２．Ｎｄｏｎｗｉ，Ｍ．ｅｔａｌ．（２０１２）ＴｈｅＣ－ｔｅｒｍｉｎｕｓｏｆｔｉｓｓｕｅｆａｃｔｏｒｐａｔｈｗａｙｉｎｈｉｂｉｔｏｒａｌｐｈａｉｓｒｅｑｕｉｒｅｄｆｏｒｉｔｓｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｗｉｔｈｆａｃｔｏｒｓＶａｎｄＶａ．ＪＴｈｒｏｍｂＨａｅｍｏｓｔ１０（９），１９４４－６．
２３．Ｗｏｏｄ，Ｊ．Ｐ．ｅｔａｌ．（２０１３）Ｔｉｓｓｕｅｆａｃｔｏｒｐａｔｈｗａｙｉｎｈｉｂｉｔｏｒ－ａｌｐｈａｉｎｈｉｂｉｔｓｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎａｓｅｄｕｒｉｎｇｔｈｅｉｎｉｔｉａｔｉｏｎｏｆｂｌｏｏｄｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ１１０（４４），１７８３８－４３．
２４．Ｗｏｏｄ，Ｊ．Ｐ．ｅｔａｌ．（２０１４）Ｂｉｏｌｏｇｙｏｆｔｉｓｓｕｅｆａｃｔｏｒｐａｔｈｗａｙｉｎｈｉｂｉｔｏｒ．Ｂｌｏｏｄ１２３（１９），２９３４－４３．
２５．Ｄａｈｌｂａｃｋ，Ｂ．ｅｔａｌ．（２０１７）ＦａｃｔｏｒＶ－ｓｈｏｒｔａｎｄｐｒｏｔｅｉｎＳａｓｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃｔｉｓｓｕｅｆａｃｔｏｒｐａｔｈｗａｙｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＴＦＰＩａ）ｃｏｆａｃｔｏｒｓ．ＲｅｓＰｒａｃｔＴｈｒｏｍＨａｅｍｏｓｔ２，１１４－１２４．
２６．Ｚｏｌｌｅｒ，Ｂ．ｅｔａｌ．（１９９５）ＥｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｂｅｔｗｅｅｎｐｒｏｔｅｉｎＳａｎｄＣ４ｂ－ｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｉｓｏｆｏｒｍｓｉｎｈｅｒｅｄｉｔａｒｙｐｒｏｔｅｉｎＳｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｎｇｔｙｐｅＩａｎｄｔｙｐｅＩＩＩｄｅｆｉｃｉｅｎｃｉｅｓｔｏｂｅｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃｖａｒｉａｎｔｓｏｆｔｈｅｓａｍｅｇｅｎｅｔｉｃｄｉｓｅａｓｅ．Ｂｌｏｏｄ８５（１２），３５２４－３１．
２７．Ｍａｌｍ，Ｊ．ｅｔａｌ．（１９８８）ＣｈａｎｇｅｓｉｎｔｈｅｐｌａｓｍａｌｅｖｅｌｓｏｆｖｉｔａｍｉｎＫ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎｓＣａｎｄＳａｎｄｏｆＣ４ｂ－ｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｄｕｒｉｎｇｐｒｅｇｎａｎｃｙａｎｄｏｒａｌｃｏｎｔｒａｃｅｐｔｉｏｎ．ＢｒＪＨａｅｍａｔｏｌ６８（４），４３７－４３．
２８．Ｍａｒｑｕｅｔｔｅ，Ｋ．Ａ．ｅｔａｌ．（１９９５）ＴｈｅｆａｃｔｏｒＶＢ－ｄｏｍａｉｎｐｒｏｖｉｄｅｓｔｗｏｆｕｎｃｔｉｏｎｓｔｏｆａｃｉｌｉｔａｔｅｔｈｒｏｍｂｉｎｃｌｅａｖａｇｅａｎｄｒｅｌｅａｓｅｏｆｔｈｅｌｉｇｈｔｃｈａｉｎ．Ｂｌｏｏｄ８６（８），３０２６－３４．
２９．Ｔｏｓｏ，Ｒ．ａｎｄＣａｍｉｒｅ，Ｒ．Ｍ．（２００４）ＲｅｍｏｖａｌｏｆＢ－ｄｏｍａｉｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓｆｒｏｍｆａｃｔｏｒＶｒａｔｈｅｒｔｈａｎｓｐｅｃｉｆｉｃｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓｕｎｄｅｒｌｉｅｓｔｈｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｂｙｗｈｉｃｈｃｏｆａｃｔｏｒｆｕｎｃｔｉｏｎｉｓｒｅａｌｉｚｅｄ．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２７９（２０），２１６４３－５０．
３０．Ｈａｐｐｏｎｅｎ，Ｋ．Ｅ．ｅｔａｌ．（２０１６）ＴｈｅＧａｓ６－ＡｘｌＰｒｏｔｅｉｎＩｎｔｅｒａｃｔｉｏｎＭｅｄｉａｔｅｓＥｎｄｏｔｈｅｌｉａｌＵｐｔａｋｅｏｆＰｌａｔｅｌｅｔＭｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２９１（２０），１０５８６－６０１．
３１．Ｄａｈｌｂａｃｋ，Ｂ．ｅｔａｌ．（１９８３）ＶｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎＣ４ｂ－ｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎａｎｄｉｔｓｃｏｍｐｌｅｘｅｓｗｉｔｈｖｉｔａｍｉｎＫ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎＳａｎｄｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎＣ４ｂ．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ８０（１１），３４６１－５．
３２．Ｈａｃｋｅｎｇ，Ｔ．Ｍ．ａｎｄＲｏｓｉｎｇ，Ｊ．（２００９）ＰｒｏｔｅｉｎＳａｓｃｏｆａｃｔｏｒｆｏｒＴＦＰＩ．ＡｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒＴｈｒｏｍｂＶａｓｃＢｉｏｌ２９（１２），２０１５－２０．
３３．Ｓｏｍａｊｏ，Ｓ．ｅｔａｌ．（２０１５）ＡｍｉｎｏａｃｉｄｒｅｓｉｄｕｅｓｉｎｔｈｅｌａｍｉｎｉｎＧｄｏｍａｉｎｓｏｆｐｒｏｔｅｉｎＳｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｔｉｓｓｕｅｆａｃｔｏｒｐａｔｈｗａｙｉｎｈｉｂｉｔｏｒｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ．ＴｈｒｏｍｂＨａｅｍｏｓｔ１１３（５），９７６－８７．
３４．Ａｌｓｈａｉｋｈ，Ｎ．Ａ．ｅｔａｌ．（２０１７）ＮｅｗｆｕｎｃｔｉｏｎａｌａｓｓａｙｓｔｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙｑｕａｎｔｉｆｙｔｈｅａｃｔｉｖａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎＣ－ａｎｄｔｉｓｓｕｅｆａｃｔｏｒｐａｔｈｗａｙｉｎｈｉｂｉｔｏｒ－ｃｏｆａｃｔｏｒａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆｐｒｏｔｅｉｎＳｉｎｐｌａｓｍａ．ＪＴｈｒｏｍｂＨａｅｍｏｓｔ１５（５），９５０－９６０．
３５．ＴｈｏｒｅｌｌｉＥ，ＫａｕｆｍａｎＲＪａｎｄＤａｈｌｂａｃｋＢ（１９９７）ＣｌｅａｖａｇｅｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｆｏｒａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆＦＶｂｙｆａｃｔｏｒＸａ，ＥｕｒＪＢｉｏｃｈｅｍ．２４７：１２－２０．
３６．Ｔｈｏｍｐｓｏｎｅｔａｌ．（１９９４）ＣＬＵＳＴＡＬＷ：ｉｍｐｒｏｖｉｎｇｔｈｅｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｏｆｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅｍｕｌｔｉｐｌｅｓｅｑｕｅｎｃｅａｌｉｇｎｍｅｎｔｔｈｒｏｕｇｈｓｅｑｕｅｎｃｅｗｅｉｇｈｔｉｎｇ，ｐｏｓｉｔｉｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃｇａｐｐｅｎａｌｔｉｅｓａｎｄｗｅｉｇｈｔｍａｔｒｉｘｃｈｏｉｃｅ．Ｎｕｃ．ＡｃｉｄＲｅｓ．２２：４６７３－４６８０
３７．Ｃａｃｅｃｉ．Ｍ．Ｓ．＆Ｃａｃｈｅｒｉｓ．Ｗ．Ｐ．（１９８４）Ｆｉｔｔｉｎｇｃｕｒｖｅｓｔｏｄａｔａ．Ｂｙｔｅ９：３４０－３６２

Claims

サンプル中の機能性プロテインＳレベルを決定するためのインビトロ方法であって、前記方法は、
（ａ）対象から得られたサンプルを、ＴＦＰＩαおよび、ＦＶ－短、もしくはＦＶ－短変異体、または機能的に同等なＦＶ変異体のうちの１つ以上と接触させるステップと、
（ｂ）前記サンプルをＦＸａと接触させるステップと、
（ｃ）前記サンプル中のＦＸａ活性のレベルを測定するステップと、を含むか、またはこれらのステップからなり、
前記ＦＸａ活性のレベルは、前記サンプル中の機能性プロテインＳのレベルを示す、方法。
前記機能性プロテインＳレベルが、前記サンプル中のプロテインＳの活性のレベルであり、任意選択で、前記活性が、ＴＦＰＩαの補因子として機能する前記プロテインＳの能力である、請求項１に記載の方法。
前記機能性プロテインＳレベルが、前記サンプル中の機能性プロテインＳの量である、請求項１に記載の方法。
前記サンプル中の前記機能性プロテインＳが、前記サンプル中の遊離プロテインＳである、請求項１～３のいずれかに記載の方法。
前記サンプル中の前記機能性プロテインＳが、前記サンプル中の非Ｃ４ＢＰ複合体化プロテインＳである、請求項１～４のいずれかに記載の方法。
ステップ（ａ）が、前記サンプルを、タンパク質の集合を可能にすることができる基質と接触させることをさらに含む、請求項１～５のいずれかに記載の方法。
タンパク質の集合を可能にすることができる前記基質が、リン脂質小胞である、請求項６に記載の方法。
ステップ（ａ）が、カルシウムをさらに含む、請求項１～７のいずれかに記載の方法。
（ｄ）機能性プロテインＳに基づく標準曲線を提供するステップと、
（ｅ）ステップ（ｃ）の測定値を、ステップ（ｄ）の前記標準曲線と比較するステップと、をさらに含むか、またはこれらのステップからなる、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
前記標準曲線が、健康な個体から得られた血漿サンプルを使用して、または既知量の精製プロテインＳを使用して、または規定量のプロテインＳを含有する培地溶液を使用して生成される、請求項９に記載の方法。
前記測定されたＦＸａ活性のレベルが、前記ＦＸａの阻害を示し、ＦＸａの阻害のレベルが、前記サンプル中の機能性プロテインＳのレベル、任意選択で前記サンプル中の機能性プロテインＳ活性のレベルを示す、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
前記サンプルが血漿であり、任意選択で前記サンプルがクエン酸血漿である、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
前記サンプルが高い希釈係数を有し、例えば、前記希釈係数が１／１０～１／２０００であり、任意選択で前記希釈係数が１／５０～１／４００である、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
ステップ（ａ）が、前記サンプルをＣ４ＢＰと接触させることをさらに含む、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。
ステップ（ｂ）が、前記サンプルを、ＦＸａの存在下で、測定可能なシグナルを放出することができる成分と、接触させることをさらに含む、請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法。
ＦＸａの存在下で放出される前記測定可能なシグナルが、蛍光または色であり、任意選択で、前記成分がＳ２７６５、Ｓ－２２２２から選択される、請求項１１に記載の方法。
測定可能なシグナルを放出することができる前記成分が、Ｓ２７６５であり、Ｓ２７６５の濃度が０．１～２ｍＭ、好ましくは０．３～１ｍＭであり、好ましくはＳ２７６５の濃度が０．８ｍＭである、請求項１６に記載の方法。
ステップ（ａ）および／またはステップ（ｂ）が、前記サンプルをトロンビン阻害剤と接触させることをさらに含む、請求項１～１７のいずれか１項に記載の方法。
前記トロンビン阻害剤がヒルジンまたはペファブロックである、請求項１８に記載の方法。
前記ＦＶ－短変異体またはＦＶ－変異体が、トロンビンによる活性化に耐性のある変異体である、請求項１～１９のいずれか１項に記載の方法。
前記ＦＶ－短変異体またはＦＶ－変異体が、アルギニンからグルタミンに変異されるトロンビン切断部位を含有し、任意選択で、前記ＦＶ－短変異体がＦＶ－短ＱＱ、ＦＶ－短ＲＱおよびＦＶ－短ＱＲから選択される、請求項２０に記載の方法。
前記ＦＶ－短変異体またはＦＶ変異体が、増強されたまたは相乗的なＴＦＰＩα補因子活性を有する変異体である、請求項１～２１のいずれか１項に記載の方法。
前記ＦＶ－短変異体が、ＦＶ－７０９－１４７６である、請求項２２に記載の方法。
前記ＦＶ－短変異体またはＦＶ変異体が、Ｂドメインの酸性Ｃ末端領域を保持する変異体である、請求項１～２３のいずれか１項に記載の方法。
前記ＦＶ変異体またはＦＶ－短変異体が、７０９位および１０１８位でトロンビンによって切断されることができ、および／または１５４５位でトロンビンによって切断されることができない、請求項１～２４のいずれか１項に記載の方法。
前記ＦＶ変異体がＦＶ－１５４５Ｑである、請求項２５に記載の方法。
前記方法が、プロテインＳの遊離形態に特異的である、請求項１～２６のいずれか１項に記載の方法。
前記方法が、プロテインＳ欠乏症を検出することが可能である、請求項１～２７のいずれか１項に記載の方法。
前記対象が、プロテインＳ欠乏症の患者であるかどうかを同定するための、請求項１～２８のいずれか１項に記載の方法。
プロテインＳ欠乏症を有すると対象を診断する方法であって、請求項１～２９のいずれか１項に記載の方法に従って、プロテインＳのレベル、任意選択でプロテインＳ活性のレベルを決定することを含む、方法。
前記プロテインＳ欠乏症が、Ｉ型プロテインＳ欠乏症である、請求項２８～３０のいずれか１項に記載の方法。
前記プロテインＳ欠乏症が、ＩＩ型プロテインＳ欠乏症である、請求項２８～３０のいずれか１項に記載の方法。
前記プロテインＳ欠乏症が、欠陥ＴＦＰＩα補因子活性を有するＩＩ型プロテインＳ欠乏症である、請求項３２に記載の方法。
前記プロテインＳ欠乏症が、ＩＩＩ型プロテインＳ欠乏症である、請求項２８～３０のいずれか１項に記載の方法。
前記プロテインＳ欠乏症が、ヘテロ接合性またはホモ接合性プロテインＳ欠乏症である、請求項２８～３４のいずれか１項に記載の方法。
前記プロテインＳ欠乏症が、後天性である、請求項２８～３５のいずれか１項に記載の方法。
前記対象がワルファリンで処置されている患者である、請求項１～３６のいずれか１項に記載の方法。
前記対象が、静脈血栓塞栓症（ＶＴＥ）を有すると診断されたか、またはその疑いがある患者である、請求項１～３７のいずれか１項に記載の方法。
前記方法が、低レベルのプロテインＳを検出することができ、例えば、プロテインＳのレベルが希釈サンプル中０．１～５ｎＭであり、任意選択で前記プロテインＳレベルが希釈サンプル中＜３ｎＭである、請求項１～３８のいずれか１項に記載の方法。
ＦＶ－短またはＦＶ－短変異体またはＦＶ変異体の濃度が０．５～２０ｎＭであり、任意選択で前記濃度が２ｎＭである、請求項１～３９のいずれか１項に記載の方法。
ステップ（ａ）が３７℃で１～１５分間実施され、任意選択で時間が１０分である、請求項１～４０のいずれか１項に記載の方法。
ステップ（ｃ）が１０分～３０分実施され、任意選択で前記時間が１５分である、請求項１～４１のいずれか１項に記載の方法。
前記サンプルが緩衝液中で希釈され、任意選択で前記緩衝液が７～８のｐＫａを有し、Ｃａ^２＋と両立性である、請求項１～４２のいずれか１項に記載の方法。
前記緩衝液がＨＮＢＳＡＣａ^２＋緩衝液またはＢＳＡ緩衝液である、請求項４３に記載の方法。
ＴＦＰＩアルファのＦＸａに対する比率が約１：１である、請求項１～４４のいずれか１項に記載の方法。
ＦＸａの濃度が０．１～１ｎＭであり、任意選択で前記濃度が０．２～０．６ｎＭであり、任意選択で前記濃度が０．３ｎＭである、請求項１～４５のいずれか１項に記載の方法。
前記方法が、総プロテインＳレベルを決定するための方法と併せて実施される、請求項１～４６のいずれか１項に記載の方法。
前記方法がトロンビン生成アッセイを含まない、請求項１～４７のいずれか１項に記載の方法。
請求項１～４８のいずれか１項に記載の方法を使用して、プロテインＳ欠乏症を有する対象を同定することと、前記対象に治療薬を投与することとを含む、処置方法。
前記治療薬が抗凝固治療薬である、請求項４９に記載の方法。
プロテインＳ欠乏症を有する対象を処置する際に使用するための治療薬であって、前記対象は、請求項３０～５０のいずれかに記載のプロテインＳ欠乏症を有すると診断されており、任意選択で、前記治療薬は抗凝固剤である、治療薬。
ＦＶ－短（もしくはＦＶ－短変異体、または機能的に同等なＦＶ－変異体）、ＴＦＰＩα、ＦＸａ、リン脂質小胞、およびＦＸａ基質のうちのいずれか２つ以上を含み、任意選択で、前記ＦＸａ基質はＳ２７６５である、サンプル中の機能性プロテインＳレベルを決定するための、キット。
請求項１～５０のいずれか１項に記載の方法、または請求項５１に記載の使用を使用して、サンプル中の機能性プロテインＳレベルを決定するための、キット。