CN114839387A - 一种游离蛋白s测定试剂盒及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种游离蛋白S测定试剂盒及其制备方法，试剂盒包括R1试剂、R2试剂；R1试剂包括第一缓冲液、第一稳定剂、促凝剂，R1试剂pH为6.0~9.0；R2试剂包括抗人FPS抗体胶乳颗粒、第二缓冲液、第二稳定剂，R2试剂pH为6.0~9.0，其中FPS为游离蛋白S；制备方法包括：取第一稳定剂、促凝剂加入到第一缓冲液中，调节pH至6.0~9.0，制得R1试剂；取抗人FPS抗体胶乳颗粒、第二稳定剂加入到第二缓冲液中，调节pH至6.0~9.0，制得R2试剂；本发明将抗人FPS抗体与胶乳颗粒偶联，采用胶乳增强免疫比浊法来测定人体血浆中FPS，准确度高、稳定性好、线性范围宽；制备方法简单、工艺稳定。

Description

一种游离蛋白S测定试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明涉及免疫分析技术领域，尤其涉及一种游离蛋白S测定试剂盒及其制备方法。
背景技术
血浆蛋白S（PS）是一种维生素K依赖的非酶性的血浆糖蛋白，它以两种形式存在于血浆：40％以游离（FPS）形式存在，具有APC辅因子的活性；60％的PS以非共价键形式与补体C4b结合蛋白(C4bp)形成复合物，结合型的PS辅助活性很低。游离型与结合型在血浆中存在动态平衡，可以互相转换，二者合称为总PS（tPS）。蛋白S属于机体内生理性抗凝物质，在凝血过程中，活化的凝血因子VIII（FVIIIa）、V（FVa）是凝血因子X（FX）和凝血酶原激活的限速因子，而蛋白C系统可使FVIIIa、FVa灭活，其中，蛋白S作为活化蛋白C（APC）的辅因子，FPS与APC形成复合物以1:1的数量结合在磷脂表面（如内皮细胞、血小板或血小板微孔），此复合物能降低APC与磷脂表面的解离常数导致 APC 与血小板或磷脂表面的亲合力增强，可使APC灭活FVIIIa、FVa的作用大大增强。另外，PS还可以减少因子Xa位点的结合而阻断凝血酶原的转换，增强活化蛋白C与异常的磷脂小体的亲合力，促进阿斯匹林与纤溶酶原激活物抑制剂的中和。在体外纯化系统中，PS表现为不依赖APC的直接抗凝活性，它抑制凝血酶原酶活性，抑制X因子与VIII结合形成活性复合物，另外通过与因子Xa和Va及与磷脂表面的相互作用，不依赖于APC而直接发挥其抗凝作用。因此，蛋白S在抗凝过程中起到非常重要的作用，其缺乏可使机体内促凝系统及抗凝系统失衡，机体处于高凝状态；因而对其活性含量进行检测很有必要。
目前市售的游离蛋白S（FPS）测定试剂盒大部分是采用凝固法的蛋白S活性检测试剂盒，凝固法特异性较差，在存在APC抵抗、FV Leiden突变或凝血酶原、FVa、FVIIIa含量过多的情况下会出现假阳性，导致测值异常偏高。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于，针对现有技术的缺陷，提供一种游离蛋白S测定试剂盒及其制备方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种游离蛋白S测定试剂盒，包括R1试剂、R2试剂；
所述R1试剂包括第一缓冲液、第一稳定剂、促凝剂，所述R1试剂的pH为6.0~9.0；
所述R2试剂包括抗人FPS抗体胶乳颗粒、第二缓冲液、第二稳定剂，所述R2试剂的pH为6.0~9.0，其中FPS为游离蛋白S。
所述抗人FPS抗体胶乳颗粒为胶乳颗粒和抗人FPS抗体的偶联物，所述抗人FPS抗体胶乳颗粒在所述R2试剂的浓度为1-10mg/L。
进一步地，在所述的试剂盒中，优选所述胶乳颗粒为羧基聚苯乙烯胶乳颗粒。
进一步地，在所述的试剂盒中，优选所述羧基聚苯乙烯胶乳颗粒的粒径为100~200nm。
进一步地，在所述的试剂盒中，优选抗人FPS抗体包括抗人FPS单克隆抗体和抗人FPS多克隆抗体中的至少一种。
进一步地，在所述的试剂盒中，优选所述第一缓冲液、第二缓冲液均为MES缓冲液、HEPES缓冲液、TRIS缓冲液、甘氨酸缓冲液、DIPSO缓冲液、MOPS缓冲液、磷酸盐缓冲液、咪唑缓冲液、巴比妥缓冲液中的至少一种。
进一步地，在所述的试剂盒中，优选所述第一缓冲液的浓度为10-100mmol/L；所述第二缓冲液的浓度为10-200mmol/L。
进一步地，在所述的试剂盒中，优选所述第一缓冲液为咪唑缓冲液；所述第二缓冲液为磷酸缓冲液。
进一步地，在所述的试剂盒中，优选所述第一稳定剂在所述R1试剂中的质量百分比为0.5~2%，所述第一稳定剂包括无关蛋白、无机盐、助悬剂、表面活性剂中的至少一种。
进一步地，在所述的试剂盒中，优选所述无关蛋白包括牛血清蛋白、脱脂奶粉、酪蛋白、明胶中的至少一种；
进一步地，在所述的试剂盒中，优选所述无机盐包括氯化钠、氯化钾、氯化钙、硫酸钠、硫酸钾、醋酸钠和醋酸钾中的至少一种；
进一步地，在所述的试剂盒中，优选所述表面活性剂包括二乙醇胺、三乙醇胺、二乙三胺、亚乙基亚胺、烷基苯磺酸钠、烷基硫酸钠、烷基聚氧乙烯醚硫酸钠、脂肪酸钠、烷基聚氧乙烯醚羧酸钠、烷基磺酸钠、亚甲基双萘磺酸钠、油酰甲基牛磺酸钠、吐温-20、吐温-21、吐温-40、吐温-60、吐温-61、吐温-80、吐温-81、吐温-85、曲拉通100、甘油中的至少一种；
进一步地，在所述的试剂盒中，优选所述助悬剂包括乙二醇、丙三醇、麦芽糖、blockmaster中的至少一种。
进一步地，在所述的试剂盒中，优选所述促凝剂包括PEG200～10000、葡聚糖4000～12000中的至少一种；所述促凝剂在所述R1试剂中的质量百分比为0.1~6%。
进一步地，在所述的试剂盒中，优选所述R1试剂、R2试剂均还包括防腐剂，所述防腐剂包括亚硝酸钠、硫柳汞、ProClin300、ProClin950中的至少一种，所述防腐剂在所述R1试剂、所述R2试剂中的质量百分比均为0.03~1%。
进一步地，在所述的试剂盒中，优选所述第二稳定剂在所述R2试剂中的质量百分比为0.1%-1%，所述第二稳定剂包括无关蛋白、无机盐、助悬剂、表面活性剂中的至少一种。
进一步地，在所述的试剂盒中，优选所述无关蛋白包括牛血清蛋白、脱脂奶粉、酪蛋白、明胶中的至少一种；
进一步地，在所述的试剂盒中，优选所述无机盐包括氯化钠、氯化钾、氯化钙、硫酸钠、硫酸钾、醋酸钠和醋酸钾中的至少一种；
进一步地，在所述的试剂盒中，优选所述表面活性剂包括二乙醇胺、三乙醇胺、二乙三胺、亚乙基亚胺、烷基苯磺酸钠、烷基硫酸钠、烷基聚氧乙烯醚硫酸钠、脂肪酸钠、烷基聚氧乙烯醚羧酸钠、烷基磺酸钠、亚甲基双萘磺酸钠、油酰甲基牛磺酸钠、吐温-20、吐温-21、吐温-40、吐温-60、吐温-61、吐温-80、吐温-81、吐温-85、曲拉通100、甘油中的至少一种；
进一步地，在所述的试剂盒中，优选所述助悬剂包括乙二醇、丙三醇、麦芽糖、blockmaster中的至少一种。
一种上述所述的试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
S1、取第一稳定剂、促凝剂加入到第一缓冲液中，调节pH至6.0~9.0，制得R1试剂；
S2、取抗人FPS抗体胶乳颗粒、第二稳定剂加入到第二缓冲液中，调节pH至6.0~9.0，制得R2试剂。
进一步地，在所述的试剂盒的制备方法中，优选在所述S2中，具体包括以下步骤：
S21、取胶乳颗粒加入至活化缓冲液中，加入活化剂进行活化，得到活化胶乳颗粒；
S22、将活化胶乳颗粒、抗人FPS抗体按比例混匀，得到抗人FPS抗体胶乳颗粒；
S23、加入第二缓冲液、第二稳定剂混匀，调节pH至6.0~9.0，制得R2试剂。
进一步地，在所述的试剂盒的制备方法中，优选所述活化缓冲液为MES溶液，所述胶乳颗粒的活化剂为EDC，胶乳颗粒与活化剂的配比为1:（2~20），活化时间为20~40min，在活化胶乳颗粒中加入抗人FPS抗体进行偶联，反应时间为2~4h。
本发明的有益效果：本发明提供本发明的试剂盒基于抗原抗体特异性免疫反应，将抗人FPS抗体通过共价键化学偶联至胶乳颗粒，所使用的抗人FPS抗体表面存在与抗原反应的特异性结合位点，仅能被含抗原决定簇的FPS抗原识别而发生特异性结合，而不与样本中其他物质反应，因此本发明的试剂盒相较于凝固法特异性强，不受APC抵抗、FV Leiden突变或凝血酶原、FVa、FVIIIa等非目标抗原影响；本发明采用胶乳颗粒作为抗人FPS抗体的固相载体，胶乳颗粒比表面积大，还具有较高的折光系数和化学惰性，可以增加散射光和透射光的变化强度，提高了检测的灵敏度；运用该本发明的试剂盒进行FPS的测试具有操作简单，准确度高，稳定性好，线性范围宽等显著特点，可用于检测样本中线性范围为10%-100%的游离蛋白S（FPS）；本发明的试剂盒的方法，操作简单，工艺稳定，适用于批量生产，可以提高检测的灵敏度和特异性，使得试剂盒的线性范围更宽，准确度更高，更好满足临床的需求。
附图说明
下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：
图1是本发明实施例1的试剂盒与参比试剂测试样本的相关性的检测结果；
图2是本发明实施例2的试剂盒与参比试剂测试样本的相关性的检测结果；
图3是本发明实施例3的试剂盒与参比试剂测试样本的相关性的检测结果。
具体实施方式
为了对本发明的技术特征、目的和效果有更加清楚的理解，现详细说明本发明的具体实施方式。
一种游离蛋白S测定试剂盒，包括R1试剂、R2试剂；R1试剂包括第一缓冲液、第一稳定剂、促凝剂，R1试剂的pH为6.0~9.0；R2试剂包括抗人FPS抗体胶乳颗粒、第二缓冲液、第二稳定剂，R2试剂的pH为6.0~9.0，其中FPS为游离蛋白S。
本发明试剂盒的工作原理：建立一种抗人FPS抗体与胶乳颗粒偶联，抗人FPS抗体包被在高分子胶乳颗粒上，当与游离蛋白S结合后，发生抗原-抗体反应，在缓冲液体系下短时间内会迅速聚集在一起，产生一定的浊度，改变反应液透光性能，在一定范围内，浊度的变化率与游离蛋白S的浓度成正比，在特定条件下取得校准曲线，将测定的样本浊度通过校准曲线算出样本中的游离蛋白S的含量。
本发明的试剂盒基于抗原抗体特异性免疫反应，将抗人FPS抗体通过共价键化学偶联至胶乳颗粒，所使用的抗人FPS抗体表面存在与抗原反应的特异性结合位点，仅能被含抗原决定簇的FPS抗原识别而发生特异性结合，而不与样本中其他物质反应，因此本发明的试剂盒相较于凝固法特异性强，不受APC抵抗、FV Leiden突变或凝血酶原、FVa、FVIIIa等非目标抗原影响；本发明采用胶乳颗粒作为抗人FPS抗体的固相载体，胶乳颗粒比表面积大，还具有较高的折光系数和化学惰性，可以增加散射光和透射光的变化强度，提高了检测的灵敏度；运用该本发明的试剂盒进行FPS的测试具有操作简单，准确度高，稳定性好，线性范围宽等显著特点，可用于检测样本中线性范围为10%-100%的游离蛋白S（FPS）；本发明的试剂盒的方法，操作简单，工艺稳定，适用于批量生产，可以提高检测的灵敏度和特异性，使得试剂盒的线性范围更宽，准确度更高，更好满足临床的需求。
抗人FPS抗体胶乳颗粒为胶乳颗粒和抗人FPS抗体的偶联物，抗人FPS抗体胶乳颗粒在R2试剂的浓度为1-10mg/L，抗人FPS抗体包括抗人FPS单克隆抗体和抗人FPS多克隆抗体中的至少一种，即可为抗人FPS单克隆抗体，也可为抗人FPS多克隆抗体，也可为抗人FPS单克隆抗体与抗人FPS多克隆抗体的混合抗体，抗人FPS单克隆抗体能够提高试剂的特异性，抗人FPS单克隆抗体表面存在与抗原反应的特异性结合位点，仅能被含抗原决定簇的FPS抗原识别而发生特异性结合，而不与样本中其他物质反应，提供抗干扰能力，抗人FPS多克隆抗体能够拓宽试剂的检测范围，满足临床高低值样本的检测，可用于检测样本中线性范围为10%-100%的游离蛋白S（FPS）；胶乳颗粒具有高生物相容性，与抗人FPS抗体的偶联效果好，提高试剂检测的准确性。
进一步地，优选胶乳颗粒为羧基聚苯乙烯胶乳颗粒。胶乳颗粒由聚苯乙烯作为基础材料构成，通过独特的表面修饰工艺，使聚苯乙烯带有羧基功能性基团，羧基基团可以与带有氨基的抗人FPS抗体通过共价键而牢固的结合，同时聚苯乙烯胶乳颗粒比表面积大，还具有较高的折光系数和化学惰性，可以增加散射光和透射光的变化强度，提高了检测的灵敏度；可以理解的，聚苯乙烯胶乳颗粒表面覆盖有羧基官能团，羧基官能团提供适宜的酸性环境，此时聚苯乙烯胶乳颗粒与活化剂EDC（1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)的活化效果更好，在过低pH时活化剂EDC（1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐）与羧酸形成的中间体不稳定，容易分解，pH值过高时，部分不稳定中间物水解可能会释放出EDC或者使半稳定的氨基反应活性中间物的产量减少从而造成蛋白质与中间物的取代反应速度下降，使与抗人FPS抗体偶联量下降，故而优选胶乳颗粒表面覆盖有羧基官能团；进一步地，优选羧基聚苯乙烯胶乳颗粒的粒径为100~200nm，胶乳颗粒的粒径控制在100~200nm内能更好的满足R2试剂要求，粒径过小或过大，都会影响到试剂灵敏性、线性范围。
进一步地，第一缓冲液、第二缓冲液均为MES缓冲液、HEPES缓冲液、TRIS缓冲液、甘氨酸缓冲液、DIPSO缓冲液、MOPS缓冲液、磷酸盐缓冲液、咪唑缓冲液、巴比妥缓冲液中的至少一种。缓冲环液用于提供缓冲环境，使R1试剂、R2试剂的pH维持在预定的范围内，即将R1试剂、R2试剂的pH稳定在6.0~9.0，且采用这些缓冲液不会对待检测样品中的游离蛋白S含量测定造成不利的影响。本发明可以采用的缓冲液的类型不做具体限制；优选第一缓冲液的浓度为10-100mmol/L；第二缓冲液的浓度为10-200mmol/L；进一步地，优选第一缓冲液为咪唑缓冲液；第二缓冲液为磷酸缓冲液。
进一步地，第一稳定剂包括无关蛋白、无机盐、助悬剂、表面活性剂中的至少一种。第一稳定剂的加入用于保护抗人FPS抗体的活性，提高试剂的稳定性，可以在不影响反应体系敏感性的前提下，抑制体系中的非特异性吸附，第一稳定剂对蛋白酶也能起到一定的保护作用；第一稳定剂的种类选择性的添加，在此不做具体的限制；无关蛋白包括牛血清蛋白、脱脂奶粉、酪蛋白、明胶中的至少一种，无关蛋白用于结合胶乳颗粒表面的未结合位点，降低抗人FPS抗体的非特异性结合，提高试剂检测的特异性；无机盐包括氯化钠、氯化钾、氯化钙、硫酸钠、硫酸钾、醋酸钠或醋酸钾中的至少一种，无机盐的加入可给R1试剂提供电离环境，降低结合时间，提高检测速率；表面活性剂包括二乙醇胺、三乙醇胺、二乙三胺、亚乙基亚胺、烷基苯磺酸钠、烷基硫酸钠、烷基聚氧乙烯醚硫酸钠、脂肪酸钠、烷基聚氧乙烯醚羧酸钠、烷基磺酸钠、亚甲基双萘磺酸钠、油酰甲基牛磺酸钠、吐温-20、吐温-21、吐温-40、吐温-60、吐温-61、吐温-80、吐温-81、吐温-85、曲拉通100、甘油中的至少一种，表面活性剂的加入可降低R1试剂的表面张力；助悬剂包括乙二醇、丙三醇、麦芽糖、blockmaster中的一种，助悬剂可增加R1试剂的黏度以减低微粒的沉降速度。进一步地，优选第一稳定剂在R1试剂中的质量百分比为0.5~2%，上述配比下，有利于提高试剂盒准确度、稳定性。
进一步地，优选促凝剂包括PEG200～10000、葡聚糖4000～12000中的至少一种；促凝剂的种类选择性的添加，在此不做具体的限制；促凝剂的加入用于提高试剂盒的反应强度，有利于检测临床高低值样本。进一步，优选促凝剂在R1试剂中的质量百分比为0.1~6%，在该配比下有利于提高试剂盒的反应强度，有利于检测临床高低值样本。
进一步地，优选R1试剂、R2试剂均还包括防腐剂，防腐剂包括亚硝酸钠、硫柳汞、ProClin300、ProClin950中的至少一种，添加防腐剂达到防腐效果，防止由于微生物污染而导致试剂盒失效，有利于延长试剂盒的储存有效期。进一步，优选防腐剂在R1试剂、R2试剂中的质量百分比为0.03~1%，该配比下，试剂的防腐效果较好。
进一步地，优选第二稳定剂在R2试剂中的质量百分比为0.1%-1%，第二稳定剂包括无关蛋白、无机盐、助悬剂、表面活性剂中的至少一种。第二稳定剂的加入用于保护抗人FPS抗体的活性，可提高R2试剂的稳定性，可以在不影响反应体系敏感性的前提下，抑制体系中的非特异性吸附，第二稳定剂对抗人FPS抗体胶乳颗粒也能起到一定的保护作用；第二稳定剂的种类选择性的添加，在此不做具体的限制；无关蛋白包括牛血清蛋白、脱脂奶粉、酪蛋白、明胶中的至少一种，无关蛋白的加入可提高R2试剂中的蛋白含量，可对抗人FPS抗体胶乳颗粒起到一定的保护作用，还用于结合胶乳颗粒表面的未结合位点，降低抗人TM抗体的非特异性结合，提高试剂检测的特异性；无机盐包括氯化钠、氯化钾、氯化钙、硫酸钠、硫酸钾、醋酸钠或醋酸钾中的至少一种，无机盐的加入可给R2试剂提供电离环境，降低结合时间，提高检测速率；表面活性剂包括二乙醇胺、三乙醇胺、二乙三胺、亚乙基亚胺、烷基苯磺酸钠、烷基硫酸钠、烷基聚氧乙烯醚硫酸钠、脂肪酸钠、烷基聚氧乙烯醚羧酸钠、烷基磺酸钠、亚甲基双萘磺酸钠、油酰甲基牛磺酸钠、吐温-20、吐温-21、吐温-40、吐温-60、吐温-61、吐温-80、吐温-81、吐温-85、曲拉通100、甘油中的至少一种，表面活性剂的加入可降低R2试剂的表面张力；助悬剂包括乙二醇、丙三醇、麦芽糖、blockmaster中的一种，助悬剂可增加R2试剂的黏度以减低微粒的沉降速度，有利于抗人FPS抗体胶乳颗粒均匀的分散于第二缓冲液中。进一步地，第二稳定剂在R2试剂中的浓度为0.1%-1%，上述配比下，有利于提高试剂盒准确度、稳定性。
一种上述的试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
S1、取第一稳定剂、促凝剂加入到第一缓冲液中，调节pH至6.0~9.0，制得R1试剂。
S2、取抗人FPS抗体胶乳颗粒、第二稳定剂加入到第二缓冲液中，调节pH至6.0~9.0，制得R2试剂。
进一步地，优选在S2中，具体包括以下步骤：S21、取胶乳颗粒加入至活化缓冲液中，加入活化剂进行活化，得到活化胶乳颗粒；具体地，活化缓冲液为MES溶液，胶乳颗粒的活化剂为EDC，胶乳颗粒与活化剂的配比为1:（2~20），活化时间为20~40min，在活化胶乳颗粒中加入抗人FPS抗体进行偶联，反应时间为2~4h，得到抗人FPS抗体胶乳颗粒，活化后加入pH值为7.4含有1-5%牛血清白蛋白的磷酸缓冲液，常温孵育2~4h，这里的牛血清白蛋白为封闭剂，磷酸缓冲液为封闭剂的缓冲液，以除去没有偶联的抗人FPS抗体以及胶乳颗粒中没有活化的基团，离心取沉淀物；S23、加入第二缓冲液、第二稳定剂混匀，调节pH至6.0~9.0，制得R2试剂。
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域对普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1
一种游离蛋白S测定试剂盒，包括R1试剂、R2试剂；具体组分见下表：
表1.实施例1的试剂盒的各试剂组分
Figure 637997DEST_PATH_IMAGE001
注：“/”表示不含此成分。
试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
R1试剂：将1%氯化钠、2%葡聚糖8000及0.03% PC300加入100mL咪唑缓冲液中，调节pH值至7.0，充分混匀后，得到R1试剂。
R2试剂：使用超滤管清洗抗人FPS抗体；使用pH值为6.5的MES溶液将粒径为180nm的羧基聚苯乙烯胶乳颗粒分别稀释至终浓度0.5%；加入10%的活化剂EDC（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐））溶液到上述溶液中，胶乳颗粒与活化剂的配比为1:2，孵育30分钟，加入亲和层析的抗人FPS抗体，37℃孵育2小时，抗体与羧基胶乳颗粒通过共价键偶联，得到抗人FPS抗体胶乳颗粒（抗人FPS抗体胶乳颗粒在R2试剂中的终浓度为5mg/L）；加入pH值为7.4的含有5%牛血清白蛋白（BSA）的磷酸缓冲液，37℃孵育2小时，封闭未偶联的基团；将溶液经12000rpm离心20分钟，取沉淀用含有第二稳定剂1%氯化钠和防腐剂0.03%PC300的100mmol/L 磷酸缓冲液，调节pH至7.4，即得R2试剂。
实施例2
一种游离蛋白S测定试剂盒，包括R1试剂、R2试剂；具体组分见下表：
表2.实施例2的试剂盒各组分配方
Figure 227241DEST_PATH_IMAGE002
注：“/”表示不含此成分。
试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
R1试剂：将0.5%氯化钠、1%葡聚糖6000及0.03% PC300加入100mL咪唑缓冲液中，调节pH值至7.0，充分混匀后，得到R1试剂。
R2试剂：使用超滤管清洗抗人FPS抗体；使用pH值为6.5的MES溶液将粒径为180nm的羧基聚苯乙烯胶乳颗粒分别稀释至终浓度0.5%；加入10%的活化剂EDC（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐））溶液到上述溶液中，胶乳颗粒与活化剂的配比为1:2，孵育30分钟，加入亲和层析的抗人FPS抗体，37℃孵育3小时，抗体与羧基胶乳颗粒通过共价键偶联，得到抗人FPS抗体胶乳颗粒（抗人FPS抗体胶乳颗粒在R2试剂中的终浓度为5mg/L）；加入pH值为7.4的含有5%牛血清白蛋白（BSA）的磷酸缓冲液，37℃孵育2小时，封闭未偶联的基团；将溶液经12000rpm离心20分钟，取沉淀用含有第二稳定剂0.5%氯化钠和防腐剂0.03%PC300的100mmol/L 磷酸缓冲液，调节pH至7.4，即得R2试剂。
实施例3
一种游离蛋白S测定试剂盒，包括R1试剂、R2试剂；具体组分见下表：
表3. 实施例3的试剂盒各组分配方
Figure 475820DEST_PATH_IMAGE003
注：“/”表示不含此成分。
试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
R1试剂：将0.5%氯化钠、0.5%葡聚糖6000及0.03% PC300加入100mL咪唑缓冲液中，调节pH值至7.0，充分混匀后，得到R1试剂。
R2试剂：使用超滤管清洗抗人FPS抗体；使用pH值为6.5的MES溶液将粒径为200nm的羧基聚苯乙烯胶乳颗粒分别稀释至终浓度0.5%；加入10%的活化剂EDC（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐））溶液到上述溶液中，胶乳颗粒与活化剂的配比为1:2，孵育30分钟，加入亲和层析的抗人FPS抗体，37℃孵育2小时，抗体与羧基胶乳颗粒通过共价键偶联，得到抗人FPS抗体胶乳颗粒（抗人FPS抗体胶乳颗粒在R2试剂中的终浓度为5mg/L）；加入pH值为7.4的含有5%牛血清白蛋白（BSA）的磷酸缓冲液，37℃孵育2小时，封闭未偶联的基团；将溶液经12000rpm离心20分钟，取沉淀用含有第二稳定剂0.5%氯化钠和防腐剂0.03%PC300的100mmol/L 磷酸缓冲液，调节pH至7.4，即得R2试剂。
实施例4
一种游离蛋白S测定试剂盒，包括R1试剂、R2试剂；具体组分见下表：
表4. 实施例4的试剂盒各组分配方
Figure 136608DEST_PATH_IMAGE004
注：“/”表示不含此成分； R1试剂中咪唑缓冲液、R2试剂中的磷酸缓冲液分别可替换为磷酸缓冲液、HEPES缓冲液、TRIS缓冲液、甘氨酸缓冲液、DIPSO缓冲液、MOPS缓冲液、MES缓冲液、咪唑缓冲液、巴比妥缓冲液中除本实施例选择的缓冲液以外的任意缓冲液，其中R1试剂、R2中的稳定剂氯化钠可替换为曲拉通100、麦芽糖可替换为牛血清蛋白、脱脂奶粉、酪蛋白、明胶、氯化钾、氯化钙、硫酸钠、硫酸钾、醋酸钠、醋酸钾、二乙醇胺、三乙醇胺、二乙三胺、亚乙基亚胺、烷基苯磺酸钠、烷基硫酸钠、烷基聚氧乙烯醚硫酸钠、脂肪酸钠、烷基聚氧乙烯醚羧酸钠、烷基磺酸钠、亚甲基双萘磺酸钠、油酰甲基牛磺酸钠、吐温-20、吐温-21、吐温-40、吐温-60、吐温-61、吐温-80、吐温-81、吐温-85、甘油、乙二醇、丙三醇、麦芽糖、blockmaster中至少一种或多种，R1试剂中投入的稳定剂的总质量百分比为2%即可，R2试剂中投入的稳定剂的总质量百分比为1%即可；R1试剂、R2中的PC300可替换为亚硝酸钠、硫柳汞、ProClin950中的至少一种；葡聚糖6000可替换为PEG200～10000、葡聚糖4000～12000中的至少一种。
试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
R1试剂：将2%氯化钠、6%葡聚糖6000及1% PC300加入100mL咪唑缓冲液中，调节pH值至9.0，充分混匀后，得到R1试剂。
R2试剂：使用超滤管清洗抗人FPS抗体；使用pH值为6.5的MES溶液将粒径为100nm的羧基聚苯乙烯胶乳颗粒分别稀释至终浓度0.5%；加入10%的活化剂EDC（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐））溶液到上述溶液中，胶乳颗粒与活化剂的配比为1:2，孵育40分钟，加入亲和层析的抗人FPS抗体，37℃孵育4小时，抗体与羧基胶乳颗粒通过共价键偶联，得到抗人FPS抗体胶乳颗粒（抗人FPS抗体胶乳颗粒在R2试剂中的终浓度为10mg/L）；加入pH值为7.4的含有5%牛血清白蛋白（BSA）的磷酸缓冲液，37℃孵育4小时，封闭未偶联的基团；将溶液经12000rpm离心20分钟，取沉淀用含有第二稳定剂1%氯化钠和防腐剂1% PC300的100mmol/L磷酸缓冲液，调节pH至9.0，即得R2试剂。
实施例5
一种游离蛋白S测定试剂盒，包括R1试剂、R2试剂；具体组分见下表：
表5. 实施例5的试剂盒各组分配方
Figure 419822DEST_PATH_IMAGE005
注：“/”表示不含此成分。
试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
R1试剂：将1.25%氯化钠、3%葡聚糖6000及0.515% PC300加入55mL咪唑缓冲液中，调节pH值至7.5，充分混匀后，得到R1试剂。
R2试剂：使用超滤管清洗抗人FPS抗体；使用pH值为6.5的MES溶液将粒径为150nm的羧基聚苯乙烯胶乳颗粒分别稀释至终浓度0.5%；加入10%的活化剂EDC（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐））溶液到上述溶液中，胶乳颗粒与活化剂的配比为11:40，孵育30分钟，加入亲和层析的抗人FPS抗体，37℃孵育3小时，抗体与羧基胶乳颗粒通过共价键偶联，得到抗人FPS抗体胶乳颗粒（抗人FPS抗体胶乳颗粒在R2试剂中的终浓度为5.5mg/L）；加入pH值为7.4的含有3%牛血清白蛋白（BSA）的磷酸缓冲液，37℃孵育3小时，封闭未偶联的基团；将溶液经12000rpm离心20分钟，取沉淀用含有第二稳定剂0.55%氯化钠和防腐剂0.515%PC300的105mmol/L 磷酸缓冲液，调节pH至7.5，即得R2试剂。
实施例6
一种游离蛋白S测定试剂盒，包括R1试剂、R2试剂；具体组分见下表：
表6. 实施例6的试剂盒各组分配方
Figure 944082DEST_PATH_IMAGE006
注：“/”表示不含此成分。
试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
R1试剂：将0.5%氯化钠、0.1%葡聚糖6000及0.03% PC300加入10mL咪唑缓冲液中，调节pH值至6.0，充分混匀后，得到R1试剂。
R2试剂：使用超滤管清洗抗人FPS抗体；使用pH值为6.5的MES溶液将粒径为200nm的羧基聚苯乙烯胶乳颗粒分别稀释至终浓度0.5%；加入10%的活化剂EDC（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐））溶液到上述溶液中，胶乳颗粒与活化剂的配比为1:20，孵育20分钟，加入亲和层析的抗人FPS抗体，37℃孵育2小时，抗体与羧基胶乳颗粒通过共价键偶联，得到抗人FPS抗体胶乳颗粒（抗人FPS抗体胶乳颗粒在R2试剂中的终浓度为1mg/L）；加入pH值为7.4的含有1%牛血清白蛋白（BSA）的磷酸缓冲液，37℃孵育2小时，封闭未偶联的基团；将溶液经12000rpm离心20分钟，取沉淀用含有第二稳定剂0.1%氯化钠和防腐剂0.03%PC300的10mmol/L 磷酸缓冲液，调节pH至6.0，即得R2试剂。
对比例1
对比例1中的R1试剂中不含促凝剂葡聚糖8000，其他组分及用量均与实施例1相同。
对比例2
对比例2中的R2试剂中不含稳定剂氯化钠，其他组分及用量均与实施例1相同。
对比例3
对比例3的试剂盒的检测方法学为凝固法，而本发明的实施例1~3检测方法均为胶乳增强免疫比浊法。
实施例1~3以及对比例1~3的FPS测定试剂盒进行定标、空白限、准确度、线性范围、重复性、抗干扰以及临床相关性测试。
1) 定标及其结果
采用实施例1~3以及对比例1在全自动凝血分析仪上搭配FPS校准品，完成定标。每个项目校准品包含C1、C2、C3、C4、C5共5个浓度水平（C1~C5浓度依次升高），定标结果如表7~10所示。
定标结果应符合要求：定标曲线的线性回归方程r≥0.980。
表7.实施例1的试剂盒定标结果
Figure 679957DEST_PATH_IMAGE007
表8.实施例2的试剂盒的定标结果
Figure 878857DEST_PATH_IMAGE008
表9.实施例3的试剂盒的定标结果
Figure 813315DEST_PATH_IMAGE009
表10.对比例1的试剂盒的定标结果
Figure 9941DEST_PATH_IMAGE010
从表7~10的测试结果发现，实施例1~3定标曲线回归方程的r均≥0.980，符合要求，证明实施例1~3能得到较好的定标曲线。而对比例1定标曲线回归方程的r＜0.98，不符合要求。
2) 空白限测试及其结果
采用实施例1~3的FPS测定试剂盒测定空白样本20次，根据公式（1）和公式（2）计算 平均值（
Figure 29850DEST_PATH_IMAGE011
）、标准差（SD）以及空白限（
Figure 970124DEST_PATH_IMAGE011
＋2SD），测试结果如表11所示。
测试结果应符合要求：空白限应≤5%。
公式（1）：
Figure 759088DEST_PATH_IMAGE012
，
公式（2）：
Figure 392195DEST_PATH_IMAGE013
；
式中：
Figure 899400DEST_PATH_IMAGE011
—测试结果的平均值；
Figure 377786DEST_PATH_IMAGE014
—每次的实测值；
n—测试的次数；
i—测试的序号；
B—相对偏差；
SD—标准差。
表11.实施例1~3的试剂盒的空白限测试结果
Figure 286836DEST_PATH_IMAGE015
从表11的测试结果发现，实施例1-3均符合所规定的空白限要求。
3) 准确度测试及其结果
采用实施例1~3以及对比例3测定正确度控制品，重复测试3次，按照上述公式（1）和（3）计算相对偏差，测试结果如表12所示。
测试结果应符合要求：相对偏差应在±15.00%范围内。
公式（3）：
Figure 825265DEST_PATH_IMAGE016
；
式中：
T——正确度控制品标示值；
B——相对偏差。
表12.实施例1~3、对比例3的试剂盒的准确度测试结果
Figure 819765DEST_PATH_IMAGE017
从表12的测试结果发现，实施例1-3的相对偏差比较低，证明实施例1-3都具有很好的准确性；而对比例3的相对偏差不符合均在±15%范围内的要求，本发明实施例1~3采用的是胶乳增加免疫比浊法，对比例3所使用的方法学是凝固法，凝固法易受样本中APC、凝血酶原、FVa、FVIIIa等的干扰而出现假阳性，导致结果异常偏高，而本发明的不易受样本中APC、凝血酶原、FVa、FVIIIa等的干扰而提供检出率，提高准确性。因此，对比例3的准确性不如实施例1~3。
4) 线性范围测试及其结果
将接近试剂盒线性范围上限的高值样本，分别稀释成6个不同浓度的样本，对每个浓度的样本测试3次，以理论浓度为（xi），实测结果均值为(yi)，求出线性回归方程，计算线性回归的相关系数（r），测试结果如表13-15所示。
测试结果应符合要求：在[10%，100%]范围内，线性相关系数r≥0.990。
表13.实施例1的试剂盒的线性范围测试结果
Figure 101842DEST_PATH_IMAGE018
表14.实施例2的试剂盒的线性范围测试结果
Figure 865399DEST_PATH_IMAGE019
表15.实施例3的试剂盒的线性范围测试结果
Figure 338843DEST_PATH_IMAGE020
从表13-15测试结果发现，实施例1~3均符合上述线性范围要求。
5) 重复性测试及其结果
采用实施例1~3以及对比例2，测试低值和高值质控品各10次。按照公式（1）和（2） 计算测试结果平均值平均值（
Figure 555061DEST_PATH_IMAGE011
）和标准差（SD），按照公式（4）计算变异系数（CV），测试结果 如表16-17所示。
测试结果应符合要求：变异系数（CV）≤10%。
公式（4）：
Figure 640829DEST_PATH_IMAGE021
，
式中：CV为变异系数。
表16.实施例1-2的试剂盒的重复性测试结果
Figure 258892DEST_PATH_IMAGE022
表17.实施例3、对比例2的试剂盒的重复性测试结果
Figure 201440DEST_PATH_IMAGE023
从表16-17的测试结果发现，实施例1-3均符合上述重复性要求，而对比例2不符合上述重复性要求，进一步说明稳定剂的添加有利于提高试剂盒检测时的重复性。
6) 抗干扰能力测试及其结果
将实施例1~3 以及对比例3测试一系列浓度的干扰物质：APC、凝血酶原、FVa、FVIIIa，测试结果如表18-21所示。
测试结果应符合要求：干扰率应在±15%范围内。
表18.实施例1的抗干扰能力测试结果
Figure 842637DEST_PATH_IMAGE024
表19.实施例2的抗干扰能力测试结果
Figure 732095DEST_PATH_IMAGE025
表20.实施例3的抗干扰能力测试结果
Figure 470244DEST_PATH_IMAGE026
表21.对比例3的抗干扰能力测试结果
Figure 583694DEST_PATH_IMAGE027
从表18~21的测试结果发现，实施例1~3符合干扰率要求。证明实施例1-3的试剂盒具有很好的抗干扰能力，几乎不受样本中APC、凝血酶原、FVa、FVIIIa的干扰。而检测原理为凝固法的对比例3检测样本时，随着样本中APC、凝血酶原、FVa、FVIIIa等的的浓度升高，测值异常偏高，超出干扰率接受范围。
7) 临床相关性测试及其结果
采用参比试剂盒和实施例1-3同时测试一组覆盖线性范围的临床样本（40例），以参比试剂盒（已上市的市售产品）的实测值为x轴，实施例1-3的实测值为y轴，做线性回归分析，测试结果如表22和附图1-3所示。
测试结果应符合要求：线性回归分析应符合线性回归方程的斜率k在0.9~1.1之间且相关系数r≥0.975。
表22.实施例1-3的临床相关性测试结果
Figure 712187DEST_PATH_IMAGE028
从表22的测试结果发现，实施例1-3的试剂盒与参比试剂盒测试临床样本的结果做线性回归分析，线性回归方程的斜率k及相关性r均符合要求，证明实施例1-3的试剂盒与参比试剂盒具有良好的相关性。
以上数据及附图表明，使用本发明的试剂盒进行相关性能测试，所得结果均符合接受标准。通过上述具体实施例来验证本发明的可行性与合理性，该实施例仅为本发明可供选择的个别实施例说明，但并不局限于此。对于本领域的技术人员而言，凡是根据本发明申请的专利范围所进行的变化，修改和替换均应包含在本专利的权利要求范围内，皆属于本发明的保护范畴。

Claims (17)

1.一种游离蛋白S测定试剂盒，其特征在于，包括R1试剂、R2试剂；
所述R1试剂包括第一缓冲液、第一稳定剂、促凝剂，所述R1试剂的pH为6.0~9.0；
所述R2试剂包括抗人FPS抗体胶乳颗粒、第二缓冲液、第二稳定剂，所述R2试剂的pH为6.0~9.0，其中FPS为游离蛋白S。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述抗人FPS抗体胶乳颗粒为胶乳颗粒和抗人FPS抗体的偶联物，所述抗人FPS抗体胶乳颗粒在所述R2试剂的浓度为1-10mg/L。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述胶乳颗粒为羧基聚苯乙烯胶乳颗粒。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述羧基聚苯乙烯胶乳颗粒的粒径为100~200nm。
5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，抗人FPS抗体包括抗人FPS单克隆抗体和抗人FPS多克隆抗体中的至少一种。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述第一缓冲液、第二缓冲液均为MES缓冲液、HEPES缓冲液、TRIS缓冲液、甘氨酸缓冲液、DIPSO缓冲液、MOPS缓冲液、磷酸盐缓冲液、咪唑缓冲液、巴比妥缓冲液中的至少一种。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述第一缓冲液的浓度为10-100mmol/L；所述第二缓冲液的浓度为10-200mmol/L。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述第一缓冲液为咪唑缓冲液；所述第二缓冲液为磷酸缓冲液。
9.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述第一稳定剂在所述R1试剂中的质量百分比为0.5~2%，所述第一稳定剂包括无关蛋白、无机盐、助悬剂、表面活性剂中的至少一种。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述无关蛋白包括牛血清蛋白、脱脂奶粉、酪蛋白、明胶中的至少一种；
所述无机盐包括氯化钠、氯化钾、氯化钙、硫酸钠、硫酸钾、醋酸钠和醋酸钾中的至少一种；
所述表面活性剂包括二乙醇胺、三乙醇胺、二乙三胺、亚乙基亚胺、烷基苯磺酸钠、烷基硫酸钠、烷基聚氧乙烯醚硫酸钠、脂肪酸钠、烷基聚氧乙烯醚羧酸钠、烷基磺酸钠、亚甲基双萘磺酸钠、油酰甲基牛磺酸钠、吐温-20、吐温-21、吐温-40、吐温-60、吐温-61、吐温-80、吐温-81、吐温-85、曲拉通100、甘油中的至少一种；
所述助悬剂包括乙二醇、丙三醇、麦芽糖、blockmaster中的至少一种。
11.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述促凝剂包括PEG200～10000、葡聚糖4000～12000中的至少一种；所述促凝剂在所述R1试剂中的质量百分比为0.1~6%。
12.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述R1试剂、R2试剂均还包括防腐剂，所述防腐剂包括亚硝酸钠、硫柳汞、ProClin300、ProClin950中的至少一种，所述防腐剂在所述R1试剂、所述R2试剂中的质量百分比均为0.03~1%。
13.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述第二稳定剂在所述R2试剂中的质量百分比为0.1%-1%，所述第二稳定剂包括无关蛋白、无机盐、助悬剂、表面活性剂中的至少一种。
14.根据权利要求13所述的试剂盒，其特征在于，所述无关蛋白包括牛血清蛋白、脱脂奶粉、酪蛋白、明胶中的至少一种；
所述无机盐包括氯化钠、氯化钾、氯化钙、硫酸钠、硫酸钾、醋酸钠和醋酸钾中的至少一种；
所述表面活性剂包括二乙醇胺、三乙醇胺、二乙三胺、亚乙基亚胺、烷基苯磺酸钠、烷基硫酸钠、烷基聚氧乙烯醚硫酸钠、脂肪酸钠、烷基聚氧乙烯醚羧酸钠、烷基磺酸钠、亚甲基双萘磺酸钠、油酰甲基牛磺酸钠、吐温-20、吐温-21、吐温-40、吐温-60、吐温-61、吐温-80、吐温-81、吐温-85、曲拉通100、甘油中的至少一种；
所述助悬剂包括乙二醇、丙三醇、麦芽糖、blockmaster中的至少一种。
15.一种权利要求1-14任意一项所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、取第一稳定剂、促凝剂加入到第一缓冲液中，调节pH至6.0~9.0，制得R1试剂；
S2、取抗人FPS抗体胶乳颗粒、第二稳定剂加入到第二缓冲液中，调节pH至6.0~9.0，制得R2试剂。
16.根据权利要求15所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，在所述S2中，具体包括以下步骤：
S21、取胶乳颗粒加入至活化缓冲液中，加入活化剂进行活化，得到活化胶乳颗粒；
S22、将活化胶乳颗粒、抗人FPS抗体按比例混匀，得到抗人FPS抗体胶乳颗粒；
S23、加入第二缓冲液、第二稳定剂混匀，调节pH至6.0~9.0，制得R2试剂。
17.根据权利要求16所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，所述活化缓冲液为MES溶液，所述胶乳颗粒的活化剂为EDC，胶乳颗粒与活化剂的配比为1:（2~20），活化时间为20~40min，在活化胶乳颗粒中加入抗人FPS抗体进行偶联，反应时间为2~4h。
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