CN102395885A - 均相凝集免疫测定方法和用于这种方法的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
一种均相凝集免疫测定方法,其中,将可能含有待测分析物的样品与用于分析物的结合伴侣和至少一种离液剂、呈至少一种盐形式的单价离子相混合,或者与至少一种离液剂和呈至少一种盐形式的单价离子的组合物相混合,在反应时间期间测量至少一种与结合伴侣和分析物的相互作用相关的信号,并且由测量的至少一种信号计算出样品中的分析物浓度。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于均相凝集测定的方法和用于这种方法的试剂盒。
背景技术
均相凝集测定通常被用于,通过采用在用于分析物检测和定量的特异性免疫伴侣(immunopartner)之间的结合反应,来确定样品中分析物的浓度。在这样的测定中,由于聚集体形成而产生的凝集程度被测量并且被用作分析物计算的基础。作为均相测定中的原则,将待分析的样品与结合性伴侣相混合,并且在任选的温育期后,直接测量在测定中的凝集情况,无需任何必需的分离步骤。
通常,结合伴侣是对所关注的分析物具有特异性的抗体。合适的分析物必须暴露出两个以上用于结合伴侣的均相或多相表位。当然,如果抗体是所关注的分析物,也可以使用抗原作为结合伴侣。
即使本发明不被具体限定,本发明也特别指向特定类型的凝集测定,该特定类型的凝集测定通常是指微粒增强的凝集测定。这些凝集测定法使用被用于所关注的分析物的结合伴侣所涂敷的微粒。
通过例如形成抗体-抗原聚集体,所使用的结合伴侣能够特异性地与所关注的分析物进行反应。通过例如在给定时间期间内的比浊或者浊度测量法,能够监控在样品中这种聚集体的形成(凝集)。被测量的凝集程度是样品中分析物浓度的指示,并且可以通过使用适当的校准曲线而被确定。
在一个典型的方法中,通过将用例如抗体涂覆的微粒加入至样品/缓冲混合物中,来启动该测定。如果所关注的分析物存在于样品中,则由于通过不同颗粒上的至少2个抗体与同一个分析物相结合而能够使两个以上颗粒被连接在一起,微粒的聚集将会发生。通过使用某一波长的比浊或者浊度测量法,能够进行凝集的检测,使用的波长的选择取决于微粒的光散射特性。作为原则,波长大于微粒的平均直径。基于样品中检测的凝集性,利用校准曲线计算出分析物浓度。
已知的微粒凝集测定法的一个主要缺陷是它们的被限制的动态范围。术语“动态范围”应该表示浓度范围,在该范围中测定产生精确的明确结果,尤其是在该范围内剂量反应曲线是线性的。
已知的测定法的正常动态范围,即,在检测极限和测量上限之间的范围,是两个数量级。许多分析物,例如可提供仅两个实施例的C反应性蛋白(CRP)或者人绒毛膜促性腺激素(HCG),能够具有几个数量级的样品浓度,这意味着在一些情况中,测定必须重复或者必须分别进行系列稀释。
在样品含有高浓度分析物时,甚至能够观察到没有发生凝集或者仅发生低程度凝集。如果这些被样品充分稀释,则将发生对应于分析物浓度的凝集。
在高分析物浓度下没有凝集或者低程度凝集的现象被称作前带效应或者“钩状效应”,并且与如下事实有关:例如,样品中过量的抗原导致形成较小的抗体-抗原聚集体,其不会凝块而形成可见的凝集。一般来讲,可以说,与抗体相比,抗原的浓度越高,在样品中观察到的信号就越低,显示出前带效应。
当提高抗原浓度超过抗体种群识别并结合的相对容量时,所造成的后果是,样品中的凝集程度不再代表分析物的浓度,导致信号降低。这种效应是动态的,并且代表着反应平衡从抗原-抗体聚集体形成到更高概率的非聚集性形成占优势的变化。
已知的免疫测定方法提供了不同的方法来拓宽凝集测定的动态范围。
美国专利6,248,597公开了用于凝集测定的试剂,其包含两个不同的微粒种群。一个微粒种群具有相比另一个微粒种群更强的光散射特性,并且被额外地涂敷有结合伴侣,该结合伴侣相比涂覆到另一个微粒种群上的结合伴侣具有更高的朝向分析物的反应性。根据US 6,248,597,两个微粒种群的混合物可提供更宽的动态范围。该颗粒用较高亲合性的抗体涂敷,覆盖测量范围的敏感部分,而用较低亲合性的抗体涂敷的颗粒提供可检测的具有高分析物浓度的凝集。
美国专利4,590,169描述了别的凝集测定。而且这种测定法用两个不同类型的抗体进行操作,这些抗体任选地被涂覆于不同类型的颗粒。这些抗体中的一种具有比另一种抗体低的对于分析物的亲合常数,并且被提供的量可避免在高抗原浓度下的假阴性效应。
已知方法的缺陷是,它们需要在抗原上不同的表位,这些表位能够在空间上容易接近。这不适用于所有的临床分析物。另外,在已知的测定中对使用不同抗体的需求代表了一项缺点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于均相凝集免疫测定的方法,其与已知方法相比具有提高的动态范围,允许分析物的所有临床相关浓度的测量,而没有假阴性结果的风险。本发明的另一个目的在于提供一种试剂盒,其能够被用于这种凝集测定。
所述目的可通过权利要求1所述的方法和权利要求13所述的试剂盒得到理解。
根据本发明的均相凝集免疫测定方法,要求将应该检查其内可能含有的分析物的浓度的样品与用于分析物的结合伴侣相混合,并且要么与至少一种离液剂相混合、要么与呈至少一种盐形式的单价离子相混合,或者与具有权利要求1所限定浓度的至少一种离液剂和单价离子的组合物相混合。除非另外说明,所有浓度值指的是在用于测量法的测定样(测量用测定样)中各个组分的浓度。
具体实施方式
为了便于更好地理解,参见表1中的值,其指的是通常用于免疫测定的尿素和NaCl及它们的组合物于37℃下在缓冲液(Tris缓冲液,pH 7.4)中的溶解度。在根据本发明的方法中,尿素是优选使用的离液剂,NaCl是优选使用的盐。表1显示了尿素的近似饱和浓度、NaCl的近似饱和浓度、以及尿素浓度与盐浓度的不同组合中的一些配对数值,该组合中发生了饱和。
表1
尿素mol/L | NaCl mol/L | |
NaCl的饱和浓度 | 0 | 5 |
组合物的饱和浓度 | 2 | 4 |
组合物的饱和浓度 | 4 | 3 |
组合物的饱和浓度 | 8 | 2 |
尿素的饱和浓度 | 10 | 0 |
从表1中可以看出,人们能够选取测量用测定样中的饱和度,对于尿素,发生饱和的浓度将会是大约10mol/L,这意味着在给定的条件下,要求的下限40%饱和浓度对应于4mol/L。
优选使用更高的离液剂浓度,超过饱和浓度的50%,更优选超过饱和浓度的60%。
这同样适用于根据本发明使用的盐浓度。测量用测定样中NaCl将发生饱和的浓度是大约5mol/L,这意味着在这些条件下要求的下限40%饱和浓度对应于2mol/L。
在此也优选使用更高的盐浓度,超过饱和浓度的50%,更优选超过饱和浓度的60%。
本发明的第三个目的涉及离液剂和单价离子的组合物的用途。
如权利要求所述的那样,在测量用测定样中组合物的浓度是超过饱和浓度的70%。举个例子,当使用4mol/L尿素和3mol/L NaCl的组合时将发生饱和。该情况下,要求的下限70%饱和浓度将对应于2.8mol/L尿素和2.1mol/L NaCl的组合。应理解,任何其他的配对数值能够以同样方式计算出来。另外,对于本领域的技术人员来说,对于离液剂和盐的不同组合,确定饱和曲线的数值是不成问题的。
为了进一步例举要求的离液剂和盐的组合物的浓度范围,参见图1,其中不同的尿素浓度(X轴)相对于不同的NaCl浓度(Y轴)绘制曲线图。连续曲线限定了其中发生饱和的浓度,而给定的尿素和盐的浓度的平行的较低虚线对应于70%的饱和浓度,并且平行的较高的虚线对应于80%的组合物饱和浓度。
优选使用的离液剂和盐的组合物浓度是超过饱和度的80%,更优选超过饱和度的90%。
本发明不同的方面包括限定测量用测定样中存在的离液剂或者盐的最低浓度、或者两组分组合物的最低浓度。
结果是,通过以相对较高的浓度使用这两种组分之一,可以得到期望的扩大的动态范围。然而,应当注意,当然,例如在本发明的第一个方面,通过限定离液剂的最低浓度,测量用测定样中还可以含有任何可能浓度的盐。这同样适用于本发明的第二个方面,除了要求的盐之外还能够包含可能浓度的离液剂。本发明的第三个方面涉及两种组分的组合物,包括本发明的一个特殊方面,即,如果期望同时以高浓度使用两种组分的情形。
在根据本发明的方法中,能够使用不同的离液剂。这种试剂的例子有尿素,胍的氯化盐或盐酸盐或者高氯酸盐(如上所述),这仅给出了一些实例。当然,本发明不局限于使用一种试剂。也可以如上所述使用试剂的混合物。
能够通过根据本发明的方法进行分析的典型样品例如是血液、血清、或尿液。一般来讲,任何体液或者组织提取液应该被包括在免疫测定中检验的术语“样品”范围内。样品可以以原样使用,也可以以稀释形式使用。
离液剂是物质这样一种物质:其可破坏大分子比如蛋白质、DNA或者RNA的三维结构。离液剂可通过非共价力比如氢键、范德华力、以及疏水效应来干扰分子内相互作用的稳定化。它们包括,例如,尿素、胍的氯化盐和高氯酸锂。
本发明中使用的离液剂不局限于一种特定的试剂。还可以使用两种以上不同离液剂的混合物。
在本发明的第二个方面,单价离子被加入测定样中。优选单价离子是带正电荷的离子,例如NH4 +、K+、Na+、Li+。这些单价离子的添加能够通过加入对应的盐比如(NH4)2SO4、NaCl或LiCl而实现。
同样,单价离子的使用不局限于一种特定的离子。还可以使用两种以上不同单价离子的混合物。
就单个组分而论,上述限定同样适用于离液剂和盐的组合物,皆落入本发明的第三个方面。同样,在此能够优选使用如上所述的不同物质。可以将一种以上不同的盐与一种以上离液剂组合起来。优选的组合物包含尿素和NaCl。
样品与结合伴侣、离液剂和任选的单价离子的混合的并非必须以特定的顺序进行。使用任何可能的混合顺序。重要的是,得到的用于测量法的混合物(测量用测定样)包含所有的组分。
在混合后,测定物能够任选地温育一个特定的时间周期,然后在给定的反应时间期间,测量在测量用测定样中与结合伴侣和分析物之间的相互作用有关的信号。
在最后步骤中,由测量的至少一种信号计算出样品中分析物浓度。
令人惊讶的结果是,如实施例所示,根据本发明的方法展示了与已知的现有技术的测定相比宽得多的动态范围,允许测量高的分析物浓度。更令人惊讶的结果是,动态范围的扩大不会导致在低分析物浓度时的灵敏度降低。
其理论是,通过向测定样中加入离液剂,抗体抗原反应的亲合性随如下结果而降低:在高分析物浓度下,在抗原-抗体聚集体和非聚集体形式之间的反应平衡会移向聚集体一侧。更通俗地讲,可以说离液剂的添加允许例如将使用的抗体的亲合性(在选择性降低作用意义上)调节至具体的期望亲合性数值,这取决于使用的离液剂浓度。
在根据本发明的方法中,当例如使用多克隆抗体时,可能的亲合性调节尤其有利。某些情况下,多克隆抗体能够显示出它们的亲合性的批间偏差。这些偏差能够通过选择性地向测定样中添加离液剂而容易被平衡。
进一步的优点是,与不包含或者包含很少离液剂的测定缓冲液相比,以述及的浓度添加离液剂可改变在测量用测定样中溶液的折射率。最终,测定样的空白试验值会降低,其意味着信噪比会提高。最后的结果是,当在测定中使用离液剂时,现有技术中所需要的稳定剂和防腐剂能够被省略。
另一方面,单价离子的添加减慢了在测定中结合伴侣、尤其是用结合伴侣涂敷的颗粒的移动,结果是它们的碰撞频率下降。这种效应还对聚集体形成有贡献,并且有助于避免在高分析物浓度下的钩状效应。在较低的分析物浓度情况下,本发明的方法与不使用离液剂和单价离子的测定法相比,将具有多少有点更慢的动力学,然而,这能够容易通过在测量步骤中略微地延长反应时间而得到补偿。
到目前为止,作为本发明的第三个方面,均相测定使用高浓度的离液剂、尤其是与高浓度的单价离子相结合而进行操作,这是本技术领域所不知的。
有一些已知的测定法,它们也使用离液剂。这些参考文献可参见EP 0 038 181和EP 0638 806。在这两个文献所描述的测定中,尿素被加入。然而,引用的文件中所描述的测定法是非均相测定,并且添加尿素的目的分别是避免非特异性相互作用、或者防止测定值漂移(assay-drift)。在均相测定中使用离液剂以便选择性地降低例如抗原抗体反应的亲合性,这在这些文献中未曾被提及或者建议。
根据本发明方法的不同实施方式进一步在从属权利要求中有阐述。
本发明的方法能够人工地、更优选在自动分析仪中实施。特别地,如果使用自动分析仪,则样品的混合优选以标准化的如下三步骤方式进行:
首先,提供第一试剂A。然后将样品加至试剂A中,并且进一步加入试剂B,以便产生测量用测定样。
优选试剂B含有结合伴侣、优选涂覆于微粒的结合伴侣,并且试剂A或试剂B或者两者都含有离液剂和/或任选的单价离子。
优选的方法要求,离液剂和单价离子被包含在试剂A中,同时试剂B中除结合伴侣、优选涂覆于颗粒的结合伴侣之外还包含单价离子。该情况下,在试剂A中最优选的单价离子浓度相当于在试剂B中的浓度。
测定优选是在4℃和45℃之间的温度下进行,用最佳温度值为37℃。
本发明的免疫测定方法,在有和没有颗粒增强的情况下,可采用所有已知的凝集试验或者凝血试验进行操作。
优选的是颗粒增强的测定。本发明的另一种实施方式因此要求,结合伴侣被固定化在微型颗粒上、尤其例如在聚合物小珠例如乳胶小珠上。然而,能够分别在普通的免疫测定、或者微型颗粒增强的光散射凝集测定中使用的任何颗粒都是合适的。与直接的凝集相比,优点是,通过使用偶联于微型颗粒的免疫活性物质,测定的灵敏度被提高。
选择的颗粒直径优选是在50nm和500nm之间。取决于测定的设定,能够使用不同的粒径,以得到较好的结果。作为一般原则,可以说,在50至100nm范围内的较小的颗粒可产生较小的钩状效应,即动态范围可提高,但同时也显示出较低的灵敏度。与其相反,直径在100至500nm范围内的较大颗粒可产生早期的钩状效应,但是由于它们更高的吸收值而显示出更高的灵敏度,如同将在后面的实施例中所讨论的那样。
考虑到上述内容,本发明优选的实施方式要求,使用至少2个不同直径的颗粒种群的混合物。优选这些种群之一所包括的颗粒的直径在50nm和100nm之间,而另一个种群所包含的颗粒的直径在100nm和500nm之间。至少2个种群的混合比率在1∶99和99∶1之间、优选在20∶80和80∶20之间、最优选在40∶60和60∶40之间。
当然,能够使用颗粒种群的混合物,这些种群的其他直径落入50至500nm的范围。
优选本发明的方法使用比浊技术用于确定例如在抗体和抗原之间的相互作用。然而,也可以使用其他技术,只要其允许定量所述相互作用和遭受前带效应,例如化学发光技术、酶免疫测定技术、荧光测定法或者浊度测定法,这只是一些实例。出于该原因,即使在此主要是指比浊测量法,本发明也并仅不限于使用该技术。
浊度测定法能够通过使用分光光度计或者浊度计而进行。使用的波长取决于测定样,并且主要取决于颗粒的直径。一般来讲,在颗粒增强的测定中的凝集优选能够在450-800nm之间、尤其优选在500nm和700nm之间的范围被测量。
如上所述,根据本发明的方法采用抗体-抗原反应(其中抗原或抗体两者都可以是分析物),同时保持免疫活性的组分是结合伴侣、优选涂覆在颗粒上的结合伴侣。
在大多数情况下,待测分析物是抗原。这样的分析物的典型实例是癌症标记,例如前列腺特异性抗原(PSA)或者HCG(人绒毛膜促性腺激素)或者炎症标记比如CRP,这只是提供的一些标记物实例,它们能够尤其受到前带现象的影响。当然,通过使用根据本发明的方法,能够检测所有其他可与抗体相互作用的分析物。
在根据本发明的方法中使用的抗体必须能够结合于所关注的分析物。术语“抗体”包括单克隆抗体和多克隆抗体。另外,还可以使用片段比如Fab、(Fab2)片段。
优选本发明的方法使用多克隆抗体。使用多克隆抗体的优点在于,它们可结合于分析物上不同的多相表位;而单克隆抗体通常需要分析物上重复的均相表位,这些表位并不总是可得到的。另外,多克隆抗体比单克隆抗体更便宜。它们的主要缺陷是,它们的亲合性可能因批次不同而变化。然而,这一缺陷能够通过在该方法中选择合适的离液剂浓度而容易被补偿。
优选在本发明方法中使用的抗体对于分析物具有高亲和性或亲和力。高亲合性或亲和力意味着抗体-抗原反应的解离常数一般在测量使用的温度下等于或小于10-7mol/L。优选解离常数是小于或等于10-8mol/L、最优选小于或等于10-9mol/L。高亲合性抗体的使用允许它们的亲合性在一个非常宽的范围内调节。
进一步的重要优点是,与需要两种不同类型的抗体的现有技术测定法相比,根据本发明的方法仅需要一个抗体来覆盖较宽的动态范围。
本发明不局限于抗体-抗原反应。分析物和结合伴侣还可以是受体与配基的组合、抗生物素蛋白或者链霉抗生物素与生物素的组合、蛋白质A与免疫球蛋白的组合、细胞受体与激动剂或者拮抗剂的组合。
此外,本发明的目的还在于提供一种能够在进行测定时使用的试剂盒。该试剂盒包含如上所述的试剂A和试剂B。
在下文中,通过两个实施例和显示在不同设定下测定性能的附图2-5,能够阐释本发明。
实施例1
1)试剂
使用的试剂具有下述组合物:
i)试剂A
加入H2O直至1000mL。任选地,可以将防腐剂、稳定剂、EDTA或者蛋白质加至试剂A中。然而,它们并非为根据本发明的方法所必需。
ii)试剂B
加入H2O直至1000mL。任选地,防腐剂、稳定剂、EDTA、蛋白质、或者除垢剂可以被包含于试剂B中。然而,它们并非为根据本发明的方法所必需。
iii)校准剂
一组校准剂,浓度范围为0-530mg/L CRP。
2)测定
在自动分析仪Olympus AU2700中于37℃下进行测定。使用的试剂A的所有不同的尿素浓度与试剂B的每个粒径相组合。
-2μL的校准剂被吸入150μL的试剂A中并混合;
-3.2分钟后,加入75μL的试剂B并混合。
-然后在4.9分钟期间内测量在700nm处的OD值。
-将OD值的变化表达为在测量周期开始和结束之间的变化。
-OD的变化被相对于在单个校准剂中CRP的浓度绘制成曲线(图2和图3)。
具有最高钩状效应浓度的剂量反应曲线被归一化,并且该剂量反应曲线的尿素浓度被用于实施例2。
实施例2
1)试剂
选择尿素浓度为8.0mol/L的试剂A。如同实施例1中的情形,试剂B能够包含158nm直径的颗粒或者101nm直径的颗粒。
2)测定
类似于实施例1,整个测定在Olympus AU2700分析仪中于37℃下进行。
-2μL的每种校准剂被吸入150μL的试剂A中并混合;
-3.2分钟后,加入75μL的试剂B并混合。
-然后在4.9分钟期间内测量在520nm、600nm或700nm处的OD值。
-对于每一波长,将OD值的变化表达为在测量周期开始和结束之间的变化。
-对于每一波长,OD的变化被相对于在单个校准剂中CRP的浓度绘制成曲线(图4(158nm);图5(101nm))。
图2和图3显示了实施例1的测定结果,实施例1使用了在不同尿素浓度下的2种不同的粒径。
用于产生图2所示曲线的颗粒具有158nm的直径,并且用于得到测量用测定样的尿素浓度是0、1.3、2.6、4.0和5.3mol/L。在700nm波长下进行测量。在这些条件下,由以不同尿素浓度测量得到的数值所制做的所有曲线(除5.3mol/L尿素浓度的曲线之外)都显示出钩状效应。
用于产生图3所示曲线的颗粒具有101nm的直径。除此之外,设定与图1中的设定相同。同样地,此处大多数曲线显示出钩状效应,除了用4.0和5.3mol/L尿素产生的曲线之外。
图2和图3都显示动态范围与尿素浓度的相关性。当比较图1和图2时,可以看到,图2的设定导致比图1稍宽的动态范围。另一方面,图2所示的在测定中测量的OD值更高,这意味着该测定与图3所示的测定相比具有更高的灵敏度。
图4和图5显示了根据实施例2进行的测定结果。此处使用158nm和101nm的不同直径的颗粒再次进行测定。仅使用一个尿素浓度,即在测量用测定样中5.3mol/L(通过用8mol/L尿素添加到试剂A中得到)。在520、600和700nm处进行测定样的测量。
在这些条件下,没有曲线产生钩状效应。使用较小颗粒的测定样生产更加线性的曲线,而使用较大颗粒的测定样则具有更高的灵敏度。
所有4个图都显示,通过调节不同的设定,本发明的方法能够以非常容易的手段进行优化。
另外,通过使用尿素和NaCl的组合而进行的进一步测定属于本发明的第三个方面。在此还可以得到较宽的动态范围。当在测量用测定样中使用例如4mol/LNaCl和2.8mol/L尿素的浓度时,可以得到剂量反应曲线(未显示),其动态范围高达600mg/L CRP。
Claims (13)
1.一种均相凝集免疫测定方法,其中:
(a)将可能含有待测分析物的样品与下述物质相混合:
-用于分析物的结合伴侣,和
-至少一种离液剂,其中调节离液剂的浓度以使得在用于步骤(b)中测量的测定样(测量用测定样)中的离液剂终浓度超过其于测量温度下在测量用测定样中的饱和浓度的40%,或者
-呈至少一种盐形式的单价离子,其中调节盐的浓度以使得盐在测量用测定样中的终浓度超过其于测量温度下的饱和浓度的40%,或者
-至少一种离液剂和呈至少一种盐形式的单价离子的组合物,其中调节离液剂和盐的浓度以使得组合物的终浓度超过于测量温度下的饱和浓度的70%,
(b)在反应时间期间,测量至少一种与在测量用测定样中的结合伴侣和分析物间的相互作用相关的信号,以及
(c)由在步骤(b)中测得的至少一种信号计算出样品中的分析物的浓度。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述测定是颗粒增强的测定,其中结合伴侣被固定在微颗粒上。
3.如权利要求2所述的方法,其特征在于,所选择的颗粒的直径优选是在50nm~500nm之间。
4.如权利要求2或3所述的方法,其特征在于,使用至少2个不同直径的颗粒种群的混合物。
5.如权利要求4所述的方法,其特征在于,所述种群之一所包括的颗粒的直径在50nm~100nm之间,而另一个种群所包含的颗粒的直径在100nm~500nm之间,所述至少2个种群的混合比率在1∶99~99∶1之间、优选在20∶80~80∶20之间、并且最优选在40∶60~60∶40之间。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法,其特征在于,所述离液剂是尿素。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法,其特征在于,在结合伴侣和分析物之间的相互作用通过比浊技术确定。
8.如权利要求7所述的方法,其特征在于,用于比浊法的波长处于450nm-800nm之间、优选在500nm-700nm之间。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法,其特征在于,所述结合伴侣是抗体、优选多克隆抗体。
10.如权利要求9所述的方法,其特征在于,所述抗体对分析物具有高亲和性或亲和力。
11.如权利要求1-10中任一项所述的方法,其特征在于,步骤(a)中所述样品的混合包括下述步骤:
(a1)提供第一试剂A,
(a2)将样品加入试剂A,以及
(a3)加入含有用所述结合伴侣涂敷的颗粒的第二试剂B,得到测量用测定样,
其中或者试剂A、或者试剂B、或者两者都含有离液剂,并且或者试剂A、或者试剂B、或者两者都含有单价离子。
12.如权利要求11所述的方法,其特征在于,所述离液剂和单价离子被包含在试剂A中,而试剂B包含所述单价离子。
13.用于如权利要求11所述方法的试剂盒,其包括试剂A和试剂B。
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