肌红蛋白检测试剂盒
技术领域
本发明属于医学免疫学领域,涉及一种免疫检测试剂,进一步地,本发明涉及一种肌红蛋白检测试剂盒。
背景技术
肌红蛋白(myoglobin,MB)是骨骼肌和心肌特异性氧结合蛋白,分子量为17.8kD,由于分子量较小,当心肌或骨骼肌损伤时,MB会从肌肉组织释放到循环血中,并且能经肾小球滤过,出现在尿中。因此血液和尿中MB测定可用于某些肌病和心脏病的诊断,如急性心肌梗死(AMI)、急性肌损伤、急慢性肾衰竭、严重充血性心力衰竭、长时间休克、肌营养不良、肌萎缩和多发性肌炎等疾病。
AMI是一种严重危及人类生命的疾病,目前AMI检测的主要生化标志物有肌酸磷酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脱氢酶(LDL)、心肌肌钙蛋白T(cTnT)、肌红蛋白和心肌肌钙蛋白I(cTnI)等,但CK-MB、LDL、cTnT、cTnI在诊断心肌梗死时的敏感性都不如MB高。MB在AMI后2~4h内,血中浓度迅速升高,8~10h后达到最高峰,研究表明MB阴性特别有助于排除AMI,可协助AMI早期诊断。由于MB在血液中的半衰期短,升高后24h内即恢复至正常水平,因此可作为观察有无再梗死及梗死有无扩展的指标。另外,MB还可作为AMI溶栓中评价再灌注与否的较敏感指标。
现有的MB检测方法主要有放射性免疫法、酶联免疫法,化学发光法和酶联荧光分析法。放射性免疫法使用放射性同位素,会造成环境污染;酶联免疫法测定周期长,不适合急诊的快速检测;化学发光法和酶联荧光分析法价格昂贵,需要专门仪器和专业人员操作,只适用于中心实验室使用,不适合中小医院尤其是没有中心实验室的乡镇医院。而胶乳增强免疫比浊法操作简单,经济,无污染,可以在绝大多数医院的自动生化分析仪上使用,特别是对急诊能实现快速定量检测,其基本原理是:将抗体包被在胶乳颗粒上,与相应抗原发生免疫反应后,形成聚集颗粒,在一定波长下,通过测定聚集物所产生的浊度,即可测出标本中被检物含量。
而抗体包被到胶乳上,一般可采用物理吸附法和化学偶联法,采用物理吸附法得到的致敏胶乳颗粒稳定性差,抗体容易从胶乳颗粒上脱落下来;而且用物理吸附法得到的胶乳,有可能受到类风湿性因子(RF)和嗜异性抗体的干扰,从而导致检测结果假阳性或假性升高。目前,采用的化学偶联法多为随机偶联法,因随机偶联的抗体会随机偶联到胶乳生物不同部位,将导致抗体损失结合力,增加了抗体用量和生产成本;若将上述方法得到的致敏胶乳颗粒用于检测试剂盒中,会造成特异性差、准确性低、抗干扰能力弱或生产成本高的缺陷。
发明内容
本发明针对现有技术的不足,提供一种检测简单而快速、灵敏度高、准确性好、抗干扰能力强及生产成本低的肌红蛋白检测试剂盒。
为了解决上述技术问题,本发明的技术方案为:一种肌红蛋白检测试剂盒,所述的试剂盒包括试剂R1、试剂R2,所述的试剂R1为适当的缓冲液;所述的试剂R2是用肌红蛋白抗体致敏聚苯乙烯胶乳颗粒、置于适当的缓冲液中。
所述的肌红蛋白抗体致敏聚苯乙烯胶乳颗粒在R2中的浓度为0.08%~0.28%(即0.08~0.28克/100ml)。
本发明所述的缓冲液包括但不限于PBS缓冲液、Tris缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、柠檬酸-磷酸盐缓冲液、碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液、2-吗啉乙磺酸(MES)缓冲液、氯化铵缓冲液以及其他具有相似性质的缓冲液中的一种或几种。
本发明上述试剂盒中R1所用的缓冲液与配制R2所用的缓冲液只要为上面的缓冲液中的一种即可,可以为相同的缓冲液,可以为不同缓冲液。
本发明上面所述的聚苯乙烯胶乳颗粒(该聚苯乙烯胶乳颗粒为市售常规产品),其平均粒径在0.01~1.5μm(10~1500nm)之间,粒径小于0.01μm时,胶乳颗粒聚集产生的光密度变化太小,结果很难达到试验敏感度要求,在制备试剂的时候,需要花费过多的离心时间,延长了试剂生产的时间,增加了试剂成本且不利于重复性。而粒径大于1.5μm的胶乳颗粒在测量高浓度检测物时,其聚集产生的光密度变化超过了检测限,结果很难获得对应于分析物浓度的光密度变化,而且颗粒太大会加速自聚集,导致分散性降低。胶乳颗粒粒径随着试验方法和设备的改变而改变。所选择的颗粒粒径最好是介于0.05~0.5μm(50~500nm)之间。
本发明上面所述的抗体包括但不限于多克隆抗体及单克隆抗体。
在本发明所述的MB检测试剂盒中,还包含MB校准。
本发明所述的试剂R2是用MB抗体致敏聚苯乙烯胶乳颗粒,置于适当的缓冲液中组成,该试剂R2的制备步骤包括:
(1)胶乳颗粒的激活:在带有羧基的聚苯乙烯胶乳颗粒(胶乳)中加入乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺(EDAC),混合反应后加入己二酸二酰肼,继续混合反应,得到激活的胶乳颗粒;
(2)抗体的氧化:用高碘酸钠将抗体非结合活性区域Fc端羧基氧化成醛基;
(3)抗体与胶乳颗粒的偶联:将步骤(1)激活的胶乳颗粒和步骤(2)氧化的抗体混合反应,待反应结束后,再加入葡萄糖封闭胶乳微球上未反应的基团,得到偶联抗体的胶乳微球即肌红蛋白抗体致敏聚苯乙烯胶乳颗粒,置于适量的缓冲液中。
上述步骤(3)中肌红蛋白抗体致敏聚苯乙烯胶乳颗粒在试剂R2中的浓度为0.08~0.28%即0.08~0.28克/100ml。
本发明上述制备方法各个步骤中物料配比为:
步骤(1)中乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺∶胶乳(原料)=0.5~5∶100(重量比);己二酸二酰肼∶胶乳=50~250∶100(重量比);
步骤(2)中高碘酸钠∶步骤(1)中的胶乳(原料)=0.5~3∶100(重量比);高碘酸钠和抗体的用量比=1~15∶10(重量比)
步骤(3)中抗体(氧化后抗体)∶激活的胶乳颗粒=2~22∶100(重量比),葡萄糖∶激活的胶乳颗粒=(25~50)∶100(重量比)。
本发明所述试剂盒所采用的检测原理为胶乳增强免疫透射比浊法,其原理是包被MB抗体的胶乳颗粒,与标本中MB发生免疫反应后,形成聚集颗粒,在一定波长下,通过测定聚集物形成所产生的浊度,即可测出标本中MB的含量。
本发明的优点和有益效果:
1.本发明的试剂盒具有检测简单而快速、灵敏度高、准确性好、抗干扰能力强及生产成本低的优点。
2.本发明采用的MB检测方法为胶乳增强免疫比浊法,该方法使得MB的检测更为经济、方便和快速,适用于绝大多数医院的自动生化分析仪,特别是对急诊能实现快速定量检测。
3.本发明试剂盒中的试剂R2的制备是采用一种抗原抗体反应试验方法,特别之处在于,本发明采用定向化学偶联法将MB抗体包被到胶乳颗粒上;本发明将抗体的非结合活性区域的Fc端定向偶联到胶乳颗粒上,不易受到类风湿性因子(RF)和嗜异性抗体的干扰,大大提升了检测结果的准确性和可信性。而且该方法不会发生抗体结合力损失的情况,可大大减少抗体用量,降低了生产成本。
具体实施方式
下面通过实施例进一步详细描述本发明,但本发明不仅仅局限于以下实施例。实施例1MB检测试剂盒的制备
本发明的试剂盒涉及试剂的主要原材料如下:
1.MB抗体:多克隆抗体(市售)。
2.胶乳:本发明仅示例性的采用直径为150~250nm带羧基基团的聚苯乙烯胶乳颗粒(市售)进行实验。
本实施例的主要试剂的配制如下:
试剂R1:含1.5%PEG6000(聚乙二醇6000)、95mmol/LNaCl的甘氨酸缓冲液,该试剂为无色透明溶液。
试剂R2:用抗人MB抗体致敏粒径为200nm的聚苯乙烯胶乳颗粒。该试剂为乳白色溶液。具体步骤如下:
1.取1ml(100mg/ml)胶乳,用0.1M(mol/L),pH5.0的MES溶液(2-吗啉乙磺酸缓冲液)洗涤3次,超声分散;
2.然后加入0.22ml用0.1M,pH5.0的MES溶液新鲜配制的EDAC(配制的溶液中EDAC的浓度为10mg/ml)混合完全,室温混和15min;
3.再加入0.88ml用0.1M,pH5.0的MES溶液新鲜配制的己二酸二酰肼(配制的溶液中己二酸二酰肼的浓度为83mg/ml),4℃反应过夜;
4.然后用0.1M,pH5.0的MES溶液洗涤2次,0.1M,pH7.5的磷酸盐溶液洗涤1次,超声分散备用;
5.取2ml抗体(2mg/ml)溶液,加入0.3ml用0.1M,pH7.5的磷酸盐溶液配制的高碘酸钠溶液(10mg/ml),室温混合15min,
6.将步骤5中氧化好的抗体加入到步骤4中已激活的胶乳溶液中,4℃反应过夜;
7.然后加入0.32ml 10%BSA(小牛血清白蛋白)溶液,4℃混合4h;
8.再加入0.4ml 10%葡萄糖溶液,4℃混合过夜;
9.然后用0.15M,pH7.5的甘氨酸溶液洗涤3次,再加入0.15M,pH7.5的甘氨酸溶液(含1%BSA,0.2%NaN3的甘氨酸缓冲液)至胶乳(结合抗体以后的胶乳重量)终浓度为0.18%(质量体积比即0.18克/100ml)。
肌红蛋白校准品:在缓冲溶液中加入不同含量肌红蛋白,除菌过滤,所述的肌红蛋白校准品中肌红蛋白含量控制在0~700ug/L之间,这些校准品均为无色透明液体。
实施例2 MB的测定
检测工具:日立7060型自动分析仪。
分析方法:两点终点法;主波长:570nm,副波长:800nm:样品量:6ul(微升);R1:200ul;R2:50ul;反应方向:上升;测定温度:37℃;样品与R1混匀后,于第10秒读取吸光度A1;于3~5min时加入R2,于5min后读取吸光度A2。反应吸光度的计算为A2与A1的差值。
计算方法:多点定标,根据吸光度与参考血清的值作剂量/响应曲线,样品含量可根据其吸光度值在剂量/响应曲线上算出。
实施例3 MB检测试剂盒性能评价
1.分析灵敏度评估
采用5%牛血清白蛋白溶液作为空白样本,空白样本应不含被测物。在生化分析仪上连续检测20次,计算20次结果的均值与标准差SD。以空白均值加两倍标准差(+2SD)作为报告方法的检测限。从表1可见,灵敏度为1.59ug/L。
表1
2.高值线性评估
将1份低值血清(20ug/L)和1份高值血清(800ug/L)按9∶1、4∶1、7∶3、3∶2、1∶1、2∶3、3∶7、1∶4、1∶9(样本顺序编号为2~10号,1号样本为未混合前的低值血清)比例混合,制备出10个不同浓度样本,每个样本重复测定2次,从表2可见,本发明检测试剂盒的最高检测范围可达到700ug/L,判定依据r2≥0.990。
表2
样本号 |
理论值(ug/L) |
测定值(ug/L) |
1 |
20 |
19 |
2 |
98 |
97 |
3 |
176 |
174 |
4 |
254 |
255 |
5 |
332 |
330 |
6 |
410 |
408 |
7 |
488 |
482 |
8 |
566 |
563 |
9 |
644 |
643 |
10 |
722 |
700 |
3.精密度评估
使用2个不同肌红蛋白含量的人血清样品,测定本发明检测试剂盒的批内精密度。使用3个批号试剂盒分别测定1个人血清样品20次,计算本发明检测试剂盒的批间相对极差。结果表明,本发明检测试剂盒的批内精密度为2.98%和1.59%(见表3),而批间相对极差为5.8%(见表4)。
表3
|
样品1 |
样品2 |
测定次数 |
20 |
20 |
平均值(ug/L) |
156 |
423 |
最小值(ug/L) |
149 |
411 |
最大值(ug/L) |
164 |
434 |
标准差(SD) |
4.648 |
6.750 |
变异系数(CV%) |
2.98 |
1.59 |
表4
4.准确性(回收实验)评估
选择合适浓度的常规检测样本,分为体积相同的3份。在其中2份样本中加入不同量的待测物标准,制成2个不同加入浓度的回收样本,计算加入的待测物的浓度。在另一份样本中加入同样量的无被测物的溶剂,制成基础样本。对回收样本和基础样本进行3次重复测定分析,取其均值进行计算。(见表5)
表5
5.干扰试验
在同一份人血清样品中分别加入不同含量的干扰物质后进行测定。加入干扰物质后的测定值除以加入干扰物质前的测定值即为回收率,试验结果表明胆红素、血红蛋白、甘油三酯以及类风湿性因子的浓度分别在30mg/dl、600mg/dl、1000mg/dl以及400IU/ml以下时,对检测结果无显著干扰(以肌红蛋白的回收率在90%~110%之间为准)。(见表6)。
表6