CN107255723A - 一种用于肌红蛋白检测的试剂盒 - Google Patents

一种用于肌红蛋白检测的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于肌红蛋白检测的试剂盒，该试剂盒包括试剂R1、试剂R2和肌红蛋白校准品，其中，所述试剂R1为适当的缓冲液；所述试剂R2是结合有肌红蛋白抗体的聚苯乙烯‑聚丙烯酸微球和适当的缓冲液混合而成；试剂R1和试剂R2的体积比为3～5：1；所述结合有肌红蛋白抗体的聚苯乙烯‑聚丙烯酸微球在试剂R2中的浓度为0.1～0.15g/100ml；所述聚苯乙烯‑聚丙烯酸微球的平均粒径为50‑90nm。本发明的本发明的试剂盒具有良好的稳定性、高灵敏度以及良好的抗干扰能力，并且检测结果更加准确和稳定。

Description

一种用于肌红蛋白检测的试剂盒
技术领域
本发明属于免疫检测领域，具体地，涉及一种用于肌红蛋白检测的试剂盒。
背景技术
肌红蛋白(Myoglobin)是骨骼肌和心肌特异性氧结合蛋白。分子量为16700，由一条含有153个氨基酸残基的多肽链和一个血红素辅基构成，呈紧密球形。
由于肌红蛋白分子量小，当肌细胞受损时，肌红蛋白会释放至循环系统中，1～2小时升高，12小时达到峰值，24小时后逐渐下降，是早期诊断急性心肌梗塞等疾病的重要参考指标。
目前肌红蛋白的免疫检测方法主要有乳胶比浊法法、胶体金免疫层析法和化学发光免疫测定法等。胶体金免疫层析法具备操作简便、快捷、可单份检测、便于保存、不需要特殊设备等优点，但由于灵敏度不高，难以实现定量等缺点限制了这种方法的使用。化学发光法对技术要求高，操作步骤相对比较繁琐，需要多步添加试剂，由于需要增加发光剂以间接反映肌红蛋白浓度，导致其技术要求高，测试结果差异性大。
胶乳增强免疫比浊法由于操作简单、经济无污染而吸引了人们的广泛关注，发展迅速。该方法一般采用抗体包被乳胶微球，包被方式一般采用物理吸附法或化学偶联法，采用物理吸附法得到的抗体包被乳胶微球稳定性较差，抗体容易从乳胶颗粒上脱落，测试结果不准确且不稳定；而采用化学偶联法中通常采用先将乳胶官能团化(如羧基化)然后再将抗体使用强氧化剂氧化再偶联，然而在强氧化剂氧化抗体过程中，必然会对抗体造成破坏，增加抗体用量，提高生产成本，并且仍然存在灵敏度低、抗体利用率低、以及稳定性和抗干扰能力不理想等问题。
因此，本领域的用于肌红蛋白检测的试剂盒，特别是胶乳增强免疫比浊法，仍然需要进一步改进。
发明内容
本发明的目的在于克服现有的乳胶免疫比浊测定法中检测灵敏度、稳定性、抗干扰能力、以及抗体利用率不高导致成本高等方面仍然存在问题的缺陷，提供一种新的用于肌红蛋白检测的试剂盒。
为了实现上述目的，本发明提供一种用于肌红蛋白检测的试剂盒，该试剂盒包括试剂R1、试剂R2和肌红蛋白校准品，其中，所述试剂R1为适当的缓冲液；所述试剂R2是结合有肌红蛋白抗体的聚苯乙烯-聚丙烯酸微球和适当的缓冲液混合而成；试剂R1和试剂R2的体积比为3～5：1；所述结合有肌红蛋白抗体的聚苯乙烯-聚丙烯酸微球在试剂R2中的浓度为0.1～0.15g/100ml；所述聚苯乙烯-聚丙烯酸微球的平均粒径为50-90nm。
在本发明中，聚苯乙烯-聚丙烯酸微球的平均粒径为微粒核心聚苯乙烯的平均粒径。
在本发明中，优选地，所述结合有肌红蛋白抗体的聚苯乙烯-聚丙烯酸微球的制备包括：
(1)将聚苯乙烯-聚丙烯酸微球加入缓冲溶液中，加入N-羟基琥珀酰亚胺，搅拌2～4小时，离心，弃去上清液，得活化聚苯乙烯-聚丙烯酸微球；
(2)将肌红蛋白抗体在缓冲溶液中分散，浓度为2～5mg/L，然后加入上述活化聚苯乙烯-聚丙烯酸微球接触反应，搅拌8～12小时，加入离心，弃去上清液；
(3)将步骤(2)得到的混合物再次在缓冲溶液中分散，加入1％BSA作为封闭液，搅拌反应2～3小时，离心，弃去上清液得结合有肌红蛋白抗体的聚苯乙烯-聚丙烯酸微球。
在本发明中，肌红蛋白抗体与聚苯乙烯-聚丙烯酸微球结合的方式为聚苯乙烯-聚丙烯酸羧酸与肌红蛋白抗体中游离氨基结合，避免了现有的对肌红蛋白抗体强氧化造成破坏、部分抗体失活导致肌红蛋白抗体利用率不高、用量增大、成本高的缺陷。并且本发明的结合稳定，特异性强，测试结果更加稳定、准确，抗干扰能力有效提高。
在本发明中，优选地，在步骤(1)中，每g聚苯乙烯-聚丙烯酸微球中含有1.2～2.5mmol羧基，N-羟基琥珀酰亚胺的加入摩尔量为羧基摩尔量的2～3倍。
肌红蛋白校准品可以通过市售获得，也可以是自行配制；其中包含已知浓度的肌红蛋白。标准品目的在于绘制一条标准曲线。因此，任何可以覆盖检测范围的校准品浓度都可以使用。肌红蛋白的浓度例如可以为0、10、50、100、300、800、1500、2000ng/ml等的人肌红蛋白。
在本发明中，所述聚苯乙烯-聚丙烯酸微球可以商购得到，也可以通过现有技术进行制备，优选情况下，采用以下方法进行制备：
(a)在氮气保护下，苯乙烯和聚乙烯基吡咯烷酮溶于水中，加热至70～80℃时，加入过硫酸钾，聚合反应进行8～10h，反应结束依次用无水乙醇和水洗涤，离心分离，干燥得到聚苯乙烯颗粒，聚苯乙烯颗粒的平均粒径为50～90nm；
(b)在氮气保护下，称取步骤(a)中得到的聚苯乙烯颗粒分散于水中，加入氢氧化钠、丙烯酸、交联剂N,N’-亚甲基双丙烯酰胺，加热至60-70℃，加入过硫酸铵引发剂，搅拌反应进行2～3h，产物洗涤，离心分离，干燥得到聚苯乙烯-聚丙烯酸微球。
在聚苯乙烯-聚丙烯酸微球的制备方法中，优选地，步骤(a)中，苯乙烯与聚乙烯基吡咯烷酮、过硫酸钾的重量比为1：0.1～0.2：0.05～0.1。优选地，步骤(b)中，聚苯乙烯颗粒与氢氧化钠、丙烯酸、N,N’-亚甲基双丙烯酰胺、过硫酸铵的重量比为1：0.3～0.5：0.2～0.3：0.3～0.5：0.05～0.1。
在本发明中，缓冲溶液可以为本领域常规使用的缓冲溶剂，例如MES缓冲液、Tris缓冲液、甘氨酸缓冲液和柠檬酸-磷酸盐缓冲液中的一种或多种。
与现有技术相比，本发明的肌红蛋白测定试剂盒具有以下优点：
1、本发明的试剂盒具有良好的稳定性和高灵敏度，并且检测结果更加准确和稳定。
2、本发明的试剂盒具有良好的抗干扰能力，不易受到诸如类风湿性因子(RF)和嗜异性抗体的干扰。
3、本发明的试剂盒制备过程肌红蛋白抗体利用率高，避免了采用强氧化剂(如高碘酸)氧化破坏、浪费抗体，而通过抗体与活化的聚苯乙烯-聚丙烯酸微球直接结合更加有效，成本更低。
本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。但这些实施例仅限于说明本发明而不是对本发明的保护范围的进一步限定。
在本发明中，颗粒的粒径由马尔文激光粒度测试仪(Malvern Zetasizer Nano-S90)进行，每个样品的粒径数据均为5次测定的平均结果。
制备例1
聚苯乙烯-聚丙烯酸微球的制备
(a)在氮气保护下，将5g苯乙烯和0.7g聚乙烯基吡咯烷酮加入150ml水中，加热至70℃时，加入0.4g过硫酸钾，聚合反应进行10h，反应结束依次用无水乙醇和水洗涤，离心分离，干燥得到聚苯乙烯颗粒，聚苯乙烯颗粒的平均粒径为65nm；
(b)在氮气保护下，称取1g聚苯乙烯颗粒分散于水中，加入0.4g氢氧化钠、0.3g丙烯酸、0.25gN,N’-亚甲基双丙烯酰胺，加热至65℃，加入0.08g过硫酸铵引发剂，搅拌反应进行3h，产物洗涤，离心分离，干燥得到聚苯乙烯-聚丙烯酸微球。
制备例2
聚苯乙烯-聚丙烯酸微球的制备
(a)在氮气保护下，5g苯乙烯和0.6g聚乙烯基吡咯烷酮溶于水中，加热至70～80℃时，加入0.5g过硫酸钾，聚合反应进行8h，反应结束依次用无水乙醇和水洗涤，离心分离，干燥得到聚苯乙烯颗粒，聚苯乙烯颗粒的平均粒径为80nm；
(b)在氮气保护下，称取1g聚苯乙烯颗粒分散于水中，加入0.5g氢氧化钠、0.25g丙烯酸、0.4gN,N’-亚甲基双丙烯酰胺，加热至70℃，加入0.1g过硫酸铵引发剂，搅拌反应进行3h，产物洗涤，离心分离，干燥得到聚苯乙烯-聚丙烯酸微球。
制备例3
结合有肌红蛋白抗体的聚苯乙烯-聚丙烯酸微球的制备
(1)将0.1g聚苯乙烯-聚丙烯酸微球加入MES缓冲液中，加入0.04g N-羟基琥珀酰亚胺，搅拌2～4小时，离心，弃去上清液，得活化聚苯乙烯-聚丙烯酸微球，其中每g聚苯乙烯-聚丙烯酸微球中含有1.8mmol羧基；
(2)将肌红蛋白抗体在缓冲溶液中分散，浓度为2～5mg/L，然后加入上述活化聚苯乙烯-聚丙烯酸微球接触反应，搅拌8小时，加入离心，弃去上清液；
(3)将步骤(2)得到的混合物再次在MES缓冲液中分散，加入1％BSA作为封闭液，搅拌反应2～3小时，离心，弃去上清液得结合有肌红蛋白抗体的聚苯乙烯-聚丙烯酸微球。
制备例4
结合有肌红蛋白抗体的聚苯乙烯-聚丙烯酸微球的制备
(1)将0.1g聚苯乙烯-聚丙烯酸微球加入MES缓冲液中，加入0.08g N-羟基琥珀酰亚胺，搅拌2～4小时，离心，弃去上清液，得活化聚苯乙烯-聚丙烯酸微球，其中每g聚苯乙烯-聚丙烯酸微球中含有2.2mmol羧基；
(2)将肌红蛋白抗体在缓冲溶液中分散，浓度为2～5mg/L，然后加入上述活化聚苯乙烯-聚丙烯酸微球接触反应，搅拌8小时，加入离心，弃去上清液；
(3)将步骤(2)得到的混合物再次在MES缓冲液中分散，加入1％BSA作为封闭液，搅拌反应2～3小时，离心，弃去上清液得结合有肌红蛋白抗体的聚苯乙烯-聚丙烯酸微球。
实施例1
一种用于肌红蛋白检测的试剂盒，该试剂盒包括：
试剂R1，R1为氨基乙酸缓冲液(30mmol/L)；
试剂R2为结合有肌红蛋白抗体的聚苯乙烯-聚丙烯酸微球(制备例3)分散于甘氨酸缓冲液中的悬浊液，质量体积比0.12w/v％(即0.12g/100ml)；
肌红蛋白校准品，肌红蛋白含量为0～2000μg/L。
实施例2
一种用于肌红蛋白检测的试剂盒，该试剂盒包括：
试剂R1，R1为氨基乙酸缓冲液(30mmol/L)；
试剂R2为结合有肌红蛋白抗体的聚苯乙烯-聚丙烯酸微球(制备例4)分散于甘氨酸缓冲液中的悬浊液，质量体积比0.15w/v％(即0.15g/100ml)；
肌红蛋白校准品，肌红蛋白含量为0～2000μg/L。
对比例1
用于肌红蛋白检测的试剂盒，包括：
试剂R1：含有0.5％NaCl、0.5％BSA、0.05％NaN3的甘氨酸缓冲液，pH为8；
试剂R2，制备方法如下：(1)取14ml抗人肌红蛋白抗体(3.1mg/ml)与20ml0.005mmol/l的高碘酸钠溶液室温混合10分钟后备用；(2)用80ml Hepes pH为7.5的溶液溶解2.5mg碳化二亚胺，使反应浓度达到0.03mg/ml，加入1.8ml粒径65nm聚苯乙烯颗粒，使聚苯乙烯颗粒浓度为0.2％，37℃摇床混匀0.5小时；(3)加入18mg乙二胺二酰肼，37℃摇床混匀0.5小时后形成致敏胶乳；(4)将氧化后的抗人肌红蛋白抗体加入到致敏胶乳颗粒缓冲液中，37℃摇床混匀2小时；(5)加入2ml封闭液(含有2mg/ml吐温-20的甘氨酸缓冲液，pH为7.4)室温摇床过夜；(6)4℃离心，15000rpm，40分钟；(7)用10,ml去离子水溶解胶乳颗粒，离心清洗；(8)弃上清液，加入150ml工作也，超声得到试剂R2；
肌红蛋白校准品，肌红蛋白含量为0～1200μg/L。
测试例
一、准确度和可重复性检测
将实施例1、实施例2、对比例1的肌红蛋白测定试剂盒对浓度为50ng/ml的肌红蛋白校准品进行检测，具体结果如表1所示。
表1
在表1中，每个试剂盒对校准品重复测定10次后分别计算测定均值(M)和标准差(S)，变异系数的计算方法为S/M×100％，相对偏差的计算方法为(1-M/样本浓度)×100％。从表1可看出，本申请的试剂盒在准确度和可重复性上都比对比例中的有了显著的提高。
上述测试在日立7060型自动分析仪进行，下同，分析方法主波长:570nm，副波长:800nm，根据吸光度与参考血清的值作剂量/响应曲线，样品含量可根据其吸光度值在剂量/响应曲线上算出。
二、灵敏度检测
采用5％牛血清白蛋白溶液作为空白样本，空白样本应不含被测物。在生化分析仪上连续检测20次，计算20次结果的均值与标准差SD。以空白均值加两倍标准差(+2SD)作为报告方法的检测限。
表2
平均值(ng/ml) 标准差
实施例1 0.29 0.057
实施例2 0.31 0.063
对比例1 0.97 1.045
从表2可见，实施例的肌红蛋白测定试剂盒的灵敏度至少为0.404ng/ml，相较于对比实施例灵敏度3.06ng/ml优势明显。
三、抗干扰试验
试验方法：在同一待测样品中分别加入血红蛋白、类风湿因子，考察本发明的抗干扰能力。加入干扰物质后的测定值除以加入干扰物质前的测定值即为回收率，回收率在10％偏差以内视为无显著干扰。具体结果如表3所示。
表3
从表3可以看出，本发明的肌红蛋白测定试剂盒同时具有良好的抗干扰能力，对于样品中影响结果较大的血红蛋白、类风湿因子都有良好的抗干扰。
四、稳定性检测
将实施例1、实施例2、对比例1中方法制备的试剂盒各10个，置于37℃恒温干燥箱内20天，在第0天(放置前)、第5天、第10天、第15天、第20天，每组随机取2个对浓度为50ng/ml的肌红蛋白校准品进行检测，并取平均值。结果如下表：
表4
第0天 第5天 第10天 第15天 第20天
实施例1 49.95 50.05 49.93 49.90 49.78
实施例2 50.08 50.09 49.92 49.93 49.85
对比例1 52.20 52.70 53.42 56.33 58.64
从上表可以看出，本申请的试剂盒在37℃条件下放置20天后仍然具有良好的性质，稳定性更好，而与常规对比例1则稳定性较差，表现出了明显的变化(假阳性)。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (7)

1.一种用于肌红蛋白检测的试剂盒，该试剂盒包括试剂R1、试剂R2和肌红蛋白校准品，其特征在于，所述试剂R1为适当的缓冲液；所述试剂R2是结合有肌红蛋白抗体的聚苯乙烯-聚丙烯酸微球和适当的缓冲液混合而成；试剂R1和试剂R2的体积比为3～5：1；所述结合有肌红蛋白抗体的聚苯乙烯-聚丙烯酸微球在试剂R2中的浓度为0.1～0.15g/100ml；所述聚苯乙烯-聚丙烯酸微球的平均粒径为50-90nm。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述结合有肌红蛋白抗体的聚苯乙烯-聚丙烯酸微球的制备包括：
(1)将聚苯乙烯-聚丙烯酸微球加入缓冲溶液中，加入N-羟基琥珀酰亚胺，搅拌2～4小时，离心，弃去上清液，得活化聚苯乙烯-聚丙烯酸微球；
(2)将肌红蛋白抗体在缓冲溶液中分散，浓度为2～5mg/L，然后加入上述活化聚苯乙烯-聚丙烯酸微球接触反应，搅拌8～12小时，加入离心，弃去上清液；
(3)将步骤(2)得到的混合物再次在缓冲溶液中分散，加入1％BSA作为封闭液，搅拌反应2～3小时，离心，弃去上清液得结合有肌红蛋白抗体的聚苯乙烯-聚丙烯酸微球。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，在步骤(1)中，每g聚苯乙烯-聚丙烯酸微球中含有1.2～2.5mmol羧基，N-羟基琥珀酰亚胺的加入摩尔量为羧基摩尔量的2～3倍。
4.根据权利要求1-3任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述聚苯乙烯-聚丙烯酸微球的制备方法包括：
(a)在氮气保护下，苯乙烯和聚乙烯基吡咯烷酮溶于水中，加热至70～80℃时，加入过硫酸钾，聚合反应进行8～10h，反应结束依次用无水乙醇和水洗涤，离心分离，干燥得到聚苯乙烯颗粒，聚苯乙烯颗粒的平均粒径为50～90nm；
(b)在氮气保护下，称取步骤(a)中得到的聚苯乙烯颗粒分散于水中，加入氢氧化钠、丙烯酸、交联剂N,N’-亚甲基双丙烯酰胺，加热至60-70℃，加入过硫酸铵引发剂，搅拌反应进行2～3h，产物洗涤，离心分离，干燥得到聚苯乙烯-聚丙烯酸微球。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，步骤(a)中，苯乙烯与聚乙烯基吡咯烷酮、过硫酸钾的重量比为1：0.1～0.2：0.05～0.1。
6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，步骤(b)中，聚苯乙烯颗粒与氢氧化钠、丙烯酸、N,N’-亚甲基双丙烯酰胺、过硫酸铵的重量比为1：0.3～0.5：0.2～0.3：0.3～0.5：0.05～0.1。
7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的缓冲溶液包括MES缓冲液、Tris缓冲液、氨基乙酸缓冲液、甘氨酸缓冲液和柠檬酸-磷酸盐缓冲液中的一种或多种。
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