CN102539784A - 一种检测心肌肌钙蛋白i的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种检测心肌肌钙蛋白I的方法及运用该方法制备的心肌肌钙蛋白I检测试剂盒。该方法将抗体组合物与聚苯乙烯胶乳颗粒进行偶联，然后与检测标本中相应抗原发生免疫反应形成聚集颗粒，在400～700nm波长下测定反应物产生的浊度，即可得出检测标本中cTnI的含量。抗体组合物由至少3种抗体组成，抗体为cTnI特异、而不与快骨骼肌型肌钙蛋白I和慢骨骼肌型肌钙蛋白I发生交叉反应，且抗体组合物中若其中一种抗体对检测标本中某个影响cTnI精确测定的因素敏感，则至少有另一种抗体对该影响cTnI精确测定的因素不敏感。该方法操作简单、适用范围广、精确度高、抗干扰能力强、生产成本低。

Description

一种检测心肌肌钙蛋白I的方法及其应用

技术领域

本发明涉及医学检验技术领域，具体涉及一种检测心肌肌钙蛋白I的方法，以及运用该方法制备的心肌肌钙蛋白I检测试剂盒。

背景技术

目前急性心肌梗死(AMI)检测的主要生化标志物有肌酸磷酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脱氢酶(LDH)、心肌肌钙蛋白T(cTnT)和心肌肌钙蛋白I(cTnI)等。CK-MB、LDH广泛分布于体内，因此特异性较低，许多疾病都可导致它们的升高，且在血液中维持时间较短；cTnT与骨骼肌肌钙蛋白T(sTnT)同源性很高，容易发生交叉反应。而cTnI具有特异性高、出现时间早、敏感性高和在血液中持续时间长等优点，可作为AMI早期诊断指标，已经被证实为心肌损伤最特异、最敏感的血清标志物之一。

目前影响cTnI测定精确度的因素有以下几方面：(1)cTnI的存在形式：不同cTnI抗体识别游离形式cTnI和复合物形式cTnI的能力不同；(2)cTnI的磷酸化：cTnI的第22位和第23位丝氨酸残基可以在蛋白激酶A作用下发生磷酸化，形成四种磷酸化形式(未磷酸化态，22Ser磷酸化态，23Ser磷酸化态，22、23Ser均磷酸化态)共同存在于细胞中，磷酸化改变了cTnI分子的构象，影响某些cTnI抗体的识别能力；(3)cTnI的氧化：cTnI的第80位和第97位胱氨酸残基会发生氧化，从而影响某些cTnI抗体的识别能力；(4)cTnI的易水解性：cTnI易受蛋白水解酶作用，且不同部分受影响的程度有差别，中心区域(第33位至110位氨基酸)稳定性较高，N端和C端易被降解，产生包含不同抗原表位的cTnI蛋白酶解片段，不同cTnI抗体对不同降解表位的结合能力不同；(5)干扰物质：类风湿性因子(RF)、嗜异性抗体会造成假阳性结果，自身抗体、胆红素和血红蛋白会造成假阴性结果；(6)抗凝剂：乙二胺四乙酸(EDTA)是Ca²⁺螯合剂，可使cTnI-cTnC复合物解离，从而影响某些抗体的结合；肝素带负电荷，易与带正电荷(pI为9.87)的cTnI结合形成复合物，从而影响某些抗体的结合。

高精确度cTnI检测要求所选用的抗体需满足下列条件：(1)针对的抗原表位位于稳定的中间区域，不受水解影响；(2)特异性高，和快骨骼肌型肌钙蛋白、慢骨骼肌型肌钙蛋白不发生交叉反应，即所针对的抗原表位应针对无同源性区域；(3)受cTnI的存在形式、磷酸化、氧化的影响较小；(4)受经常出现的血液和血浆成分干扰较小。

目前商业化的试剂盒大都采用夹心免疫法，通常使用2～3个单克隆抗体，组合形式为1～2个捕获抗体加1个检测抗体或者1个捕获抗体加1～2个检测抗体。但是这样的组合不可能做到对已知cTnI测定影响因素不敏感，也无法满足高精确度cTnI检测抗体的条件，因此试剂盒无法达到高精确度要求。

现有的cTnI检测方法主要有酶联免疫法(ELISA)，化学发光法和酶联荧光分析法。ELISA方法测定周期长；化学发光法和酶联荧光分析法价格昂贵，需有专门仪器和专业人员操作，只适用于中心实验室使用，检测结果到达医生手中的时间较长，不能满足临床快速检测需要，也不适合于中小医院尤其是没有中心实验室的乡镇医院。而胶乳增强免疫比浊法操作简单，适用于绝大多数医院的自动生化分析仪使用，特别是对急诊能实现快速定量检测，其基本原理是：将抗体包被在胶乳颗粒上，与相应抗原发生免疫反应后，形成聚集颗粒，在一定波长下，通过测定聚集物所产生的浊度，即可测出标本中被检物的含量。

而cTnI抗体包被到胶乳颗粒上，一般可以采用物理吸附法和化学偶联法，物理吸附法稳定性较化学偶联法要差，易受到类风湿性因子(RF)和嗜异性抗体的干扰，导致检测结果假阳性或假性升高。目前采用的化学偶联法多为随机偶联法，该法将导致抗体结合力的损失，增加了抗体用量和生产成本。

针对目前的现状，需要寻找一种新的cTnI检测方法，该方法应该具有操作简单、适用范围广、精确度高和生产成本低等特点。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种操作简单、适用范围广、精确度高、抗干扰能力强及生产成本低的检测心肌肌钙蛋白I的方法。

本发明所采用的技术方案为：

一种检测心肌肌钙蛋白I的方法：将抗体组合物与聚苯乙烯胶乳颗粒进行偶联，然后与检测标本中相应抗原发生免疫反应形成聚集颗粒，在400～700nm波长下测定反应物产生的浊度，即可得出检测标本中cTnI的含量。

此方法的反应原理是胶乳增强免疫比浊法，基本反应过程为：将抗体包被在胶乳颗粒上，与相应抗原发生免疫反应后，形成聚集颗粒，在一定波长下，通过测定聚集物所产生的浊度，即可测出标本中被检物的含量。在本发明中，检测标本中的cTnI与结合在胶乳颗粒表面的抗人cTnI抗体结合，产生抗原抗体反应，使胶乳颗粒形成聚集，在400～700nm波长处测定吸光度，对照标准曲线可求出cTnI的含量。

所述抗体组合物由至少3种抗体组成，每种抗体的量由与其结合的具体抗原的量决定。抗体的选择原则为：抗体为cTnI特异、而不与快骨骼肌型肌钙蛋白I和慢骨骼肌型肌钙蛋白I发生交叉反应，即所述抗体是cTnI特异性的，不会和快骨骼肌型肌钙蛋白I、慢骨骼肌型肌钙蛋白I发生免疫反应。抗体组合物的选择原则为：抗体组合物中若其中一种抗体对检测标本中某个影响cTnI精确测定的因素敏感(该因素会影响“一种抗体”与cTnI的结合)，则至少有另一种抗体对该影响cTnI精确测定的因素不敏感(该因素不会对“另一种抗体”与cTnI的结合构成干扰)，即如果选择了一种对检测标本中某个影响因素比较敏感的抗体，那么选择的其他抗体中至少要有一种抗体对该影响因素不敏感，抗体经组合后，能够形成较强的反应性。检测标本中影响cTnI精确测定的因素包括cTnI的存在形式、cTnI的磷酸化、cTnI的氧化、cTnI的易水解性、抗凝剂(具体影响状况如背景技术中所述)对抗体结合的影响。抗凝剂如乙二胺四乙酸、肝素(具体影响状况如背景技术中所述)。

所述抗体为单克隆抗体或多克隆抗体，即由抗体组成的抗体组合物可以是单克隆抗体组合物、多克隆抗体组合物、或者单克隆抗体和多克隆抗体的组合物。

作为优选，所述抗体组合物为M18_18～28单克隆抗体、19C7_41～49单克隆抗体、560_83～93单克隆抗体、MF4_190～196单克隆抗体按1∶1∶1∶1的比例进行组合，或M18_18～28单克隆抗体、19C7_41～49单克隆抗体、8E10_86～90单克隆抗体、458_169～178单克隆抗体按1∶1∶1∶1的比例进行组合。

作为优选，所述聚苯乙烯胶乳颗粒的平均粒径为0.05～0.5μm。

所述偶联为定向化学偶联，使得抗体组合物以特定取向连接到聚苯乙烯胶乳颗粒上，包括以下步骤：

(1)聚苯乙烯胶乳颗粒的激活：在聚苯乙烯胶乳颗粒(带有羧基)中加入乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺(EDAC)，EDAC与聚苯乙烯胶乳颗粒的重量比为0.5～5∶100，反应0.5～1h后加入己二酸二酰肼，己二酸二酰肼与聚苯乙烯胶乳颗粒的重量比为50～250∶100，继续反应0.5～1h，得到激活的聚苯乙烯胶乳颗粒；

(2)抗体组合物的氧化：用高碘酸钠将抗体组合物非结合活性区域Fc端的羧基氧化成醛基，高碘酸钠与抗体组合物的重量比为1～15∶10；

(3)抗体组合物与聚苯乙烯胶乳颗粒的偶联：将步骤(1)激活的聚苯乙烯胶乳颗粒与步骤(2)氧化的抗体组合物混合，抗体组合物与聚苯乙烯胶乳颗粒的重量比为2～22∶100，反应1～2h后，加入葡萄糖，葡萄糖与激活的聚苯乙烯胶乳颗粒的重量比为(25～50)∶100，继续反应2～4h，得到偶联抗体组合物的聚苯乙烯胶乳颗粒。

本发明还提供运用上述检测心肌肌钙蛋白I的方法制备的心肌肌钙蛋白I检测试剂盒，该试剂盒包括试剂1、试剂2，其中试剂1为缓冲液，试剂2由偶联抗体组合物的聚苯乙烯胶乳颗粒、缓冲液组成，偶联抗体组合物的聚苯乙烯胶乳颗粒与缓冲液的重量体积比为0.05～0.35％。

作为优选，所述缓冲液为PBS缓冲液、Tris缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、柠檬酸-磷酸盐缓冲液、碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液、2-吗啉乙磺酸(MES)缓冲液、氯化铵缓冲液中的一种或几种。所述试剂盒中试剂1所用的缓冲液与试剂2所用的缓冲液只要为上面的缓冲液中的一种任意搭配均可。

该心肌肌钙蛋白I试剂盒除包括试剂1和试剂2外，还可以包括校准品，所述校准品采用cTnI-cTnT-cTnC复合物作为配制材料。目前各种试剂盒采用的校准品材料都各不相同，既有cTnI的单体形式，又有cTnC-TnI、cTnC-cTnT-cTnI复合物形式，研究结果表明，采用cTnI-cTnT-cTnC复合物作为校准品，由于其分子稳定性好又能被多数抗体识别，可大大缩小各试剂盒之间检测结果差异。

本发明的优点和有益效果：

1、本发明所采用的检测方法具有操作简单、适用范围广、精确度高及生产成本低的优点；

2、本发明检测方法中采用至少3种以上抗体的组合物，尽可能地满足了高精度cTnI检测抗体所需条件，均衡了抗体对各种测定影响因素的敏感性，可以最小化阴性或阳性干扰，增加了测定方法的精确度；

3、本发明采用定向偶联法将cTnI抗体包被到胶乳颗粒上，抗体偶联部位为Fc片段，使抗原结合位点指向流动相，因此不会发生抗体结合力损失的情况，保持了抗体的活力，大大减少了抗体的用量，降低了生产成本。除此之外，该方法得到的致敏胶乳颗粒稳定性较好，抗体不会从胶乳颗粒上脱落，而且由于化学偶联过程中，Fc片段发生了结构上的改变，因此减少了类风湿性因子(RF)和嗜异性抗体的干扰，大大提升了检测结果的准确性和可信性；

4、本发明试剂盒中采用结构稳定、能被多数抗体识别的cTnI-cTnT-cTnC复合物作为校准品配制材料，进一步提高了试剂的检测性能。

附图说明

图1所示的是本发明试剂盒与对照试剂盒的蛋白酶降解敏感性比较图；

图2所示的是本发明试剂盒与对照试剂盒的肝素敏感性比较图；

图3所示的是本发明试剂盒与对照试剂盒的磷酸化敏感性比较图。

具体实施方式

下面通过实施例进一步详细描述本发明，但本发明不仅仅局限于以下实施例。

实施例1 cTnI抗体组合物的选择

本实施例选用两种抗体组合物作为本发明试剂盒的制备，进行试验，这两种抗体组合物分别为：M18_18～28、19C7_41～49、560_83～93、MF4_190～1964个单克隆抗体(购自HyTest)按1∶1∶1∶1的比例进行组合，及M18_18～28、19C7_41～49、8E10_86～90、458_169～1784个单克隆抗体(购自HyTest)按1∶1∶1∶1的比例进行组合。

当然，除了以上组合的抗体组合物外，也可以为符合要求的其他组合的抗体组合物。

实施例2 cTnI检测试剂盒的制备

本实施例的主要原材料如下：

1.抗体：

本发明试剂盒1：M18_18～28、19C7_41～49、560_83～93、MF4_190～196(比例为1∶1∶1∶1)

本发明试剂盒2：M18_18～28、19C7_41～49、8E10_86～90、458_169～1784(比例为1∶1∶1∶1)

对照试剂盒：M18_18～28、19C7_41～49(比例为1∶1)

2.胶乳：

本发明仅示例性地采用直径为150～250nm的带羧基基团的聚苯乙烯胶乳颗粒进行实验。

本实施例的主要试剂配制如下：

试剂R1：含1.2％PEG6000(聚乙二醇6000)、0.15M(mol/L)NaCl的甘氨酸缓冲液。该试剂为无色透明溶液。

试剂R2：用抗人cTnI抗体组合物偶联聚苯乙烯胶乳颗粒。该试剂为乳白色溶液。

具体步骤如下：

1.取1ml(100mg/ml)聚苯乙烯胶乳颗粒，用0.1M、pH5.0的MES溶液(2-吗啉乙磺酸缓冲液)洗涤3次，超声分散；

2.加入0.2ml用0.1M、pH5.0的MES溶液新鲜配制的EDAC(10mg/ml)混合完全，室温混和15min；

3.加入0.8ml用0.1M、pH5.0的MES溶液新鲜配制的己二酸二酰肼(83mg/ml)，4℃反应过夜；

4.用0.1M、pH5.0的MES溶液洗涤2次，0.1M、pH7.5的磷酸盐溶液洗涤1次，超声分散备用；

5.取1.5ml抗体组合物(3.9mg/ml)溶液，加入0.2ml用0.1M、pH7.5的磷酸盐溶液配制的高碘酸钠溶液(10mg/ml)，室温混合15min；

6.将步骤5中氧化好的抗体组合物加入到步骤4中已激活的聚苯乙烯胶乳溶液中，4℃反应过夜；

7.加入0.22ml 10％BSA(小牛血清白蛋白)溶液，4℃混合4h；

8.加入0.3ml 10％葡萄糖溶液，4℃混合过夜；

9.用0.12M、pH7.5甘氨酸溶液洗涤3次，加入0.12M、pH7.5甘氨酸溶液(含1％BSA、0.1％TW-20、0.2％NaN₃的甘氨酸缓冲液)至聚苯乙烯胶乳颗粒终浓度为0.15％。

cTnI校准品：在磷酸盐缓冲溶液中加入不同含量的cTnI-cTnT-cTnC复合物，除菌过滤，所述的cTnI校准品中cTnI-cTnT-cTnC复合物含量控制在0～10ug/L之间，这些校准品均为无色透明液体。

实施例3 cTnI的测定

检测工具：日立7060型自动生化分析仪。

分析方法：两点终点法；波长：600nm；样品量：25ul；R1：200ul；R2：50ul；校准方式：多点校准；反应方向：向上；测定温度：37℃；样品与R1混匀后，于第1min读取吸光度A₁；于5min时加入R2，于4min时读取吸光度A₂。反应吸光度的计算为A2与A1的校准差值。

计算方法：采用多点校准，多参数曲线方程(如logit/log)拟合，以ΔA可求得肌钙蛋白含量。

实施例4 不同影响因素的敏感性分析

1、蛋白酶降解敏感性分析

将内源性组织蛋白酶的混合物和cTnI-cTnT-cTnC复合物一起孵育120h，本发明试剂盒(包括本发明试剂盒1、本发明试剂盒2)和对照试剂盒同时检测孵育前和孵育后cTnI-cTnT-cTnC复合物浓度，其中孵育前复合物浓度为10ug/L。实验结果表明，和对照试剂盒相比，本发明试剂盒大大提高了检测结果的稳定性(见图1)。

2、肝素敏感性分析

本发明试剂盒(包括本发明试剂盒1、本发明试剂盒2)和对照试剂盒同时检测不含肝素和含10IU/ml肝素的样本，实验结果表明，对照试剂盒对含有肝素的样本敏感性很高，和不含肝素的样本相比，其反应性有所降低，而本发明试剂盒在测定不含肝素或含有肝素样本时，反应性变化不大，即对肝素敏感性不高(见图2)。

3、磷酸化敏感性分析

本发明试剂盒(包括本发明试剂盒1、本发明试剂盒2)和对照试剂盒同时检测未发生磷酸化和被人为磷酸化的cTnI-cTnT-cTnC复合物，实验结果表明，对照试剂盒对磷酸化敏感性很高，而本发明试剂盒对磷酸化基本不敏感(见图3)。

实施例所用的原料，除另有说明外，均为市售工业品。

本发明的上述实施例是对本发明的说明而不能用于限制本发明，与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在权利要求书的范围内。

Claims (9)

1.一种检测心肌肌钙蛋白I的方法，其特征在于：将抗体组合物与聚苯乙烯胶乳颗粒进行偶联，然后与检测标本中相应抗原发生免疫反应形成聚集颗粒，在400～700nm波长下测定反应物产生的浊度，即可得出检测标本中cTnI的含量；所述抗体组合物由至少3种抗体组成，所述抗体为cTnI特异、而不与快骨骼肌型肌钙蛋白I和慢骨骼肌型肌钙蛋白I发生交叉反应，且所述抗体组合物中若其中一种抗体对检测标本中某个影响cTnI精确测定的因素敏感，则至少有另一种抗体对该影响cTnI精确测定的因素不敏感，检测标本中影响cTnI精确测定的因素包括cTnI的存在形式、cTnI的磷酸化、cTnI的氧化、cTnI的易水解性、抗凝剂对抗体结合的影响，抗体经组合后有较好的反应性。

2.根据权利要求1所述的一种检测心肌肌钙蛋白I的方法，其特征在于：所述抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。

3.根据权利要求1所述的一种检测心肌肌钙蛋白I的方法，其特征在于：所述抗凝剂包括乙二胺四乙酸、肝素。

4.根据权利要求1所述的一种检测心肌肌钙蛋白I的方法，其特征在于：所述抗体组合物为M18_18～28单克隆抗体、19C7_41～49单克隆抗体、560_83～93单克隆抗体、MF4_190～196单克隆抗体按1∶1∶1∶1的比例进行组合，或M18_18～28单克隆抗体、19C7_41～49单克隆抗体、8E10_86～90单克隆抗体、458_169～178单克隆抗体按1∶1∶1∶1的比例进行组合。

5.根据权利要求1所述的一种检测心肌肌钙蛋白I的方法，其特征在于：所述聚苯乙烯胶乳颗粒的平均粒径为0.05～0.5μm。

6.根据权利要求1所述的一种检测心肌肌钙蛋白I的方法，其特征在于：所述偶联为定向化学偶联，包括以下步骤：

(1)聚苯乙烯胶乳颗粒的激活：在聚苯乙烯胶乳颗粒中加入乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺，乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺与聚苯乙烯胶乳颗粒的重量比为0.5～5∶100，反应0.5～1h后加入己二酸二酰肼，己二酸二酰肼与聚苯乙烯胶乳颗粒的重量比为50～250∶100，继续反应0.5～1h，得到激活的聚苯乙烯胶乳颗粒；

(2)抗体组合物的氧化：用高碘酸钠将抗体组合物非结合活性区域Fc端的羧基氧化成醛基，高碘酸钠与抗体组合物的重量比为1～15∶10；

(3)抗体组合物与聚苯乙烯胶乳颗粒的偶联：将步骤(1)激活的聚苯乙烯胶乳颗粒与步骤(2)氧化的抗体组合物混合，抗体组合物与聚苯乙烯胶乳颗粒的重量比为2～22∶100，反应1～2h后，加入葡萄糖，葡萄糖与激活的聚苯乙烯胶乳颗粒的重量比为(25～50)∶100，继续反应2～4h，得到偶联抗体组合物的聚苯乙烯胶乳颗粒。

7.运用权利要求1所述的一种检测心肌肌钙蛋白I的方法制备的心肌肌钙蛋白I检测试剂盒，其特征在于：包括试剂1、试剂2，其中试剂1为缓冲液，试剂2由偶联抗体组合物的聚苯乙烯胶乳颗粒、缓冲液组成，偶联抗体组合物的聚苯乙烯胶乳颗粒与缓冲液的重量体积比为0.05～0.35％。

8.根据权利要求7所述的心肌肌钙蛋白I检测试剂盒，其特征在于：所述缓冲液为PBS缓冲液、Tris缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、柠檬酸-磷酸盐缓冲液、碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液、2-吗啉乙磺酸缓冲液、氯化铵缓冲液中的一种或几种。

9.根据权利要求7所述的心肌肌钙蛋白I检测试剂盒，其特征在于：还包括校准品，所述校准品采用cTnI-cTnT-cTnC复合物作为配制材料。

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