CN105137071A - 心肌肌钙蛋白i均相酶免疫法测定试剂盒 - Google Patents

心肌肌钙蛋白i均相酶免疫法测定试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN105137071A
CN105137071A CN201510465272.3A CN201510465272A CN105137071A CN 105137071 A CN105137071 A CN 105137071A CN 201510465272 A CN201510465272 A CN 201510465272A CN 105137071 A CN105137071 A CN 105137071A
Authority
CN
China
Prior art keywords
ctni
troponin
reagent
peptide section
peptide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201510465272.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105137071B (zh
Inventor
李锐
吴蓓蕾
唐霞蔚
包晓峰
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wenzhou Xu Tang Biotechnology Co. Ltd.
Original Assignee
ANHUI PROVINCE XUTANG MEDICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ANHUI PROVINCE XUTANG MEDICAL TECHNOLOGY Co Ltd filed Critical ANHUI PROVINCE XUTANG MEDICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Priority to CN201510465272.3A priority Critical patent/CN105137071B/zh
Publication of CN105137071A publication Critical patent/CN105137071A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105137071B publication Critical patent/CN105137071B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/566—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using specific carrier or receptor proteins as ligand binding reagents where possible specific carrier or receptor proteins are classified with their target compounds

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明涉及肌钙蛋白I竞争免疫比浊法检测试剂盒。本发明是采用定人工合成所需人心肌肌钙蛋白I(cTnI)的三条微型肽段，并将所获得肽段与酶蛋白藕联，与作用于该微型肽段的抗体组成试剂。利用该酶联免疫试剂制备的试剂盒可用于半自动或全自动生发分析仪器测定血清中心肌肌钙蛋白I(cTnI)含量。

Description

心肌肌钙蛋白I均相酶免疫法测定试剂盒
技术领域
本发明涉及心肌肌钙蛋白I均相酶免疫法测定试剂盒。本发明是应用作用于人心肌肌钙蛋白I(cTnI)单肽链特定位点的抗体，及采用该抗体制备测定血清中心肌肌钙蛋白I(cTnI)含量的均相酶联免疫试剂的方法。该发明制备的试剂盒可用于半自动或全自动生发分析仪器，属于医学生物学领域。
背景技术
心肌肌钙蛋白I(cTnI)是心肌损伤敏感及特异性最强的标志物之一，在急性心肌损伤及心肌炎中作为判断心肌细胞损伤的金标准，也作为冠动脉综合征危险分层及预后的关键生化标志物。肌钙蛋白属于调节蛋白，分子呈球形，由肌钙蛋白T(TnT)、肌钙蛋白I(TnI)、肌钙蛋白C(TnC)三条肽段组成，其中肌钙蛋白I(cTnI)属于一种碱性蛋白，共210个氨基酸，在血清中游离形式只占4.1％，大部分与肌钙蛋白T及C亚单位结合在一起，以复合体形式存在(WardDG,CornesMP,TrayerIP.StructuralconsequencesofcardiactroponinIphosphorylation.JBiolChem,2002,277(44):41795.)，此外还有可能以氧化型、还原型、磷酸化、去磷酸化及蛋白降解形式释放(WardDG,AshtonPR,TrayerHR,etal.AdditionalPKAphosphorylationsitesinhumancardiactroponinI.EurJBiochem,2001,268(1):179.)，属于心肌损伤高敏感指标性物质，在“微型心肌损伤”中肌钙蛋白I即可出现阳性结果，因此是临床上作为心肌细胞损伤的标志性生化检测项目之一。
由于肌钙蛋白I(cTnI)在血清中存在的形式多样，而且衰减周期短，因此对识别肌钙蛋白I(cTnI)的抗体有很高要求，且不同方法制备的抗体在测定肌钙蛋白I(cTnI)含量时，所得结果也完全不同，使得临床上对肌钙蛋白I(cTnI)含量测定无法标准化(KatrukhaA,BereznikovaA,FilatovV,etal.BiochemicalfactosinfluencingmeasurementofcardiactroponinIinserum.ClinChemLabMed,1999,37(11/12):1091.)。
临床上对肌钙蛋白I(cTnI)的检测灵敏度及特异性要求很高，虽然测定肌钙蛋白I(cTnI)的方法很多，但是定量测定受到许多因素的影响，从而导致各种检测结果之间相差很大。其中最主要原因是在患者血清中肌钙蛋白I(cTnI)会有不同程度的降解、游离、复合物形式及不同的清除率，形成肌钙蛋白I(cTnI)在血清中的不同半衰期，因此各种检测方法中分别使用针对上述不同抗原决定簇的抗体，其免疫反应必然有很大差异。
目前关于比浊测定法测定肌钙蛋白I(cTnI)的试剂有很多厂家，但是不管是试剂灵敏度，还是特异性都很难满足临床检测要求，这是因为肌钙蛋白I(cTnI)在正常人血清中含量极低，在0.08ng/ml以下，而大多比浊法检测极限在1ng/ml，而且在此检测极限情况下，影响测定结果的因素也被成倍放大。
发明内容
本发明的目的是设计一组cTnI的微型肽段，将该组微型肽段分别标记于载体酶上(FriguetB,Djavadi-OhanianceL,PagesJ,BussardA,GoldbergM.Aconvenientenzyme-linkedimmunosorbentassayfortestingwhethermonoclonalantibodiesrecognizethesameantigenicsite.Applicationtohybridomasspecificforthebeta2-subunitofEscherichiacolitryptophansynthase.JImmunolMethods,1983Jun10:60(3):351-8.)，与作用于该组肽段抗体共同组成一个测定样本cTnI的检测试剂，该试剂可用于半自动或全自动生化分析仪器准确、特异性的测定血清中心肌肌钙蛋白I(cTnI)含量。
本发明的技术方案
1.一种肌钙蛋白I均相酶免疫法检测试剂盒，其特征在于该检测试剂盒包括：根据肌钙蛋白I全氨基酸序列合成相应抗体作用位点10-30个氨基酸的微型肽段，将合成肽段共价标记于载体(酶蛋白)并制备反应试剂；同时采用肽段作用的抗体制备成免疫酶试剂和纯化人心肌肌钙蛋白I(cTnI)制备而成的标准品。
2.如权利要求1所述肌钙蛋白I均相酶免疫法检测试剂盒，其特征在于该试剂盒中的免疫酶试剂是按以下方法制备的：
(1)据肌钙蛋白I(cTnI)氨基酸序列，分别选取氨基端(序列2)，羧基端(序列4)和中心区(序列3)氨基酸序列，获得其相应肽段(序列5或8，7或10和6或9)，一般氨基残基数在5-30个，采用多肽合成仪进行合成，反相高效液相色谱法进行分离纯化；
(2)选用酶蛋白作为载体，采用碳化二亚胺将获取肽段与载体共价偶联；并将上述肽段混合后与载体进行标记，或分别与载体进行标记，标记完成后，对混合体系进行分离纯化，获得标记量均一的肽段-酶标记物；
(3)分别将上述作用位点的cTnI多克隆抗体与酶相应底物制备成免疫反应试剂。
3.如权利要求1所述肌钙蛋白I均相酶免疫法检测试剂盒，其特征在于该试剂盒中
免疫酶试剂的配方是：缓冲液20mmol/L、酶底物10g/L、cTnI多克隆抗体1g/L加纯水至1000ml；
反应试剂的配方是：缓冲液20mmol/L、cTnI肽段-酶标记物0.1g/L加纯水至1000ml；
标准品：纯化人心肌肌钙蛋白I(cTnI)5ng/ml、pH＝5.8的PBS缓冲液。
具体实施方式
本发明是采用人工合成获得所需人心肌肌钙蛋白I(cTnI)的三条肽段，将获得的肽段分别与载体(酶蛋白)制备成肽段-酶标记物。同时利用三条肽段作为配体，聚丙烯酰胺为配基制备的亲和层析柱，将获得的高效价血清进行免疫亲和层析，从而获得针对该肽段特异性识别的多克隆抗体。该抗体其优点是亲和力高于相应单克隆抗体，特异性与相应单克隆抗体相当，且制备成本低，相对于单克隆抗体制备流程简单。
将上述方法筛选获得的抗体、酶底物和缓冲液制备成试剂1(免疫酶试剂)；将肽段-酶标记物和缓冲液制备成试剂2(反应试剂)。
具体操作步骤如下：
1.肌钙蛋白I(cTnI)不同肽段抗体的制备：
(1)按常规方法(D.R.马歇克J.T.门永R.R.布格斯等著，朱厚础译.蛋白质纯化与鉴定实验指南.科技出版社，2000版。)提取自人血清中的肌钙蛋白I(cTnI)肽链，并进行氨基酸序列测序，所得氨基酸序列(序列1)：
MetAlaAspglySerSerAspAlaAlaArgGluProArgProAlaProAlaProIleArgArgArgSerSerAsnTyrArgAlaTyrAlaThrGluProHisAlaLysLysLysSerLysIleSerAlaSerArgLysLeuGlnLeuLysThrLeuLeuLeuGlnIleAlaLysGinGluLeuGluArgGluAlaGluGluArgArgGlyGluLysGlyArgAlaLeuSerThrArgCysGinProLeuGluLeuAlaGlyLeuGlyPheAlaGluLeuGlnAspLeuCysArgGlnLeuHisAlaArgValAspLysValAspGluGluArgTyrAspIleGLUAlaLysValThrLysAsnIleThrGluIleAlaAspLeuThrGlnLysIlePheAspLeuArgGlyLysPheLysArgProThrLeuArgArgValArgIleSerAlaAspAlaMetMetGinAlaLeuLeuGlyAlaArgAlaLysGluSerLeuAspLeuArgAlaHisLeuLysGlnValLysLysGluAspThrGluLysGluAsnArgGluValGlyAspTrpArgLysAsnIleAspAlaLeuSerGlyMetGluGlyArgLysLysLysPheGluSer
(2)利用蛋白水解酶定点水解肌钙蛋白I(cTnI)肽链，采用凝胶排阻色谱法和反相高效液相色谱法进行肽段分布测定和纯化，收集需要的肽段。
1)氨基端肽段：长度为70个氨基酸残基，氨基酸序列在氨基端1～70残基之内(序列2)；:
MetAlaAspglySerSerAspAlaAlaArgGluProArgProAlaProAlaProIleArgArgArgSerSerAsnTyrArgAlaTyrAlaThrGluProHisAlaLysLysLysSerLysIleSerAlaSerArgLysLeuGlnLeuLysThrLeuLeuLeuGlnIleAlaLysGinGluLeuGluArgGluAlaGluGluArgArgGly
2)中心区肽段：长度为82个氨基酸残基，氨基酸序列在氨基端34～116残基之内(序列3):
HisAlaLysLysLysSerLysIleSerAlaSerArgLysLeuGlnLeuLysThrLeuLeuLeuGlnIleAlaLysGinGluLeuGluArgGluAlaGluGluArgArgGlyGluLysGlyArgAlaLeuSerThrArgCysGinProLeuGluLeuAlaGlyLeuGlyPheAlaGluLeuGlnAspLeuCysArgGlnLeuHisAlaArgValAspLysValAspGluGluArgTyrAspIleGlu
3)羧基端肽段：长度为101个氨基酸残基，氨基酸序列在氨基端110～210残基之内(序列4):
GluArgTyrAspIleGluAlaLysValThrLysAsnIleThrGluIleAlaAspLeuThrGlnLysIlePheAspLeuArgGlyLysPheLysArgProThrLeuArgArgValArgIleSerAlaAspAlaMetMetGinAlaLeuLeuGlyAlaArgAlaLysGluSerLeuAspLeuArgAlaHisLeuLysGlnValLysLysGluAspThrGluLysGluAsnArgGluValGlyAspTrpArgLysAsnIleAspAlaLeuSerGlyMetGluGlyArgLysLysLysPheGluSer
上述水解用蛋白酶可以蛋白酶K，胰凝乳蛋白酶，无花果蛋白酶，胃蛋白酶，链霉蛋白酶，菠萝蛋白酶，羧肽酶Y。水解时间为0.5～4小时，本发明优选蛋白酶K和羧肽酶Y，水解时间为1小时。
(3)用牛血清白蛋白分别将以上氨基端肽段、中心区肽段和羧基端肽段进行修饰，与弗氏佐剂混合对兔进行免疫，也可选用山羊，本发明优选兔。
上述选用的肽段修饰载体也可选用鸡卵清蛋白，兔血清白蛋白，纤维蛋白原，优选牛血清白蛋白。
(4)获取兔抗人肌钙蛋白I(cTnI)各肽段的高效价混合免疫血清，采用高效液相色谱分离纯化获得各区段目标多肽为配体，聚丙烯酰胺为配基的亲和层析柱，将多克隆抗体血清进行亲和层析
获得的具有高亲和力和特异性的抗体，分别编号：
识别氨基端肽段的抗体为：cTnI-Ab-1
识别中心区肽段的抗体为：cTnI-Ab-2
识别羧基端肽段的抗体为：cTnI-Ab-3。
2.该试剂盒cTnI肽段-酶试剂是按以下方法制备的：
(1)肽段的合成
根据肌钙蛋白I(cTnI)氨基酸序列，分别选取羧基端、氨基端和中心区氨基酸序列，获得其相应肽段，一般氨基残基数在5～20个。采用多肽合成仪进行合成(MACKIERK,SMITHDM.(editor)Guidebooktoorganicsynthesis.CHENSHAO，DINGCHENYUAN，CENRENWANG(Translators)，Beijing：SciencePress，1988:360-363)，反相高效液相色谱法进行分离纯化。
氨基端肽段序列范围1-30(序列5)：
MetAlaAspGlySerSerAspAlaAlaArgGluProArgProAlaProAlaProIleArgArgArgSerSerAsnTyrArgAlaTyrAla
中心区域肽段序列范围61-100(序列6)：
LeuGluArgGluAlaGluGluArgArgGlyGluLysGlyArgAlaLeuSerThrArgCysGinProLeuGluLeuAlaGlyLeuGlyPheAlaGluLeuGlnAspLeuCysArgGlnLeu
羧基段肽段序列范围181-210(序列7)：
ThrGluLysGluAsnArgGluValGlyAspTrpArgLysAsnIleAspAlaLeuSerGlyMetGluGlyArgLysLysLysPheGluSer
(2)肽段筛选
分别选用肌钙蛋白I氨基端多克隆抗体、中心区域多克隆抗体和羧基端多克隆抗体分别与合成肽段进行酶联免疫叠加实验。
优先选取序列如下：
氨基端序列11-30(序列8)：
GluProArgProAlaProAlaProIleArgArgArgSerSerAsnTyrArgAlaTyrAla
中心区肽段序列71-80(序列9)：
GluLysGlyArgAlaLeuSerThrArgCys
羧基端序列191-200(序列10)：
TrpArgLysAsnIleAspAlaLeuSerGly
(3)载体酶标记
选用碱性磷酸酶作为载体，采用碳化二亚胺将获取肽段与载体共价偶联。可以将上述肽段混合后与载体进行标记，也可分别与载体进行标记，标记完成后，对混合体现进行分离纯化，获得标记量均一的肽段-酶标记物。本步骤也可选用辣根过氧化物酶、腺苷脱氨酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶作为载体，本发明优选碱性磷酸酶做为载体。肽段-酶标记物分别以如下命名：
肽段-酶标记物：cTnI-ALP
氨基端肽段-酶标记物：cTnI-ALP-1
中心区肽段-酶标记物：cTnI-ALP-2
羧基端肽段-酶标记物：cTnI-ALP-3。
3.试剂盒组成
(1)试剂1(免疫酶试剂)主要成分如下：
底物根据选用酶的不同进行变化。
(2)试剂2(反应试剂)主要成分如下：
缓冲液20～50mmol/L
cTnI-ALP0.01～0.05％
加纯水至1000ml
(3)标准品：
纯化人心肌肌钙蛋白I(cTnI)5ng/ml
pH＝5.8的PBS缓冲液
备注：测定时，用pH＝5.8的PBS缓冲液将5ng/ml标准液按倍比稀释的方法稀释成浓度分别为5ng/ml、2.5ng/ml、1.25ng/ml、0.625ng/ml、0.313ng/ml五组标准液，采用五点定标的方式做标准曲线。
4.用该试剂盒定量测定样本中人心肌肌钙蛋白I(cTnI)的步骤
(1)检测仪器及试剂：奥林巴斯AU640全自动生化分析仪，本发明配制的液体双试剂(反应试剂和胶乳试剂)。
(2)可采用新鲜人血清或重组人心肌肌钙蛋白I(cTnI)。
(3)操作步骤如下表1：
表1定量测定样本中心肌肌钙蛋白I(cTnI)的术式
结果计算：样品中肌钙蛋白值(μg/L)＝△AT/△AS×校准液浓度
式中：△AT：样本管吸光度值
△AS：校准管吸光度值
本发明中使用的试剂购置于国内相关生物试剂公司。
本发明的积极意义
本发明涉及肌钙蛋白I均相酶联免疫法检测试剂盒。本发明是采用人工合成所需人心肌肌钙蛋白I(cTnI)的三条微型肽段，并将所获得肽段与酶蛋白藕联，与作用于该微型肽段的抗体组成试剂。利用该酶联免疫试剂制备的试剂盒可用于半自动或全自动生发分析仪器测定血清中心肌肌钙蛋白I(cTnI)含量。
实施例
以下实施例是为更好的说明本发明，而不对本发明要求保护的技术方案产生限制。
实施例1
1.肽段合成：采用Tribute双通道多肽合成仪(ProteinTechnologies公司)进行固相多肽合成。
2.肽段筛选：酶联免疫叠加实验进行肽段筛选,，选取序列8；序列9；序列10。
3.载体酶标记
(1)分别将氨基端肽段、中心区肽段和羧基端肽段按2:3:1(质量比)进行混合，取混合后肽段3mg溶于pH＝6.5的磷酸缓冲液中，加入100mgEDC，室温反应1小时后，加入6mg碱性磷酸酶震荡反应过夜。
(2)将反应后的酶标记物混合液用SephadexG-100层析柱分离纯化，将分子量低于70KD和高于200KD的酶蛋白弃去，保留分子量在80-200KD之间的cTnI-ALP。
4.试剂组成
试剂1(免疫酶试剂)
试剂1(反应试剂)
校准品：
pH＝5.8的PBS缓冲液20mM
纯化人心肌肌钙蛋白I5ng/mL。
实施例2
1.肽段合成：采用Tribute双通道多肽合成仪(ProteinTechnologies公司)进行固相多肽合成。
2.肽段筛选：酶联免疫叠加实验进行肽段筛选,，选取序列8。
3.载体酶标记
(1)将氨基端肽段取3mg溶于pH＝6.5的磷酸缓冲液中，加入100mg碳化二亚胺(EDC)，室温反应1小时后，加入6mg碱性磷酸酶震荡反应过夜。
(2)将反应后的酶混合液用SephadexG-100层析柱分离纯化，将分子量低于70KD和高于200KD的酶蛋白弃去，保留分子量在81-200KD之间的cTnI-ALP-1。
4.试剂组成
试剂1(免疫酶试剂)：
100mmol/L磷酸缓冲液pH＝7.5
cTnI-Ab-10.2％
对硝基苯磷酸盐1.2％
试剂1(反应试剂)：
50mmol/LAMP-盐酸缓冲液pH＝9.0
cTnI-ALP-10.015％
校准品：
pH＝5.8的PBS缓冲液20mM
纯化人心肌肌钙蛋白I5ng/mL
实施例3
1.肽段合成：采用Tribute双通道多肽合成仪(ProteinTechnologies公司)进行固相多肽合成。
2.肽段筛选：酶联免疫叠加实验进行肽段筛选,，选取序列9。
3.载体酶标记
(1)将中心区肽段取3mg溶于pH＝6.5的磷酸缓冲液中，加入100mgEDC，室温反应1小时后，加入6mg碱性磷酸酶震荡反应过夜。
(2)将反应后的酶混合液用SephadexG-100层析柱分离纯化，将分子量低于70KD和高于200KD的酶蛋白弃去，保留分子量在80～200KD之间的cTnI-ALP-2。
4.试剂组成
试剂1(免疫酶试剂)：
100mmol/L磷酸缓冲液pH＝7.5
cTnI-Ab-20.3％
对硝基苯磷酸盐1.3％
试剂1(反应试剂)：
50mmol/LAMP-盐酸缓冲液pH＝9.0
cTnI-ALP-20.01％
校准品：
pH＝5.8的PBS缓冲液20mM
纯化人心肌肌钙蛋白I5ng/mL
实施例4
1.肽段合成：采用Tribute双通道多肽合成仪(ProteinTechnologies公司)进行固相多肽合成。
2.肽段筛选：酶联免疫叠加实验进行肽段筛选,，选取序列10。
3.载体酶标记
(1)将羧基端肽段取3mg溶于pH＝6.5的磷酸缓冲液中，加入100mgEDC，室温反应1小时后，加入6mg碱性磷酸酶震荡反应过夜。
(2)将反应后的酶混合液用SephadexG-100层析柱分离纯化，将分子量低于70KD和高于200KD的酶蛋白弃去，保留分子量在80-200KD之间的cTnI-ALP-3。
4.试剂组成
试剂1(免疫酶试剂)：
100mmol/L磷酸缓冲液pH＝7.5
cTnI-Ab-30.3％
对硝基苯磷酸盐1.5％
试剂1(反应试剂)：
50mmol/LAMP-盐酸缓冲液pH＝9.0
cTnI-ALP-30.03％
校准品：
pH＝5.8的PBS缓冲液20mM
纯化人心肌肌钙蛋白I5ng/mL。
表2实验结果

Claims (3)

1.一种肌钙蛋白I均相酶免疫法检测试剂盒，其特征在于该检测试剂盒包括：根据肌钙蛋白I全氨基酸序列合成相应抗体作用位点10-30个氨基酸的微型肽段，将合成肽段共价标记于载体(酶蛋白)并制备反应试剂；同时采用肽段作用的抗体制备成免疫酶试剂和纯化人心肌肌钙蛋白I(cTnI)制备而成的标准品。
2.如权利要求1所述肌钙蛋白I均相酶免疫法检测试剂盒，其特征在于该试剂盒中的酶免疫试剂是按以下方法制备的：
(1)据肌钙蛋白I(cTnI)氨基酸序列，分别选取氨基端(序列2)，羧基端(序列4)和中心区(序列3)氨基酸序列，获得其相应肽段(序列5或8，7或10和6或9)，一般氨基残基数在5-30个，采用多肽合成仪进行合成，反相高效液相色谱法进行分离纯化；
(2)选用酶蛋白作为载体，采用碳化二亚胺将获取肽段与载体共价偶联；并将上述肽段混合后与载体进行标记，或分别与载体进行标记，标记完成后，对混合体系进行分离纯化，获得标记量均一的肽段-酶标记物；
(3)分别将上述作用位点的cTnI多克隆抗体与酶相应底物制备成免疫反应试剂。
3.如权利要求1所述肌钙蛋白I均相酶免疫法检测试剂盒，其特征在于该试剂盒中
免疫酶试剂的配方是：缓冲液20mmol/L、酶底物10g/L、cTnI多克隆抗体1g/L加纯水至1000ml；
反应试剂的配方是：缓冲液20mmol/L、cTnI肽段-酶标记物0.1g/L加纯水至1000ml；
标准品：纯化人心肌肌钙蛋白I(cTnI)5ng/ml、pH＝5.8的PBS缓冲液。
CN201510465272.3A 2015-07-29 2015-07-29 心肌肌钙蛋白i均相酶免疫法测定试剂盒 Active CN105137071B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510465272.3A CN105137071B (zh) 2015-07-29 2015-07-29 心肌肌钙蛋白i均相酶免疫法测定试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510465272.3A CN105137071B (zh) 2015-07-29 2015-07-29 心肌肌钙蛋白i均相酶免疫法测定试剂盒

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105137071A true CN105137071A (zh) 2015-12-09
CN105137071B CN105137071B (zh) 2017-08-11

Family

ID=54722495

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510465272.3A Active CN105137071B (zh) 2015-07-29 2015-07-29 心肌肌钙蛋白i均相酶免疫法测定试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105137071B (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106770821A (zh) * 2016-12-13 2017-05-31 南通大学附属医院 肽段同位素稀释质谱法定量重组肌钙蛋白i含量的方法
CN108037282A (zh) * 2017-12-22 2018-05-15 太原瑞盛生物科技有限公司 一种肌钙蛋白i检测试剂及其制备和检测方法
CN111735965A (zh) * 2020-07-02 2020-10-02 北京美联泰科生物技术有限公司 心肌肌钙蛋白i检测试剂和制备方法以及心肌肌钙蛋白i检测试剂盒
CN114316042A (zh) * 2022-01-19 2022-04-12 天津奇云诺德生物医学有限公司 一种cTnI蛋白抗原决定簇多肽及其应用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008142057A1 (en) * 2007-05-21 2008-11-27 Gentian As Turbidimetric immunoassay for assessing human cystatin c
CN102539784A (zh) * 2011-12-26 2012-07-04 宁波美康生物科技股份有限公司 一种检测心肌肌钙蛋白i的方法及其应用
CN103529208A (zh) * 2012-07-04 2014-01-22 上海交通大学 一种均相免疫分析方法
CN103760348A (zh) * 2014-02-11 2014-04-30 苏州博源医疗科技有限公司 一种甘胆酸免疫检测试剂及其制备和检测方法
CN103940986A (zh) * 2014-03-24 2014-07-23 安徽省煦棠医疗科技有限公司 肌钙蛋白i 特定位点抗体制备及其检测试剂盒
CN104569431A (zh) * 2015-01-04 2015-04-29 深圳市艾瑞生物科技有限公司 一种快速定量检测肌钙蛋白i的均相荧光免疫试剂组及其制备方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008142057A1 (en) * 2007-05-21 2008-11-27 Gentian As Turbidimetric immunoassay for assessing human cystatin c
CN102539784A (zh) * 2011-12-26 2012-07-04 宁波美康生物科技股份有限公司 一种检测心肌肌钙蛋白i的方法及其应用
CN103529208A (zh) * 2012-07-04 2014-01-22 上海交通大学 一种均相免疫分析方法
CN103760348A (zh) * 2014-02-11 2014-04-30 苏州博源医疗科技有限公司 一种甘胆酸免疫检测试剂及其制备和检测方法
CN103940986A (zh) * 2014-03-24 2014-07-23 安徽省煦棠医疗科技有限公司 肌钙蛋白i 特定位点抗体制备及其检测试剂盒
CN104569431A (zh) * 2015-01-04 2015-04-29 深圳市艾瑞生物科技有限公司 一种快速定量检测肌钙蛋白i的均相荧光免疫试剂组及其制备方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
王琛等: "基于肽的均相电化学发光法检测肌钙蛋白I", 《中国化学会第十届全国发光分析学术研讨会论文集》 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106770821A (zh) * 2016-12-13 2017-05-31 南通大学附属医院 肽段同位素稀释质谱法定量重组肌钙蛋白i含量的方法
CN106770821B (zh) * 2016-12-13 2020-04-17 南通大学附属医院 肽段同位素稀释质谱法定量重组肌钙蛋白i含量的方法
CN108037282A (zh) * 2017-12-22 2018-05-15 太原瑞盛生物科技有限公司 一种肌钙蛋白i检测试剂及其制备和检测方法
CN111735965A (zh) * 2020-07-02 2020-10-02 北京美联泰科生物技术有限公司 心肌肌钙蛋白i检测试剂和制备方法以及心肌肌钙蛋白i检测试剂盒
CN111735965B (zh) * 2020-07-02 2023-07-25 北京美联泰科生物技术有限公司 心肌肌钙蛋白i检测试剂和制备方法以及心肌肌钙蛋白i检测试剂盒
CN114316042A (zh) * 2022-01-19 2022-04-12 天津奇云诺德生物医学有限公司 一种cTnI蛋白抗原决定簇多肽及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN105137071B (zh) 2017-08-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103940986B (zh) 肌钙蛋白i特定位点抗体制备及其检测试剂盒
JP7022969B2 (ja) ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症を診断するための方法および試薬
CN104991077B (zh) 肌钙蛋白i竞争比浊法检测试剂盒
US7763435B2 (en) Method for diagnosis of alzheimer's disease with determination of LASP-1 immunoreactivity
US5296354A (en) Kit for the specific assay of angiotensin II
CN105137071A (zh) 心肌肌钙蛋白i均相酶免疫法测定试剂盒
RU2009143671A (ru) Высокочувствительные иммуноанализы и наборы для определения представляющих интерес пептидов и белков
CN111077320B (zh) 一种检测鸡或鸭骨骼肌肌钙蛋白i的酶联免疫试剂盒及其制备方法与应用
WO2012175602A2 (en) Elisa for calprotectin
JP5252339B2 (ja) Ｐａｄ４及び抗ｐａｄ４抗体の測定方法並びに関節リウマチの検出方法
US20110045508A1 (en) Urinary CA125 Peptides as Biomarkers of Ovarian Cancer
AU715797B2 (en) Methods for determining the presence of brain protein S-100
CN110082537A (zh) 血管内皮生长因子化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法
EP3045916A1 (en) Kit and method for diagnosis, prognosis or monitoring of liver disease through measurement of amount of ast
CN110850104A (zh) 用于阿尔兹海默症自身抗体检测的蛋白抗原组合及其应用
LU500306B1 (en) Method for detecting DNASE1L3 based on magnetic particle chemiluminescence immunoassay
EP2918600B1 (en) Novel peptide and use thereof
Ropers et al. Enzyme immunoassay for the measurement of human tenascin-C on the Bayer Immuno 1™ analyzer
EP4187246A1 (en) Method for assisting diagnosis of inflammatory bowel disease
US20160370382A1 (en) Method for immunoassay of autoantibody against ku86, kit for use in same, and method for determination of primary hepatocellular carcinoma using same
CN117606896B (zh) 一种人血清样品中gnp浓度的检测方法
JP7066142B2 (ja) 試料に含まれるペリオスチン測定の感度の改善方法
CN118005797A (zh) 一种抗人碱性磷酸酶单克隆抗体及其在免疫类诊断试剂阻断剂制备中的应用
Lianidou et al. BRCA1 tumor suppressor gene product shares immunoreactive epitopes with a protein present in seminal plasma
CN102942531A (zh) 一种三聚氰胺衍生物及三聚氰胺单克隆抗体的制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20170607

Address after: 325000, No. 1, No. 1305, 1599, Binhai Park, Wenzhou economic and Technological Development Zone, Zhejiang, China

Applicant after: Wenzhou Xu Tang Biotechnology Co. Ltd.

Address before: 305, room 1, building 80, science and Technology Pioneer Park, No. 246000, Tianzhu Road, Anqing Economic Development Zone, Anhui, China

Applicant before: ANHUI PROVINCE XUTANG MEDICAL TECHNOLOGY CO., LTD.

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant