CN104991077B - 肌钙蛋白i竞争比浊法检测试剂盒 - Google Patents

肌钙蛋白i竞争比浊法检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及肌钙蛋白I竞争免疫比浊法检测试剂盒。本发明是采用定人工合成所需人心肌肌钙蛋白I(cTnI)的三条微型肽段，并将所获得肽段与惰性载体蛋白藕联，与作用于该微型肽段的抗体制备的聚苯乙烯胶乳微球组成试剂。利用该免疫乳胶试剂制备的试剂盒可用于半自动或全自动生发分析仪器测定血清中心肌肌钙蛋白I(cTnI)含量。

Description

肌钙蛋白I竞争比浊法检测试剂盒
技术领域
本发明涉及一种心肌肌钙蛋白I竞争免疫比浊法测定试剂盒，属于医学领域。
背景技术
心肌肌钙蛋白I(cTnI)是心肌损伤敏感及特异性最强的标志物之一，在急性心肌损伤及心肌炎中作为判断心肌细胞损伤的金标准，也作为冠动脉综合征危险分层及预后的关键生化标志物。肌钙蛋白属于调节蛋白，分子呈球形，由肌钙蛋白T(TnT)、肌钙蛋白I(TnI)、肌钙蛋白C(TnC)三条肽段组成，其中肌钙蛋白I(cTnI)属于一种碱性蛋白，共210个氨基酸，在血清中游离形式只占4.1％，大部分与肌钙蛋白T及C亚单位结合在一起，以复合体形式存在(Ward DG,Cornes MP,Trayer IP.Structural consequences of cardiactroponin I phosphorylation.J Biol Chem,2002,277(44):41795.，此外还有可能以氧化型、还原型、磷酸化、去磷酸化及蛋白降解形式释放(Ward DG,Ashton PR,Trayer HR,etal.Additional PKA phosphorylation sites in human cardiac troponin I.Eur JBiochem,2001,268(1):179.)，属于心肌损伤高敏感指标性物质，在“微型心肌损伤”中肌钙蛋白I即可出现阳性结果，因此是临床上作为心肌细胞损伤的标志性生化检测项目之一。
由于肌钙蛋白I(cTnI)在血清中存在的形式多样，而且衰减周期短，因此对识别肌钙蛋白I(cTnI)的抗体有很高要求，且不同方法制备的抗体在测定肌钙蛋白I(cTnI)含量时，所得结果也完全不同，使得临床上对肌钙蛋白I(cTnI)含量测定无法标准化(KatrukhaA,Bereznikova A,Filatov V,et al.Biochemical factos influencing measurement ofcardiac troponin I in serum.Clin ChemLab-Med,1999,37(11/12):1091.)。
临床上对肌钙蛋白I(cTnI)的检测灵敏度及特异性要求很高，虽然测定肌钙蛋白I(cTnI)的方法很多，但是定量测定受到许多因素的影响，从而导致各种检测结果之间相差很大。其中最主要原因是在患者血清中肌钙蛋白I(cTnI)会有不同程度的降解、游离、复合物形式及不同的清除率，形成肌钙蛋白I(cTnI)在血清中的不同半衰期，因此各种检测方法中分别使用针对上述不同抗原决定簇的抗体，其免疫反应必然有很大差异。
目前关于比浊测定法测定肌钙蛋白I(cTnI)的试剂有很多厂家，但是不管是试剂灵敏度，还是特异性都很难满足临床检测要求，这是因为肌钙蛋白I(cTnI)在正常人血清中含量极低，在0.08ng/ml以下，而大多比浊法检测极限在1ng/ml，而且在此检测极限情况下，影响测定结果的因素也被成倍放大。
发明内容
本发明的目的是为了解决以上现有技术测定肌钙蛋白I(cTnI)的试剂中存在灵敏度，还是特异性都很难满足临床检测要求的问题，使得临床上对肌钙蛋白I(cTnI)含量测定标准化；本发明是将待测样本与免疫聚苯乙烯微球混合，待测样本中的肌钙蛋白I与微球上抗体发生免疫复合反应，由于抗体作用位点单一，避免形成具有浊度的大颗粒复合物，当加入2号试剂时，载体蛋白上的肌钙蛋白I微型肽段与抗体发生免疫复合反应，计算浊度强度得出游离抗体浓度则可推算出待测物中心肌肌钙蛋白I的浓度。
本发明的技术方案
1.一种肌钙蛋白I竞争比浊法检测试剂盒，该检测试剂盒包括：根据肌钙蛋白I全氨基酸序列合成相应抗体作用位点的微型肽段(10-30个氨基酸)，将合成肽段共价标记于惰性载体蛋白并制备成反应试剂；同时采用肽段作用的抗体包被于聚苯乙烯微球上制备成免疫乳胶试剂和纯化人心肌肌钙蛋白I(cTnI)制备而成的标准品。
2.该试剂盒中的免疫胶乳试剂是按以下方法制备的：
(1)据肌钙蛋白I(cTnI)氨基酸序列，分别选取氨基端(序列2)，羧基端(序列4)和中心区(序列3)氨基酸序列，获得其相应肽段(序列5或8，7或10和6或9)，一般氨基残基数在5-30个。采用多肽合成仪进行合成，反相高效液相色谱法进行分离纯化；
(2)选用惰性蛋白作为载体，采用碳化二亚胺将获取肽段与载体蛋白共价偶联；并将上述肽段混合后与载体蛋白进行标记，或分别与载体蛋白进行标记，标记完成后，对混合体系进行分离纯化，获得标记量均一的肽段-载体蛋白标记物；
(3)采用碳化二亚胺活化微球羧基，分别将上述作用位点的cTnI多隆抗体与活化的羧基胶乳微球混合反应，制备成免疫胶乳微球。
3.该试剂盒中：
试剂1(免疫胶乳试剂)的配方是：缓冲液20mmol/L、促凝剂30g/L、氯化钠9g/L、cTnI单克隆抗体标记微球cTnIAb-PS 1g/L加纯水至1000ml。
试剂2(反应试剂)的配方是：缓冲液20mmol/L、肽段-蛋白标记物cTnI-BSA 0.01g/L加纯水至1000ml；
标准品：纯化人心肌肌钙蛋白I(cTnI)5ng/ml、pH＝5.8的PBS缓冲液。
具体实施方式
本发明是采用人工合成获得所需人心肌肌钙蛋白I(cTnI)的三条肽段，将获得的肽段分别与惰性载体蛋白制备成肽段-载体蛋白标记物。同时利用三条肽段作为配体，聚丙烯酰胺为配基制备的亲和层析柱，将获得的高效价血清进行免疫亲和层析，从而获得针对该肽段特异性识别的多克隆抗体。该抗体优点是亲和力高于相应单克隆抗体，特异性与相应单克隆抗体相当，且制备成本低，相对于单克隆抗体制备流程简单。
将上述方法筛选获得的抗体分别与羧基聚苯乙烯胶乳微球进行化学固定，将获得的免疫聚苯乙烯微球与缓冲液制备成试剂1(免疫乳胶试剂)，将肽段-载体蛋白标记物制备成试剂2(反应试剂)。
具体操作步骤如下：
1.肌钙蛋白I(cTnI)不同肽段抗体的制备：
(1)按常规方法(D.R.马歇克J.T.门永R.R.布格斯等著，朱厚础译.蛋白质纯化与鉴定实验指南.科技出版社，2000版。)提取自人血清中的肌钙蛋白I(cTnI)肽链，并进行氨基酸序列测序，所得氨基酸序列(序列1)：
(2)利用蛋白水解酶定点水解肌钙蛋白I(cTnI)肽链，采用凝胶排阻色谱法和反相高效液相色谱法进行肽段分布测定和纯化，收集需要的肽段。
1)氨基端肽段：长度为70个氨基酸残基，氨基酸序列在氨基端1～70残基之内(序列2)；:
2)中心区肽段：长度为82个氨基酸残基，氨基酸序列在氨基端34～116残基之内(序列3):
3)羧基端肽段：长度为101个氨基酸残基，氨基酸序列在氨基端110～210残基之内(序列4):
上述水解用蛋白酶可以蛋白酶K，胰凝乳蛋白酶，无花果蛋白酶，胃蛋白酶，链霉蛋白酶，菠萝蛋白酶，羧肽酶Y。水解时间为0.5～4小时，本发明优选蛋白酶K和羧肽酶Y，水解时间为1小时。
(3)用牛血清白蛋白分别将以上氨基端肽段、中心区肽段和羧基端肽段进行修饰，与弗氏佐剂混合对兔进行免疫，也可选用山羊，本发明优选兔。
上述选用的肽段修饰载体也可选用鸡卵清蛋白，兔血清白蛋白，纤维蛋白原，优选牛血清白蛋白。
(4)获取兔抗人肌钙蛋白I(cTnI)各肽段的高效价混合免疫血清，采用高效液相色谱分离纯化获得各区段目标多肽为配体，聚丙烯酰胺为配基的亲和层析柱，将多克隆抗体血清进行亲和层析
获得的具有高亲和力和特异性的抗体，分别编号：
识别氨基端肽段的抗体为：cTnI-Ab-1
识别中心区肽段的抗体为：cTnI-Ab-2
识别羧基端肽段的抗体为：cTnI-Ab-3
2.心肌肌钙蛋白I(cTnI)肽段的制备：
(1)根据肌钙蛋白I(cTnI)氨基酸序列，分别选取羧基端、氨基端和中心区氨基酸序列，获得其相应肽段，一般氨基残基数在5-20个。采用多肽合成仪进行合成，反相高效液相色谱法进行分离纯化(MACKIERK,SMITHDM.(editor)Guidebooktoorganicsynthesis.CHEN SHAO，DING CHENYUAN，CEN RENWAN G(Translators)，Beijing：Scien-ce Press，1988：360-363)。
氨基端肽段序列范围1-30：
中心区域肽段序列范围61-100：
羧基段肽段序列范围181-210：
(2)肽段筛选
分别选用肌钙蛋白I氨基端多克隆抗体、中心区域多克隆抗体和羧基端多克隆抗体分别与合成肽段进行酶联免疫叠加实验，选取具有抗体免疫位点的肽段序列。
优先选取序列如下：
氨基端序列11-30：
中心区肽段序列71-80：
Glu Lys Gly Arg Ala Leu Ser Thr Arg Cys(序列9)
羧基端序列191-200：
Trp Arg Lys Asn Ile Asp Ala Leu Ser Gly(序列10)
3.载体蛋白标记
选用牛血清蛋白作为载体，采用碳化二亚胺将获取肽段与载体共价偶联。可以将上述肽段混合后与载体进行标记，也可分别与载体进行标记，标记完成后，对混合体系进行分离纯化，获得标记量均一的肽段-载体标记物。本步骤也可选用卵清蛋白，本发明优选牛血清白蛋白做为载体。肽段-载体标记物分别以如下命名：
肽段-载体标记物：cTnI-BSA
氨基端肽段-载体标记物：cTnI-BSA-1
中心区肽段-载体标记物：cTnI-BSA-2
羧基端肽段-载体标记物：cTnI-BSA-3。
4.免疫胶乳微球的标记
选用羧基微球，采用碳化二亚胺活化微球羧基，分别将上述作用位点的cTnI多克隆抗体与活化的羧基胶乳微球混合反应，制备成免疫胶乳微球。也可将各作用位点的cTnI多克隆抗体混合后与活化的羧基胶乳微球标记。本发明优选混合后的cTnI多克隆抗体标记微球。标记后的免疫胶乳微球分别命名如下：
氨基端cTnI-Ab-1抗体标记微球为：cTnIAb-PS-1
中心区cTnI-Ab-2抗体标记微球为：cTnIAb-PS-2
羧基端cTnI-Ab-3抗体标记微球为：cTnIAb-PS-3。
将上述三个位点多克隆抗体混合后标记微球为：cTnIAb-PS
5.试剂盒的组装
(1)试剂1(免疫胶乳试剂)
加纯水至1000ml。
(2)试剂2(反应试剂)
缓冲液 20mmol/L
肽段-蛋白标记物：cTnI-BSA 0.01g/L
加纯水至1000ml
(3)标准品：纯化人心肌肌钙蛋白I(cTnI) 5ng/ml
pH＝5.8的PBS缓冲液
备注：测定时，用pH＝5.8的PBS缓冲液将5ng/ml标准液按倍比稀释的方法稀释成浓度分别为5ng/ml、2.5ng/ml、1.25ng/ml、0.625ng/ml、0.313ng/ml五组标准液，采用五点定标的方式做标准曲线。
6.用该试剂盒定量测定样本中人心肌肌钙蛋白I(cTnI)的步骤
(1)检测仪器及试剂：奥林巴斯AU640全自动生化分析仪，本发明配制的液体双试剂(反应试剂和胶乳试剂)。
(2)可采用新鲜人血清或重组人心肌肌钙蛋白I(cTnI)。
(3)操作步骤如下表1：
表1定量测定样本中心肌肌钙蛋白I(cTnI)的术式
结果计算：样品中肌钙蛋白值(μg/L)＝△AT/△AS×校准液浓度
式中：△AT：样本管吸光度值
△AS：校准管吸光度值
本发明的积极意义
本发明涉及肌钙蛋白I竞争免疫比浊法检测试剂盒。本发明是采用定人工合成所需人心肌肌钙蛋白I(cTnI)的三条微型肽段，并将所获得肽段与惰性载体蛋白藕联，与作用于该微型肽段的抗体制备的聚苯乙烯胶乳微球组成试剂。利用该免疫乳胶试剂制备的试剂盒可用于半自动或全自动生发分析仪器测定血清中心肌肌钙蛋白I(cTnI)含量。
本发明中使用的试剂购置于国内相关生物试剂公司，
实施例
以下实施例是为更好的说明本发明，而不对本发明要求保护的技术方案产生限制。
实施例1
(1)肽段合成：采用Tribute双通道多肽合成仪(Protein Technologies公司)进行固相多肽合成。
(2)肽段筛选：酶联免疫叠加实验进行肽段筛选,，选取氨基酸序列8；序列9；序列10。
(3)载体蛋白标记
1)分别将氨基端肽段、中心区肽段和羧基端肽段按2:3:1(质量比)进行混合，取混合后肽段10mg溶于pH＝6.5的磷酸缓冲液中，加入100mg EDC，室温反应1小时后，加入6mg牛血清白蛋白震荡反应过夜。
2)将反应后的牛血清白蛋白混合液用Sephadex G-100层析柱分离纯化，将分子量低于100KD的蛋白弃去，保留分子量在100KD以上的cTnI-BSA。
(4)免疫胶乳微球标记
使用碳化二亚胺活化微球羧基，将氨基端抗体标记微球、中心区标抗体记微球和羧基端抗体标记微球按2:3:1(质量比)进行混合，获得混合的cTnI多隆抗体标记微球cTnIAb-PS。
(5)试剂组成
试剂1(免疫乳胶试剂)
试剂2(反应试剂)
磷酸缓冲液 pH＝7.5
肽段-蛋白标记物：cTnI-BSA 0.01g/L
加纯水至1000ml
标准品：纯化人心肌肌钙蛋白I(cTnI) 5ng/ml
pH＝5.8的PBS缓冲液
实施例2
(1)肽段合成：采用Tribute双通道多肽合成仪(Protein Technologies公司)进行固相多肽合成。
(2)肽段筛选：酶联免疫叠加实验进行肽段筛选,，选取序列8。
(3)载体蛋白标记
1)将氨基端肽段取10mg溶于pH＝6.5的磷酸缓冲液中，加入100mg EDC，室温反应1小时后，加入6mg牛血清白蛋白震荡反应过夜。
2)将反应后的牛血清白蛋白混合液用Sephadex G-100层析柱分离纯化，将分子量低于100KD的蛋白弃去，保留分子量在100KD以上的cTnI-BSA-1。
(4)免疫胶乳微球标记
使用碳化二亚胺活化微球羧基，获得氨基端的cTnI多克隆抗体标记微球cTnIAb-PS-1。
(5)试剂组成
试剂1(免疫乳胶试剂)
试剂2(反应试剂)
磷酸缓冲液 pH＝7.5
肽段-蛋白标记物：cTnI-BSA-1 0.01g/L
加纯水至1000ml
标准品：
纯化人心肌肌钙蛋白I(cTnI) 5ng/ml
pH＝5.8的PBS缓冲液
实施例3
(1)肽段合成：采用Tribute双通道多肽合成仪(Protein Technologies公司)进行固相多肽合成。
(2)肽段筛选：酶联免疫叠加实验进行肽段筛选,，选取序列9。
(3)载体蛋白标记
1)将中心区肽段取10mg溶于pH＝6.5的磷酸缓冲液中，加入100mg EDC，室温反应1小时后，加入6mg牛血清白蛋白震荡反应过夜。
2)将反应后的牛血清白蛋白混合液用Sephadex G-100层析柱分离纯化，将分子量低于100KD的蛋白弃去，保留分子量在100KD以上的cTnI-BSA-2。
(4)免疫胶乳微球标记
使用碳化二亚胺活化微球羧基，获得中心区cTnI多克隆抗体标记微球cTnIAb-PS-2。
(5)试剂组成
试剂1(免疫乳胶试剂)
加纯水至1000ml。
试剂2(反应试剂)
磷酸缓冲液 pH＝7.5
肽段-蛋白标记物：cTnI-BSA-2 0.01g/L
加纯水至1000ml
标准品：
纯化人心肌肌钙蛋白I(cTnI) 5ng/ml
pH＝5.8的PBS缓冲液
实施例4
(1)肽段合成：采用Tribute双通道多肽合成仪(Protein Technologies公司)进行固相多肽合成。
(2)肽段筛选：酶联免疫叠加实验进行肽段筛选,，选取序列10。
(3)载体蛋白标记
1)将羧基端肽段取10mg溶于pH＝6.5的磷酸缓冲液中，加入100mg EDC，室温反应1小时后，加入6mg牛血清白蛋白震荡反应过夜。
2)将反应后的牛血清白蛋白混合液用Sephadex G-100层析柱分离纯化，将分子量低于100KD的蛋白弃去，保留分子量在100KD以上的cTnI-BSA-3。
(4)免疫胶乳微球标记
使用碳化二亚胺活化微球羧基，获得羧基端cTnI多克隆抗体标记微球cTnIAb-PS-3。
(5)试剂组成
试剂1(免疫乳胶试剂)
试剂2(反应试剂)
磷酸缓冲液 pH＝7.5
肽段-蛋白标记物：cTnI-BSA-3 0.01g/L
加纯水至1000ml
标准品：
纯化人心肌肌钙蛋白I(cTnI) 5ng/ml
pH＝5.8的PBS缓冲液
实施例5
按上述实施例制备不同胶乳配比浓度的试剂盒测定同组样本，分别与ELISA法测定结果进行比较，，其结果见表2：
表2不同胶乳配比浓度的试剂盒测定同组样本与ELISA法测试结果的比较
根据表2中数据显示，本发明中四种不同胶乳配比浓度的试剂盒测定同组样本的结果与ELISA法测试结果比较显示出良好相关性。

Claims (2)

1.一种肌钙蛋白I竞争比浊法检测试剂盒，其特征在于该检测试剂盒包括：采用肌钙蛋白I肽段共价标记于惰性载体蛋白并制备成反应试剂；采用针对所述肽段的抗体包被于聚苯乙烯微球上制备成免疫乳胶试剂和纯化人心肌肌钙蛋白I(cTnI)制备而成的标准品；
该试剂盒中的反应试剂和免疫胶乳试剂是按以下方法制备的：
(1)据肌钙蛋白I(cTnI)氨基酸序列，分别选取氨基端序列2，羧基端序列4和中心区序列3氨基酸序列，获得其相应肽段序列5或8，7或10和6或9，采用多肽合成仪进行合成，反相高效液相色谱法进行分离纯化；
(2)选用惰性蛋白作为载体，采用碳化二亚胺将获取肽段与载体蛋白共价偶联；该偶联是将上述肽段混合后与载体蛋白进行标记，或分别与载体蛋白进行标记，标记完成后，对混合体系进行分离纯化，获得标记量均一的肽段-载体蛋白标记物；
(3)采用碳化二亚胺活化微球羧基，分别将针对上述各肽段的cTnI多克隆抗体与活化的羧基胶乳微球混合反应，制备成免疫胶乳试剂。
2.如权利要求1所述肌钙蛋白I竞争比浊法检测试剂盒，其特征在于该试剂盒中
试剂1为免疫胶乳试剂，其配方是：缓冲液20mmol/L、促凝剂30g/L、氯化钠9g/L、cTnI单克隆抗体标记微球cTnIAb-PS 1g/L加纯水至1000ml；
试剂2为反应试剂，其配方是：缓冲液20mmol/L、肽段-载体蛋白标记物cTnI-BSA0.01g/L加纯水至1000ml；
标准品：纯化人心肌肌钙蛋白I(cTnI)5ng/ml、pH＝5.8的PBS缓冲液。
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