CN102175870A - 一种胶乳微球交联方式增加胶乳试剂灵敏度的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医学检验领域，公开了一种胶乳微球交联方式增加胶乳试剂灵敏度的方法，包括将一株鼠抗待测抗原单克隆抗体，一株羊抗待测抗原的多克隆抗体F(ab)2’片段，一株鼠抗羊Fc’端的单克隆抗体分别包被到胶乳微球上，反应缓冲液中加入待测抗原多克隆抗体，当样品中存在待测抗原时，上述包被了不同抗体的胶乳微球之间因为抗原抗体的特异性结合彼此连接，进而造成浊度上升，待测抗原愈多，吸光度变化愈多，进而通过测定样品吸光度的变化，以及根据标准曲线能计算出样本中待测抗原的含量。该方法具有特异性强，灵敏度高，检测速度快等优势，可以配套全自动生化分析仪使用，为病人疾病的及时治疗争取宝贵的时间。
Description
技术领域
本发明属于医学检验领域，涉及一种胶乳微球交联方式增加胶乳试剂灵敏度的方法。
背景技术
心肌肌钙蛋白I(cardiac troponin I，cTnI)是心肌肌钙蛋白复合物的亚单位之一，具有较高的心肌特异性及敏感度，已越来越多地用于心肌梗死、心绞痛的诊断和鉴别诊断，并逐渐有取代心肌酶的趋势。在生理条件下，用现有的免疫学方法不能测出这些蛋白的浓度。在缺血时，细胞膜的完整性受损，这些细胞内的蛋白可从损伤的肌细胞中释放入血。因为所用试剂不同，不同的文献报道cTnI的最低检测限不同，大约为0.03～0.1ng/ml。正常下限值也不一样，自0.1至2.5ng/ml均有报道。在心肌梗塞开始后cTnI 3.25～6h开始升高，11.5～24h(平均18h)达峰，持续时间大于96h。cTnI升高的数值可超过测定低限的158倍。cTnI在急性心肌梗死后的释放呈单向时间依赖曲线，第2～4天有一长的平台期。cTnI不仅可以用于诊断急性心肌梗死，对判断心梗病人溶栓是否成功也有一定指导意义。与传统的心肌酶CK、CK-MB、LDH等相比，cTnI在诊断急性心肌梗死方面显示出较高的敏感度。由于cTnI在心肌和心肌外组织的形式不同，因而是理想的心肌损伤时的血清学标志物。
对cTnI的检测方法，主要有传统的酶联免疫吸附法，化学发光法，化学发光磁酶免疫法，胶乳免疫比浊法等。传统的酶联免疫吸附法检测时间较长且灵敏度不够高，越来越不被广大临床学者所采用，而灵敏度较高的化学发光法，化学发光磁酶免疫试剂和仪器因其检测速度快，备受各级医院青睐。虽然胶乳试剂有检测速度快，定量准确等优势，但是传统的胶乳试剂灵敏度有限，因此无法应用在要求极高灵敏度的检测项目，目前高敏cTnI的测定基本全部依靠国外进口的胶乳试剂和仪器，但目前仅有加拿大司派克诊断技术公司一家提供，其灵敏度为0.3ng/ml，尚无国产试剂盒出现。利用本专利介绍的新型胶乳微球交联方式，能大幅度的增加肌钙蛋白I的检测灵敏度，便于预测就诊病人的心肌梗塞等疾病，为疾病的及时治疗争取宝贵的时间，其现实意义巨大。
发明内容
本发明的目的是提供了一种胶乳微球交联方式增加胶乳试剂灵敏度的方法，以解决传统的胶乳微球交联方式在检测待测抗原过程中灵敏度达不到临床检测的问题。
为解决上述问题，本发明采用以下技术方案予以实现：
一种胶乳微球交联方式增加胶乳试剂灵敏度的方法，包括将一株鼠抗待测抗原单克隆抗体，一株羊抗待测抗原的多克隆抗体F(ab)2’片段，一株鼠抗羊Fc’端的单克隆抗体分别包被到胶乳微球上，反应缓冲液中加入羊抗待测抗原多克隆抗体，其中所述的鼠抗待测抗原单克隆抗体、羊抗待测抗原的多克隆抗体F(ab)2’片段和羊抗待测抗原多克隆抗体分别与待测抗原的不同氨基酸片段特异性结合；当样品中存在待测抗原时，上述包被了不同抗体的胶乳微球之间因为抗原抗体的特异性结合而彼此交联，进而造成浊度上升，待测抗原愈多，吸光度变化愈多，进而通过测定样品吸光度的变化，以及根据标准曲线能计算出样本中待测抗原的含量。
所述的反应缓冲液0.2M Tris-HCl，0.9％NaCl，0.25％BSA，0.05％Tween-20，1％PEG6000，pH 8.2。
所述的胶乳微球为被化学基团修饰的100-200纳米的聚苯乙烯胶乳微球。
所述的化学基团优选羧基或氨基。
所述的鼠抗待测抗原单克隆抗体、羊抗待测抗原的多克隆抗体F(ab)2’片段通过共价偶联的方式包被到聚苯乙烯胶乳微球上。
所述的待测抗原是人cTnI。
所述的鼠抗待测抗原的单克隆抗体为特异性识别人cTnI氨基酸序列87-91的鼠抗人cTnI单克隆抗体；所述的羊抗待测抗原的多克隆抗体F(ab)2’片段是特异性识别人cTnI氨基酸序列88-106的羊抗人cTnI多克隆抗体F(ab)2’片段；所述的反应缓冲液中添加的待测抗原的多克隆抗体为识别人cTnI氨基酸序列27-40的羊抗人cTnI的多克隆抗体，该多克隆抗体在反应缓冲液中的终浓度为100ng/ml。
检测时加入的分别包被鼠抗待测抗原单克隆抗体，羊抗待测抗原的多克隆抗体F(ab)2’片段，鼠抗羊Fc’端的单克隆抗体的胶乳微球的质量比是(1-2)∶1∶(1-3)。
新型胶乳微球交联方式增加胶乳试剂灵敏度的方法中试剂的制备，包括如下步骤：
1)先制备包被致敏胶乳微球，用活化缓冲液(20mM MES缓冲液，pH 5.6，含与胶乳微球等质量的EDAC和胶乳微球3/5质量的Sulfo-NHS)活化胶乳微球表面化学基团，活化完成后使用偶联缓冲液(20mM磷酸盐缓冲液，pH7.5)清洗胶乳微球，按照加入1/5胶乳微球质量的抗体，反应后使用封闭缓冲液封闭纳米粒上空余的活化基团，既得分别用鼠抗待测抗原单克隆抗体、羊抗待测抗原的多克隆抗体F(ab)2’片段以及鼠抗羊Fc’端的单克隆抗体包被的致敏胶乳微球。
2)按照合适的比例将各种致敏胶乳混合。
3)最后制备加入待测抗原多克隆抗体的反应缓冲液(0.2M Tris-HCl，0.9％NaCl，0.25％BSA，0.05％Tween-20，100ng/ml羊抗人cTnI氨基酸序列27-40多克隆抗体，1％PEG6000，pH 8.2)，精确称取各种化学药品，使用去离子水溶解后使用pH计校准溶液的pH，去离子水定容。
一种胶乳试剂盒，包含：表面包被鼠抗待测抗原单克隆抗体的胶乳微球，表面包被羊抗待测抗原的多克隆抗体F(ab)2’端的致敏胶乳微球，表面包被鼠抗羊Fc’端的单克隆抗体的致敏胶乳微球；含有待测抗原多克隆抗体的反应缓冲液；所述含有待测抗原多克隆抗体的反应缓冲液配方为0.2M Tris-HCl，0.9％NaCl，0.25％BSA，0.05％Tween-20，100ng/ml待测抗原多克隆抗体，1％PEG6000，pH 8.2。
所述的鼠抗待测抗原的单克隆抗体为特异性识别人cTnI氨基酸序列87-91的鼠抗人cTnI单克隆抗体；所述的羊抗待测抗原的多克隆抗体F(ab)2’片段是特异性识别人cTnI氨基酸序列88-106的羊抗人cTnI多克隆抗体F(ab)2’片段；所述的反应缓冲液中添加的待测抗原的多克隆抗体为识别人cTnI氨基酸序列27-40的羊抗人cTnI的多克隆抗体，该多克隆抗体在反应缓冲液中的终浓度为100ng/ml。
检测时加入的包被鼠抗人cTnI单克隆抗体，羊抗人cTnI多克隆抗体F(ab)2’片段，鼠抗羊Fc’端的单克隆抗体的胶乳微球的质量比是(1-2)∶1∶(1-3)。
有益效果：
本发明的胶乳微球交联方式利用胶乳微球彼此连接后引起浊度增加的方法，通过在胶乳微球上共价偶联识别待测抗原特定氨基酸序列的抗体以及反应缓冲液中含有的识别待测抗原特定氨基酸序列的抗体，当有待测抗原存在的时候，微球之间便通过待测抗原产生交联，导致溶液浊度上升，待测抗原愈多，吸光度变化愈多，进而通过测定样品吸光度的变化，以及根据标准曲线能计算出样本中待测抗原的含量。该方法具有特异性强，灵敏度高，检测速度快等优势，可以配套全自动生化分析仪使用，能广泛应用于中级以上医院和医疗机构，为病人疾病的及时治疗争取宝贵的时间。本发明方法应用于cTnI的检测，可显著提高灵敏度至0.3ng/ml。
附图说明
图1是本发明的交联方式结构示意图：
其中：1、包被特异性识别人cTnI氨基酸序列87-91的鼠抗cTnI单克隆抗体的致敏胶乳微球；2、包被鼠抗羊Fc’端的单克隆抗体的致敏胶乳微球；3、包被特异性识别人cTnI氨基酸序列88-106的羊抗人cTnI多克隆抗体F(ab)2’片段的致敏胶乳微球；4、人cTnI；5、特异性识别人cTnI氨基酸序列87-91的鼠抗cTnI单克隆抗体；6、特异性识别人cTnI氨基酸序列88-106的羊抗cTnI多克隆抗体F(ab)2’片段；7、识别人cTnI氨基酸序列27-40的羊抗人cTnI的多克隆抗体；8、鼠抗羊Fc’端的单克隆抗体。
图2传统方法制作的胶乳试剂检测cTnI的灵敏度检测结果。
图3本发明方法制作的胶乳试剂检测cTnI的灵敏度检测结果。
图4本发明方法制作的胶乳试剂与Siemens Centaur R全自动免疫分析仪检测cTnI血清样本的相关性分析图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步详细的说明。
实施例1
如图1所示，cTnI胶乳检测试剂，包括表面包被特异性识别cTnI氨基酸序列87-91的鼠抗cTnI单克隆抗体5的致敏胶乳微球1，表面包被特异性识别cTnI氨基酸序列88-106的羊抗cTnI多克隆抗体F(ab)2’片段6的致敏胶乳微球3，表面包被鼠抗羊Fc’端的单克隆抗体8的致敏胶乳微球2；上述三种致敏胶乳微球按照1∶1∶1的比例混合而成；含有识别cTnI氨基酸序列27-40的羊抗人cTnI的多克隆抗体7的反应缓冲液(配方为0.2M Tris-HCl，0.9％NaCl，0.25％BSA，0.05％Tween-20，100ng/ml羊抗人cTnI的多克隆抗体，1％PEG6000，pH 8.2)。
致敏胶乳微球1、2、3是通过碳化二亚胺(EDAC)法共价偶联抗体制备的，具体方法为：在活化缓冲液中添加EDAC和Sulfo-NHS使胶乳微球∶EDAC∶sulfo-NHS的质量比为1∶1∶0.6，24℃活化1小时，20mM磷酸盐缓冲液(pH7.5)清洗三遍纳米粒后，添胶乳微球1/5质量的对应抗体。24℃反应12小时后添加1/20体积甘氨酸封闭液(1mol/L甘氨酸水溶液)24℃封闭1小时。50mM甘氨酸缓冲液(50mM Glycine，0.9％NaCl，0.05％Tween-20，pH8.0)清洗胶乳微球三次，50mM甘氨酸缓冲液(50mM Glycine，0.9％NaCl，0.1％BSA，0.05％Tween-20，pH8.0)中，使致敏胶乳微球的浓度为0.25％(W/V)，既得包被抗体的致敏胶乳微球。
上述制备致敏胶乳微球所涉及的抗体如下：
鼠抗cTnI单抗5，特异性抗人cTnI 87-91氨基酸序列，购于Fitzgerald；
羊抗cTnI多克隆抗体F(ab)2’片段6，特异性抗人cTnI 88-106氨基酸序列，购于Fitzgerald，按照胃蛋白酶∶抗体质量比1∶50的比例酶切抗体，使用ProteinA亲和层析和葡聚糖凝胶过滤纯化F(ab)2’端；
鼠抗羊Fc’端单抗8，购于antibody-online(订购号：ABIN235576)；
实施例2
1、实验器材和试剂：
奥林巴斯5400全自动生化分析仪，cTnI标准品(BIO-RAD公司)，TBS-T缓冲液(0.2MTris-HCl，0.9％NaCl，0.25％BSA，0.05％Tween-20)，EDAC(Sigma公司)，Sulfo-NHS(阿拉丁公司)，cTnI标准品稀释液为含20％牛血清的PBS-T缓冲液，cTnI胶乳试剂盒同实施例1，使用的抗体同实施例1。
2、实验步骤：
2.1传统的胶乳试剂交联方式实验步骤
将单株羊抗人cTnI多克隆抗体(购于Fitzgerald)按照实施例1中的方法偶联到胶乳微球上，使致敏胶乳微球的终浓度为0.25％(W/V)。R1反应缓冲液配方为0.2M Tris-HCl，0.9％NaCl，0.25％BSA，0.05％Tween-20，1％PEG6000，pH 8.2。配制cTnI标准品溶液，使其浓度分别为0ng/ml，30ng/ml，100ng/ml，300ng/ml，667ng/ml，1000ng/ml，3000ng/ml，10000ng/ml，20000ng/ml，30000ng/ml，作为待测样本进行检测。试验条件参照表1，操作步骤按照表2所示方法进行。
表1
| 主波长 | 630nm | 样本 | 10μl |
| 反应温度 | 37℃ | 反应类型 | 终点法 |
| R1 | 180μl | R2 | 20μl |
表2
2.2本专利中新型胶乳试剂交联方式实验步骤
按照实施例1中的方法偶联抗体到胶乳微球制成致敏胶乳微球，将三种致敏微球按照1∶1∶1的比例混合，浓度为0.25％(W/V)，组成R2胶乳试剂。R1反应缓冲液配方为0.2M Tris-HCl，0.9％NaCl，0.25％BSA，0.05％Tween-20，100ng/ml羊抗人cTnI氨基酸序列27-40抗体，1％PEG6000，pH 8.2。配制cTnI标准品溶液，使其浓度分别为0ng/ml，0.3ng/ml，1.0ng/ml，3.0ng/ml，6.7ng/ml，10.0ng/ml，15ng/ml，20ng/ml，30ng/ml，作为待测样本进行检测。试验条件参照表1，操作步骤按照表2所示方法进行。
按照表2列出的步骤检测16份血清样本(Siemens Centaur R全自动免疫分析仪定值)，使用0.3ng/ml，1.0ng/ml，3.0ng/ml，6.7ng/ml，10.0ng/ml的cTnI标准品溶液5点定标，所得的数值与Siemens Centaur R全自动免疫分析仪定值的血清做相关性分析。
3、实验结果：
实验结果表明传统方法制作的胶乳试剂在300ng/ml-10000ng/ml有较好的线性关系(R2＝0.9893)(图2)，而本专利中使用的新型方法制作的胶乳试剂在0.3ng/ml-10ng/ml之间有良好的线性关系(R2＝9983)(图3)，检测下限为0.3ng/ml，使用本专利中使用的新型方法测出血清样本的浓度与Siemens Centaur R全自动免疫分析仪的定值有良好的相关性(R2＝9834)(图4)。实验证明利用此新型的胶乳微球交联方式可以增加胶乳试剂的灵敏度。
在以上的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
Claims (10)
1.一种胶乳微球交联方式增加胶乳试剂检测灵敏度的方法，其特征在于包括将一株鼠抗待测抗原单克隆抗体，一株羊抗待测抗原的多克隆抗体F(ab)2’片段，一株鼠抗羊Fc’端的单克隆抗体分别包被到胶乳微球上，反应缓冲液中加入待测抗原多克隆抗体，其中所述的鼠抗待测抗原单克隆抗体、羊抗待测抗原的多克隆抗体F(ab)2’片段和羊抗待测抗原多克隆抗体分别与待测抗原的不同氨基酸片段特异性结合；当样品中存在待原时，上述包被了不同抗体的胶乳微球之间因为抗原抗体的特异性结合而彼此交联，进而造成浊度上升，待测抗原愈多，吸光度变化愈多，进而通过测定样品吸光度的变化，以及根据标准曲线能计算出样本中待测抗原的含量。
2.根据权利要求1所述的胶乳微球交联方式增加胶乳试剂检测灵敏度的方法，其特征在于所述的反应缓冲液配方为0.2M Tris-HCl，0.9％NaCl，0.25％BSA，0.05％Tween-20，1％PEG6000，pH 8.2。
3.根据权利要求1所述的胶乳微球交联方式增加胶乳试剂检测灵敏度的方法，其特征在于所述的胶乳微球为被化学基团修饰的100-200纳米的聚苯乙烯胶乳微球，所述的化学基团优选羧基或氨基。
4.根据权利要求3所述的胶乳微球交联方式增加胶乳试剂检测灵敏度的方法，其特征在于所述的鼠抗待测抗原单克隆抗体、羊抗待测抗原的多克隆抗体F(ab)2’片段通过共价偶联的方式包被到聚苯乙烯胶乳微球上。
5.根据权利要求3所述的胶乳微球交联方式增加胶乳试剂检测灵敏度的方法，其特征在于检测时加入的分别包被鼠抗待测抗原单克隆抗体，羊抗待测抗原的多克隆抗体F(ab)2’片段，鼠抗羊Fc’端的单克隆抗体的胶乳微球的质量比是(1-2)∶1∶(1-3)。
6.根据权利要求4所述的胶乳微球交联方式增加胶乳试剂检测检测灵敏度的方法，其特征在于所述的待测抗原为人心肌肌钙蛋白I。
7.根据权利要求4所述的胶乳微球交联方式增加胶乳试剂检测灵敏度的方法，其特征在于所述的鼠抗待测抗原单克隆抗体为特异性识别心肌肌钙蛋白I氨基酸序列87-91的鼠抗人心肌肌钙蛋白I单克隆抗体；所述的羊抗待测抗原的多克隆抗体F(ab)2’片段是特异性识别人心肌肌钙蛋白氨基酸序列88-106的羊抗人心肌钙蛋白I多克隆抗体F(ab)2’片段；所述的反应缓冲液中添加的待测抗原的多克隆抗体为识别人心肌钙蛋白I氨基酸序列27-40的羊抗人心肌钙蛋白I多克隆抗体，该多克隆抗体在反应缓冲液中的终浓度为100ng/ml。
8.一种胶乳试剂盒，其特征在于包含：表面包被鼠抗待测抗原单克隆抗体的致敏胶乳微球，表面包被羊抗待测抗原的多克隆抗体F(ab)2’片段的致敏胶乳微球，表面包被鼠抗羊Fc’端的单克隆抗体的致敏胶乳微球；含有待测抗原多克隆抗体的反应缓冲液；所述含有待测抗原多克隆抗体的反应缓冲液配方为0.2M Tris-HCl，0.9％NaCl，0.25％BSA，0.05％Tween-20，100ng/ml待测抗原多克隆抗体，1％PEG6000，pH 8.2。
9.根据权利要求8所述的胶乳试剂盒，其特征在于所述的鼠抗待测抗原单克隆抗体为特异性识别人心肌钙蛋白I氨基酸序列87-91的鼠抗人心肌钙蛋白I单克隆抗体；所述的羊抗待测抗原的多克隆抗体F(ab)2’片段是特异识别人心肌钙蛋白I氨基酸序列88-106的羊抗人心肌钙蛋白I多克隆抗体F(ab)2’片段；所述的反应缓冲液中添加的待测抗原的多克隆抗体为识别人心肌钙蛋白I氨基酸序列27-40的羊抗人心肌钙蛋白I多克隆抗体。
10.根据权利要求9所述的胶乳微球交联方式增加胶乳试剂检测灵敏度的方法，其特征在于检测时加入的包被鼠抗人心肌肌钙蛋白I单克隆抗体，羊抗人心肌钙蛋白I多克隆抗体F(ab)2’片段，鼠抗羊Fc’端的单克隆抗体的胶乳微球的质量比是(1-2)∶1∶(1-3)。
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