CN102628865A - 检测肌红蛋白含量的胶乳增强免疫比浊试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种检测肌红蛋白含量的胶乳增强免疫比浊试剂盒，具体而言，本发明涉及一种检测人血清或尿液中肌红蛋白含量的胶乳增强免疫比浊试剂盒，该试剂盒包括试剂R1、试剂R2和肌红蛋白标准品，R1为适当缓冲液，试剂R2为苯乙烯胶乳颗粒、肌红蛋白抗体和适当的缓冲液形成的白色胶乳悬浊液，标准品为含有不同浓度肌红蛋白的适当缓冲液。本发明试剂盒可快速有效稳定的检测血清或尿液中10-1000ng/mL线性内的肌红蛋白水平，最低检测限为3ng/ml，CV＜10％，能够及时验证心肌损伤状况，满足临床需要。

Description

检测肌红蛋白含量的胶乳增强免疫比浊试剂盒

技术领域

本发明涉及一种检测肌红蛋白含量的胶乳增强免疫比浊试剂盒，具体而言，本发明涉及一种应用胶乳粒子增强技术提高肌红蛋白浓度检测的灵敏度的试剂盒。

背景技术

肌红蛋白是肌肉中运载氧的蛋白质，由153个氨基酸残基组成，可帮助肌细胞将氧转运到线粒体。肌红蛋白在正常人血清中含量甚微，当心肌或骨骼肌受损时，会从受损肌细胞中释放入血。在急性心肌梗塞时发生心肌缺血坏死，细胞通透性增加，由于肌红蛋白的分子量仅为17,500，远小于CKMB和AST等酶分子，因此更易释放进入血循环，12h内几乎所有心肌梗塞患者肌红蛋白都有升高，幅度大于各种心肌酶，从而成为急性心肌梗塞最早的诊断学指标。

另一方面，由于肌红蛋白半衰期短(15min)，胸痛发作后6-12h不升高，有助于排除心肌梗塞的诊断，是筛查心肌梗塞重要而有效的指标。肌红蛋白还是溶栓治疗中判断有无再灌注的敏感而准确的指标。若溶栓术后1-2小时内肌红蛋白的浓度超出溶栓术前的4倍，则提示成功再灌注。由于在心肌梗塞后患者血中肌红蛋白很快从肾脏清除，发病18-30h内可完全恢复到正常水平，故肌红蛋白的测定有助于在心肌梗塞病程中观察有无再梗死或梗死再扩展。肌红蛋白频繁增高，提示原有心肌梗死仍在延续。因此，高灵敏度的肌红蛋白的检测在诊断心肌损伤疾病方面的及时性、进程、预后及治疗效果方面具有广泛的临床意义。

目前临床常用检测肌红蛋白的方法有ELISA法、胶体金法和化学发光法等。其中ELISA法适合大批量检测，但重复性差，操作复杂；胶体金法特异性相对较好，但敏感度偏低；化学发光法灵敏度高，特异性好，但成本要求过高。另外免疫化学法也比较灵敏，但抗血清必须是对肌红蛋白特异的。对流免疫电泳是一种定性方法，灵敏度只有2mg/ml(血清中肌红蛋白参考范围：0-70ng/ml)，不适宜检测心肌梗死。放射免疫试验灵敏度高，特异性强，但使用放射性同位素，造成对环境的污染，现已少用。

现有的乳胶免疫比浊试剂盒灵敏度低，线性差、抗体利用率也较低，导致价格昂贵。因此有必要采取新的技术方案来克服现有产品抗体利用率低、线性差和灵敏度低的缺点。

发明内容

因此，本发明的技术目的在于研制一种抗体利用率高、线性好、灵敏度高的肌红蛋白胶乳增强免疫比浊试剂盒。

因此，本发明的第一方面涉及一种检测人血清或尿液中肌红蛋白含量的胶乳增强免疫比浊试剂盒，该试剂盒包括试剂R1、试剂R2和肌红蛋白标准品，其中试剂R1为反应缓冲液，试剂R2为苯乙烯胶乳颗粒、肌红蛋白抗体和反应缓冲液形成的白色胶乳悬浊液，肌红蛋白标准品为含有不同浓度肌红蛋白的反应缓冲液，其特征在于所述的肌红蛋白抗体先利用高碘酸盐氧化然后利用碳化二亚胺和双官能团交联剂定向固定在苯乙烯胶乳颗粒上。

优选地，所述的反应缓冲液为PBS缓冲液、Hepes缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液或氯化铵缓冲液中的一种或几种，缓冲液浓度在20-500mM之间，优选地，反应缓冲液为PBS缓冲液、Hepes缓冲液、甘氨酸缓冲液中的一种或两种组合，浓度为20-200mM。

优选地，所述的苯乙烯胶乳颗粒粒径范围为0.05-0.5μm，优选地，苯乙烯胶乳颗粒粒径为0.08-03μM，羧基含量为100-300μmol/g，优选地，含量为120-200μmol/g。

优选地，所述的肌红蛋白抗体为非亲和的IgG抗体、亲和的IgG抗体或IgY抗体中的一种或两种，抗体来源为兔抗人、山羊抗人、绵羊抗人、鼠抗人、鸡抗人、鸭抗人抗体中的一种或两种，抗体种类包括单克隆抗体和多克隆抗体。

优选地，所述的肌红蛋白抗体利用碳化二亚胺和双官能团交联剂定向固定在苯乙烯胶乳颗粒的途径为：称取2-20mg(优选地，5-15mg，更优选地，7-10mg)碳化二亚胺加入20-200ml(优选地，50-100ml)适当缓冲液中溶解均匀，加入1-10ml(优选地，3-8ml，更优选地，5ml)苯乙烯胶乳颗粒，混匀，37℃摇床反应0.5-3h(优选地，1-2h)，然后加入15-150mg(优选地，30-100mg，更优选地，60mg)双官能团交联剂，37℃摇床反应0.5-6h(优选地，1-3h)，形成活化的苯乙烯胶乳颗粒；量取0.35-35ml(优选地，1-20ml)肌红蛋白抗体与300-3000ml(优选地，500-2000ml，更优选地，1000ml)适当缓冲液混匀，放入三角瓶中，加入0.002-0.05mmol/l(优选地，0.005-0.02mmol/l，更优选地，0.01mmol/l)的高碘酸钠0.4-4ml(优选地，1-3ml，更优选地，2ml)混匀10-60min(优选地，20-40min，更优选地，30min)，加入已活化的苯乙烯胶乳颗粒50ml，颠倒混匀，37℃摇床反应2-8h(优选地，4-6h，更优选地，5h)后离心，去上清液，超声分散后置于缓冲液中形成试剂R2。

优选地，双官能团交联剂选自乙二胺、丁二胺、乙二胺二酰肼的一种或几种。

优选地，试剂R2中结合有人肌红蛋白抗体的苯乙烯胶乳含量为0.5-3mg/ml，优选地，苯乙烯胶乳含量为1-2mg/ml。

优选地，所述的肌红蛋白标准品为含有稳定剂的不同浓度的肌红蛋白的反应缓冲液，其中肌红蛋白含量分别为100、200、400、800ng/ml或类似比例的浓度。

优选地，所述肌红蛋白标准品中含有的稳定剂选自牛血清白蛋白、鸡蛋清蛋白、多聚赖氨酸、脱脂奶粉、抗生素、叠氮钠或硫柳汞中的一种或几种，浓度在0.05-5g/L，优选地，稳定剂选用牛血清白蛋白、多聚赖氨酸和叠氮钠两种或两种以上组合使用，浓度为0.5-5g/L。

最优选地，所述的检测人血清或尿液中肌红蛋白含量的胶乳增强免疫比浊试剂盒选自具有如下组成的试剂盒：

试剂盒1：

试剂R1：0.5％NaCl、0.5％BSA、0.05％NaN₃、20mM甘氨酸缓冲液pH8，

试剂R2：0.5％BSA、0.05％NaN₃、20mM甘氨酸缓冲液pH8.5、40mg抗人肌红蛋白抗体，0.05μm胶乳颗粒；

肌红蛋白标准品：人肌红蛋白、0.5％BSA、0.05％NaN₃、20mMHepes缓冲液；

试剂盒2：

试剂R1：8％NaCl、5％BSA、0.5％NaN₃、500mM甘氨酸缓冲液pH8，

试剂R2：5％BSA、0.5％NaN₃、500mM甘氨酸缓冲液pH8.5、150mg抗人肌红蛋白抗体、0.5μm胶乳颗粒

肌红蛋白标准品：人肌红蛋白、5％BSA、0.5％NaN₃、500mM Hepes缓冲液。

换言之，本发明从抗体固定化分子朝向入手，建立了抗体定向固定化工艺，提高了抗体固定化效率，大大节约了试剂成本。该试剂能够用于检测人血清或尿液中的肌红蛋白，具有较高的灵敏度和线性范围。本发明研究选择了合适的胶乳颗粒以及肌红蛋白抗体和苯乙烯胶乳颗粒共价结合的合适途径，建立了低浓度肌红蛋白水平与已结合苯乙烯胶乳颗粒的肌红蛋白抗体发生作用形成在340nm-700nm可以检测的浊度反应体系，这个体系包括反应必需的合适缓冲液，pH值和离子强度等。

具体而言，为了解决上述技术问题，本发明的技术方案为：一种胶乳增强免疫比浊方法检测人血清或尿液中肌红蛋白含量的试剂盒，该试剂盒包含试剂R1、试剂R2、标准品，所述的试剂R1为适当的缓冲液。

所述的试剂R2为：用高碘酸钠氧化过的抗人肌红蛋白抗体致敏由碳化二亚胺活化过的苯乙烯胶乳颗粒，然后将致敏后的苯乙烯胶乳颗粒置于适当的缓冲液中形成试剂R2，试剂R2中结合有人肌红蛋白抗体的苯乙烯胶乳含量为0.5-3mg/ml。

上述的抗人肌红蛋白抗体包括但不限于兔、羊、鼠、鸡、鸭来源的单克隆抗体或多克隆的非亲和的IgG抗体、亲和的IgG抗体或IgY抗体中的一种或两种。

上述所述的适当缓冲液包括但不限于PBS缓冲液、Hepes缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液或氯化铵缓冲液以及其他具有相似性质的缓冲液中的一种或几种；缓冲液浓度在20-500mM之间。

在本发明所述的肌红蛋白检测试剂盒中，还包含肌红蛋白标准品，所述的肌红蛋白标准品为含有稳定剂的不同浓度肌红蛋白的适当缓冲液，其中肌红蛋白含量分别为100、200、400、800ng/ml或类似比例的含量。

上述所述的稳定剂包括但不限于牛血清白蛋白、鸡蛋清蛋白、多聚赖氨酸、脱脂奶粉、抗生素、叠氮钠或硫柳汞中的一种或几种；稳定剂浓度在0.5-5g/L。

本发明上面所述的用高碘酸钠氧化过的抗人肌红蛋白抗体，其原理是高碘酸钠可以将肌红蛋白抗体Fc片段上的羟基氧化成醛基，而醛基可以快速的和活化过的苯乙烯胶乳颗粒表面氨基结合，使抗人肌红蛋白抗体定向连接于苯乙烯胶乳颗粒上。

本发明所述的由碳化二亚胺活化过的苯乙烯胶乳颗粒，其是由碳化二亚胺与苯乙烯胶乳颗粒上的羧基发生反应后再与二胺或二酰肼类分子反应，胶乳表面生成氨基，氨基可与醛基快速反应进行交联。

本发明采用胶乳增强免疫比浊方法检测人血清或尿液中肌红蛋白含量，其原理是以多克隆抗体为基础的改良免疫比浊分析。利用基因工程或化学方法将抗体与胶乳颗粒结合，当抗原抗体相结合时便形成了抗原-抗体-胶乳颗粒复合物，增强了反应吸光度，反应液住一定波长处比浊，与同样处理的标准液比较，即可计算样本中抗原的含量。在本发明中，血清或尿液中的肌红蛋白与结合在胶乳颗粒表面的抗人肌红蛋白抗体结合，发生抗原抗体反应，使胶乳颗粒凝集产生浊度，在340nm-700nm波长处测定吸光度，对照标准曲线可得出样本中肌红蛋白的含量。

本发明的优点和有益效果：

此试剂盒可用于检测人血清或尿液中浓度范围为10-1000ng/ml的肌红蛋白水平，灵敏度达3ng/ml，CV＜10％，因此能够用于早期诊断心肌梗塞等心肌损伤疾病，满足临床需要。

本发明是一种基于抗原抗体反应的试验方法，其特别之处在于，本发明采用的是不同于常规的抗体与苯乙烯胶乳颗粒致敏方法，提供了新的肌红蛋白抗体和苯乙烯胶乳颗粒共价结合的合适途径。以往的交联方法抗体是随机结合在苯乙烯胶乳颗粒上，抗体利用率低；为了提高灵敏度，需要加入更多量的抗体，提升了成本。而本发明所用的交联方法，即用高碘酸钠氧化过的抗人肌红蛋白抗体致敏由碳化二亚胺活化过的苯乙烯胶乳颗粒的方法，与已知的抗体致敏胶乳方法相比，本法能够使抗体定向的结合到苯乙烯胶乳颗粒上，提高抗体定向固定化效率，降低了试剂盒的制作成本。

附图说明

图1：肌红蛋白试剂盒标准曲线。

具体实施方式

为了使本发明的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于了解，下面结合具体实施例进一步阐述本发明。

实施例

实施例1 肌红蛋白检测试剂盒的制备

试剂盒1的制备

试剂R1：含有0.5％NaCl、0.5％BSA、0.05％NaN₃的甘氨酸缓冲液，pH8，该试剂为无色透明溶液。

试剂R2：

制备方法：

(1)取14ml抗人肌红蛋白抗体(3.1mg/ml)与20ml 0.005mmol/l的高碘酸钠溶液室温混合10分钟后备用；

(2)用80ml Hepes pH7.5溶液溶解2.5mg碳化二亚胺，使反应浓度达到0.03mg/ml，加入1.8ml粒径50nm胶乳颗粒，使胶乳颗粒活化浓度为0.2％，37℃摇床混匀0.5小时；

(3)加入18mg乙二胺二酰肼，37℃摇床混匀0.5小时后形成致敏胶乳；

(4)将氧化后的抗人肌红蛋白抗体加入到致敏胶乳颗粒缓冲液中，37℃摇床混匀2小时；

(5)加入2ml封闭液(含有2mg/ml吐温-20的甘氨酸缓冲液，pH7.4)室温摇床过夜；

(6)4℃离心，15000rpm，40分钟；

(7)用10ml去离子水溶解胶乳颗粒，离心清洗；

(8)弃上清，加入150ml工作液(含有0.5％BSA、0.05％NaN₃的甘氨酸缓冲液，pH8.5)，超声重悬后得到的乳白色溶液即为试剂R2。

肌红蛋白标准品为：在含有0.5％BSA、0.05％NaN₃的20mM Hepes缓冲液中分别加入100、200、400、800ng/ml的肌红蛋白，除菌过滤。

试剂盒2的制备

试剂R1：含有8％NaCl、5％BSA、0.5％NaN₃的甘氨酸缓冲液，pH8，该试剂为无色透明溶液。

试剂R2：

制备方法：

(1)取40ml抗人肌红蛋白抗体(3.1mg/ml)与20ml 0.05mmol/l的高碘酸钠溶液室温混合60分钟后备用；

(2)用80ml Hepes pH7.5溶液溶解25mg碳化二亚胺，使反应浓度达到0.3mg/ml，加入20ml粒径500nm胶乳颗粒，使胶乳颗粒活化浓度为2％，37℃摇床混匀4小时；

(3)加入200mg乙二胺二酰肼，37℃摇床混匀4小时后形成致敏胶乳；

(4)将氧化后的抗人肌红蛋白抗体加入到致敏胶乳颗粒缓冲液中，37℃摇床混匀8小时；

(5)加入25ml封闭液(含有20mg/ml吐温-20的甘氨酸缓冲液，pH7.4)室温摇床过夜；

(6)4℃离心，15000rpm，60分钟；

(7)用100ml去离子水溶解胶乳颗粒，离心清洗；

(8)弃上清，加入1500ml工作液(含有5％BSA，0.5％NaN₃的，甘氨酸缓冲液，pH8.5)，超声重悬后得到的乳白色溶液即为试剂R2。

肌红蛋白标准品为：在含有5％BSA、0.5％NaN₃的500mM Hepes缓冲液中分别加入100、200、400、800ng/ml的肌红蛋白，除菌过滤。

对照试剂盒的制备方法：

试剂R1：与本发明试剂盒1的试剂R1相同；

试剂R2：

(1)用80ml Hepes pH7.5溶液溶解8.75mg碳化二亚胺，使反应浓度达到0.07mg/ml，加入6.25ml粒径200nm胶乳颗粒，使胶乳颗粒活化浓度为0.5％，37℃摇床混匀1小时，形成致敏胶乳颗粒；

(2)鸡抗人肌红蛋白抗体加入到致敏胶乳颗粒缓冲液中，37℃摇床混匀4小时；

(3)加入7.5ml封闭液(含有10mg/ml吐温-20的甘氨酸缓冲液，pH7.4)室温摇床过夜；

(4)4℃离心，15000rpm，40分钟；

(5)用10ml去离子水溶解胶乳颗粒，离心清洗；

(6)弃上清，加入500ml工作液(含有1％BSA，0.1％NaN₃的，甘氨酸缓冲液，pH8.5)，超声重悬后得到的乳白色溶液即为试剂R2。

肌红蛋白标准品为：在含有1％BSA、0.1％NaN₃的Hepes缓冲液中分别加入100、200、400、800ng/ml的肌红蛋白，除菌过滤。肌红蛋白标准品均为无色透明液体。

实施例2 肌红蛋白检测试剂盒测定步骤，定标曲线的绘制，与通用制备方法进行对比情况

检测工具：Olympus全自动生化分析仪

分析方法：2点终点法；

主波长：570nm，副波长：800nm；

样品量：6.0ul；R1：180ul；R2：60ul；

校准方式：样条函数Spline；反应方向：上升；测定稳定：37℃；

样品与R1混匀后，于第10秒读取吸光度A₁，于3-5分钟加入R2，于5分钟时读取吸光度A₂。反应吸光度的计算为A₂与A₁的校准差值。

计算方法：多点定标，以样条函数作为计算方法，根据吸光度与标准品的值做剂量/反应曲线，样品含量可根据其吸光度值在剂量/反应曲线上求出。

以标准品浓度为横轴，相应的ΔOD₅₇₀为纵轴，运用不同的交联方法及不同的抗体浓度，采用非线性拟合，如spline绘制出标准曲线，结果见图1。

实施例3 肌红蛋白检测试剂盒测定肌红蛋白

检测工具：Olympus全自动生化分析仪

分析方法：2点终点法；

主波长：700nm，副波长：800nm；

样品量：6.0ul；R1：180ul；R2：60ul；

校准方式：样条函数Spline；反应方向：上升；测定稳定：37℃；

样品与R1混匀后，于第10秒读取吸光度A₁，于3-5分钟加入R2，于5分钟时读取吸光度A₂。反应吸光度的计算为A₂与A₁的校准差值。

计算方法：多点定标，以样条函数作为计算方法，根据吸光度与标准品的值做剂量/反应曲线，样品含量可根据其吸光度值在剂量/反应曲线上求出。

参考范围：血清/血浆肌红蛋白≤70ng/ml。

实施例4 肌红蛋白检测试剂盒1各项性能指标测试

1)最小检测限

用本申请的试剂盒1测定4种不同肌红蛋白含量的质控样品，每个样品测10次，通过计算均值和SD值，得到试剂检测的最小检测限。结果表明，本发明检测试剂盒1的灵敏度为3ng/ml，对照试剂盒为10ng/ml(见表1和2)。

表1：本发明试剂盒1的最小检测限

表2：对照试剂盒的最小检测限

2)检测范围

等比例(按10％、20％、30％...100％)稀释一份高值血清样品，每点重复测定两次，通过计算相关系数考察线性(见表3和4)。结果表明，本发明检测试剂盒的最高检测范围可达1000ng/ml，对照试剂盒为870ng/ml。

表3：本发明试剂盒1的检测范围

表4：对照试剂盒的检测范围

3)准确度实验

用待检试剂三管平行测定高、低两份质控品，计算每个浓度的均值，用相对偏差表示测定结果的不准确度。结果表明，本发明检测试剂盒的不准确度为0.07％和1.36％，优于对照试剂的3.10％和2.60％(见表5和6)。

表5：本发明试剂盒1的准确度

样本	质控1	质控2
			1	101.9	298.3
2	99.9	297.9
			3	101.0	294.5
均值	100.9	296.9
			偏差	0.07％	1.36％

表6：对照试剂盒的准确度

样本	质控1	质控2
			1	96.8	294.9
2	98.7	292.4
			3	98.1	292.2
均值	97.87	293.2
			偏差	3.10％	2.60％

4)精密度实验

采用高、低两份质控品，用试剂盒1连续测定20次，计算测定结果变异系数(见表7和8)。结果表明，本发明检测试剂盒的精密度为1.70％和0.74％，优于对照试剂的6.80％和4.79％。

表7：本发明试剂盒1的精密度

样品ng/ml	质控1	质控2
			测定次数	20	20
均值	100.29	296.17
			SD	1.72	2.20
变异系数	1.70％	0.74％

表8：对照试剂盒的精密度

实施例5 肌红蛋白检测试剂盒2各项性能指标测试

按照与实施例4所述方法步骤相同的方法步骤检测了本发明试剂盒2与对照试剂盒的最小检测限、检测范围、准确度和精密度，结果表明试剂盒2的上述各项指标与试剂盒1均类似(数据略)。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的有点。本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的知识说明书发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

Claims (10)

1.一种检测人血清或尿液中肌红蛋白含量的胶乳增强免疫比浊试剂盒，该试剂盒包括试剂R1、试剂R2和肌红蛋白标准品，其中试剂R1为反应缓冲液，试剂R2为苯乙烯胶乳颗粒、肌红蛋白抗体和反应缓冲液形成的白色胶乳悬浊液，肌红蛋白标准品为含有不同浓度肌红蛋白的反应缓冲液，其特征在于所述的肌红蛋白抗体先利用高碘酸盐氧化然后利用碳化二亚胺和双官能团交联剂定向固定在苯乙烯胶乳颗粒上。

2.根据权利要求1所述的检测人血清或尿液中肌红蛋白含量的胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在于，所述的反应缓冲液为PBS缓冲液、Hepes缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液或氯化铵缓冲液中的一种或几种，缓冲液浓度在20-500mM之间。

3.根据权利要求1或2所述的检测人血清或尿液中肌红蛋白含量的胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在于，所述的苯乙烯胶乳颗粒粒径范围为0.05-0.5μm，羧基含量为100-300μmol/g。

4.根据权利要求1至3任一项所述的检测人血清或尿液中肌红蛋白含量的胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在于，所述的肌红蛋白抗体为非亲和的IgG抗体、亲和的IgG抗体或IgY抗体中的一种或两种，抗体来源为兔抗人、山羊抗人、绵羊抗人、鼠抗人、鸡抗人、鸭抗人抗体中的一种或两种，抗体种类包括单克隆抗体和多克隆抗体。

5.根据权利要求1至4任一项所述的检测人血清或尿液中肌红蛋白含量的胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在于，所述的肌红蛋白抗体利用碳化二亚胺和双官能团交联剂定向固定在苯乙烯胶乳颗粒的途径为：称取2-20mg碳化二亚胺加入20-200ml适当缓冲液中溶解均匀，加入1-10ml苯乙烯胶乳颗粒，混匀，37℃摇床反应0.5-3h，然后加入15-150mg双官能团交联剂，37℃摇床反应0.5-6h，形成活化的苯乙烯胶乳颗粒；量取0.35-35ml肌红蛋白抗体与300-3000ml适当缓冲液混匀，放入三角瓶中，加入0.002-0.05mmol/l的高碘酸钠0.4-4ml混匀10-60min，加入已活化的苯乙烯胶乳颗粒50ml，颠倒混匀，37℃摇床反应2-8h后离心，去上清液，超声分散后置于缓冲液中形成试剂R2。

6.根据权利要求1至5任一项所述的检测人血清或尿液中肌红蛋白含量的胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在于双官能团交联剂选自乙二胺、丁二胺、乙二胺二酰肼的一种或几种。

7.根据权利要求1至6任一项所述的检测人血清或尿液中肌红蛋白含量的胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在于试剂R2中结合有人肌红蛋白抗体的苯乙烯胶乳含量为0.5-3mg/ml。

8.根据权利要求1至7任一项所述的检测人血清或尿液中肌红蛋白含量的胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在于所述的肌红蛋白标准品为含有稳定剂的不同浓度的肌红蛋白的反应缓冲液，其中肌红蛋白含量分别为100、200、400、800ng/ml或类似比例的浓度。

9.根据权利要求8所述的检测人血清或尿液中肌红蛋白含量的胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在于所述肌红蛋白标准品中含有的稳定剂选自牛血清白蛋白、鸡蛋清蛋白、多聚赖氨酸、脱脂奶粉、抗生素、叠氮钠或硫柳汞中的一种或几种，浓度在0.05-5g/L。

10.根据权利要求1至9任一项所述的检测人血清或尿液中肌红蛋白含量的胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在于其选自具有如下组成的试剂盒：

试剂盒1：

试剂R1：0.5％NaCl、0.5％BSA、0.05％NaN₃、20mM甘氨酸缓冲液pH8，

试剂R2：0.5％BSA、0.05％NaN₃、20mM甘氨酸缓冲液pH8.5、40mg抗人肌红蛋白抗体，0.05μm胶乳颗粒；

肌红蛋白标准品：人肌红蛋白、0.5％BSA、0.05％NaN₃、20mMHepes缓冲液；

试剂盒2：

试剂R1：8％NaCl、5％BSA、0.5％NaN₃、500mM甘氨酸缓冲液pH8，

试剂R2：5％BSA、0.5％NaN₃、500mM甘氨酸缓冲液pH8.5、150mg抗人肌红蛋白抗体、0.5μm胶乳颗粒，

肌红蛋白标准品：人肌红蛋白、5％BSA、0.5％NaN₃、500mM Hepes缓冲液。

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