CN114354949A - 双粒径聚苯乙烯微球偶联肌红蛋白测定试剂盒及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种双粒径聚苯乙烯微球偶联肌红蛋白测定试剂盒，R1试剂、R2试剂以及校准品，其中，R1试剂成分中含有第一缓冲液、促凝剂、稳定剂、防腐剂；R2试剂成分中含有第二缓冲液、氯化钠、偶联抗肌红蛋白抗体的聚苯乙烯微球、防腐剂；校准品含有：肌红蛋白、第三缓冲液、稳定剂、防腐剂，所述聚苯乙烯微球为带有羧基臂的聚苯乙烯微球。本发明还提供了上述试剂盒的制备方法。本发明不仅可以促进抗原抗体的结合，使其快速形成复合物，又能抑制免疫复合物的解离，使沉淀出现快，提高了检测的速度和灵敏度；而且还不会因此而扩大非特异性范围，使得肌红蛋白测定试剂盒保持一个宽的线性范围。

Description

双粒径聚苯乙烯微球偶联肌红蛋白测定试剂盒及制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种检测试剂盒，具体来说是一种双粒径聚苯乙烯微球偶联肌红蛋白测定试剂盒及其制备方法。

背景技术

肌红蛋白(myoglobin，MYO)广泛存在于人的心肌，骨骼肌细胞中的胞内蛋白，是一种小分子蛋白质，其分子结构与血红蛋白相似，在肌细胞内具有转运和储存氧的功能(参见《Nature》，2001年，

M,Fletcher M A,Dobson C M，Amyloid fibrils from musclemyoglobin[J])。人体心肌和骨骼肌内均有大量肌红蛋白，经过肾脏代谢并排出。当心肌或者横纹肌受到损伤时，肌红蛋白便释放到人血中，血清中的肌红蛋白可明显升高。一般在正常情况下，人血液中MYO含量较低，约小于70ng/mL，而当心肌受到损伤时，MYO可直接快速的进入到血液循环中，1-2h内开始升高，12可达到峰值(参见《河北医学》，2006年，王临光等，急性冠脉综合症诊断中检测心肌肌钙蛋白I肌红蛋白及肌酸激酶同工酶及超敏C-反应蛋白的意义[J])。因此MYO是肌细胞损伤后较敏感的检测标志物，也是诊断早期急性心肌梗死(AMI)的特异性生化标志物之一(参见《Circulation》，1994年，Tunstallpedoe H等，Myocardial infarction and coronary deaths in the World Health OrganizationMONICA Project.Registration procedures,event rates,and case-fatality rates in38 populations from 21countries in four continents[J])，另外在心肌损伤时MYO出现的时间早于其它生化标志物，可用于心肌梗死的早期快速诊断，并能根据其出现的时间推测心肌梗死面积和判断溶栓疗效。

目前临床常用的肌红蛋白检测方法主要包括：乳胶凝集法、酶联免疫吸附法(ELISA)、胶乳增强免疫比浊法、免疫金标法等(参见《Labeled Immunoassays&ClinicalMedicine》，2001年，Liu H W等，A Rapid ELISA for Serum Myoglobin to Diagnose AMI[J]，《细胞与分子免疫学杂志》，2013年，骆敏儿等，玉米赤霉烯酮单克隆抗体的制备及胶体金免疫层析法的建立[J])。

其中乳胶凝集法操作简单，快速，适用于急诊检测，但是只能用于定性或半定量的检测，常作为筛查用；酶联免疫吸附实验法精确，定量，敏感性高，但操作要求严格，步骤繁琐，不适用于急诊和临床病人的快速诊断和监测；免疫金标法具有乳胶凝集法的易于操作、快速，又具有ELISA法准确、定量的特点，但类风湿因子、肝素及血脂等对其检测的结果具有一定的干扰，不适于大规模推广使用；胶乳免疫比浊法具有操作简便、快速、定量准确、特异性强、敏感度高等优点，可满足门诊和急诊的需要，在临床应用中越来越广泛。但现有的利用胶乳免疫比浊法制备的肌红蛋白测定试剂盒大多存在下述缺点，例如在试剂盒灵敏度提高时，就会造成了线性范围窄、稳定性欠佳等缺点；而进口试剂盒价格昂贵、检测成本高，不利于该检测项目在临床诊断中的推广应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高灵敏度肌红蛋白测定试剂盒及其制备方法，使得肌红蛋白测定试剂盒具有线性范围广、稳定性好、灵敏度高、成本低廉的优点。

本发明提供了一种双粒径聚苯乙烯微球偶联肌红蛋白测定试剂盒，包含：R1试剂、R2试剂以及校准品，其中，R1试剂成分中含有第一缓冲液、促凝剂、稳定剂、防腐剂；R2试剂成分中含有第二缓冲液、氯化钠、偶联抗肌红蛋白抗体的聚苯乙烯微球、防腐剂；校准品含有：肌红蛋白、第三缓冲液、稳定剂、防腐剂，所述聚苯乙烯微球为带有羧基臂的聚苯乙烯微球。

进一步，所述的第一缓冲液、第二缓冲液和第三缓冲液为以下之一或其组合：三羟甲基氨基甲烷缓冲液、磷酸盐缓冲液。

进一步的，所述稳定剂为以下之一或其任意组合：离子稳定剂、悬浮稳定剂；所述防腐剂为以下之一或其任意组合：叠氮钠、硫柳汞、苯酚、乙基汞硫代硫酸钠；所述促凝剂为以下之一或其任意组合：葡聚糖或聚苯乙烯吡络烷酮。

进一步的，所述离子稳定剂为以下之一或其组合：氯化钠、氯化钾，所述悬浮稳定剂为聚乙二醇。

本发明还提供了上述的一种双粒径聚苯乙烯微球偶联肌红蛋白试剂盒的制备方法，包含以下步骤：

1)R1试剂的制备，R1试剂成分中含有第一缓冲液、促凝剂、稳定剂、防腐剂；

2)R2试剂的制备，R2试剂成分中含有第二缓冲液、氯化钠、偶联抗肌红蛋白抗体的聚苯乙烯微球、防腐剂；

3)一个聚苯乙烯微球的活化步骤：用缓冲液将聚苯乙烯微球稀释后，加入N-羟基琥珀酰亚胺溶液，混合均匀、搅拌，在搅拌中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液，继续搅拌反应30～60min之后离心、超声洗涤溶解到缓冲液中，即得到聚苯乙烯微球溶液；

4)抗体的偶联：向所述聚苯乙烯微球溶液中加入抗肌红蛋白抗体溶液，震荡反应60～120min；

5)微球的封闭：向所述震荡反应过程中的混合液加入牛血清白蛋白；

6)洗涤、溶解：将所述震荡反应结束后的混合物经过离心、超声洗涤后，溶解到缓冲液中，即得肌红蛋白测定试剂盒。

进一步的，所述聚苯乙烯微球的活化步骤中的聚苯乙烯粒子的粒径为60～400nm。

本发明实施方式相对于现有技术而言，通过将抗肌红蛋白抗体偶联到大小不同粒径的聚苯乙烯微球上，使得肌红蛋白测定试剂盒不仅可以提高了检测的灵敏度；而且还不会因此而扩大非特异性范围，使得肌红蛋白测定试剂盒保持一个宽的线性范围。

另外，要求R1和R2试剂中的缓冲液的可调节pH范围在7.0～9.0之间，优选为以下之一：三羟甲基氨基甲烷缓冲液、磷酸盐缓冲液，与其他缓冲液相比，这两种缓冲液具有缓冲能力强、溶解度高、很好的生物想任性和反应惰性，且pH随温度和稀释度的改变而改变很小的优点。

另外，聚苯乙烯微球与抗肌红蛋白抗体的偶联是通过化学偶联完成反应，其结合力要比物理吸附更强，不容易被洗脱，试剂的稳定性更好。

另外，稳定剂为以下之一或其任意组合：离子稳定剂、悬浮稳定剂；防腐剂为以下之一或其任意组合：叠氮钠、硫柳汞、苯酚、乙基汞硫代硫酸钠，这些防腐剂防腐效果好，毒性低，为比较常用的防腐剂。

另外，离子稳定剂为以下之一或其组合：氯化钠、氯化钾，悬浮稳定剂为聚乙二醇，少量的聚乙二醇可以起到稳定剂的作用，与离子稳定剂一起作用可以使试剂的稳定性提高。所述促凝剂为以下之一或其任意组合：葡聚糖或聚苯乙烯吡络烷酮。

另外，聚苯乙烯微球的活化步骤中的缓冲液为2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液，其中，缓冲液的浓度为25～50mM，pH为5.5～6.5。在此条件下聚苯乙烯微球上的羧基活化程度最大，有利于结合更多的抗体，提高偶联率，从而增加试剂检测的灵敏度。

另外，通过实验探索的结果，最终优选N-羟基琥珀酰亚胺溶液以及1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液的浓度分别为50～100mg/mL和5～10mg/mL。

另外，聚苯乙烯微球的活化步骤中的聚苯乙烯微球的粒径，其中粒径1的范围为60～200nm，粒径2的范围为240～400nm。这一宽的粒径范围，有利于在制备过程中，改善试剂的灵敏度和提高线性范围。

另外，通过实验探索，在聚苯乙烯微球的活化以及洗涤、溶解步骤中，最佳的离心的速率为18000～20000rpm，离心的时间为1～30min；超声的时间为1～5min，这样可以保证抗体可以在粒子很快均匀分散，增加抗体与粒子的偶联率。

综上所述，本发明通过将抗肌红蛋白抗体连接到带有羧基臂，不同粒径大小的聚苯乙烯微球(PS)表面上，制备一种灵敏度高，特异性强，线性范围宽、稳定性好、成本低廉的MYO检测试剂盒。

本发明实施方式相对于现有技术而言，通过将抗肌红蛋白抗体偶联到大小不同粒径的聚苯乙烯微球上，使得肌红蛋白测定试剂盒不仅可以提高了检测的灵敏度；而且还不会因此而扩大非特异性范围，使得肌红蛋白测定试剂盒保持一个宽的线性范围。

另外，要求R1和R2试剂中的缓冲液的可调节pH范围在7.0～9.0之间，优选为以下之一：三羟甲基氨基甲烷缓冲液、磷酸盐缓冲液，与其他缓冲液相比，这两种缓冲液具有缓冲能力强、溶解度高、很好的生物想任性和反应惰性，且pH随温度和稀释度的改变而改变很小的优点。

另外，聚苯乙烯微球与抗肌红蛋白抗体的偶联是通过化学偶联完成反应，其结合力要比物理吸附更强，不容易被洗脱，试剂的稳定性更好。

另外，稳定剂为以下之一或其任意组合：离子稳定剂、悬浮稳定剂；防腐剂为以下之一或其任意组合：叠氮钠、硫柳汞、苯酚、乙基汞硫代硫酸钠，这些防腐剂防腐效果好，毒性低，为比较常用的防腐剂；所述促凝剂为以下之一或其任意组合：葡聚糖或聚苯乙烯吡络烷酮。

另外，离子稳定剂为以下之一或其组合：氯化钠、氯化钾，悬浮稳定剂为聚乙二醇，少量的聚乙二醇可以起到稳定剂的作用，与离子稳定剂一起作用可以使试剂的稳定性提高。

另外，聚苯乙烯微球的活化步骤中的缓冲液为2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液，其中，缓冲液的浓度为25～50mM，pH为5.5～6.5。在此条件下聚苯乙烯微球上的羧基活化程度最大，有利于结合更多的抗体，提高偶联率，从而增加试剂检测的灵敏度。

另外，通过实验探索的结果，最终优选N-羟基琥珀酰亚胺溶液以及1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液的浓度分别为50～100mg/mL和5～10mg/mL。

另外，聚苯乙烯微球的活化步骤中的聚苯乙烯微球的粒径，其中粒径1的范围为60～200nm，粒径2的范围为240～400nm。这一宽的粒径范围，有利于在制备过程中，改善试剂的灵敏度和提高线性范围。

另外，通过实验探索，在聚苯乙烯微球的活化以及洗涤、溶解步骤中，最佳的离心的速率为18000～20000rpm，离心的时间为1～30min；超声的时间为1～5min，这样可以保证抗体可以在粒子很快均匀分散，增加抗体与粒子的偶联率。

本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。采用双粒径聚苯乙烯微球为载体制备的肌红蛋白测定试剂盒与单粒径聚苯乙烯微球为载体制备的肌红蛋白测定试剂盒相比，不仅可以促进抗原抗体的结合，使其快速形成复合物，又能抑制免疫复合物的解离，使沉淀出现快，提高了检测的速度和灵敏度；而且还不会因此而扩大非特异性范围，使得肌红蛋白测定试剂盒保持一个宽的线性范围。另外，该方法操作简单，有利于扩大生产，具有很好的应用前景。

附图说明

图1是根据本发明第一实施方式中PS-309nm的线性结果。

图2是是根据本发明第一实施方式中PS-100nm的线性结果。

图3是根据本发明第一实施方式中双粒径PS-MYO的线性结果。

图4是根据本发明第一实施方式中的4℃试剂校准曲线。

图5是根据本发明第一实施方式中的37℃试剂校准曲线。

图6是根据本发明第一实施方式中的相关性。

图7是根据本发明第一实施方式中的一致性检测曲线。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的各实施方式进行详细的阐述。然而，本领域的普通技术人员可以理解，在本发明各实施方式中，为了使读者更好地理解本申请而提出了许多技术细节。但是，即使没有这些技术细节和基于以下各实施方式的种种变化和修改，也可以实现本申请所要求保护的技术方案。

本发明的第一实施方式涉及一种肌红蛋白测定试剂盒，该试剂盒包含：缓冲液、偶联抗肌红蛋白抗体的聚苯乙烯微球、稳定剂以及防腐剂，其中，聚苯乙烯微球为带有羧基臂的聚苯乙烯微球。

值得注意的是，在本实施方式中，缓冲液可以是三羟甲基氨基甲烷缓冲液，缓冲液还可以是磷酸盐缓冲液；或者缓冲液也可以是上述两种缓冲液的组合。

进一步地，在本实施方式中，稳定剂可以是离子稳定剂；稳定剂还可以是悬浮稳定剂；或者稳定剂还可以是上述两种稳定剂的组合，另外，防腐剂可以是叠氮钠；或者硫柳汞；或者苯酚；或者乙基汞硫代硫酸钠；或者上述4种防腐剂的组合，本实施方式不应以此为限。

另外，在本实施方式中，离子稳定剂可以是氯化钠；或者氯化钾，悬浮稳定剂可以为聚乙二醇；促凝剂为：聚苯乙烯吡络烷酮360。

在实际使用肌红蛋白测定试剂盒过程中，通常将肌红蛋白测定试剂盒分成R1试剂、R2试剂以及校准品，其中，R1试剂成分中含有缓冲液、促凝剂、稳定剂、防腐剂；R2试剂成分中含有缓冲液、偶联抗肌红蛋白抗体的聚苯乙烯微球、防腐剂；校准品含有：肌红蛋白、缓冲液、稳定剂、防腐剂。

具体地，R1试剂的缓冲液优选HEPES缓冲液，pH在7.0-8.5之间；稳定剂可以为氯化钠，质量百分比浓度为0.2-0.5％之间；防腐剂叠氮钠的质量百分比浓度可以为0.1％；促凝剂聚苯乙烯吡络烷酮360的质量百分比浓度可以为0.5-1.0％之间。R2试剂是由抗肌红蛋白抗体与羧基化的聚苯乙烯微球在2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液中通过化学交联法交联，之后经过离心，洗涤后，在含有稳定剂和防腐剂的Good’s缓冲液中分散而成。

下面通过实验检测本实施方式配制的肌红蛋白测定试剂盒的各项参数：

1.肌红蛋白测定试剂盒R1试剂的制备

肌红蛋白测定试剂盒R1试剂的配方如表1：

2.肌红蛋白测定试剂盒R2试剂的配制

肌红蛋白测定试剂盒R2试剂稀释液的配方如表2：

由抗肌红蛋白抗体与羧基化的聚苯乙烯微球在MES缓冲液中通过化学交联法交联，之后经过离心，洗涤后，在含有稳定剂和防腐剂的Good’s缓冲液中分散而成。

含稳定剂和防腐剂的Good’s缓冲液配制如下：

3.洗涤液配方如表3：

4.羧基化聚苯乙烯微球与抗体的偶联过程

a.分别取2mL粒径为100nm和309nm的羧基化聚苯乙烯微球母液，用25mM pH6.1的2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液通过离心、超声洗涤1-2次；

b.将沉淀用2-(N-吗啡啉)乙磺酸稀释到10mg/mL混匀之后，加入0.5mL和0.75mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(10mg/mL)和N-羟基琥珀酰亚胺(100mg/mL)溶液，活化聚苯乙烯微球上的羧基，室温下震荡反应30min；

c.活化结束之后，离心弃去上清，取2.0mL 25mM pH6.1的2-(N-吗啡啉)乙磺酸溶解，并用超声混合均匀之后，加入18mg/mL的抗肌红蛋白抗体，室温震荡下交联60min，之后加入体积百分比浓度为0.5％的牛血清白蛋白，室温震荡封闭30min；

d.用25mM pH6.1的2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液洗涤2次；再用50mM pH7.4的3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸洗涤一次；

e.加入4.0mL含有50mM pH7.4的4-羟乙基哌嗪乙磺酸，100mM，体积百分比浓度0.1％牛血清白蛋白溶液中，2-8℃保存。

5.校准品的配制

a.取适量的MYO(肌红蛋白)抗原母液溶解于4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液中，使其稀释至800ng/mL，作为校准品S5；

b.以生研MYO检测试剂盒检测S5，得到其初始浓度，约800ng/mL。

c.将S5用4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液对半稀释成5个不同浓度梯度(S1-S5)作为肌红蛋白检测试剂盒的校准品，浓度分别为50、100、200、400、800ng/mL并分别加入体积百分比浓度0.9％的牛血清白蛋白、体积百分比浓度为0.15％的甘露醇及氯化钠和质量百分比浓度0.05％叠氮钠混合均匀，2-8℃保存备用。

6.检测样本的方法及结果

(1)将接近线性范围的人血高值样本，用生理盐水配制成11个浓度梯度，分别为0、1/160、1/80、1/40、1/20、1/5至1；每个样本测试2遍，结果如表1及图1-3所示：

表1双粒径PS-MYO试剂盒与单粒径PS-MYO试剂盒线性测试表

从表中结果可以看出当样本浓度为50ng/mL时，单粒径PS-309nm-MYO检测试剂盒的吸光度为569，单粒径PS-100nm-MYO检测试剂盒的吸光度为39，双粒径PS-MYO检测试剂盒的吸光度为276；从图中的线性拟合曲线方程得出单粒径PS-309nm-MYO检测试剂盒的r＝0.889，单粒径PS-100nm-MYO检测试剂盒的r＝0.985，双粒径PS-MYO检测试剂盒的r＝0.9996。通过以上结果可以得出双粒径PS-MYO检测试剂盒的灵敏度远高于单粒径PS-100nm-MYO检测试剂盒，线性范围远宽于单PS-309nm-MYO检测试剂盒，双粒径PS-MYO检测试剂盒既保证了高灵敏度又兼顾了宽的线性范围，有利于早期心肌梗死的快速准确检出

(2)37℃热加速稳定性结果

取配好的校准品(S1-S5)，进行spline非线性曲线拟合，其中双粒径PS-MYO肌检测试剂盒在37℃下放置7天。结果如图4-5所示:

从图中可以看出，双粒径PS-MYO检测试剂盒37℃放置7天之后，与4℃试剂的校准曲线反应基本一致。

(3)重复性结果

取高低不同浓度的人血清样本，用双粒径PS-MYO试剂盒和单粒径PS-MYO试剂盒同时测定，每个样本测试10次，计算每个样本的精密度。结果如表2所示：

表2双粒径PS-MYO试剂盒与单粒径PS-MYO试剂盒精密度测试表

(4)抗干扰结果

取足够量的随机血清混合均匀之后，分成3份，分别加入游离型胆红素(450mg/mL)、血红蛋白(5g/L)、甘油三酯(15mM)、Vc(600mg/mL)、乳糜(福尔马肼)浊度为(2940)；用本发明的试剂盒与市售对照试剂盒分别对每个样本重复测定3次，求取平均值(μg/L)，与未加入干扰的混合血清比较，计算干扰对结果的影响。结果如表3所示：

表3双粒径PS和单粒径PS-MYO检测试剂盒测试不同干扰物结果

从表中结果可以看出双粒径PS-MYO检测试剂盒对随机血清中加入不同干扰物的相对误差均小于5％，即可认为在中轻度溶血、黄疸和乳糜时，其检测结果几乎不受影响；另外单粒径PS-MYO检测试剂盒的测试结果相对误差较大，容易受Vc、溶血和乳糜等物质的影响，不利于疾病的诊断检出和诊断。

(5)稳定性结果

取足够量的双粒径PS-MYO检测试剂盒，放置37℃环境下7天取出，与放置在2-8℃环境下的双粒径PS-MYO检测试剂盒测试同一个样本，计算两者测试结果相对偏差，结果如表4所示：

表4双粒径PS-MYO检测试剂盒4℃和37℃测试结果

从表中结果可以看出双粒径PS-MYO检测试剂盒放置37℃环境7天后与4℃试剂测试样本结果偏差均小于5％，试剂稳定性较好。

(6)相关性和一致性结果

(a)相关性：共收集120例血清样本，根据EP9-A2[9]进行方法间离群点的分析：计算两组测定结果间的相对差值及其平均值，按相对差值平均值的四倍计算相对检测限值，将各相对差值和相对检测限值进行比较，标记出相对差值超过相对检测限值的样本。计算两组测定结果间的绝对差值及其平均值，按绝对差值平均值的四倍计算绝对检测限值，将各绝对差值和绝对检测限值进行比较，标记出绝对差值超过绝对检测限值的样本。若两种检测方法都未通过的测定结果判断为离群点，该样本为离群样本。经计算120例样本测试结果没有离群样本。结果如图6所示：

双粒径PS-MYO检测试剂盒与生研MYO试剂盒的相关性方程为y＝1.0632x+0.0517；相关性系数：r＝0.997，与生研测定结果相关性较好。

(b)一致性结果

对上述测试结果用Bland-Altman统计学方法对测定结果进行分析，以每个样本的考核试剂测定结果与参比试剂测定结果的差值为纵坐标，两者测定结果的均值为横坐标作图。如图7所示：

计算所有测定结果的比值的平均值(A)及标准差(SD)，并根据公式A±1.96SD得到95％的一致性界限范围。本次临床试验中A＝1.04，SD＝0.07，因此95％的一致性界限范围为：0.905～1.18。上述结果显示，97.5％(117/120)的测定结果在上述范围内，双粒径PS-MYO检测试剂盒和生研MYO检测试剂盒试剂测定结果在此区间的统计学上有着一致性，具有统计学意义上的等效性。

由此可见本发明提供的试剂盒在临床上对于急性心肌梗死等疾病的诊断和病程检测具有同样的准确率，可在临床上代替进口试剂盒的使用，减低检测成本。

不难发现，与现有技术相比，本发明实施方式中的肌红蛋白测定试剂盒具有下述优点：

(1)本发明实施方式中的肌红蛋白测定试剂盒具有较高的检测灵敏度，宽的线性范围，好的重复性；操作简单，快速。

(2)本发明实施方式中的肌红蛋白测定试剂盒特异性强，在一定范围内不受其他物质的干扰；

(4)本发明实施方式中的肌红蛋白测定试剂盒稳定性好，在2-8℃至少可保存24个月，试剂开瓶后可以保存42天；比现有市售的试剂盒开瓶后保存时间久；

(5)本发明实施方式中的肌红蛋白测定试剂盒与对照进口试剂相比，其检测的结果准确可靠，且成本低，可在医院中推广使用。

本领域的普通技术人员可以理解，上述各实施方式是实现本发明的具体实施例，而在实际应用中，可以在形式上和细节上对其作各种改变，而不偏离本发明的精神和范围。

Claims (8)

1.一种双粒径聚苯乙烯微球偶联肌红蛋白测定试剂盒，其特征在于包含：R1试剂、R2试剂以及校准品，其中，R1试剂成分中含有第一缓冲液、促凝剂、稳定剂、防腐剂；R2试剂成分中含有第二缓冲液、氯化钠、偶联抗肌红蛋白抗体的聚苯乙烯微球、防腐剂；校准品含有：肌红蛋白、第三缓冲液、稳定剂、防腐剂，所述聚苯乙烯微球为带有羧基臂的聚苯乙烯微球。

2.根据权利要求1所述的双粒径聚苯乙烯微球偶联肌红蛋白测定试剂盒，其特征在于，所述的第一缓冲液、第二缓冲液和第三缓冲液为以下之一或其组合：三羟甲基氨基甲烷缓冲液、磷酸盐缓冲液。

3.根据权利要求1所述的双粒径聚苯乙烯微球偶联肌红蛋白测定试剂盒，其特征在于，所述稳定剂为以下之一或其任意组合：离子稳定剂、悬浮稳定剂；所述防腐剂为以下之一或其任意组合：叠氮钠、硫柳汞、苯酚、乙基汞硫代硫酸钠，所述的促凝剂为以下或其任意组合：葡聚糖、聚乙烯吡络烷酮。

4.根据权利要求3所述的双粒径聚苯乙烯微球偶联肌红蛋白测定试剂盒，其特征在于，所述离子稳定剂为以下之一或其组合：氯化钠、氯化钾，所述悬浮稳定剂为聚乙二醇; 所述的促凝剂为聚乙烯吡络烷酮。

5.权利要求1所述的一种双粒径聚苯乙烯微球偶联肌红蛋白试剂盒的制备方法，其特征在于包含以下步骤：

R1试剂的制备，R1试剂成分中含有第一缓冲液、促凝剂、稳定剂、防腐剂；

R2试剂的制备，R2试剂成分中含有第二缓冲液、氯化钠、偶联抗肌红蛋白抗体的聚苯乙烯微球、防腐剂；

一个聚苯乙烯微球的活化步骤：用缓冲液将聚苯乙烯微球稀释后，加入N-羟基琥珀酰亚胺溶液，混合均匀、搅拌，在搅拌中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液，继续搅拌反应30～60min之后离心、超声洗涤溶解到缓冲液中，即得到聚苯乙烯微球溶液；

抗体的偶联：向所述聚苯乙烯微球溶液中加入抗肌红蛋白抗体溶液，震荡反应60～120min；

微球的封闭：向所述震荡反应过程中的混合液加入牛血清白蛋白；

洗涤、溶解：将所述震荡反应结束后的混合物经过离心、超声洗涤后，溶解到含有防腐剂缓冲液中，即得肌红蛋白测定试剂盒。

6.根据权利要求5所述的一种双粒径聚苯乙烯微球偶联肌红蛋白试剂盒的制备方法，其特征在于，所述聚苯乙烯微球的活化步骤中的缓冲液为2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液，其中，所述缓冲液的浓度为25～50mM，pH为5.5～6.5。

7.根据权利要求5所述的一种双粒径聚苯乙烯微球偶联肌红蛋白试剂盒的制备方法，其特征在于使用以下两个物质活化聚苯乙烯微球，所述N-羟基琥珀酰亚胺溶液的浓度为50～100 mg/mL，所述的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液的浓度为5～10mg/mL。

8.根据权利要求5所述的一种双粒径聚苯乙烯微球偶联肌红蛋白试剂盒的制备方法，其特征在于，所述聚苯乙烯微球的活化步骤中的聚苯乙烯粒子的粒径为60～400nm。

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