CN103163306A - 25羟维生素d检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及25羟维生素D检测试剂盒及其制备方法。该试剂包括第一试剂、第二试剂,可选地还可以包括校准品。第一试剂包含25羟维生素D抗体、维生素D结合蛋白抗体和缓冲液;第二试剂含有结合有25羟维生素D抗原的微球和缓冲液。该试剂盒利用样本中的25羟维生素D与结合在微球表面的抗原竞争结合25羟维生素D抗体,使得结合有25羟维生素D的微球与25羟维生素D抗体反应形成的浊度下降,通过该浊度的下降程度推算样本中25羟维生素D的含量。
Description
技术领域
本发明涉及临床体外诊断及医学免疫学领域;具体地涉及一种免疫检测试剂;更进一步地,本发明涉及一种25羟维生素D检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
维生素D也称抗佝偻病维生素,又可分为维生素D2和维生素D3。维生素D2多含于植物性食物中,它是由植物的麦角固醇经阳光照射而合成的,维生素D3可由人体皮肤和脂肪组织在7-脱氢胆固醇经过阳光照射合成。维生素D2属脂溶性维生素,来自食物中的维生素D与脂肪一起经小肠吸收,在胆汁协助下形成乳糜微粒,由淋巴管进入血液,与自身合成的维生素D3一起转运入肝脏。在肝脏中经肝细胞微粒体中的单氧酶系统(25-羟化酶)的作用,形成25羟维生素D。25羟维生素D在肾近端小管上皮细胞线粒体内α羟化酶系统的作用下转变为1,25(OH)2D3,它是维生素D最大的生物作用形式,可以促进肠道钙结合蛋白的合成。而25羟维生素D是代谢中的主要循环形式,能够反映机体的维生素D水平。
维生素D缺乏又称维生素D缺乏性佝偻病。常见于婴幼儿,多见于膳食中缺乏维生素D,或者是人体缺乏阳光的照射。由于体内维生素D不足而引起钙、磷代谢障碍,钙盐不能正常地沉积于骨骼的生长部分,以致出现生长骨发生病变为特征的一种慢性营养性疾病,称为佝偻病。如果该病发生于成人,则出现发育成熟骨骼的钙化不全,称为骨软化症。研究还表明,维生素D缺乏可能使某些癌症、心血管疾病、自身免疫性疾病和感染性疾病的发病风险升高。
根据当前糖尿病报告杂志上发表的结果,3,262例年龄50-70岁之间的中国人参加的一项研究表明94%的人维生素D缺乏或不足,这些人中有42%还有代谢综合征。其它一些研究表明,维生素D缺乏和不足在中国的孕妇以及6-16岁的儿童中也很常见。而长期摄入过多的维生素D(5000IU),将引起高血钙和高尿钙。特征为食欲减退,过度口渴、恶心、呕吐、烦躁、体弱、便泌腹泻交替出现,严重者将因肾钙化、心脏和大动脉钙化而死亡。随着医疗专业人员和患者意识到维生素D缺乏的潜在健康风险,实验室检验量激增,需要我们提供更快、更准、更有效的检测方法,帮助医生和患者更早的得到检测结果。
目前25羟维生素D的测定方法主要有酶联免疫法(如CN102628872A中公开的方法和试剂盒,以及DRG提供的25-OH维他命D(总)检测试剂盒EIA5396)、放射免疫法(如Hollis BW等人,1985)、液相色谱-质谱检测法(如郑晓艳等人,2012)以及化学发光法(如单咏梅等人,2011;索灵生产的25-羟基总维生素D定量测定试剂盒(化学发光法))。酶联免疫法自动化程度不高,且受人为因素影响较大。放射免疫法存在着环境污染问题;液相色谱质谱操作复杂,用时较长;而化学发光法灵敏度虽高,但检测成本较高,需要特定化学发光仪,这些原因导致其应用范围较小。
本发明采用胶乳增强免疫透射比浊法测定人样本中25羟维生素D浓度,该方法对仪器设备要求不高,没有环保和操作人员自身防护等问题。而目前市场上还未出现胶乳增强免疫透射比浊法测定人样本中25羟维生素D浓度的试剂盒,与其它测定方法比较,本方法简便快速、灵敏可靠,普通自动或半自动生化分析仪就可,有较大应用范围和实用价值。
发明内容
根据本发明的第一方面,提供了一种25羟维生素D检测试剂盒,其包含第一试剂,和第二试剂。第一试剂包含25羟维生素D抗体、维生素D结合蛋白抗体和缓冲液,第二试剂包含结合有25羟维生素D抗原的微球和缓冲液。在一些实施方式中,第一试剂和第二试剂中的缓冲液选自磷酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、MES缓冲液、硼酸缓冲液、醋酸盐缓冲液、2-吗啉乙磺酸缓冲液或氯化铵缓冲液中的一种或几种;缓冲液浓度为10-500mM。
在一些实施方式中,第一试剂和第二试剂中的缓冲液类型可以相同也可以不同;第一试剂和第二试剂中的缓冲液浓度可以相同也可以不同。
在一些优选实施方式中,第一试剂和第二试剂中的缓冲液类型相同;第一试剂和第二试剂中的缓冲液浓度不同。
在一个具体实施方式中,第一试剂的缓冲液是50mM MES缓冲液;第二试剂的缓冲液是20mM MES缓冲液。本领域技术人员可以理解,随着缓冲液类型、浓度等因素的改变,缓冲液的pH值可以有所不同。
在一些实施方式中,25羟维生素D抗体为多克隆抗体或单克隆抗体;维生素D结合蛋白抗体为多克隆抗体或单克隆抗体;其中多克隆抗体源自兔、羊或鸡,单克隆抗体源自鼠或兔。
在一些实施方式中,所述25羟维生素D抗原为自然抗原或人工合成抗原。
在一些实施方式中,所述微球是由聚苯乙烯、丙烯酸、丙烯酸相关酯类中的一种或几种聚合而成的胶乳颗粒;微球直径在150-500nm之间。在一个具体实施方式中,所述微球是聚苯乙烯胶乳颗粒,微球直径为223nm。
根据需要,根据本发明的25羟维生素D检测试剂盒还包括校准品,校准品主要用于校准测量系统、评价测量程序或为待测样本赋值。因此,所述校准品包含已知浓度的25羟维生素D,校准品的值甚至可以追溯至参考物质或者追溯至参考方法(ISO17511:2003)。本领域技术人员可以根据待测物质的浓度范围,采用本领域常用的方法自行制备适当浓度的校准品,也可以使用市售校准品、或制造商提供的工作校准品等。
在一些具体实施方式中,根据本发明的25羟维生素D检测试剂盒还包括若干不同浓度的校准品,例如2个、3个、4个、5个甚至更多浓度的校准品。
在一个实施方式中,本发明的25羟维生素D检测试剂盒包括5个不同浓度的校准品。校准品含有25羟维生素D(分别为,但不限于,20ng/ml、45ng/ml、65ng/ml、100ng/ml和150ng/ml)、缓冲液,适当时还含有稳定剂、或防腐剂等。校准品可制备成液体形式、干粉或冻干粉形式。
根据本发明的另一方面,提供了一种结合有25羟维生素D抗原的微球的制备方法,包括步骤:
活化25羟维生素D抗原;
活化微球;
将活化的25羟维生素D抗原与活化的微球连接,从而获得结合有25羟维生素D抗原的微球。其中活化25羟维生素D抗原的步骤与活化微球的步骤的操作顺序是可互换的。
在一些实施方式中,活化25羟维生素D抗原的步骤所用的试剂选自羰基二咪唑、无水丙酮、二氨基二丙基亚胺、乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺和2-吗啉乙磺酸中的一种或多种。
在一些实施方式中,所述微球为羧基修饰的微球。
采用本发明的试剂盒,第一试剂包含足够多的维生素D结合蛋白抗体,其能够将维生素D与维生素结合蛋白分开;还包含足够多的25羟维生素D抗体,受试者样本(如全血、血浆、血清)中的25羟维生素D可以和该抗体发生特异性结合;第二试剂含有结合有25羟维生素D抗原的微球,微球上的25羟维生素D抗原和未结合样本中25羟维生素D的剩余抗体可以发生特异性反应;利用胶乳增强免疫比浊的方法原理,检测微球与剩余抗体反应产生的吸光度,可以推算出样本中25羟维生素D的含量。
附图说明
图1:25羟维生素D试剂盒标准曲线。
图2:本发明方法和对照方法所制备的试剂之间标准曲线的比较。◆本发明方法;■对照方法。
图3:本发明的试剂盒与酶联免疫分析法的血清测值的相关性。
具体实施方式
为了使本发明易于理解,下面结合具体实施例进一步阐述本发明。除非另有指明,“%”表示质量/体积。以下提供了本发明实施方式中所使用的具体材料及其来源。但是,应当理解的是,这些仅仅是示例性的,并不意图限制本发明,与如下试剂和仪器的类型、型号、品质、性质或功能相同或相似的材料均可以用于实施本发明。以下实施例以血清为例进行了测试,但是本领域技术人员能够理解,血浆和全血同样可用作根据本发明的方法和试剂盒的受试样本,因为其检测对象均为样本中的25羟维生素D,血清、血浆和全血的采集、保存、预处理等操作可以按照临床检验领域中的常规方法进行。
实施例
实施例1:25羟维生素D检测试剂盒的制备
1.第一试剂制备过程如下:
第一试剂组成:
用含有0.15M NaCl、0.1%NaN3、0.1%BSA的50mM MES溶液,在室温下稀释维生素D结合蛋白抗体和25羟维生素D抗体,至抗体终浓度为0.2%。
2.第二试剂制备过程如下:
a)用无水丙酮在室温下稀释4ml人25羟维生素D抗原(10mg/ml),至抗原终浓度为2mg/ml;
b)称取20mg羰基二咪唑加入到上述溶液中,混匀,在30℃150rpm摇床中反应0.5-2小时,例如1小时;
c)用20mM MES溶液(pH5.0)在室温下稀释1ml223nm聚苯乙烯胶乳颗粒,至胶乳浓度为4%;
d)称取10mg二氨基二丙基亚胺溶于7.5ml无水丙酮中,加入1.5mg乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺搅拌10至60min,例如30min;
e)将c)获得的聚苯乙烯胶乳颗粒滴加进d),混匀,30℃150rpm摇床中反应1-3小时,例如2小时;
f)将e)获得的活化的聚苯乙烯胶乳颗粒滴加进b)中,混匀,30℃150rpm摇床中反应1-4小时,例如3小时;
g)将f)获得的液体离心,并用去离子水清洗2-3遍,去上清,获得胶乳颗粒沉淀;
h)用20mM MES溶液(pH5.0)稀释g)获得的胶乳颗粒至1.25%,根据需要可以加入0.1%防腐剂;
i)超声分散后,获得第二试剂。
3.校准品的制备过程:
校准品组成:
其余为去离子水
按参考校准品所需要浓度,将25羟维生素D纯品加入含有0.15MNaCl、0.1%NaN3、0.5%BSA、10%无水乙醇、5%蔗糖的50mM MES溶液中,制得20ng/ml、45ng/ml、65ng/ml、100ng/ml、150ng/ml浓度的25羟维生素D参考校准品。
尽管上述方法中提供了具体的实验条件,但是本领域技术人员应当理解,其可以在本发明的精神范围内,针对实验规模等因素进行适当的调整。例如,当制备规模不同时,可以改变上述试剂的用量,并选择适当的反应设备以匹配规模的需求;再比如,搅拌速度不同时,搅拌时间可以适当地延长或缩短。
实施例2:对照制备方法
1.第一试剂的制备同实施例1。
2.第二试剂制备过程如下:
a)用20mM MES溶液(pH5.0)在室温下稀释4ml人25羟维生素D抗原(10mg/ml),至抗原终浓度为2mg/ml;
b)用20mM MES溶液(pH5.0)在室温下稀释1ml223nm聚苯乙烯胶乳颗粒,至胶乳浓度为4%;
c)称取1.5mg二氨基二丙基亚胺加入b)中搅拌10至60min,例如30min;
d)将c)获得的聚苯乙烯胶乳颗粒滴加进a),混匀,30℃150rpm摇床中反应1-4小时,例如3小时;
e)将d)获得的液体离心,并用去离子水清洗2-3遍,去上清,获得胶乳颗粒沉淀;
f)用20mM MES溶液(pH5.0)稀释e)获得的胶乳颗粒至1.25%,根据需要可以加入0.1%防腐剂;
g)超声分散后,获得第二试剂。
3.校准品的制备过程同实施例1。
实施例3:25羟维生素D校准曲线的绘制
本发明试剂盒的测定步骤如下:
以校准品浓度为横轴,相应的△OD570为纵轴,采用非线性拟合,如spline绘制出标准曲线,如图1。
实施例4:25羟维生素D试剂的线性和最低检测限
1.线性实验:
采用本领域技术人员已知的方法,将某一高25羟维生素D浓度样本(血清)做倍比稀释,测定稀释后的浓度,测定三次求平均值,与理论浓度相比较,计算其线性偏差。
表1.线性结果(ng/ml)
线性 | 读取1 | 读取2 | 读取3 | 均值 | 理论值 | 偏差% |
1 | 156.70 | 158.11 | 159.56 | 158.12 | 157.73 | 0.25 |
0.5 | 76.73 | 77.97 | 78.53 | 77.74 | 78.58 | -1.06 |
0.25 | 39.38 | 39.56 | 38.76 | 39.23 | 39.00 | 0.60 |
0.125 | 18.69 | 19.53 | 19.28 | 19.17 | 19.21 | -0.24 |
0.0625 | 9.37 | 9.48 | 9.58 | 9.48 | 9.32 | 1.69 |
0.03125 | 4.54 | 4.57 | 4.49 | 4.53 | 4.37 | 3.69 |
从表1可以看出本发明试剂盒线性范围可达0-150ng/ml。
2.最低检测限:
采用本领域技术人员已知的方法,将空白液(去离子水)和同一份用生理盐水进行稀释的几个低浓度样品(血清),重复测定15次,读取吸光度变化量。然后计算出扣除空白吸光度后的各样品的吸光度值,计算均值,标准偏差。采用99.7%的置信度来计算最低检测限。将每个样本的均值减去3倍的各自的标准偏差,然后与空白液的3倍的标准偏差比较,如果前者高于后者,我们就认定有99.7%的可能性出现的最小吸光度一定大于空白吸光度,能定量的报告结果。测定结果如表2和表3。
表2.样本的吸光度测量结果
(A-A0)*10000 | 1 | 2 | 3 | 4 | 水空白 |
1 | 3356 | 3895 | 4158 | 4385 | 4599 |
2 | 3357 | 3887 | 4059 | 4384 | 4432 |
3 | 3353 | 3892 | 4155 | 4367 | 4596 |
4 | 3345 | 3882 | 4143 | 4377 | 4559 |
5 | 3359 | 3896 | 4196 | 4410 | 4587 |
6 | 3345 | 3894 | 4157 | 4399 | 4598 |
7 | 3353 | 3891 | 4203 | 4378 | 4595 |
8 | 3348 | 3785 | 4148 | 4286 | 4473 |
9 | 3359 | 3899 | 4063 | 4369 | 4570 |
10 | 3353 | 3892 | 4221 | 4421 | 4558 |
11 | 3330 | 3893 | 4156 | 4389 | 4597 |
12 | 3356 | 3899 | 4163 | 4392 | 4568 |
13 | 3358 | 3896 | 4039 | 4357 | 4610 |
14 | 3356 | 3903 | 4167 | 4431 | 4608 |
15 | 3353 | 3892 | 4152 | 4384 | 4556 |
均值 | 3352 | 3886 | 4290 | 4382 | 4567 |
SD | 7.61876 | 28.49762 | 52.45152 | 33.20599 | 50.60304 |
CV% | 0.23% | 0.73% | 1.22% | 0.76% | 1.11% |
3SD | 22.85628 | 85.49286 | 157.3546 | 99.61798 | 151.8091 |
A+3SD | 3375 | 3972 | 4447 | 4482 | 4719 |
A+3SD+3S0 | 3505 | 4102 | 4578 | 4612 | - |
表3.最低检测限的结果
由表3得知,本发明方法所制备的试剂的最低检测限制可达3.98ng/ml。
实施例5:本发明的制备方法(实施例1)与对照方法(实施例2)的比较
采用本发明制备方法所制备的试剂与对照方法所制备的试剂,按照实施例3所述的操作,并绘制出标准曲线,如图2所示。
如图2所示,采用本发明制备方法所制备的试剂与对照方法所制备的试剂绘制的标准曲线相比,定标吸光度增加1倍以上,即在维生素D抗原质量固定的情况下,通过本申请的方法可以将更多的维生素D交联到微球上,大大提高了维生素D抗原的利用率;亦即在同一吸光度水平下可以降低维生素D抗原的投入,能够降低试剂成本。
实施例6:本发明25羟维生素D试剂与酶联免疫分析法(Elisa)测值相关性
相关性考察所用样本:肝素钠抗凝血清样本。
本发明的25羟维生素D检测试剂盒与现有技术(酶联免疫分析法)所得的测定值进行比较(如图3),并进行回归分析,获知相关性r2=0.988,y=1.010x-1.856;显示出本方法与酶联免疫分析法在肝素钠抗凝血清25羟维生素D测定方面具有良好的相关性。
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Claims (10)
1.一种25羟维生素D检测试剂盒,其包含:
第一试剂,和
第二试剂;
其中,
第一试剂包含25羟维生素D抗体、维生素D结合蛋白抗体和缓冲液,
第二试剂包含结合有25羟维生素D抗原的微球和缓冲液。
2.根据权利要求1所述的25羟维生素D检测试剂盒,其中
所述缓冲液选自磷酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、MES缓冲液、硼酸缓冲液、醋酸盐缓冲液、2-吗啉乙磺酸缓冲液或氯化铵缓冲液中的一种或几种;
所述缓冲液浓度为10-500mM。
3.根据权利要求1所述的25羟维生素D检测试剂盒,其中
所述维生素D结合蛋白抗体为多克隆抗体或单克隆抗体;
所述25羟维生素D抗体为多克隆抗体或单克隆抗体;
其中多克隆抗体源自兔、羊或鸡,单克隆抗体源自鼠或兔。
4.根据权利要求1所述的25羟维生素D检测试剂盒,其中
所述25羟维生素D抗原为自然抗原或人工合成抗原。
5.根据权利要求1所述的25羟维生素D检测试剂盒,其中
所述微球是由聚苯乙烯、丙烯酸、丙烯酸相关酯类中的一种或几种聚合而成的胶乳颗粒;微球直径在150-500nm之间。
6.根据权利要求1所述的25羟维生素D检测试剂盒,其还包括校准品,所述校准品包含已知浓度的25羟维生素D。
7.一种结合有25羟维生素D抗原的微球的制备方法,所述方法包括步骤:
活化25羟维生素D抗原;
活化微球;
将活化的25羟维生素D抗原与活化的微球连接,从而获得结合有25羟维生素D抗原的微球。
8.根据权利要求7所述的制备方法,其中所述活化25羟维生素D抗原的步骤所用的试剂选自羰基二咪唑、无水丙酮、二氨基二丙基亚胺、乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺和2-吗啉乙磺酸中的一种或多种。
9.根据权利要求7所述的制备方法,其中所述微球为羧基修饰的微球。
10.根据权利要求7所述的制备方法,其中所述活化25羟维生素D抗原的步骤与所述活化微球的步骤的操作顺序是可互换的。
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