CN105352958B - 总25-羟基维生素d检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

一种总25‑羟基维生素D检测试剂盒，其特征在于:包含试剂1，试剂2和试剂3；其中，试剂1是含有表面活性剂的解离液，试剂2由含有抗人25‑羟基维生素D2和D3的抗体置于适当的缓冲液中构成,试剂3由表面标记有人25‑羟基维生素D2和D3的聚苯乙烯胶乳颗粒置于适当的缓冲液中构成。本发明试剂盒具有检测的灵敏度和准确度高、精密度好、检测线性宽、稳定性好、检测时间短且生产成本低的优点。

Description

总25-羟基维生素D检测试剂盒

技术领域

本发明涉及一种医学检测试剂盒，具体讲是一种总25-羟基维生素D检测试剂盒。

背景技术

25-羟基维生素D(25羟基维生素D)是一种类固醇激素在促进肠道中钙的吸收及维持其动态平衡具有重要的意义，对人体骨骼的生长，健康起到关键的作用。近年来研究表明，维生素D除了具有骨骼效应外，还与自身免疫性疾病，糖尿病，心血管病，细胞生长分化等有关的非骨骼效应。维生素D有维生素D2和D3两种形式。人体中维生素D来源于饮食，而维生素D3则可由暴露在紫外线下的皮肤组织合成。在肝脏中，维生素D经过25-羟化酶作用，可形成25-羟基维生素D。被运送到肾脏后，经过1-羟化酶作用，形成1，25-双羟基维生素D。1，25-双羟基维生素D是活性最高的维生素D代谢物，但在人体血液中含量很低。在血液中的维生素D主要以25-羟基维生素D形式存在，因此被认为是个体中维生素D状态的准确指标。维生素D缺乏已被证实与许多疾病有关，包括骨质疏松，佝偻病，骨软化症和恶性肿瘤，而过量服食或者注射维生素D，会引起维生素D中毒。

目前市场上，通过酶联免疫法和化学发光免疫法来检测人体血清中总25-羟基维生素D(总25-羟基维生素D包括25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3)，其中有代表性的检测产品由英国的IDS和德国的Roche Diagnostics公司推出。使用酶联免疫法检测25-羟基维生素D反应时间比较长、通常需要2-3个小时，还需要配套专用的仪器，因此不能实现大批量的检测。使用化学发光法检测25-羟基维生素D，虽然检测灵敏度高，但是反应速度相对较慢，检测一般需要30分钟，也需要配套价格昂贵的封闭式免疫发光仪来检测，而且进口试剂盒价格高。

发明内容

本发明针对现有技术的上述不足，提供一种检测的灵敏度和准确度高、精密度好、检测线性宽、稳定性好、检测时间短且生产成本低的总25-羟基维生素D检测试剂盒。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术解决方案为：一种总25-羟基维生素D检测试剂盒，包括试剂1、试剂2和试剂3，所述试剂1是含有表面活性剂的酸性解离液；所述试剂2由含有抗人25-羟基维生素D2和D3抗体置于适当的缓冲液中构成；所述试剂3是表面标记有25-羟基维生素D2和D3的聚苯乙烯胶乳颗粒置于适当的缓冲液中构成。

本发明试剂1中的表面活性剂选自Tween-20(聚氧乙烯失水山梨醇月桂酸酯,吐温20),TritonX-100(聚乙二醇辛基苯基醚),Brij-35(聚氧乙烯月桂醚，布里杰-35)中的一种或几种，优选Tween-20。缓冲液选自HEPES缓冲液、PEPES缓冲液、MOPS缓冲液、磷酸盐缓冲液、柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液中的一种或几种，优选柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液。

本发明所述的试剂1由以下组分组成：10-100mM(mmoL/L)、pH4.0-6.0的柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液，0.05-0.5％(v/v)(Tween-20本身就是液体，V/V是指0.05-0.5ml Tween-20对应99.95-99.5ml试剂1)Tween 20，1mg/mL Proclin-300(Proclin-300防腐剂，构成完整酸性解离液的试剂1的一个添加组分)。

作为优选，所述的柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液的浓度为20-50mM，pH为4.5-5.5，Tween-20含量为0.1-0.4％(v/v)。

本发明试剂2中所述的抗人25-羟基维生素D2和D3抗体为单克隆抗体或多克隆抗体，其中多克隆抗体源自兔、羊或鸡，单克隆抗体源自鼠或兔；作为优选，所述抗人25-羟基维生素D2和D3抗体为单克隆抗体；作为进一步优选，所述抗人25-羟基维生素D2和D3抗体为鼠源性单克隆抗体。

本发明试剂2中所述的抗人25-羟基维生素D2和D3抗体在试剂2中的终浓度为0.1-1mg/ml；作为优选，所述抗人25-羟基维生素D2和D3抗体在试剂2中的终浓度为0.2-0.8mg/ml；作为进一步优选，所述抗人25-羟基维生素D2和D3抗体在试剂2中的终浓度为0.5mg/ml。

本发明试剂2中的缓冲液为磷酸盐缓冲液，HEPES缓冲液，Tris-HCl缓冲液，MOPS缓冲液中的一种或者几种，优选磷酸盐缓冲液；缓冲液在试剂2中的含量为10-100mM，优选缓冲液的含量为20-60mM。

本发明所述试剂3中的表面标记有25-羟基维生素D2和D3的聚苯乙烯胶乳颗粒的粒径为50-150nm，在试剂3中的终浓度为2mg/ml-10mg/ml；作为优选，所述试剂3中的聚苯乙烯胶乳颗粒的粒径为100-150nm，终浓度为2mg/ml-8mg/ml；作为进一步优选，所述试剂3中表面标记有25-羟基维生素D2和D3的聚苯乙烯胶乳颗粒的粒径为130nm，终浓度为4mg/ml。

本发明所述试剂3中的缓冲液为磷酸盐缓冲液，MES缓冲液，HEPES缓冲液，Tris-HCl缓冲液，MOPS缓冲液中的一种或者几种。

本发明试剂3是将表面标记有25-羟基维生素D2和D3的聚苯乙烯胶乳颗粒置于适当的缓冲液中，通过化学交联把25-羟基维生素D2和D3标记在带有羧基的聚苯乙烯胶乳颗粒表面；具体为：(1)活化25-羟基维生素D2和D3分子；(2)活化表面带有羧基的聚苯乙烯胶乳颗粒；(3)通过化学交联，把活化后的25-羟基维生素D2和D3标记在活化后的聚苯乙烯胶乳颗粒表面；25-羟基维生素D2和D3标记量为2.5μg-25μg/mg胶乳颗粒；作为优选，所述25-羟基维生素D2和D3标记量为2.5μg-15μg/mg胶乳颗粒。

本发明所述活化带有羧基的聚苯乙烯胶乳颗粒和活化25-羟基维生素D2和D3的试剂选自1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺、N-羟基丁二酰亚胺、2-吗啉乙磺酸中，半胱胺、溴代乙酸酐中的一种或多种。

本发明试剂盒中试剂1与试剂2和试剂3的容积比为1：1：1。

作为试剂盒的一部分，本发明中总25-羟维生素D检测试剂盒还包括校准品和质控品。校准品主要用于对本发明试剂盒的检测进行校准，质控品主要用于对本发明试剂盒检测准确度的确认。本发明试剂盒中包含的校准品和质控品为已知浓度的总25-羟基维生素D(包含25-羟基维生素D2和D3)，总25-羟基维生素D从人体中提取或化学合成。本领域技术人员根据国际参考物对本试剂盒的校准品和质控品进行赋值，并且采用本领域常用的方法自行制备适当浓度的校准品和质控品。

本发明总25-羟基维生素D检测试剂盒中包含的校准品分为已知总25-羟基维生素D浓度的缓冲液，总25-羟基维生素D的浓度分别为0ng/ml、8.75ng/ml、17.5ng/ml、35ng/ml、70ng/ml和140ng/ml。质控品为已知2个总25-羟基维生素D浓度的缓冲液，2个浓度分别为高浓度105.0ng/ml和低浓度15.0ng/ml；质控品和校准品可以为液体或者冻干粉末。

本发明试剂1为含有表面活性剂Tween-20的酸性缓冲液。由于25-羟基维生素D在人体血液中以游离和结合两种方式存在，那些结合在人体血液蛋白(如：白蛋白)上的25-羟基维生素D2和D3，其抗体结合位点和白蛋白结合后，形成封闭作用，不能再和试剂盒中的抗体结合，试剂盒检测不到这部分结合的25-羟基维生素D2和D3。为了检测的准确性，本发明试剂1提供了一种25-羟基维生素D2和D3与人体血液中蛋白的解离环境，通过血清样本以1；7比例稀释到试剂1，在37℃环境中孵育5分钟后，结合型25-羟基维生素D2和D3从血清蛋白中解离，形成游离状态，便于后续的检测。

本发明的优点和有益效果：

1.本发明中的总25-羟基维生素D检测试剂盒采用胶乳增强免疫比浊竞争法测定血清中总25-羟基维生素D含量，其原理是：经过试剂1解离作用后的血清样本和试剂2中的抗总25-羟基维生素D抗体反应，试剂2中过量的抗总25-羟基维生素D的抗体再和试剂3中表面标记总25-羟基维生素D的胶乳微粒反应，通过标记在胶乳表面的总25-羟基维生素D抗原和试剂2中过量抗体发生免疫反应后，形成聚集颗粒，在一定波长下，通过测定聚集物形成所产生的浊度，即可测出标本中被检物的含量。

2.进一步的，所述本发明中，样本中游离状态的总25-羟基维生素D与抗总25-羟基维生素D抗体结合，产生抗原抗体特异性反应，试剂2中过量的抗总25-羟基维生素D抗体再和表面标记有总25-羟基维生素D的胶乳颗粒产生特异性反应，促使胶乳颗粒形成聚集，在546nm波长处测定反应吸光度，对照校准曲线可求出血清样本中总25-羟基维生素D的含量。更进一步讲，本发明中的检测方法采用的是一种竞争法，区别与传统胶乳增强免疫比浊法。样本中总25-羟基维生素D的浓度与反应吸光度成反比。样本浓度越高，反应吸光度约低。因此，反应方向为向下反应。

3.本发明的胶乳增强免疫比浊法具有检测灵敏度高，稳定性好，检测速度快，试剂价格适中，可以配套开放式的全自动生化分析仪使用，实现在大中型医院或者基层医院开展批量检测。本发明检测试剂盒用来检测人体血液中总25-羟基维生素D的含量，并以此来辅助诊断由维生素D缺乏而引起的各种疾病，以及预防由于维生素D补充过量而可能引起的毒害作用。

附图说明

图1：为本发明总25-羟基维生素D检测试剂盒定标曲线。

图2：为本发明总25-羟基维生素D检测试剂盒与进口试剂盒检测相关性数据图。

图3：为本发明总25-羟基维生素D检测试剂盒实施例中开口稳定性实验数据图。

图4：为本发明总25-羟基维生素D检测试剂盒实施例中热稳定性实验数据图。

图5：为本发明总25-羟基维生素D检测试剂盒实施例中检测线性范围实验数据图。

具体实施方式

下面用具体实施例对本发明做进一步详细说明，但本发明不仅局限于以下具体实施例。

实施例1：试剂配制

1.试剂3的配制：

(1)用10mM，pH 6.0MES缓冲液稀释粒径为130nm的聚苯乙烯胶乳颗粒至在缓冲液中的浓度为4mg/mL；然后加入浓度为1mg/mL的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDAC)溶液，使EDAC在上述溶液体系中的终浓度达到100μg/mL，加入1mg/ml的N-羟基丁二酰亚胺(NHS)溶液，使NHS在上述溶液体系中的终浓度达到60μg/mL，25℃反应1h，反应结束后15000rpm离心40min，去上清液后，超声分散后再加入15mM、pH7.4的磷酸缓冲液，然后再加入浓度为1mg/ml的半胱胺溶液，使半胱胺在反应体系中的终浓度达到250ug/ml,25℃反应3h，反应结束后，15000rpm离心40min，去上清液后，然后加入15mM、pH7.4的磷酸缓冲液，超声分散后得到活化的聚苯乙烯胶乳悬浊液，置于4℃环境下，待用。

(2)用15mM、pH＝7.4的磷酸缓冲液，将25-羟基维生素D2和D3颗粒溶解至2mg/mL，再加入浓度为1mg/mL的溴代乙酸酐，使溴代乙酸酐在上述溶液体系中的终浓度达到100μg/mL，25℃搅拌反应5小时，反应结束后加入到步骤(1)制备活化的聚苯乙烯胶乳悬浊液中，25℃搅拌反应16小时，反应结束后15000rpm离心40min，去上清液，沉淀悬浮于20mM，pH7.4的磷酸缓冲液中，超声分散，重复上述离心和悬浮步骤一次，超声分散后，加入100mg/ml的甘氨酸溶液，至其终浓度为10mg/ml,25℃搅拌反应2h，15000rpm离心40min，去上清液，用50mMHEPES pH7.1+0.5％BSA+0.1％叠氮化钠储存液悬浮胶乳，并且超声分散。获得含有表面标记有25-羟基维生素D2和D3的聚苯乙烯胶乳颗粒的试剂3。试剂3制备完成后，4℃储存。

2、试剂2的配制：

试剂2为含有抗人25-羟基维生素D2和D3单克隆抗体的磷酸盐缓冲液，向该缓冲液中分别加入浓度为2.5mg/ml和4.2mg/ml的抗人25-羟基维生素D2和D3单克隆抗体溶液，使两种单克隆抗体溶液在上述溶液体系中的终浓度分别均达到0.5mg/ml。抗人25-羟基维生素D2和D3单克隆抗体来自于美国RayBiotech公司销售产品。

3、试剂1的配制：

试剂1为100mM柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液，向该缓冲液中分别加入Tween-20和Proclin-300。各组分的终浓度分别为0.4％(v/v)Tween-20和1mg/mL Proclin-300。向缓冲液里添加完各组分后，调节pH值到4.5。

3、总25-羟基维生素D试剂盒校准品制备：

含高浓度25-羟基维生素D血清，用相应的类似人血清基质的溶液(1mg/mL BSA，9mg/mL NaCl，15mM磷酸盐缓冲液pH 7.5)进行稀释和过滤除菌，所述的总25-羟基维生素D校准品中总25-羟基维生素D含量分别控制在8.75ng/ml、17.5ng/ml、35ng/ml、70ng/ml和140ng/ml这些校准品均为微黄色液体。以进口的总25-羟基维生素D试剂盒对照，分别对制备的校准品进行测定和调整，调整合适后分别检测20次，求出平均值达到校准品所要求的五个梯度的浓度，分别为8.75ng/ml、17.5ng/ml、35ng/ml、70ng/ml和140ng/ml。

实施例2：总25-羟基维生素D的检测方法

总25-羟基维生素D测定方法是两点终点法，检测波长分别为主波长546nm，副波长700nm。试剂1和试剂2和试剂3的用量都为70μl。样本用量为10μl；反应方向向下，测定温度为37℃。样本与试剂1混匀后，置37℃孵育5分钟，之后加入试剂2，置37℃孵育5分钟，之后再加入试剂3，反应10秒后即开始读点，反应5min后读取另一点。使用日立7180自动生化分析仪测得5种不同含量的总25-羟基维生素D校准品的校准曲线(如图1所示)，其中X轴为总25-羟基维生素D校准品浓度ng/ml，Y轴为反应吸光度。

实施例3：试剂性能指标检测

1、相关性实验

从市场上购买总25-羟基维生素D检测试剂盒和本发明试剂盒在日立7180全自动生化分析仪上按照各自设定的上机参数，对40份新鲜人血清(血清取自医院)进行检测，对测定值进行相关性分析，结果如图2所示，回归方程为：Y＝1.023X-2.762，相关系数R²＝0.975，结果表明本试剂与目前市场销售的试剂相关性好。

2、开口稳定性实验

从市场上购买总25-羟基维生素D纯品(高值，低值)(干粉)，依说明书的要求，复溶分管后储存于-20℃条件下，长期保存。对本发明试剂上机开口保存。进行30天开口稳定性检测实验。在第1天进行定标之后，不再进行重复定标。分别在第1、3、5、7、14、21、30天对纯品进行检测。检测结果如图3所示，本发明试剂测定随着天数的增加，测值偏差维持在5％之内。结果表明本试剂的开口至少能够稳定1个月，稳定性好。

3、热稳定性实验

从市场上购买总25-羟基维生素D纯品(高值，低值)(干粉)，依说明书的要求，复溶分管后储存于-20℃条件下，长期保存。第一天定标后，将本发明试剂闭口放置在37℃烘箱中保存。进行10天加速破坏性实验。分别在第1、3、5、7、9、11、13、15天测定纯品。检测结果如图4所示，本发明试剂在前15天测定值偏差在5％之内，第15天测值超过5％。结果表明本发明试剂至少在37℃环境中能保存13天。按照试剂保存在4℃条件下估算，试剂至少能够稳定18个月。稳定性好。

4、精密度实验

从市场上购买总25-羟基维生素D纯品(高值，低值)(干粉)，依说明书的要求，复溶分管后储存于-20℃条件下，长期保存。试剂定标后，一天内分别重复检测高值和低值纯品各20次，计算相对极差(CV％)为批内精密度。试剂第一天定标后，每天检测一次高值和低值，总共测定20天，计算相对极差(CV％)为日间精密度。如下表所示本发明检测试剂盒检测高，低值两个纯品的检测批内精密度分别为(2.8％和2.1％)，日间精密度分别为(3.0％和2.3％)，本发明试剂检测精明度好。

表1 批内精明度

	低值	高值
			测定次数	20	20
平均值(mg/L)	15.2	105.5
			最小值(mg/L)	13.9	102.2
最大值(mg/L)	16.1	107.3
			标准差(SD)	0.43	2.25
变异系数(CV％)	2.8％	2.1％

表2 日间精密度

	低值	高值
			测定天数	20	20
平均值(mg/L)	15.9	103.2
			最小值(mg/L)	13.9	101.6
最大值(mg/L)	16.4	106.5
			标准差(SD)	0.48	2.38
变异系数(CV％)	3.0％	2.3％

5、试剂盒检测线性检测

取高浓度样本(120ng/mL)和低浓度样本(15ng/mL)按不同比例混合配制出不同浓度的样本用于线性实验，见表3。

表3：线性实验各浓度样本配制方法

水平1	1000μl低浓度样本+0μl高浓度样本
		水平2	990μl低浓度样本+10μl高浓度样本
水平3	950μl低浓度样本+50μl高浓度样本
		水平4	900μl低浓度样本+100μl高浓度样本
水平5	500μl低浓度样本+500μl高浓度样本
		水平6	50μl低浓度样本+950μl高浓度样本
水平7	0μl低浓度样本+1000μl高浓度样本

按照上述方法，配制出来的7份样本的理论浓度分别为15，16.05，20.25，25.5，67.5，114.75和120μg/L，再加上生理盐水为0μg/L，一共8个不同浓度的样本用于线性实验。

表4：本发明试剂盒线性分析实验结果

如图5所示，回归方程为Y(理论值)＝1.035x(真实值)-0.342，R²＝0.999.本发明检测试剂盒的线性范围可达120ng/mL.

以上仅是本发明的特征实施范例，对本发明保护范围不构成任何限制。凡采用同等交换或者等效替换而形成的技术方案，均落在本发明权利保护范围之内。

Claims (6)

1.一种总25-羟基维生素D检测试剂盒，其特征在于:包括试剂1、试剂2和试剂3，所述试剂1是含有表面活性剂的酸性解离液；所述试剂2由含有抗人25-羟基维生素D2和D3抗体置于适当的缓冲液中构成；所述试剂3是表面标记有25-羟基维生素D2和D3的聚苯乙烯胶乳颗粒置于适当的缓冲液中构成；

所述的试剂1由以下组分组成：10-100mM、pH4.0-6.0的柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液，0.05-0.5％Tween20，1mg/mLProclin-300；所述的0.05-0.5％Tween20为Tween20在试剂1中的体积百分含量；

试剂2中的抗人25-羟维生素D2和D3抗体为多克隆抗体或单克隆抗体，其中多克隆抗体源自兔、羊或鸡，单克隆抗体源自鼠或兔；所述的抗人25-羟基维生素D2和D3抗体在试剂2中的终浓度为0.1-1mg/ml；

试剂3中聚苯乙烯胶乳颗粒的粒径为50-150nm，含量为2mg/ml-10mg/ml。

2.根据权利要求1所述的总25-羟基维生素D检测试剂盒，其特征在于：试剂2中的缓冲液为磷酸盐缓冲液，HEPES缓冲液，Tris-HCl缓冲液，MOPS缓冲液中的一种或者几种；缓冲液在试剂2中的含量为10-100mM。

3.根据权利要求1所述的总25-羟基维生素D检测试剂盒，其特征在于：试剂3是通过化学交联把25-羟基维生素D2和D3标记在带有羧基的聚苯乙烯胶乳颗粒表面；具体为：(1)活化25-羟基维生素D2和D3分子；(2)活化表面带有羧基的聚苯乙烯胶乳颗粒；(3)通过化学交联，把活化后的25-羟基维生素D2和D3标记在活化后的聚苯乙烯胶乳颗粒表面；25-羟基维生素D2和D3标记量为2.5μg/mg -25μg/mg胶乳颗粒。

4.根据权利要求3所述的总25-羟基维生素D检测试剂盒，其特征在于：所述活化表面带有羧基的聚苯乙烯胶乳颗粒和活化25-羟基维生素D2和D3的试剂选自1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺、N-羟基丁二酰亚胺、2-吗啉乙磺酸中，半胱胺、溴代乙酸酐中的一种或多种。

5.根据权利要求1所述的总25-羟基维生素D检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒还包括校准品和质控品；校准品主要用于对本发明试剂盒的检测进行校准，质控品主要用于对本发明试剂盒检测准确度的确认；包含的校准品和质控品为已知浓度的总25-羟基维生素D，总25-羟基维生素D从人体中提取或化学合成。

6.根据权利要求5所述的总25-羟基维生素D检测试剂盒，其特征在于：包含的校准品分为已知总25-羟基维生素D浓度的缓冲液，总25-羟基维生素D的浓度分别为0ng/ml、8.75ng/ml、17.5ng/ml、35ng/ml、70ng/ml和140ng/ml；质控品为已知2个总25-羟基维生素D浓度的缓冲液，2个浓度分别为高浓度105.0ng/ml和低浓度15.0ng/ml；质控品和校准品为液体或者冻干粉末。