CN106199015A - 用于血清样品检测的维生素d释放剂、制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于血清样品检测的维生素D释放剂，其能解决国产25‑羟基维生素D检测试剂盒精度低于市场上一流进口试剂盒的关键技术问题，本发明还提供了维生素D释放剂的制备方法及其在血清中25‑羟基维生素D含量检测中的应用。按照重量体积比计，该维生素D释放剂包括：全氟辛酸0.2%~0.5%，二甲亚砜0.1%~0.5%，乙二醇0.1%~0.5%，乙醇0.01%~0.1%，剩余为0.05M Tris‑HCl缓冲液。

Description

用于血清样品检测的维生素D释放剂、制备方法及应用
技术领域
本发明涉及体外诊断技术领域，具体涉及用于血清样品检测的维生素D释放剂、制备方法及应用。
背景技术
维生素D（Vitamin D,VD）是一类7脱氢菲胆固醇类衍生物，是人体内进行新陈代谢不可缺少的营养物质。其经典作用途径为：通过调节人体内的骨钙代谢和血磷代谢，促进人体内骨骼生长；作为人体细胞内维生素D受体的配体；还直接参与人体细胞的分化和免疫功能的调节。因此，人体内维生素D的营养状况，直接关系到人体新陈代谢的平衡，影响着人体健康。
维生素D主要有维生素D2与D3两种形式。维生素D2是由紫外线照射植物中的麦角固醇产生，但在自然界存量很少；维生素D3则由人体表皮和真皮内含有的7-脱氢胆固醇经日光中紫外线照射转变而成。维生素D2和维生素D3对人体的作用和作用机制完全相同，但维生素D3的生理活性强于维生素D2。维生素D在肝脏和肾脏转化成为有生物活性的25-羟基维生素D和1,25-二羟基维生素D。由于在循环（24小时）中，维生素D、1,25-二羟基维生素D相较于25-羟基维生素D具有较短的生物半衰期以及具有较大的波动浓度存在，因此，通过检测25-羟基维生素D（包括25-羟基维生素D2与25-羟基维生素D 3）来评估人体维生素D水平。
血清中88%左右的25-羟基维生素D与维生素D结合蛋白(DBP)结合，12%左右的与白蛋白结合。维生素D结合蛋白是血清浓度为250mg/L~400mg/L的浓度丰富的蛋白。25-羟基维生素D以接近抗体亲合力的相对高亲合与DBP结合。精确测量血清中25-羟基维生素D的度，首先需要将其从DBP上释放出来。
意大利的索灵公司一直是业界维生素D检测的领导者，其产品25-羟基维生素D检测试剂盒在国内外应用多年，广受好评，被国内的广大试剂盒公司作为主流标准采纳。维生素D释放剂是检测试剂盒的重要组成部分，采用国产维生素D释放剂处理血清后，25-维生素D的检测精度往往低于索灵公司的25-羟基维生素D检测试剂盒的检测精度。因此，如何改良国产维生素D释放剂以使得25-羟基维生素D检测精度达到主流标准一直是业内亟待解决的问题。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了用于血清样品检测的维生素D释放剂，其能解决国产维生素D释放剂处理血清后检测精度低于市场上一流进口试剂盒的关键技术问题，本发明还提供了该维生素D释放剂的制备方法，及其应用。
其技术方案是这样的，用于血清样品检测的维生素D释放剂，按照重量体积比计，包括：全氟辛酸0.2%~0.5% ，二甲亚砜 0.1%~0.5%，乙二醇0.1%~0.5%，乙醇0.01%~0.1%，剩余为0.05M Tris-Hcl缓冲液。
进一步的，所述维生素D释放剂包括全氟辛酸0.3%，二甲亚砜0.2%，乙二醇0.15%，乙醇0.05%，0.05M Tris-Hcl缓冲液99.3%。
进一步的，所述维生素D释放剂的pH值为7.0。
本发明还提供了上述维生素D释放剂的制备方法如下：按照配比，首先将称取的全氟辛酸完全溶解于二甲亚砜中，然后转入pH=8.3的0.05M Tris-Hcl缓冲液中，再加入乙二醇和乙醇，待完全溶解后，最后用pH=8.3的0.05M Tris-Hcl缓冲液定容。调PH至7.0。
本发明还提供了上述维生素D释放剂在血清中25-羟基维生素D含量检测中的应用。
进一步的，所述血清中25-羟基维生素D含量检测包括如下步骤：
（a）向包被了25-羟基维生素D抗体的包被板孔中加入血清样本和维生素D释放剂，震荡孵育；
（b）向包被板孔中加入维生素D功能标记物，震荡反应；
（c）向包被板孔中加入化学发光底物，测量相对发光强度（RLU）；根据不同浓度的25-羟基维生素D标准品的相对发光强度值绘制的标准曲线计算血清样品中的25-羟基维生素D浓度。
更进一步的，所述维生素D功能标记物为链酶亲和素标记的辣根过氧化物酶与生物素化维生素D的结合物；所述化学发光底物包括鲁米诺和双氧水。
经实验证实，采用本发明的上述维生素D释放剂及检测方法，与索灵公司的25-羟基维生素D检测试剂盒相比，两者25-维生素D的释放水平相近并且检测的一致性较好，进而达到提高25-维生素D检测精度的目的。
附图说明
图1为释放剂4与索灵公司试剂盒的释放效果比较关系图。
具体实施方式
以下实施例中，除特别注明外，所使用的原料均市售可得。
实施例1
（1）释放剂1~4的制备
按照重量体积比计，释放剂1~4的组分及配比如表1所示：
表1
制备方法如下：按照上述释放剂1~4的配比，首先将称取全氟辛酸完全溶解于二甲亚砜中，然后转入pH=8.3的0.05M Tris-Hcl缓冲液中，再加入乙二醇和乙醇，待完全溶解后，最后用pH=8.3的0.05M Tris-Hcl缓冲液定容。调PH至7.0。
（2）检测一
取1份血清质控品，按照以下方法对血清质控品的25-羟基维生素D浓度进行10次重复检测：
释放剂1~4的实验组：取30µl血清样品加入到包被了25-羟基维生素D抗体的化学发光板孔中，再加入100µl相应的释放剂1~4，室温（25℃±5℃），一同震荡孵育120分钟；洗板；在加入维生素D功能标记物，即链酶亲和素标记的辣根过氧化物酶与生物素化维生素D的结合物，震荡反应30分钟，使血清样本中释放出来的25-羟基维生素D与维生素D功能标记物竞争性与25-羟基维生素D抗体结合；洗板；加入化鲁米诺学发光底物（郑州博赛生物技术有限公司，反应A液主要包括鲁米诺，反应B液主要包括双氧水），使用化学发光免疫分析仪读取相对发光强度（RLU）；应用数学模型对结果进行分析，根据已知不同浓度的25-羟基维生素D标准品的RLU值绘制标准曲线，通过曲线计算血清样品中的25-羟基维生素D浓度。
其中，25-羟基维生素D抗体的制备参考文献Hollis,Clin.Chem31/11,1815-1819(1985)；Hollis,Clin.Chem39/3,529-533(1993)；或参考文献万巍巍，张换敬等，细胞与分子免疫学杂志，2011，27（11），1173~1175，1179；
链酶亲和素标记的辣根过氧化物酶与生物素化维生素D的结合物制备过程如下，将链酶亲和素标记的辣根过氧化物酶溶液和生物素化维生素D溶液混合反映1.5小时，即得到该结合物。
对照：血清样品使用25-羟基维生素D检测试剂（来源自意大利索灵公司，国食药监械(进)字2011第2402777号）进行检测。
释放测量结果如表2所示：
表2
表1的释放测量结果表明，释放剂1~4的25-羟基维生素D释放水平均接近意大利索灵公司的25-羟基维生素D检测试剂盒所能达到释放水平，其中释放剂4最为接近，为最优释放剂。
（3）检测二
取110份临床血清样品(来源自无锡市妇幼保健院)，按照（2）检测一中的方法对临床血清样品中的25-羟基维生素D浓度进行检测。其中实验组采用释放剂4处理，对照组采用索灵公司的25-羟基维生素D检测试剂。
如图1所示，索灵公司的试剂盒的释放测量结果（x）与释放剂4的释放测量结果（y）的线性回归方程为y=1.0517x-0.706，相关系数为R2=0.9459。结果表明采用本发明的释放剂4处理后的样品与对照具有较好的一致性，能够很好地应用于血清样品的25-羟基维生素D的检测，具有广泛的应用前景。

Claims (7)

1.用于血清样品检测的维生素D的释放剂，按照重量体积比计，包括：全氟辛酸0.2%~0.5% ，二甲亚砜 0.1%~0.5%，乙二醇0.1%~0.5%，乙醇0.01%~0.1%，剩余为0.05M Tris-Hcl缓冲液。
2.根据权利要求1所述的用于血清样品检测的维生素D释放剂，其特征在于：所述维生素D释放剂包括全氟辛酸0.3%，二甲亚砜0.2%，乙二醇0.15%，乙醇0.05%，0.05M Tris-Hcl缓冲液99.3%。
3.根据权利要求2所述的用于血清样品检测的维生素D释放剂，其特征在于：所述维生素D释放剂的pH值为7.0。
4.权利要求1~3中任一所述的维生素D释放剂的制备方法，按照配比，首先将称取的全氟辛酸完全溶解于二甲亚砜中，然后转入pH=8.3的0.05M Tris-Hcl缓冲液中，再加入乙二醇和乙醇，待完全溶解后，最后用pH=8.3的0.05M Tris-Hcl缓冲液定容，调PH到7.0。
5.权利要求1~3中任一所述的维生素D释放剂在血清中25-羟基维生素D含量检测中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述血清中25-羟基维生素D含量检测包括如下步骤：
（a）向包被了25-羟基维生素D抗体的包被板孔中加入血清样本和维生素D释放剂，震荡孵育；
（b）向包被板孔中加入维生素D功能标记物，震荡反应；
（c）向包被板孔中加入化学发光底物，测量相对发光强度（RLU）；根据不同浓度的25-羟基维生素D标准品的相对发光强度值绘制的标准曲线计算血清样品中的25-羟基维生素D浓度。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述维生素D功能标记物为链酶亲和素标记的辣根过氧化物酶与生物素化维生素D的结合物；所述化学发光底物包括鲁米诺和双氧水。
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