CN108467888A - 关键维生素d代谢相关基因遗传多态组合及用途 - Google Patents

关键维生素d代谢相关基因遗传多态组合及用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及关键维生素D代谢相关基因遗传多态组合及用途。具体而言，本发明提供一种检测试剂盒，所述检测试剂盒含有：(1)检测对象血中总25(OH)D3水平的试剂；和(2)检测对象DBP单体型的试剂；和任选的(3)检测对象以下遗传变异位点的试剂：rs10741657、rs7968585、rs12512631、rs2296241、rs6013897、rs2209314和rs4809958；和任选的(4)用于实施各检测所需的器具，包括但不限于一次性的采血器具和容器。本发明的检测试剂盒可用于分析、判断对象是否为维生素D缺乏，以及用于确定对象服用30万国际单位的维生素D的服药方案。

Description

关键维生素D代谢相关基因遗传多态组合及用途
技术领域
本发明涉及关键维生素D代谢相关基因遗传多态组合及用途。
背景技术
维生素D为固醇类衍生物，是一种脂溶性维生素，具有抗佝偻病作用。维生素D有五种化合物，对健康关系较密切的是维生素D2和维生素D3，它们有以下三点特性：它存在于部分天然食物中；人体皮下储存有从胆固醇生成的7-脱氢胆固醇，受紫外线的照射后，可转变为维生素D3。
从食物中得来的维生素D与脂肪一起吸收。当维生素D运到肝脏中，在微粒体中经单氧酶系统作用，其25位被羟基化，形成25(OH)D，肝外的其他组织也可吸取维生素D及25(OH)D。
维生素D缺乏会导致少儿佝偻病和成年人的软骨病。佝偻病多发于婴幼儿，主要表现为神经精神症状和骨骼的变化。神经精神症状上表现为多汗、夜惊、易激惹。维生素D主要用于组成和维持骨骼的强壮。它被用来防治儿童的佝偻病和成人的软骨症，关节痛等等。患有骨质疏松症的人通过添加合适的维生素D和镁可以有效的提高钙离子的吸收度。
临床上发现，不同个体对维生素D的补充效果存在差异。因此，本领域仍需要可以临床指导对患者实行更为精准有效的维生素D补充干预的方法。
发明内容
本发明第一方面提供一种检测试剂盒，所述检测试剂盒含有：
(1)检测对象血中总25(OH)D3水平的试剂；和
(2)检测对象DBP单体型的试剂。
在一个或多个实施方案中，所述检测试剂盒还含有：
(3)检测对象以下遗传变异位点的试剂：rs10741657、rs7968585、rs12512631、rs2296241、rs6013897、rs2209314和rs4809958。
在一个或多个实施方案中，(2)所述的检测对象DBP单体型的试剂为检测对象rs7041和rs4588的试剂。
在一个或多个实施方案中，(2)所述的DBP单体型为Gc1s、Gc1f或Gc2。
在一个或多个实施方案中，所述Gc1s单体型的基因型为rs7041G和rs4588C，Gc1f单体型的基因型为rs7041T和rs4588C，Gc2单体型的基因型为rs7041T和rs4588A。
在一个或多个实施方案中，所述检测试剂盒还包括用于实施各检测所需的器具，包括但不限于一次性的采血器具和容器。
在一个或多个实施方案中，所述检测试剂盒用于分析、判断对象是否为维生素D缺乏。
在一个或多个实施方案中，所述检测试剂盒还用于确定对象服用30万国际单位的维生素D的服药方案。
本发明第二方面提供药盒，所述药盒含有2剂以上维生素D药剂，其中，每剂维生素D药剂含有30万国际单位(IU)的维生素D。
本发明第三方面提供以下试剂在制备检测试剂盒中的应用：
(1)检测对象血中总25(OH)D3水平的试剂；和
(2)检测对象DBP单体型的试剂。
在一个或多个实施方案中，所述检测试剂盒还含有：
(3)检测对象以下遗传变异位点的试剂：rs10741657、rs7968585、rs12512631、rs2296241、rs6013897、rs2209314和rs4809958。
在一个或多个实施方案中，(2)所述的检测对象DBP单体型的试剂为检测对象rs7041和rs4588的试剂。
在一个或多个实施方案中，(2)所述的DBP单体型为Gc1s、Gc1f或Gc2。
在一个或多个实施方案中，所述Gc1s单体型的基因型为rs7041G和rs4588C，Gc1f单体型的基因型为rs7041T和rs4588C，Gc2单体型的基因型为rs7041T和rs4588A。
在一个或多个实施方案中，所述检测试剂盒还包括用于实施各检测所需的器具，包括但不限于一次性的采血器具和容器。
在一个或多个实施方案中，所述检测试剂盒用于分析、判断对象是否为维生素D缺乏。
在一个或多个实施方案中，采用以下方法判定对象是否为维生素D缺乏：
根据对象血中总25(OH)D3水平结合该对象的DBP单体型计算出该对象血中生物活性25(OH)D3水平；若由此计算得到的对象血中生物活性25(OH)D3水平小于5ng/ml，则认为该对象维生素D缺乏。
在一个或多个实施方案中，所述检测试剂盒还用于确定对象每次服用30万国际单位的维生素D的服药方案。
在一个或多个实施方案中，采用以下式子测算该对象服用高剂量维生素D之后相应天数时血液中总的25(OH)D3水平：
第1天：Y＝71.70+1.15X1-0.67X4+10.72X5+6.38X7+6.66X14；
第2天：Y＝69.81+1.26X1-0.79X4+9.85X5+6.16X14；
第3天：Y＝105.93+1.18X1-13.48X2-0.90X4+7.06X5+6.38X7+6.22X14；
第7天：Y＝121.70+1.13X1-2.86X3-0.38X4+8.79X10-10.77X12+6.22X14；
第28天：Y＝75.55+0.95X1-11.87X2-0.46X4+7.49X5+6.53X9；
第56天：Y＝46.90+0.71X1-1.23X3+4.70X10-7.24X12+4.50X13；
第84天：Y＝17.64+0.56X1+5.40X5-4.29X6；
第112天：Y＝8.24+0.56X1+3.89X5-3.78X6-4.17X12+4.04X13；
上述式子中：
Y＝总25(OH)D3水平；
X1＝基线25(OH)D3(以1ng/mL计)；
X2＝性别(男性赋值为0，女性赋值为1)；
X3＝年龄(岁)；
X4＝体重(千克)；
X5＝rs10741657(CYP2R1,AA+GA vs.GG)；
X6＝rs7968585(VDR,TT+CT vs.CC)；
X7＝rs12512631(GC,CC+CT vs.TT)；
X9＝rs7041(GC,GG+TG vs.TT)；
X10＝rs2296241(CYP24A1,TT+CT vs.CC)；
X12＝rs6013897(CYP24A1,AA+TA vs.TT)；
X13＝rs2209314(CYP24A1,AA+AG vs.GG)；
X14＝rs4809958(CYP24A1,CC+AC vs.AA)。
并以天数为横坐标、Y值为纵坐标绘制曲线；
其中，当根据曲线测算得到该对象在某日之后其血液中25(OH)D3水平低于50nmol/L时，可得出该对象应在该日或该日前一天或数天服用所述剂量的维生素D的结论。
本发明第四方面提供一种确定对象维生素D服药方案的方法，其中所述服药方案为每次30万国际单位的维生素D，所述方法包括：
(1)检测对象血中总25(OH)D3水平；
(2)检测对象DBP单体型；
(3)根据(1)所获得的总25(OH)D3水平结合(2)所获得的DBP单体型计算出该对象血中生物活性25(OH)D3水平；若由此计算得到的对象血中生物活性25(OH)D3水平小于5ng/ml，则认为该对象维生素D缺乏，可每次服用30万国际单位的维生素D；和
(4)检测对象以下遗传变异位点的试剂：rs10741657、rs7968585、rs12512631、rs2296241、rs6013897、rs2209314和rs4809958，并采用以下式子测算该对象服用高剂量维生素D之后相应天数时血液中总的25(OH)D3水平：
第1天：Y＝71.70+1.15X1-0.67X4+10.72X5+6.38X7+6.66X14；
第2天：Y＝69.81+1.26X1-0.79X4+9.85X5+6.16X14；
第3天：Y＝105.93+1.18X1-13.48X2-0.90X4+7.06X5+6.38X7+6.22X14；
第7天：Y＝121.70+1.13X1-2.86X3-0.38X4+8.79X10-10.77X12+6.22X14；
第28天：Y＝75.55+0.95X1-11.87X2-0.46X4+7.49X5+6.53X9；
第56天：Y＝46.90+0.71X1-1.23X3+4.70X10-7.24X12+4.50X13；
第84天：Y＝17.64+0.56X1+5.40X5-4.29X6；
第112天：Y＝8.24+0.56X1+3.89X5-3.78X6-4.17X12+4.04X13；
上述式子中：
Y＝总25(OH)D3水平；
X1＝基线25(OH)D3(以1ng/mL计)；
X2＝性别(男性赋值为0，女性赋值为1)；
X3＝年龄(岁)；
X4＝体重(千克)；
X5＝rs10741657(CYP2R1,AA+GA vs.GG)；
X6＝rs7968585(VDR,TT+CT vs.CC)；
X7＝rs12512631(GC,CC+CT vs.TT)；
X9＝rs7041(GC,GG+TG vs.TT)；
X10＝rs2296241(CYP24A1,TT+CT vs.CC)；
X12＝rs6013897(CYP24A1,AA+TA vs.TT)；
X13＝rs2209314(CYP24A1,AA+AG vs.GG)；
X14＝rs4809958(CYP24A1,CC+AC vs.AA)。
并以天数为横坐标、Y值为纵坐标绘制曲线；
其中，当根据曲线测算得到该对象在某日之后其血液中25(OH)D3水平低于50nmol/L时，可得出该对象应在该日或该日前一天或数天服用所述剂量的维生素D的结论。
附图说明
图1：口服300,000IU维生素，对受试者体内25(OH)D3进行动态观察，在第0、1、2、3、7、28、56、84和112天维生素D体内代谢的动态监测值结果。
图2：两个遗传多态位点与维生素D结合蛋白的含量，循环血中总的维生素D以及活性形式维生素D高度相关。其中，图a、b、c分别代表受试者以rs4588位点的不同基因型GG、TG、TT进行分组所得的各组维生素D结合蛋白、总维生素D、生物可利用维生素D的体内含量(均值±标准差)，同时组间比较可知GG组这三个指标均高于TG组和TT组，P<0.05，具有统计学差异。图d、e、f分别代表受试者以rs4588位点的不同基因型TT、GT、GG进行分组所得的各组维生素D结合蛋白、总维生素D、生物可利用维生素D的体内含量(均值±标准差)，同时组间比较可知维生素D结合蛋白和总维生素D这两个指标TT组要低于GT和GG；生物可利用维生素DTT组要高于GT和GG，P<0.05，具有统计学差异。
图3：活性形式维生素D、骨密度及骨代谢相关生物标记物之间的相关性研究结果。圆形面积越大表示相关性更强，正值代表正相关，负值代表负相关。
图4：维生素D结合蛋白与血液中总维生素D成正相关，与活性形式维生素D成负相关。其中，图a代表维生素D结合蛋白与血液中总维生素D成正相关，Y＝0.011X+18.14，随着维生素D结合蛋白含量的增加，血液中总维生素D含量增加，p<0.05，具有统计学差异；图b代表维生素D结合蛋白与活性形式维生素D成负相关，Y＝-0.014X+6.375，随着维生素D结合蛋白含量的增加，血液中活性形式维生素D含量减少，p<0.05，具有统计学差异。
图5：生物活性维生素D与骨密度线性相关，具有统计学差异(p<0.05)。其中，图a代表血液中总维生素D与骨密度没有相关性，p>0.05；图b代表活性形式维生素D与骨密度呈线性相关，Y＝0.0059X+0.8802，随着活性形式维生素D含量增加，骨密度增加，具有统计学差异(p<0.05)。
具体实施方式
本发明发现，不同个体的遗传变异对维生素D补充后的体内25(OH)D的水平具有显著的影响，由此完成本发明。
具体而言，本发明的目的是判断某个个体是否适合于补充高剂量的维生素D，以及在补充完高剂量的维生素D之后，需要在何时服用后续高剂量的维生素D。本发明中，高剂量的维生素D通常为每剂或每次30万国际单位(IU)的维生素。
本发明发现，某个个体是否适于补充高剂量的维生素D，以及在补充完高剂量的维生素D之后，需要在何时服用后续高剂量的维生素D，与该个体血中总25(OH)D水平、年龄、性别、体重，以及数个遗传变异位点等因素有关。这些遗传变异位点包括：rs10741657、rs7968585、rs12512631、rs7041、rs2296241、rs6013897、rs2209314和rs4809958。通常，可根据以下式子测算该个体服用高剂量维生素D之后相应天数时血液中总的25(OH)D3水平：
第1天：Y＝71.70+1.15X1-0.67X4+10.72X5+6.38X7+6.66X14；
第2天：Y＝69.81+1.26X1-0.79X4+9.85X5+6.16X14；
第3天：Y＝105.93+1.18X1-13.48X2-0.90X4+7.06X5+6.38X7+6.22X14；
第7天：Y＝121.70+1.13X1-2.86X3-0.38X4+8.79X10-10.77X12+6.22X14；
第28天：Y＝75.55+0.95X1-11.87X2-0.46X4+7.49X5+6.53X9；
第56天：Y＝46.90+0.71X1-1.23X3+4.70X10-7.24X12+4.50X13；
第84天：Y＝17.64+0.56X1+5.40X5-4.29X6；
第112天：Y＝8.24+0.56X1+3.89X5-3.78X6-4.17X12+4.04X13；
上述式子中：
Y＝总25(OH)D3水平；
X1＝基线25(OH)D3(以1ng/mL计)；
X2＝性别(男性赋值为0，女性赋值为1)；
X3＝年龄(岁)；
X4＝体重(千克)；
X5＝rs10741657(CYP2R1，AA+GA vs.GG)；
X6＝rs7968585(VDR，TT+CT vs.CC)；
X7＝rs12512631(GC，CC+CT vs.TT)；
X9＝rs7041(GC，GG+TG vs.TT)；
X10＝rs2296241(CYP24A1，TT+CT vs.CC)；
X12＝rs6013897(CYP24A1，AA+TA vs.TT)；
X13＝rs2209314(CYP24A1，AA+AG vs.GG)；
X14＝rs4809958(CYP24A1，CC+AC vs.AA)；
X5-X14中，遗传多态性的赋值对应于1+1vs 0(例如，以X5为例，当为AA或GA时，赋值为1，当为GG时，赋值为0)。
可将计算得到的Y值与相应的时间绘制曲线，可由该曲线判断个体在服用高剂量维生素D后在某个时间(天)时血液中总25(OH)D3水平，从而判断该个体何时将出现维生素D缺乏。图1示出了实测的血液中总25(OH)D3水平曲线，从图中可以看出，在服用30万IU的维生素D后，血清中25(OH)D3水平逐渐增高，于约3天达到最高值，之后血清中25(OH)D3水平逐渐下降，在第30天左右血清中25(OH)D3水平下降到50nmol/L以下。
本文根据美国医药研究所内分泌学会推荐的通用标准判断个体是否处于维生素D缺乏，具体而言，血中25(OH)D3<25nmol/L为严重缺乏，<50nmol/L为缺乏；50-75nmol/L为不足，≥75nmol/L为充足。因此，当根据曲线测算得到个体在某日之后其血液中25(OH)D3水平低于50nmol/L时，可得出该个体应在该日或该日前一天或数天继续服用本发明所述的高剂量维生素D的结论。
通常，在实施本发明方法时，先确定哪些个体需要服用高剂量的维生素D。可先通过检测血中总25(OH)D3水平来初步确定维生素D处于不足或缺乏水平线以下的潜在受试对象；接着通过检测影响血中生物活性25(OH)D3水平的维生素D结合蛋白(DBP)上的两个遗传多态位点SNP(rs7041、rs4588)来精确的选择出生物活性25(OH)D3水平偏低(“缺乏”)的人群作为推荐补充人群。例如，对于中国人，较为常见的DBP单体型为Gc1s、Gc1f和Gc2，这三种单体型对应的不同维生素D亲和常数分别为KGc1s＝0.6*109、KGc1f＝1.12*109和KGc2＝0.36*109，据此计算得到不同的生物活性25(OH)D3水平。DBP单体型的区分方法通过探针法检测并加以区分，其中Gc1s单体型的基因型为rs7041G和rs4588C，Gc1f单体型的基因型为rs7041T和rs4588C，Gc2单体型的基因型为rs7041T和rs4588A。
之后可通过个体血中总25(OH)D3水平结合该个体的单体型来计算出该个体血中生物活性25(OH)D3水平CBio D。可根据以下公式进行计算：
CBio D＝CDFree+CDAlb＝(Kalb×CAlb+1)×CDFree
式中，
CDFree＝游离形式维生素D浓度；
CDAlb＝与白蛋白结合的25(OH)D的浓度；
Kalb＝25(OH)D与白蛋白亲和常数，为6×105M-1；
CAlb＝白蛋白浓度；
其中，
ax2+bx+c＝0
式中，a＝KDBP×Kalb×CAlb+KDBP；
b＝KDBP×CTotal DBP－KDBP×CTotal D+Kalb×CAlb+1；
c＝-CTotal D；
KDBP1S＝25(OH)D与维生素D结合蛋白亲和常数(Gc1S型)，为0.6*109M-1；
KDBP1F＝25(OH)D与维生素D结合蛋白亲和常数(Gc1F型)，为1.12*109M-1；
KDBP2＝25(OH)D与维生素D结合蛋白亲和常数(Gc2型)，为0.36*109M-1；
CTotal DBP＝维生素D结合蛋白浓度；
CTotal D＝总维生素D浓度＝CDAlb+CDDBP+CDFree；和
CDDBP＝与维生素D结合蛋白结合的25(OH)D的浓度。
通常，若采用上述方法计算得到的个体血中生物活性25(OH)D3水平小于5ng/ml，则认为该个体维生素D水平缺乏，对于这种情况建议考虑采用本发明所述的方法补充维生素D。
当确定好可以按照本发明方法补充高剂量维生素D后，可根据前文所述进一步检测该个体的rs10741657、rs7968585、rs12512631、rs2296241、rs6013897、rs220，9314和rs4809958，计算相应天数时的Y值，绘制曲线，从而确定该个体服用高剂量维生素D的方案。
因此，本发明也包括在分析、判断个体是否需要采用本发明方法补充维生素D，以及采取何种服药方案补充维生素D时所用到的各种检测试剂和/或检测试剂盒。这些检测试剂尤其包括检测对象DBP单体型的试剂，具体为检测rs7041和rs4588的试剂，例如引物(如SEQ ID NO:9和10)和/或探针；以及检测对象以下遗传变异位点的试剂，如引物和/或探针：rs10741657、rs7968585、rs12512631、rs2296241、rs6013897、rs2209314和rs4809958，如SEQ ID NO:3－8和11－18。检测试剂还包括检测对象血中总25(OH)D3水平的试剂。本发明的检测试剂盒中至少包括检测对象DBP单体型的试剂，如引物(如SEQ ID NO:9和10)和/或探针；还可进一步包括检测对象血中总25(OH)D3水平的试剂和/或检测对象以下遗传变异位点中的一种或多种的试剂，如引物和/或探针：rs10741657、rs7968585、rs12512631、rs2296241、rs6013897、rs2209314和rs4809958，如SEQ ID NO:3－8和11－18。本发明的检测试剂盒中还可包括用于实施各检测所需的器具，包括但不限于一次性的采血器具和容器等。
下文将以具体实施例的方式阐述本发明。应理解，这些实施例仅仅是阐述性的，并非限制本发明。实施例中所用到的方法和材料，除非另有说明，否则为本领域常规的方法和材料。此外，本文中，“受试者”和“对象”可互换使用。
一、实验方法
基因多态性位点可以通过Sanger法测序和Taqman探针技术来检测实现。
血液中总25(OH)D通过质谱法来检测。
体内活性形式维生素D含量的计算参考：Powe CE、Evans MK、Wenger J、ZondermanAB和Berg AH等，2013，Vitamin D-Binding Protein and Vitamin D Status of BlackAmericans and White Americans，New England Journal of Medicine 369：1991-2000。
二、实验步骤
1.1 单次口服补充高剂量维生素D3实验设计及流程
1.1.1 志愿者招募及研究设计
2013年本发明人开展了单次口服维生素D3在中国健康受试者中的药动学和药效学研究。采用单剂量、开放设计纳入30例中国健康青年受试者(男女各15例，年龄25～35岁)，进行单次口服补充高剂量维生素D3的人体药动学和药效学特征及安全性研究。受试者在研究人员的监护下一次性口服维生素D3补充剂一瓶(含300,000IU维生素D3)。单次口服干预之后受试者在整个研究过程中将不再服用且不建议自行服用任何含有维生素D的补充剂。在干预及随访受试者5个月后，项目结束。实验过程中分别在0，1，2，3，7，14，28，56，84，112，140天对受试者采集空腹血液和尿液样本。
志愿者的纳入和排除标准
纳入：a.年龄25～35岁；
b.体重指数BMI在正常范围18-25kg/m2；
c.体内维生素D缺乏或不足(总25(OH)D<30ng/mL)
排除：a.临床诊断有心血管系统、消化系统或心理疾病；
b.在近六个月时间里使用过任何含维生素D和钙剂的膳食补充剂；
c.严重贫血患者(血红蛋白浓度<70g/L)；
d.血清总25(OH)D≥30ng/mL；
e.在近3个月时间里参与了其他临床研究；
f.有药物成瘾或药物滥用使；
g.有酗酒或吸烟史(每周超过14杯，每杯相当于360mL啤酒，150mL白酒或45mL烈酒)；
h.体检血液生化，血液常规，尿液常规有异常值；
i.怀孕或哺乳期。
1.1.2 维生素D补充干预和随访
受试者在研究人员的监护下一次性口服维生素D3补充剂一瓶(含300,000IU维生素D3)，单次口服干预之后受试者在整个研究过程中将不再服用且不建议自行服用任何含有维生素D的补充剂或钙剂。在干预之后，以自我和临床评估的方式进行随访，随访内容包括有无任何药物不良反应，同时采集0，1，2，3，7，14，28，56，84，112，140天受试者的空腹血液和尿液样本。除此之外，收集和询问随访期间就医情况、户外活动以及维生素补充剂的使用情况。
1.1.3 样本储存及指标检测
收集10mL空腹血液到抗凝管中，3000g离心取出上层血浆部分等量分装置于-20℃保存待用；在15mL晨尿样本中加入抗菌剂，同样保存于-20℃待用。利用高效液相色谱和质谱联用检测血浆中25(OH)D；其他血液生化，血液常规，尿液常规由医院化验科提供。
1.1.4 遗传变异位点的选择与基因分型
以下基因序列上的一些遗传变异位点与血浆中25(OH)D水平相关：CYP2R1(rs10741657)、VDR(rs7968585)、GC(rs12512631、rs222020和rs7041)和CYP24A1(rs2296241、rs2762939、rs6013897、rs2209314和rs4809958)。
用血液样本DNA抽提试剂盒抽提受试者基因组DNA，然后用聚合酶链反应以及Sanger法测序的方法进行基因分型。
1.2 绝经后妇女骨代谢与生物活性维生素D相关性研究
1.2.1 志愿者招募
2015年9月到12月期间，本发明人在上海市徐汇区开展绝经后妇女骨质疏松与生物活性维生素D相关性研究。采用横断面调查的方法进行研究，在社区招募大于50岁的女性绝经期女性居民作为调查对象。最终有967名志愿者入选，所有志愿者均通过知情同意。
志愿者的纳入和排除标准
纳入：a.年龄≥50周岁；
b.绝经期女性；
排除：a.有肿瘤、中风和免疫相关疾病者；
b.近三个月内摄入过维生素D及其类似物，包括麦角钙化醇，胆钙化醇，阿尔法骨化醇等；
c.接受过骨代谢疾病相关治疗者。
1.2.2 现场数据资料收集与血液样本采集
现场数据采集分为两部分：主观资料与客观资料。主观资料即为采用面对面访谈的形式进行，询问居民的一般情况，既往疾病史，用药史，体力活动与膳食情况以及骨质疏松生活质量等；客观资料包括有身高、体重、握力与骨密度检测，其中，身高与体重采用便携式身高体重测量仪测量，握力由电子握力计测量志愿者双手的最大握力，骨密度由直通车载骨密度仪来测量腰椎骨骨密度。同时采集志愿者7ml空腹血，分装在含有EDTA的抗凝管与非抗凝管中，抗凝管通过3000rpm离心后分离出血浆，非抗凝管用同样的方法分离出血清。样本尽快送回实验室保存于-80℃待用，血细胞用于抽提基因组DNA，DNA样本置于-20℃冰箱保存待用。
1.2.3 实验室分析
血液中总25(OH)D采用串联质谱仪检测，维生素D结合蛋白由人源维生素D结合蛋白酶联免疫试剂盒来检测。其他的血液学检测指标交予公司检测，包括钙、磷、镁、肌酐、碱性磷酸酶、促甲状腺素、I型胶原蛋白氨基末端肽(PINP)、骨钙素、β胶联降解产物(β-CTX)、骨保护素(OPG)等指标。基因分型我们采用Taqman探针法进行检测，主要针对维生素D结合蛋白基因上的两个单核苷酸多态性位点rs4588和rs7041进行检测。探针序列如下所示：
rs4588：
GCAAAATTGCCTGATGCCACACCCA[A/C]GGAACTGGCAAAGCTGGTTAACAAG(SEQ ID NO:1)
rs7041：
AGGGGTAGGGGGAATGGGGACAGGC[A/T]CTTTCCCCCTTGGGGGTCCCCTGCC(SEQ ID NO:2)
rs10741657：
正向引物：CGGGACTCTTGTCTGCACTT(SEQ ID NO:3)
反向引物：TCAGCTCCAATGTCATCTTCCT(SEQ ID NO:4)
rs7968585：
正向引物：GTTAACACTTTGCAGCTTCCACT(SEQ ID NO:5)
反向引物：CCCAGGCAACAGGGAGTATC(SEQ ID NO:6)
rs12512631：
正向引物：ACTAGTAGCCTTGTGGTGGTG(SEQ ID NO:7)
反向引物：TGAAACATGCCCTGCAACCA(SEQ ID NO:8)
rs7041和rs4588：
正向引物：TGGCAGAGCGACTAAAAGCA(SEQ ID NO:9)
反向引物：ACAGCAGTTGGAGGCAAAGT(SEQ ID NO:10)
rs2296241：
正向引物：AAGCTTCAGGGTGGCTTCAG(SEQ ID NO:11)
反向引物：AGTGAGCAAGTCTGTGACGA(SEQ ID NO:12)
rs6013897：
正向引物：GGACTCCTGGTTGGGTGATG(SEQ ID NO:13)
反向引物：TCCTTGATCCAAATGTCCGCA(SEQ ID NO:14)
rs2209314：
正向引物：GGTAAGGGTGGGCTGGATTT(SEQ ID NO:15)
反向引物：GCCAGGGCAGAGAACTTTACT(SEQ ID NO:16)
rs4809958：
正向引物：CCCTGGATCTCCTGTGTGAC(SEQ ID NO:17)
反向引物：ACTGCTTTCTTAAAGAGGCTGC(SEQ ID NO:18)。
1.2.4 生物1.2.4活性形式维生素D计算方法
生物活性形式的维生素D包括循环血液中游离形式的维生素D以及与44血液中白蛋白结合的维生素D两部分组成。本发明借鉴哈弗大学布里格姆女子医院Camille E.Powe教授等2013年在新英格兰杂志发表的关于维生素D结合蛋白的研究，计算生物活性形式维生素D的含量。
三、实验结果
2.1 单次口服补充高剂量维生素D3实验结果
本发明的研究证明了单次30万UI维生素D3补充方案是安全并且是有效的，一次补充可以维持在充足血清25(OH)D水平(>30ng/ml)长达56天。同时，我们还针对补充后血清25(OH)D水平的影响因素进行了探讨，我们发现体重、性别、本底25(OH)D水平和CYP2R1(rs10741657)、CYP24A1(rs2296241、rs6013897、rs4809958)、维生素D结合蛋白(rs222020、rs7041)和维生素D结合受体(rs7968585)与补充后体内维生素D水平显著相关，其中不同的酶参与维生素D代谢的不同阶段，这些遗传多态性位点与血药浓度的达峰时间，峰值以及衰减速度有很强的相关性。
2.1.1 受试者基本情况如下表1所示。
表1
*女性与男性参与者之间的比较；
#维生素D缺乏〔20ng/mL<总25(OH)D<30ng/mL〕；
**维生素D缺乏〔总25(OH)D<20ng/mL〕。
2.1.2 受试者本底与干预后血中甲状旁腺激素(PTH)，Ca，维生素D结合蛋白，血肌酐，血糖，血脂，血胆固醇和尿钙(肌酐修正值)的检测结果以及不同时间点各指标与本底水平比较结果如下表2所示。
表2
ANOVA：方差分析；DBP：维生素D结合蛋白；PTH：甲状旁腺激素；SD：标准偏差。
*P值，下一个测定日与第0天之间的P值。
2.1.3 采用多重线性回归的方法将本底25(OH)D3水平，性别，年龄，体重以及遗传多态位点这些因素纳入统计学模型中，发现了一些影响干预后维生素D水平与其中一些因素显著相关，结果如下表3所示。
表3
表3(续)
GC，组特异性组分，也称为维生素D结合蛋白；SE，标准误差；VDR，维生素D受体。
2.1.4 口服300,000IU维生素D3后，对受试者体内25(OH)D3进行动态观察，分别测得0,1,2,3,7,28,56,84和112天的动态监测值21.0±5.0,57.7±11.0,67.8±12.1,71.4±12.9,70.6±11.8,50.8±7.7,35.4±6.0,28.0±4.7和25.8±4.5ng/mL，绘制维生素D的在体内代谢示意图如图1所示。
2.2 绝经后妇女骨代谢与生物活性维生素D相关性研究结果
维生素D结合蛋白基因上的两个遗传多态性位点:rs4588和rs7041与循环血液中活性形式维生素D显著相关，同时骨密度较高的绝经后妇女体内有较高的活性形式维生素D，骨代谢指标也趋于正常。
2.2.1 招募志愿者的一般情况如下表4所示。
表4
2.2.2 志愿者具体检测指标情况如下表5所示。
表5
BMD：骨密度；FGF23:成纤维生长因子23；TSH：促甲状腺激素；OST：骨钙素；ALP：碱性磷酸酶。
2.2.3 如图2所示，两个遗传多态位点与维生素D结合蛋白的含量，循环血中总的维生素D以及活性形式维生素D高度相关。
2.2.4 活性形式维生素D、骨密度及骨代谢相关生物标记物之间的相关性研究结果如图3所示。图3中，圆形面积越大表示相关性更强，正值代表正相关，负值代表负相关。
2.2.5 如图4所示，维生素D结合蛋白与血液中总维生素D成正相关，与活性形式维生素D成负相关。
2.2.6 如图5所示，生物活性维生素D与骨密度线性相关，具有统计学差异(p<0.05)。
序列表
<110> 中国科学院上海生命科学研究院
<120> 关键维生素D代谢相关基因遗传多态组合及用途
<130> 166474
<160> 18
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> rs4588的序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(26)
<223> n是A和C
<400> 1
gcaaaattgc ctgatgccac acccanggaa ctggcaaagc tggttaacaa g 51
<210> 2
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> rs7041的序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(26)
<223> n是A或T
<400> 2
aggggtaggg ggaatgggga caggcncttt cccccttggg ggtcccctgc c 51
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 3
cgggactctt gtctgcactt 20
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 4
tcagctccaa tgtcatcttc ct 22
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 5
gttaacactt tgcagcttcc act 23
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 6
cccaggcaac agggagtatc 20
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 7
actagtagcc ttgtggtggt g 21
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 8
tgaaacatgc cctgcaacca 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 9
tggcagagcg actaaaagca 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 10
acagcagttg gaggcaaagt 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 11
aagcttcagg gtggcttcag 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 12
agtgagcaag tctgtgacga 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 13
ggactcctgg ttgggtgatg 20
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 14
tccttgatcc aaatgtccgc a 21
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 15
ggtaagggtg ggctggattt 20
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 16
gccagggcag agaactttac t 21
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 17
ccctggatct cctgtgtgac 20
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 18
actgctttct taaagaggct gc 22

Claims (10)

1.一种检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒含有：
(1)检测对象血中总25(OH)D3水平的试剂；和
(2)检测对象DBP单体型的试剂；和任选的
(3)检测对象以下遗传变异位点的试剂：rs10741657、rs7968585、rs12512631、rs2296241、rs6013897、rs2209314和rs4809958；和任选的
(4)用于实施各检测所需的器具，包括但不限于一次性的采血器具和容器。
2.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，(2)所述的检测对象DBP单体型的试剂为检测对象rs7041和rs4588的试剂；其中，所述DBP单体型为Gc1s、Gc1f或Gc2，所述Gc1s单体型的基因型为rs7041G和rs4588C，Gc1f单体型的基因型为rs7041T和rs4588C，Gc2单体型的基因型为rs7041T和rs4588A。
3.如权利要求1或2所述的检测试剂盒，其特征在于，
(2)所述试剂包括引物，如SEQ ID NO:9和10所示的引物序列；
(3)所述试剂包括引物，如SEQ ID NO:3－8和11－18所示的引物序列。
4.以下试剂在制备检测试剂盒中的应用：
(1)检测对象血中总25(OH)D3水平的试剂；和
(2)检测对象DBP单体型的试剂；和任选的
(3)检测对象以下遗传变异位点的试剂：rs10741657、rs7968585、rs12512631、rs2296241、rs6013897、rs2209314和rs4809958。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，(2)所述的检测对象DBP单体型的试剂为检测对象rs7041和rs4588的试剂；其中，所述DBP单体型为Gc1s、Gc1f或Gc2。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述Gc1s单体型的基因型为rs7041G和rs4588C，Gc1f单体型的基因型为rs7041T和rs4588C，Gc2单体型的基因型为rs7041T和rs4588A。
7.如权利要求4－6中任一项所述的应用，其特征在于，所述检测试剂盒用于分析、判断对象是否为维生素D缺乏；其中，采用以下方法判定对象是否为维生素D缺乏：
根据对象血中总25(OH)D3水平结合该对象的DBP单体型计算出该对象血中生物活性25(OH)D3水平；若由此计算得到该对象血中的生物活性25(OH)D3水平小于5ng/ml，则认为该对象维生素D缺乏。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，根据下式计算出该对象血中生物活性25(OH)D3水平CBio D：
CBio D＝CDFree+CDAlb＝(Kalb×CAlb+1)×CDFree
式中，
CDFree＝游离形式维生素D浓度；
CDAlb＝与白蛋白结合的25(OH)D的浓度；
Kalb＝25(OH)D与白蛋白亲和常数，为6×105M-1；
CAlb＝白蛋白浓度；
其中，
ax2+bx+c＝0
式中，a＝KDBP×Kalb×CAlb+KDBP；
b＝KDBP×CTotal DBP－KDBP×CTotal D+Kalb×CAlb+1；
c＝-CTotal D；
KDBP1S＝25(OH)D与维生素D结合蛋白亲和常数(Gc1S型)，为0.6*109M-1；
KDBP1F＝25(OH)D与维生素D结合蛋白亲和常数(Gc1F型)，为1.12*109M-1；
KDBP2＝25(OH)D与维生素D结合蛋白亲和常数(Gc2型)，为0.36*109M-1；
CTotal DBP＝维生素D结合蛋白浓度；
CTotal D＝总维生素D浓度＝CDAlb+CDDBP+CDFree；和
CDDBP＝与维生素D结合蛋白结合的25(OH)D的浓度。
9.如权利要求4－8中任一项所述的应用，其特征在于，所述检测试剂盒用于确定对象服用30万国际单位的维生素D的服药方案；其中，采用以下式子测算该对象服用高剂量维生素D之后相应天数时血液中总的25(OH)D3水平，并以天数为横坐标、Y值为纵坐标绘制曲线：
第1天：Y＝71.70+1.15X1-0.67X4+10.72X5+6.38X7+6.66X14；
第2天：Y＝69.81+1.26X1-0.79X4+9.85X5+6.16X14；
第3天：Y＝105.93+1.18X1-13.48X2-0.90X4+7.06X5+6.38X7+6.22X14；
第7天：Y＝121.70+1.13X1-2.86X3-0.38X4+8.79X10-10.77X12+6.22X14；
第28天：Y＝75.55+0.95X1-11.87X2-0.46X4+7.49X5+6.53X9；
第56天：Y＝46.90+0.71X1-1.23X3+4.70X10-7.24X12+4.50X13；
第84天：Y＝17.64+0.56X1+5.40X5-4.29X6；
第112天：Y＝8.24+0.56X1+3.89X5-3.78X6-4.17X12+4.04X13；
上述式子中：
Y＝总25(OH)D3水平；
X1＝基线25(OH)D3(以1ng/mL计)；
X2＝性别(男性赋值为0，女性赋值为1)；
X3＝年龄(岁)；
X4＝体重(千克)；
X5＝rs10741657，其中，AA或GA赋值1，GG赋值0；
X6＝rs7968585，其中，TT或CT赋值1，CC赋值0；
X7＝rs12512631，其中，CC或CT赋值1，TT赋值0；
X9＝rs7041，其中，GG或TG赋值1，TT赋值0；
X10＝rs2296241，其中，TT或CT赋值1，CC赋值0；
X12＝rs6013897，其中，AA或TA赋值1，TT赋值0；
X13＝rs2209314，其中，AA或AG赋值1，GG赋值0；
X14＝rs4809958，其中，CC或AC赋值1，AA赋值0；
其中，当根据曲线测算得到该对象在某日之后其血液中25(OH)D3水平低于50nmol/L时，可得出该对象应在该日或该日前一天或数天服用所述剂量的维生素D的结论。
10.一种药盒，其特征在于，所述药盒含有2剂以上维生素D药剂，其中，每剂维生素D药剂含有30万国际单位(IU)的维生素D。
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