CN102985826A - 游离的维生素d的免疫分析 - Google Patents

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Abstract

本发明公开的是从血液或血液成分，特别是血清或血浆中进行游离的25(OH)维生素D的免疫吸附，之后，测量被吸收的材料。使用氟烷基表面活性剂来增强维生素D的溶解性并且可以测量游离的维生素D。因此，本发明采用结合蛋白来吸收游离的25(OH)维生素D。其后，利用标记的维生素D化合物，优选放射性标记的、荧光标记的、发光标记的、生物素标记的、金标记的或酶标记的化合物，使包括25-OH维生素D的结合蛋白经受竞争性结合分析。可替换地，可通过质谱分析对免疫捕获的25-OH维生素D进行定量。

Description

游离的维生素D的免疫分析
技术领域
本发明涉及用于分析（测定）血液或血液成分样品的游离的维生素D（free vitamin D）的免疫分析（免疫测定，immunoassay）方法。本发明还涉及免疫分析和用于进行（引导，conduct）这样的免疫分析的试剂盒，其中所述免疫分析包括重点照顾检验（点照顾测试，point-of-care tests）。
背景技术
被称为“维生素D”的物质包括一组脂肪可溶解的激素原以及其代谢物和类似物。体内出现的维生素D的主要形式是维生素D2（麦角钙化醇）和维生素D3（胆钙化醇）。后者是维生素D的内源性形式，人类可在太阳光的影响下在皮肤中形成维生素D3。前者是从食物中摄取的维生素D的外源性形式。在美国，维生素D2被用作药物学维生素D补充物。除非另外指出，本公开内容中的术语维生素D涉及维生素D的任何一种或多种形式，包含维生素D代谢物如25-羟基-维生素D或1,25二羟基维生素D。
虽然维生素D2和D3在它们的侧链的分子结构方面不同，但是它们在现有的激素原中共有相同的生物活性，在两个步骤中，最终被代谢为也称为钙三醇（骨化三醇，calcitriol）的1,25二羟基维生素D（1,25-(OH)2-维生素D），或1,25二羟基胆钙化醇。前述的代谢物，25-羟基维生素D（25-(OH)-维生素D）或钙三醇，由肝中的转变产生，且其被认为是体内维生素D的贮藏形式。
循环的维生素D主要由25-(OH)-维生素D3和25-(OH)-维生素D2组成。生物学上，25-(OH)-维生素D2与25-(OH)-维生素D3一样有效。循环中25-(OH)-维生素D2的半衰期较短。对于临床实践，推荐使用25-(OH)-维生素D分析，其测量25-(OH)-维生素D3以及25-(OH)-维生素D2（1）。
维生素D长期已被认为是重要的物质，其活化形式在骨的形成和维持中以及在人类或动物身体的其他过程中发挥作用。因此，它通过促进肠内来自食物的钙和磷的吸收和肾中钙的重吸收，用于增加钙到血流中的流量；使骨能够正常矿化和预防低血钙性抽搐。其也是造骨细胞和破骨细胞的骨成长和骨重建所必需的。
维生素D缺乏引起削弱的骨矿化和导致骨软化疾病，儿童佝偻病和成人软骨病，并且可能产生骨质疏松症。
维生素D在人类健康中发挥许多其他的作用，包括抑制从甲状腺的降血钙素释放。降血钙素直接地作用于破骨细胞，引起骨再吸收和软骨降解的抑制。维生素D也能抑制从甲状旁腺的甲状旁腺激素分泌，调节神经肌肉和免疫功能和减少炎症。因此，具有适当的维生素D水平对于人类和动物的健康是基本的。
然而，维生素D的过量（其可能由于过量用药而发生）是有毒的。维生素D毒性的某些症状是由增加的肠钙吸收引起的血钙过多（血液中钙的水平升高）。已知维生素D毒性是高血压的原因。维生素D毒性的胃肠症状可包括厌食、恶心、和呕吐。这些症状常常伴随多尿（过多的产生尿）、烦渴（增加的口渴）、虚弱、神经过敏、瘙痒症（发痒）、和最终地肾衰竭。
明显地，能够诊断可能的维生素D缺乏的受试者是重要的。特别是对于补充维生素D的受试者，能够检验潜在的维生素D过量的受试者，也是重要的。总的25-(OH)-维生素D的血清水平被认为是维生素D状态的主要指示剂（2）。然而，这种观念一直都有争议。
通过维生素D结合蛋白（88%）和白蛋白（12%）结合血清中几乎所有循环的25-(OH)-维生素D。维生素D结合蛋白（DBP）是血清的主要成分，浓度为250-400mg/L血清。仅仅占据DBP的维生素D结合位点的小部分，大约为2%。25-(OH)-维生素D的非常小的部分（分数，fraction），0.04%以游离的、非蛋白质结合形式循环。
所有人类中DBP浓度都不是恒定的，并且可通过其他因素影响DBP的浓度，其他因素包括怀孕、口服避孕药的使用、肾病和肝病。DBP浓度的认识对于患者的真实的25-(OH)-维生素D状态的准确评价是至关重要的。例如，服用口服避孕药的年轻女性可能具有处于正常范围内的总的25-(OH)-维生素D水平。然而，由于她的升高的DBP，可显著地降低游离的25-(OH)-维生素D的浓度，使得她处于临床25-(OH)-维生素D不足的增加的风险之中和那个条件承担的所有风险之中。
已经显示了，体内甲状腺和甾醇激素的生理活性与她们的游离的、非蛋白质结合的部分的相关性，比与血浆中荷尔蒙的总的浓度的相关性更好。特别是在升高或减少了结合蛋白水平的情形中，总的循环荷尔蒙的测量可导致错误的诊断。在这样的情形中，游离循环的荷尔蒙浓度的测量提供较好的信息。这种观念被称为“游离的荷尔蒙假设”。Mendel（3）表明，游离的荷尔蒙假设很可能对于所有组织的甲状腺荷尔蒙、皮质醇、并且还对于维生素D的羟基化代谢物来说是正确的。
Bikle等人（4）检验1,25-(OH)2-维生素D的游离的荷尔蒙假设的正确性。数据表明，甚至在患有肝病和减少的DBP水平的受试者中，尽管总的1,25-(OH)2-维生素D显著减少，好像也能很好地维持游离的1,25-(OH)2-维生素D水平。
在随后的关于25-(OH)-维生素D的研究中，推荐相同的组，从而在具有更改的结合蛋白浓度的情形中测量游离的25-(OH)-维生素D。作者推论，总的维生素D代谢物测量可能误导具有肝病的患者的维生素D状况的评价，并且推荐在进行维生素缺乏的诊断之前也确定游离的25-(OH)-维生素D水平。Bikle等人使用超滤作用以确定游离的25-(OH)-维生素D的水平（5）。这种方法需要高度纯净的放射性标记的维生素D并且倾向于过高估计游离的维生素D的部分。
Lauridsen等人（6）显示，不同DBP表型的女性具有不同的1,25(OH)2维生素D和25(OH)维生素D的浓度。这些作者表明，在较低的血浆25(OH)维生素D水平下，具有Gc2-2的女性是维生素D充足的。
某些背景技术可涉及有关的游离的分析物的确定。
美国专利4366143描述涉及有机物质或配体的游离部分的分析的发明，其中所述有机物质或配体以结合的和游离的形式存在于生物流体中。该方法基本上是竞争性免疫分析，其中，在一个步骤中，将标记的配体和特异性结合剂同时加入到样品中。配体的游离部分和标记的配体竞争与特异性结合剂反应，且以依赖于样品中存在的游离的配体部分的量的比例结合到特异性结合剂上。该公开方法的缺点是，由于特异性结合剂和标记的配体两者的存在，存在能够干扰结合的和游离的配体之间的平衡的多个因素，其使得该方法几乎不适用于以相对较低的量存在的游离的配体，如维生素D的情况。事实上，其并没有公开如何使用游离的维生素D测量的分析。
美国专利第4,292,296号公开了用于在样品中确定游离的分析物的方法，其中所述样品含有游离的分析物和受体结合的分析物。该方法涉及两个步骤，第一步骤是将样品与分析物的吸收剂接触，以从溶液中去除分析物。第二步骤包括将吸收剂结合的分析物与标记的分析物类似物接触。因此，从吸收剂中去除溶解相，并且确定结合的和洗掉的相中的标记的量。描述了用于确定游离的甲状腺荷尔蒙的浓度的方法。
美国专利申请2008/0182341涉及用于测量流体中游离的或未结合的分析物浓度的稳定剂。其表明，稳定剂防止配体与它的结合蛋白的分离。参考采用同时分析程序并且列举了各种稳定剂。提供的稳定剂不包括烷基胺氟表面活性剂。
没有现有技术参考文献具体地提供关于确定维生素D的分析，其反映了游离的维生素D的状况。
应该注意，关于游离的维生素D的分析已经知道了几十年，但是这些使用方法如平衡透析或速率透析作为它们的基础。这样的方法对于研究人员和高度训练过的技术人员来说是可接受的，但是几乎不适于常规的实验室，其中所述常规的实验室为了达到他们的财政目的需要高生产量自动化检验。因此，期望提供能够自动化的且适用于重点照顾检验的游离的维生素D的分析。
前述已编号的参考是：
1.Hollis BW.Measuring 25-hydroxyvitamin D in a clinical environment:
challenges and needs.
Am J Clin Nutr.2008Aug;88(2):507S-510S.
2.Holick MF.Vitamin D:extraskeletal health.
Endocrinol Metab Clin North Am.2010Jun;39(2):381-400.
3.Mendel CM.The free hormone hypothesis:a physiologically basedmathematical model.
Endocr Rev.1989Aug;10(3):232-74.
4.Bikle D,Gee E，Halloran B,Haddad J.Free 1,25-Dihydroxyvitamin DLevels in Serum from Normal Subjects,Pregnant Subjects,and Subjectswith Liver Disease.
J Clin Invest.1984;74:1966-1971.
5.Bikle D,Gee E,Halloran B,Kowalski MA,Ryzen E,Haddad J.Assessment of the free fraction of 25-hydroxyvitamin D in serum and itsregulation by albumin and the vitamin D-binding protein.
J Clin Endocrinol Metab.1986Oct;63(4):954-9.
6.Lauridsen AL,Vestergaard P，Hermann AP，Brot C,Heickendorff L,Mosekilde L,Nexo E.
Plasma concentrations of 25-hydroxy-vitamin D and1,25-dihydroxy-vitamin D are related to the phenotype of Gc(vitaminD-binding protein):a cross-sectional study on 595early postmenopausalwomen.
CalcifTissue Int.2005Jul;77(1):15-22.
7.van Hoof HJ,Swinkels LM,Ross HA,Sweep CG，Benraad TJ.
Determination of non-protein-bound plasma 1,25-dihydroxyvitamin D bysymmetric(rate)dialysis.Anal Biochem 1998May 1;258(2):176-83.
发明内容
为了较好地解决一个或更多前述的期望，在一个方面中，本发明提供了一种用于分析存在游离的维生素D（包括维生素D代谢物如25-羟基-维生素D或1,25二羟基维生素D）的血液或血液成分样品的方法，包括：
（a）将对于25-OH维生素D的固定的结合蛋白或抗体加入到样品中；
（b）将样品与稀释剂（diluent）混合，所述稀释剂包括氟烷基表面活性剂（fluoroalkyl surfactant）；
（c）将样品孵育有效量的时间，以使得期望量的25-OH维生素D结合到结合蛋白上；
（d）通过洗涤去除未结合的血清和血清成分；
（e）利用标记的维生素D化合物，使包括结合到其上的25-OH维生素D的固定的结合蛋白或抗体经受竞争性结合（competitive binding）；
（f）确定结合到结合蛋白上的标记的维生素D化合物的浓度。
在另一个方面中，本发明涉及用于进行前述方法的试剂盒。
在进一步的方面中，本发明涉及一种用于分析存在游离的维生素D的血液或血液成分的样品的方法，所述方法包括：在第一步骤中，在固定的结合剂（immobilized binder）如对于25-OH维生素D的固定的结合蛋白或抗体上捕获维生素D，和在随后的步骤中，使捕获的25-OH维生素D相对于标记的维生素D变体经受竞争性结合分析，其中通过如此有限地螯合（sequestering）一定量的结合的维生素D以便满足反复试验来实现游离的维生素D的捕获，其中使从其中捕获维生素D的样品经受捕获维生素D和使捕获的维生素D经受相同的竞争性结合分析的相同步骤，并且其中在两个竞争性结合分析之后测量的游离的维生素D的浓度基本上是相同的。
在还有的进一步的方面中，本发明涉及一种用于分析存在游离的维生素D的血液或血液成分样品的方法，该方法包括：在第一步骤中，在固定的结合剂如对于25-OH维生素D的固定的结合蛋白或抗体上捕获维生素D，和在随后的步骤中，使捕获的25-OH维生素D相对于标记的维生素D变体经受竞争性结合分析，其中捕获0.5-5wt%的结合的维生素D。
在还有的另一个方面中，该方法可用于重点照顾检验。后者是指在病患照顾的地点处或附近进行检验，即，而不是采取血液样品和将这些发送给诊断实验室，可立即将样品引入到便携式的，优选手持式装置中，其能够尽可能以有限的多个步骤进行分析，和尽可能利用有限的多个手动操作。
在另一个方面中，本发明涉及氟烷基表面活性剂优选全氟羧酸盐表面活性剂并且更优选全氟辛酸（PFOA）在用于确定游离的维生素D的免疫分析中作为维生素D的溶解性增强剂（solubility enhancer）中的应用。
附图说明
图1代表在本发明的分析的第一和第二通道（pass）中游离的维生素D浓度之间的相互关系。示出的线由利用具有不同游离的维生素D水平的10个样品进行重复免疫提取而产生。回归线的斜率整体没有显著不同。
具体实施方式
广义上，本发明涉及用于游离的维生素D的确定的两步骤分析，包括从血液或血液成分特别是血清或血浆中免疫吸附非-蛋白质结合的25(OH)-维生素D，之后，测量吸收的维生素D。
可以本领域已知的任何方式，从受试者，特别是人类中采集这样的样品，期望在其血液中分析游离的25-OH-维生素D的存在。
游离的维生素D是指维生素D的循环的、未结合的部分。这涉及维生素D的任何形式，包括维生素D2、维生素D3、和代谢物25(OH)-维生素D2、25-(OH)-维生素D3、1,25(OH)2-维生素D2和1,25(OH)2-维生素D3。分析可用于单独地或以组合测量游离的维生素D的这些形式中的任一种。优选地，本发明的分析用于测量游离的25(OH)-维生素D，导致25(OH)-维生素D2和25-(OH)-维生素D3的确定。术语“游离的（free）”和“未结合的”是指没有结合到任何蛋白质上的部分，主要包括维生素D结合蛋白（VDBP或DBP）。
优选在结合蛋白加入之前、期间、或之后稀释样品。样品稀释剂可以是水基的并且优选是缓冲液（缓冲溶液，buffer solution）。优选地，缓冲的pH在从6.0至8.0范围内。缓冲液包括氟烷基表面活性剂。应该理解，可通过将稀释剂加入到样品中、通过将样品加入到稀释剂中、或通过同时将缓冲液和样品加入彼此之中完成缓冲液与样品的混合。出于实际的原因，优选将稀释剂加入到样品中。
不希望受到理论的束缚，本发明人认为，表面活性剂以这样的方式增强了维生素D的溶解性使得导致维生素D的有限的螯合。
在另一个方面中，本发明涉及分析游离的维生素D的新的概念。关于分析游离的维生素D的问题是，游离的维生素D的初始浓度是非常低的，且不能通过现有的免疫分析测量。解决这个问题的现有的尝试基于期望避免维生素D从DBP上的去除（例如，通过“稳定”游离的和结合的维生素D之间的平衡的尝试），或仅仅涉及屈服于不能分析游离的DBP的事实，和这些分析仅仅涉及维生素D从DBP的转移。
在本发明中，可预见维生素D的有限的螯合，其中螯合的维生素D的分数（部分，fraction）足够低，优选存在于样品中的总的维生素D的0.1-10%并且优选不超过它的5%，从而仍然反映了最初的游离的维生素D的浓度。
这可以在样品中通过含氚的维生素D和稀释缓冲液的加入无需过度的实验而证实。结合到维生素D结合蛋白上的维生素D不应该减少超过5%。可替换地，样品可被吸收到抗体涂覆的孔的壁上。在去除样品之后，添加生物素化的维生素D，并且对吸收到抗体上的游离的维生素D定量。在第二个孔中引入从其上去除最初量的维生素D的样品，且再一次孵育和定量。测量的游离的维生素D的浓度应该与来自第一次孵育的结果相同。
优选通过添加按重量计0.05至0.5%的氟烷基表面活性剂，优选0.1-0.25%的氟烷基表面活性剂实现维生素D的有限的螯合。优选氟烷基表面活性剂是全氟烷基表面活性剂，更优选是全氟羧酸盐表面活性剂（perfluoro carboxylate surfactant），并且最优选是全氟辛酸（PFOA）。优选使用0.1至0.2%，更优选0.15%的PFOA。在这些条件下，样品与不同水平的DBP但是相同浓度的总的维生素D的反应，与通过对称透析测量的游离的维生素D的浓度有关。
可以想象地，在本发明中，可以使用PFOA自身、或它的衍生物。这些衍生物通常是指包括全氟辛酸部分（perfluoro octanoic moiety），特别地包括PFOA盐，如PFOA铵盐的衍生物，以及是指相应的磺酸，即PFOA磺酸盐，简写为PFOS（全氟辛烷磺酸盐，也被称为全氟辛烷磺酸）。
根据本发明确定游离的维生素D（包括维生素D代谢物）的方法的优势是，它提供了能够自动化的分析形式。这显著地将本发明的分析与确定游离的维生素D的现有的分析区分开来。
在本发明的分析中，添加对于25-OH-维生素D的结合蛋白。对于维生素D的结合蛋白，例如，抗体是本领域已知的，并且广泛用于维生素D的现有的免疫分析中。这些相同的抗体以及其他结合蛋白，也可用于本发明中。例如，代替对于维生素D的抗体，可使用如利用噬菌体展示技术产生的抗体片段。适当的抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。它们可以以已知的方式获得，例如，多克隆山羊抗维生素D、多克隆兔抗维生素D、或如来自维生素D的免疫分析应用的领域中已知的任何其他适当的维生素D抗体。例如从下列参考文献中已知适当的抗体：Hollis,Clin.Chem 31/11,1815-1819(1985)；Hollis,Clin.Chem 39/3,529-533(1993)。
优选以包括固体载体的颗粒形式加入结合蛋白。通常，将结合蛋白涂覆在固相（solid phase）上，例如，涂覆在微量滴定板上。在优选的实施方式中，将结合蛋白涂覆到磁性粒子（magnetic particle）上，其在磁场中促进它们的分离。
在添加结合蛋白例如抗体之后，使样品孵育（培养，incubate）。需要的时间将取决于环境，如试剂的浓度、结合蛋白的类型、和孵育期间的条件，例如，摇动和温度。通常，孵育时间的范围从10秒至几个小时，优选1分钟至2个小时。对于自动化的平台，优选短的孵育时间（10秒至10分钟，优选30秒至30分钟）。基本上，时间段不具有特别的关联性，只要在期望的时间段期间在环境下在校准系统（calibration system）中确定要结合多少游离的维生素D。更短和更长的时间段明显是可能的，条件是发生适当的校准。因此，优选地，在相同的条件下，利用校准器的比较涉及相同的时间段。
在孵育时期之后，可以利用标记的维生素D化合物以已知的方式使样品经受竞争性结合分析。许多标记的化合物是已知的，其能够在用于确定维生素D的免疫分析中用作竞争性结合抗原。典型的标记是放射性标记（radiolabel）、荧光标记、发光标记（luminescent label）、生物素标记（biotinlabel）、金标记（gold label）、酶标记。竞争性结合分析对于本领域技术人员是已知的，且不需要说明，特别地是因为可以利用已知适合于确定维生素D的任何标记进行本发明的方法的这个部分。可使用的标记尤其是在现有的维生素D免疫分析的前述参考文献中公开的那些标记。
因此，利用允许测量浓度的标记，确定样品中游离的维生素D的浓度。应该理解，通过校准测量，即通过相同的分析中的校准器的响应，确定测量的值的解释。
可替换地，借助于质谱分析（质谱法，mass spectroscopy），可以使捕获的维生素D经受定量分析。
通过提供校准器可以完成用于本发明的分析的校准，其中所述校准器包括预定浓度的游离的25-OH-维生素D。可通过对称透析确定这些校准器中的游离的维生素D的部分。在对称透析中，在透析细胞的一个侧面上装载血清样品。利用其中添加痕量的放射性标记的维生素D的相同样品装载其他的隔室（compartment）。放射性标记的维生素D从一个透析隔室到另一个的移动速率直接与维生素D的游离部分成比例（7）。
根据本发明的游离的维生素D的测量在基本上不影响游离的维生素D的浓度的情况下，依赖于游离的维生素D的浓度的评价，还基于上述讨论的维生素D的有限的螯合。
在另一个方面，本发明以在血液或血液成分中用于确定25-OH维生素D的免疫分析的形式提供了产物，其中分析利用根据前述实施方式中任一个的方法。更具体地，将以用于进行免疫分析的试剂盒的形式提供这样的产物。这样的试剂盒可包括所包含的单独的试剂，即，结合蛋白和标记的维生素D化合物。可单独提供这些试剂，因此只在它们用于本发明的分析时形成试剂盒。优选地，可以一起提供试剂，优选一起包装试剂，作为一个试剂盒套件（成套试剂盒，试剂盒部件，部件试剂盒，kit of part）。试剂盒可选地包括对于血液或血液成分样品的容器，但是按照惯例这也可被单独提供。通常，试剂盒包括固定在固相上的结合剂和单独结合的（conjugated）维生素D。按照本领域中的惯例，其他试剂盒成分可依赖于选择的标记，因为不同的标记可需要不同的试剂。
本发明还涉及氟烷基表面活性剂优选全氟羧酸盐（perfluorocarboxylate）表面活性剂并且更优选全氟辛酸和/或全氟庚酸（perfluoroheptanoic acid）在用于确定游离的维生素D的免疫分析中作为维生素D的溶解性增强剂中的应用。
优选的表面活性剂是全氟烷基表面活性剂，更优选全氟羧酸盐如全氟庚酸或全氟辛酸。更优选地，表面活性剂是全氟辛酸（PFOA）、或它的衍生物。这些衍生物通常是指包括全氟辛酸部分的衍生物，特别地包括PFOA盐，如PFOA铵盐，以及是指相应的磺酸，即PFOA磺酸盐，简写为PFOS（全氟辛烷磺酸盐，也称为全氟辛烷磺酸）。还可使用其他全氟羧酸盐表面活性剂的类似衍生物。
应该理解，本发明不限于上文描述的实施方式和配方。也应该理解，在权利要求书中单词“包括”不排除其他要素或步骤。其中当涉及单数名词例如“一个”或“一种”、“该”时使用不定冠词或定冠词，除非具体地地指出别的物件，否则这包括那些名词的复数。
将参考下列非限制性的实施例和所附非限制性的附图说明本发明。
实施例
材料
涂覆的微量滴定板
利用抗小鼠IgG抗体以200ng/孔的浓度涂覆Nunc maxisorp微量滴定板。随后，将单克隆抗-25(OH)维生素D抗体的层以2ng/孔的浓度吸收到抗小鼠IgG层上。利用含有BSA和蔗糖的硼酸盐缓冲液封闭板。
样品稀释剂
样品稀释剂由含有防腐剂和0.15%的PFOA的pH 8.0的0.1M TRIS缓冲液组成。
结合物（coniugate）（即，标记的维生素D化合物）是生物素化的维生素D。在含有0.1%牛血清白蛋白和防腐剂的pH 7.5的0.1MTris缓冲液中以25pg/ml的浓度提供结合剂。
链霉亲和素-HRP和TMB来自商业来源。
方案
如下进行分析。在微量滴定板的孔中，用滴管吸取90μl的样品稀释剂。接下来，将10μl的样品加入到稀释剂中。将这种混合物在37°C下孵育90分钟。随后，利用洗涤缓冲液将孔洗涤三次。将100μl的HRP结合物加入到试管中，且孵育30分钟。再次利用洗涤缓冲液将孔洗涤三次。然后，通过辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素产生比色信号。在37°C下孵育20分钟之后，利用洗涤缓冲液将孔洗涤三次。随后，将100μl TMB溶液加入到孔中。在室温下在黑暗中孵育20分钟之后，加入100μl终止溶液，且在450nm上读取吸收率。
在孔中产生的信号与样品或校准器中的游离的25(OH)维生素D的浓度成反比。通过将未知的信号与校准器的响应进行比较，可计算出原始样品中游离的25(OH)维生素D的浓度。
结果
在标准参考样品上利用本发明的分析，产生关于游离的25(OH)维生素D的测量的典型的校准曲线，且在下面的表格中说明。
可使人类或动物受试者，例如，患者的血液或血液成分样品经受本发明的分析。测量的维生素D的量可以与校准曲线有关并且由此进行解释。

Claims (16)

1.一种用于分析存在游离的维生素D（包括维生素D代谢物如25-羟基-维生素D或1,25二羟基维生素D）的血液或血液成分的样品的方法，包括：
（a）将对于25-OH维生素D的固定的结合蛋白或抗体加入到所述样品中；
（b）将所述样品与稀释剂混合，所述稀释剂包括氟烷基表面活性剂；
（c）将所述样品孵育有效量的时间，以使得期望量的维生素D结合到所述结合蛋白上；
（d）通过洗涤去除未结合的血清和血清成分；
（e）利用标记的维生素D化合物使包括结合到其上的捕获的维生素D的固定的结合蛋白或抗体经受竞争性结合；
（f）确定结合到所述结合蛋白上的标记的维生素D化合物的浓度。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述氟烷基表面活性剂是全氟羧酸，优选选自由全氟辛酸、全氟庚酸、以及它们的混合物组成的组。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述表面活性剂的浓度为按重量计0.05%至0.5%，优选按重量计0.1%-0.25%。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述稀释剂是缓冲液，所述缓冲液具有在从6.0至8.0范围内的缓冲的pH。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述结合蛋白是抗体。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述结合蛋白是维生素D结合蛋白。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述样品是人类血清或血浆。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，以涂覆在磁性粒子上的形式提供所述结合蛋白。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述标记的维生素D化合物包括选自由放射性标记、荧光标记、发光标记、生物素标记、金标记、酶标记组成的组中的标记。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，参考对于游离的25-OH维生素D的校准浓度来确定所述浓度。
11.一种用于分析存在游离的维生素D的血液或血液成分的样品的方法，包括：在第一步骤中，在对于维生素D的固定的结合剂上捕获维生素D，和在随后的步骤中，使捕获的维生素D相对于标记的维生素D变体经受竞争性结合分析，其中通过如此有限地螯合一定量的结合的维生素D以便满足反复试验来实现游离的维生素D的捕获，其中使从其中捕获维生素D的样品经受捕获维生素D和使捕获的维生素D经受相同的竞争性结合分析的相同步骤，并且其中在两个竞争性结合分析之后测量的游离的维生素D的浓度基本上是相同的。
12.根据权利要求11所述的方法，根据权利要求1-10中任一项进行。
13.根据权利要求11或12所述的方法，其中，螯合的维生素D的分数是所述样品中存在的总的维生素D的0.1-10wt%，并且优选不超过它的5wt%。
14.一种用于从血清或血浆样品中对游离的维生素D定量的方法，包括根据权利要求1中限定的步骤（a）、（b）、（c）和（d），以及借助于质谱分析使捕获的维生素D经受定量分析。
15.一种用于确定血液或血液成分中的游离的维生素D的免疫分析，其中，所述分析利用根据前述权利要求中任一项所述的方法。
16.一种利用权利要求1-10中任一项所述的方法用于进行免疫分析的试剂盒，所述试剂盒包括固定在固相上的对于维生素D的结合蛋白、和标记的维生素D化合物。
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