ES2348126T3 - Determinación directa de la vitamina d en suero o plasma. - Google Patents
Determinación directa de la vitamina d en suero o plasma. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2348126T3 ES2348126T3 ES08708477T ES08708477T ES2348126T3 ES 2348126 T3 ES2348126 T3 ES 2348126T3 ES 08708477 T ES08708477 T ES 08708477T ES 08708477 T ES08708477 T ES 08708477T ES 2348126 T3 ES2348126 T3 ES 2348126T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- vitamin
- serum
- metabolites
- proteinase
- hydroxyvitamin
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/82—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving vitamins or their receptors
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Un procedimiento para cuantificar metabolitos de la vitamina D directamente en plasma o suero sanguíneos, sin necesidad de purificación previa de los metabolitos de la vitamina D, que comprende las siguientes etapas: (a) adición de una cantidad apropiada de una serina proteasa con actividad endo y exoproteolítica a una muestra que contiene plasma o suero sanguíneos y la digestión de las proteínas de unión a vitamina D en el plasma o suero sanguíneos, hasta que ya no puedan unir más metabolitos de la vitamina D; (b) dilución de dicha muestra que contiene la serina proteasa, los metabolitos de la vitamina D y las proteínas plasmáticas o séricas digeridas usando un tampón de dilución, en el que la serina proteasa es sustancialmente inactiva; (c) proporción de una composición trazadora de la vitamina D, que está acoplada a una fase sólida; (d) proporción de un anticuerpo monoclonal contra los metabolitos pertinentes de la vitamina D; (e) combinación de la muestra con los metabolitos de la vitamina D, la fase sólida con la composición trazadora de la vitamina D y el anticuerpo monoclonal, y la realización durante un periodo de tiempo predeterminado de una reacción de unión competitiva entre los metabolitos de la vitamina D, el trazador de la vitamina D unido a una fase sólida y el anticuerpo monoclonal en un tampón de unión en el que la serina proteasa es sustancialmente inactiva; (f) separación de la fase sólida con el compuesto trazador de la vitamina D y del anticuerpo monoclonal unido del tampón de unión, y opcionalmente, el lavado de la fase sólida; y (g) determinación de la cantidad de anticuerpo monoclonal sobre la fase sólida, y cuantificación de los metabolitos de la vitamina D en el plasma o suero sanguíneos por correlación con muestras patrón.
Description
Determinación directa de la vitamina D en suero
o plasma.
La invención se refiere a un procedimiento para
la determinación cuantitativa de la vitamina D en suero o
plasma.
Los seres humanos pueden formar vitamina D_{3}
(colecalciferol) en la piel con la ayuda de la luz solar. La
vitamina D_{2} (ergocalciferol) se ingiere con la comida. A pesar
de que las vitaminas D_{2} y D_{3} difieren ligeramente en sus
cadenas laterales, tienen una actividad biológica idéntica. En
circulación ambas se unen a la proteína de unión a la vitamina D
(VDBP) y se metabolizan en el hígado a
25-hidroxivitamina D. La
25-hidroxivitamina D es la forma de almacenamiento
en el cuerpo y el metabolito de la vitamina D con la concentración
más alta en suero o plasma. Cuando es necesaria, se hidroxila en el
riñón a 1\alpha,25-hidroxivitamina D (la
denominada hormona D) que es la forma biológicamente activa y que
regula la absorción de calcio en el intestino, la mineralización de
los huesos, la diferenciación de los osteoplastos, la síntesis de la
matriz ósea y, entre otras, también las funciones neuromusculares.
Incluso una pequeña deficiencia de menos de 15 ng de
25-hidroxivitamina D por ml de suero (37,5 nmol/l de
25-OH-Vit.D/l) provoca un incremento
del nivel de parathormona y un incremento de la resorción ósea,
debido a la reducción de la absorción de calcio (Chapuy MC y col.
en J Clin Endocrinol Metab 1996; 81: 1129-33). La
deficiencia en vitamina D es un factor de riesgo importante en la
osteoporosis senil. Un diagnóstico temprano y el suplemento de
vitamina D_{2} permiten una prevención eficaz de las fracturas
óseas. Una deficiencia severa de vitamina D de menos de 5 ng de
25-hidroxivitamina D por ml de suero (12,5 nmol/l
de 25-OH-Vit.D/l) provoca raquitismo
en niños y osteomalacia en adultos (Scharla y col. Exp Clin
Endocrinol. Diabetes, 1996, 104:289-292). El exceso
de vitamina D debido a una sobredosificación provoca hipercalcemia.
Durante el invierno, en Alemania aproximadamente un tercio de la
población mayor de 50 años sufre de deficiencia en vitamina D
debido a la falta de luz (Scharla y col., Osteoporose Int. 1998; 8
(Supplement 2):S7-S12). La gente más joven también
puede sufrir de deficiencia en vitamina D, debido a enfermedades
gastrointestinales, disfunción hepática, una mala adsorción, o un
metabolismo acelerado inducido por fármacos, por ejemplo, provocado
por antiepilépticos.
Las técnicas de laboratorio convencionales para
la determinación de la 25-hidroxivitamina D en suero
y plasma son muy laboriosas (Tanner y col. (1988), J. Assoc, of
Analyt. Chem., 17, 607-710). Además, la patente de
EE.UU. 5.981.779 (Holick y col.), el documento WO 89/01631 y la EP 0
583 945 (DeLuca y col.) enseñan una prueba para vitamina D basada
en la unión a la VDBP. Para conseguir eso, en primer lugar se deben
extraer los metabolitos de la vitamina D del plasma o suero usando
disolventes orgánicos, y a continuación se deben purificar por
cromatografía. El documento WO 99/67211 (Armbruster y col.) enseña
la preparación de una muestra que supone la precipitación de las
proteínas plasmáticas y séricas con etanol. A continuación el
precipitado de proteínas se extrae por centrifugación y el
sobrenadante etanólico, que comprende los metabolitos solubles de la
vitamina D, se usa en el ensayo de unión. El documento EP 0 753 743
(Hollis) enseña la preparación de la muestra de plasma o suero
usando precipitación con peryodato. A continuación se lleva a cabo
la cuantificación de los compuestos de vitamina D en el
sobrenadante exento de proteínas. El documento WO 2004/063704
(Diasorin Inc.) describe un procedimiento de ensayo de una muestra
de sangre o suero para la determinación de la presencia de
25-hidroxivitamina D que comprende una reducción del
pH de la muestra a 5,5 o inferior para disociar la
25-hidroxivitamina D de las proteínas de unión a
vitamina D. Las proteínas de unión a vitamina D no se eliminan
antes de la cuantificación de los metabolitos de la vitamina D en la
muestra. El documento WO 02/46746 (Immunodiagnostic Systems Ltd.)
se refiere a un procedimiento para medir la
25-hidroxivitamina D en el que se añade un agente
de desplazamiento no competitivo, tal como la warfarina, para llevar
a cabo la separación del analito en la muestra de las proteínas de
unión a vitamina D. La cuantificación de los metabolitos de la
vitamina D en la muestra se lleva a cabo en presencia de proteínas
de unión a vitamina D y del agente de desplazamiento añadido. Los
documentos WO 03/023391 (Immundiagnostik AG) y DE 10144 905
(Armbruster y col.) describen un procedimiento para la
determinación de la vitamina D directamente en plasma o suero en el
que se añade un compuesto salicílico soluble al suero o plasma para
liberar la 25-hidroxivitamina D de la VDBP. A
continuación se determina directamente la cantidad de
25-hidroxivitamina D en plasma o suero usando
anticuerpos.
Los procedimientos de preparación de muestras
mencionados anteriormente son laboriosos o tienden a generar
errores, o ambos. Es el objeto de la presente invención proporcionar
un procedimiento simple y fiable para la determinación cuantitativa
directa de la 25-hidroxivitamina D en suero o
plasma.
Este problema se ha resuelto mediante el
procedimiento según la reivindicación 1. Las formas de realización
preferidas del procedimiento se describen en las reivindicaciones
dependientes.
Según la presente invención, el procedimiento
directo para la determinación cuantitativa de los metabolitos de la
vitamina D en plasma o suero sanguíneos por análisis de unión
competitiva, sin la necesidad de la purificación de los metabolitos
de la vitamina D del plasma o suero sanguíneos, incluye las
siguientes etapas: (a) adición de una cantidad apropiada de una
serina proteasa con actividad endo y exoproteolítica tal como la
proteinasa K a una muestra que contiene plasma o suero sanguíneos y
la digestión de las proteínas de unión a vitamina D en el plasma o
suero sanguíneos, hasta que ya no se puedan unir más metabolitos de
la vitamina D; (b) dilución de la muestra que contiene la serina
proteasa, los metabolitos de la vitamina D y las proteínas
plasmáticas o séricas digeridas usando un tampón de dilución, en el
que la serina proteasa es sustancialmente inactiva; (c) proporción
de una composición trazadora de la vitamina D, que está acoplada a
una fase sólida; (d) proporción de un anticuerpo, preferentemente
un anticuerpo monoclonal contra los metabolitos pertinentes de la
vitamina D, en el que dicho anticuerpo es sustancialmente
resistente a la actividad endoproteolítica de la serina proteasa
usada, y (e) combinación de la muestra con los metabolitos de la
vitamina D (analito), la fase sólida con el compuesto trazador de
la vitamina D y el anticuerpo monoclonal durante un periodo
predeterminado, y la realización durante un periodo de tiempo
determinado de una reacción de unión competitiva del metabolito de
la vitamina D y el trazador de la vitamina D sobre el anticuerpo
monoclonal en un tampón de unión, en el que la serina proteasa es
esencialmente inactiva y no se puede producir una unión inespecífica
entre la vitamina D y las proteínas séricas remanentes, y (f) la
separación de la fase sólida con el compuesto trazador de la
vitamina D y del anticuerpo monoclonal opcionalmente unido del
tampón de unión, y opcionalmente, el lavado de la fase sólida; y
(g) determinación de la cantidad de anticuerpo monoclonal sobre la
fase sólida, y (h) determinación de la cantidad de metabolito de la
vitamina D en el plasma o suero sanguíneos usando datos
comparativos.
En una realización preferida del procedimiento,
el análisis de unión se lleva a cabo a un valor de pH entre 3,0 y
10,0 en presencia del 0,1 al 5,0% (p/v) de gelatina, 1 a 10 mmol/l
de EDTA o EGTA, y opcionalmente inhibidores de la serina proteasa,
y del 0,005 al 0,050% (p/v) de
\beta-mercaptoetanol. El anticuerpo usado en las
etapas (d) y (f) también puede ser una mezcla de anticuerpos
monoclonales, que se unen específicamente a la
25-hidroxivitamina D_{3} y
25-hidroxivitamina D_{2}, respectivamente. En una
realización de la invención, el anticuerpo monoclonal se puede unir
a la 25-hidroxivitamina D_{3} o a la
25-hidroxivitamina D_{2} o a ambas. En una
realización diferente del procedimiento de la invención, el
anticuerpo monoclonal se puede unir a la
1\alpha,25-dihidroxivitamina D_{2} o a la
1\alpha,25-dihidroxivitamina D_{3} o a ambos
metabolitos de la dihidroxivitamina D.
El metabolito de la vitamina D determinado
mediante el procedimiento según la invención se selecciona entre
25-hidroxivitamina D_{2},
25-hidroxivitamina D_{3},
1\alpha,25-dihidroxivitamina D_{2}, y
1\alpha,25-dihidroxivitamina D_{3}. El análisis
de unión de proteínas y la posterior determinación cuantitativa
preferentemente se llevan a cabo en un ELISA (ensayo
inmunoabsorbente unido a enzimas), RIA (radioinmunoensayo), FIA
(inmunoensayo de fluorescencia), LIA (inmunoensayo de
luminiscencia), ILMA (ensayo inmunoluminométrico) o ECLA (ensayo de
luminiscencia electroquímico). La cantidad de anticuerpo monoclonal
unido preferentemente se determina usando un segundo anticuerpo.
Normalmente el segundo anticuerpo es, por tanto, de una especie
diferente. El anticuerpo monoclonal para el análisis de unión
también puede estar acoplado a un marcador de color, enzimático, de
fluorescencia, de luminiscencia, de quimioluminiscencia (por
ejemplo, acridina) o electroluminiscencia (por ejemplo, complejo de
rutenio) cuantificables.
Un aspecto adicional de la invención se refiere
a un kit de prueba para llevar a cabo el procedimiento anteriormente
mencionado, que incluye uno o más anticuerpos específicos para los
metabolitos de la vitamina D, un trazador de la vitamina D acoplado
a una fase sólida, la proteinasa K, y disoluciones tampón
apropiadas. Las disoluciones tampón preferidas en el kit de prueba
de la invención comprenden un tampón de digestión con agentes
desnaturalizantes y que despliegan las proteínas de unión a la
vitamina D, que entonces son digeridas y destruidas por una serina
proteasa tal como la proteinasa K, un tampón de ensayo, que
comprende preferentemente una sustancia que inhibe la proteinasa K
y un agente que libera un grupo salicílico, preferentemente ácido
salicílico en una cantidad entre 0,1 y 1,0 mol/l, para evitar una
nueva unión inespecífica de la vitamina D a proteínas séricas
parcialmente digeridas.
Como se ha mencionado anteriormente, en el
procedimiento de la invención, la muestra de plasma o suero se
trata antes del análisis con proteinasa K, de tal forma que todas
las proteínas plasmáticas o séricas que se puedan unir a los
metabolitos de la vitamina D son digeridas y cortadas, de manera que
ya no se puedan unir de ninguna forma a la
25-hidroxivitamina D o a cualquier otro metabolito
de la vitamina D. Esto se consigue preferentemente mediante la
digestión con proteinasa K, lo más preferentemente en presencia de
agentes desnaturalizantes de proteínas y agentes de liberación de
vitamina D de manera que las proteínas de unión a vitamina D son
desplegadas y resultan digeridas por la proteasa. Después de eso,
se diluye una alícuota del suero o plasma tratados con la
proteinasa K en una disolución tampón que inhibe y detiene la
actividad de la proteinasa K y que evita una unión inespecífica o
específica de metabolitos de la vitamina D a las proteínas séricas
remanentes, y se determina rápidamente la cantidad en la muestra
del metabolito de la vitamina D deseado usando análisis de unión
por competición sobre anticuerpos, preferentemente anticuerpos
monoclonales que son sustancialmente resistentes a la proteinasa K.
Como se ha mencionado anteriormente, se puede asegurar una digestión
completa de las proteínas de unión a vitamina D mediante la adición
de agentes desnaturalizantes antes de la digestión con una serina
proteasa. Los agentes desnaturalizantes de proteínas útiles son SDS
(0,1%), detergentes, y agentes de liberación de vitamina D tales
como agentes desnaturalizantes ácidos como ácido salicílico,
warfarina, ácidos sulfónicos, ácidos toluensulfónicos, ácido
naftalensulfónico, ácidos anilinonaftalensulfónicos (ANS), de
manera notable el ácido
1-anilinonaftalen-8-sulfónico
(1,8-ANS) y el ácido
8-anilinonaftalen-1-sulfónico
(8-ANS), ácidos salicílicos y sus derivados,
preferentemente en una concentración eficaz de 0,01 a 20 mg/ml, más
preferentemente de 0,1 a 10 mg/ml, lo más preferentemente en
cantidades no inferiores a 0,5 mg/ml de suero. Las can-
tidades y tipos de agentes desnaturalizantes se deben elegir y seleccionar individualmente para cada proteasa sérica.
tidades y tipos de agentes desnaturalizantes se deben elegir y seleccionar individualmente para cada proteasa sérica.
Comparado con procedimientos anteriores, el
procedimiento según la invención tiene la ventaja de que las
proteínas de unión a vitamina D no pueden interferir con la
medición después de su digestión. Nótese que, aparte de las VDBP,
se pueden unir muchas otras proteínas a la vitamina D, por ejemplo,
la albúmina, fetoproteína, etc., y que estas proteínas son
abundantes en el suero. A pesar de que estas proteínas se separan en
gran parte de los metabolitos de la vitamina D en la precipitación
convencional usando etanol o peryodato según procedimientos
conocidos, puede permanecer alguna cantidad remanente en la muestra
y cuando se cambia el tampón se puede renaturalizar durante el
ensayo de unión por competición, y entonces puede interferir con el
análisis de unión. La cantidad de proteína remanente también se
puede unir a la pared de los vasos de precipitados, o a la fase
sólida, y, dependiendo de qué tipo se use, incluso al trazador de la
vitamina D, lo cual falsea gravemente las mediciones. El uso de
agentes de desplazamiento de la vitamina D tales como los compuestos
salicílicos o la warfarina en tampones de liberación o de unión no
resuelve este problema fundamental.
El problema se resuelve fundamentalmente con el
tratamiento del suero o plasma sanguíneos con proteinasa K. En
primer lugar, ese tratamiento enzimático de la proteína plasmática y
sérica es un procedimiento establecido, que es fácil de controlar,
y no existe el riesgo de precipitación inesperada. En segundo lugar,
al contrario de lo que ocurre en una precipitación
desnaturalizante, las proteínas no se pueden volver a renaturalizar
después de la digestión, ni siquiera después de cambiar el medio o
el tampón. Tercero, la digestión se puede extender a voluntad,
hasta que los resultados de la medición se hayan estabilizado, o se
puede intensificar o complementar con la adición de agentes
desnaturalizantes y agentes de liberación de vitamina D. Cuarto, la
digestión usando proteinasa K se puede automatizar fácilmente, a
diferencia de la precipitación de proteínas. Por tanto, el único
problema restante es asegurarse de que el análisis de unión por
competición no es alterado por la presencia de proteinasa K. Según
la invención, este problema se soluciona con un cambio de las
condiciones de pH, la dilución de la proteinasa K en un tampón que
contiene gelatina y, de manera más genérica, variando las
condiciones de manera que inhiban la actividad de la proteinasa K.
La actividad de la proteinasa K se puede inhibir adicionalmente con
la adición de EGTA.
El EGTA es el compuesto químico ácido
etilenglicoltetraacético, un agente quelante que está relacionado
con el compuesto EDTA, más conocido, pero con una afinidad por el
calcio mucho mayor que por los iones magnesio. Es útil para
preparar disoluciones tampón que se asemejen al entorno en el
interior de células vivas, en las que normalmente los iones calcio
están al menos 1000 veces menos concentrados que los iones magnesio.
El pKa para la unión de iones calcio por el EGTA tetrabásico es de
11,00 y el EGTA es, además, un inhibidor de la proteinasa K.
Adicionalmente, el ensayo de unión por competición según la presente
invención se caracteriza por el uso de compañeros de unión que son
sustancialmente resistentes a la proteinasa K. El análisis de unión
por competición según la invención además implica múltiples lavados
que diluyen y arrastran rápidamente del sistema de ensayo las
proteínas no unidas tales como la proteinasa K. Se deben evitar
cantidades remanentes de proteinasa K sobre la pared del vaso de
precipitados o en fase sólida, y en ese caso no interferirán con el
análisis de unión o la determinación de la cantidad de anticuerpos
unidos.
Ventajas, características y formas de
realización adicionales de la invención se describen en la
descripción detallada de la invención, en los ejemplos y en los
dibujos.
La Figura 1 muestra una representación gráfica
de la correlación entre los valores de la
25-hidroxivitamina D sérica medidos directamente
determinados mediante ELISA (digestión con proteinasa K durante 1
hora a 37ºC) de acuerdo con el Ejemplo 1 de la invención, y los
valores determinados mediante ELISA haciendo uso de un reactivo de
disociación de ácido salicílico convencional.
La Figura 2 muestra una representación gráfica
de la correlación entre los valores de la
25-hidroxivitamina D sérica medidos directamente
determinados mediante ELISA (digestión con proteinasa K durante 1
hora a 37ºC) de acuerdo con el Ejemplo 1 de la invención y según se
determina mediante ELISA de 25-hidroxivitamina D de
Immunodiagnostic Systems Limited (IDS) Limited, RU, que hace uso de
un tampón de liberación y disociación privado de IDS que contiene
warfarina.
La Figura 3 muestra una tabla de correlación de
dos procedimientos de referencia analíticos establecidos distintos
para medir la vitamina D, que son la medición por
LC-MS/MS y HPLC.
La Figura 4 muestra una gráfica de Bland y
Altman que representa la diferencia relativa entre los valores de
suero directos obtenidos mediante el procedimiento de IDS y el
procedimiento de referencia por LC-MS/MS según el
Ejemplo 5.
La Figura 5 muestra un diagrama de cajas y
bigotes de las mediciones obtenidas mediante el procedimiento según
la invención y las mediciones de referencia por HPLC, según el
Ejemplo 5.
La Figura 6 muestra una gráfica de correlación
de las mediciones obtenidas mediante el procedimiento según la
invención y las mediciones de referencia por HPLC, según el Ejemplo
5.
La Figura 7 muestra una gráfica de Bland y
Altman que representa la diferencia en porcentaje entre las
mediciones obtenidas mediante el procedimiento de la invención
comparadas con las mediciones medias obtenidas según el Ejemplo
5.
La Figura 8 muestra una gráfica de cajas y
bigotes que compara los valores séricos de vitamina D obtenidos
mediante el procedimiento proteolítico directo según la invención
(ID EIA), un procedimiento de disociación directo (IDS RIA) y tres
procedimientos comerciales indirectos (Roche, DiaSorin RIA y
DiaSorin LIA) y los valores séricos obtenidos mediante la HPLC de
referencia.
La proteinasa K es una serina proteasa de tipo
subtilisina muy activa procedente del hongo Tritirachium
album con una masa de 28.904 Da (Roelcke, D. y Uhlenbruck, G.
(1969) Z. Med. Mikrobiol. Immunol. 155, 156-170).
La enzima tiene una amplia especificidad para proteínas nativas y
desnaturalizadas y se usa habitualmente en la purificación de ADN y
ARN. Los agentes desnaturalizantes tales como el dodecilsulfato
sódico (SDS) o la urea, así como temperaturas elevadas de 50 a 60ºC
aumentan su actividad. La concentración recomendada es de 50 a 100
\mug/ml para la eliminación de la proteína y la activación de la
enzima, y de hasta 2 mg/ml para el tratamiento de tejidos. En la
eliminación de las proteínas plasmáticas y séricas, la proteinasa K
se usó preferentemente a una concentración final de 100 a 300
\mug/ml de suero de 37 a 50ºC. La proteinasa K normalmente se
prepara en una disolución madre de 20 mg/ml (600 mAU/ml) a partir de
un polvo liofilizado, y se almacena a -20ºC hasta su uso. La enzima
se activa en el intervalo de pH de 7,5 a 12. Alcanza su máxima
actividad catalítica de 50 a 60ºC. La proteinasa K requiere la
presencia de iones calcio para su estabilidad, pero no para su
actividad proteolítica. Según la invención, la digestión de las
proteínas en el plasma o suero sanguíneos normalmente se produce
durante un periodo de 60 minutos de 25 a 50ºC, preferentemente de 30
a 40ºC, lo más preferentemente de 37ºC con 200 \mug/ml de
proteinasa K (a partir de una disolución madre que contiene 20 mg
de proteinasa K/ml en Tris HCl 50 mM, pH 8,0; CaCl_{2} 10 mM),
opcionalmente en presencia de SDS al 0,1% o de agentes de
liberación de vitamina D tales como la warfarina,
8-ANS, 1,8-ANS, ácidos
toluensulfónicos y similares, más preferentemente en presencia de
0,1 a 10 mg/ml, lo más preferentemente de 0,5 a 2 mg/ml de
8-ANS.
Los estudios cristalográficos de difracción por
rayos X han demostrado que la proteinasa K presenta dos sitios de
unión de iones calcio (Bajorath y col., 1989, Nature 337,
481-484). A pesar de que el Ca^{2+} no participa
de manera directa en el mecanismo catalítico, su eliminación reduce
la actividad de la proteinasa K al 20% aproximadamente del valor
original, medida usando un sustrato patrón de
Succinil-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilida
sintético. Según la invención, la eliminación del Ca^{2+} se
consigue con la adición de agentes secuestradores y quelantes,
tales como etilendiamintetraacetato (EDTA) o
etilenglicoltetraacetato (EGTA) en una concentración de, por
ejemplo, 2 a 10 mmol/ml. La proteinasa K se desactiva adicionalmente
mediante inhibidores de serina proteasa tales como fluoruro de
fenilmetilsulfonilo (PMSF), diisopropilfluorofosfato (DFP) o
fluoruro de 4-(2-aminoetil)bencenosulfonilo
(AEBSF). El AEBSF tiene un espectro de actividad similar al PMSF,
pero es considerablemente más estable, especialmente en un entorno
de pH bajo. Normalmente, se usan disoluciones con una concentración
de 0,1 a 1 mM. Reactivos de sulfhidrilo, tales como
para-cloromercuriobenzoato (PCMB),
L-1-tosilamido-2-feniletilclorometilcetona
(TPCK),
N-alfa-p-tosil-L-lisil-clorometilcetona,
N-etilmaleimida (NEM), yodacetamida, y
o-fenantrolina, tienen sólo una influencia limitada
sobre la actividad de la proteinasa K.
El pH de la muestra se ajusta de 3,0 a 10,0,
preferentemente de 7,0 a 8,0 para el análisis de unión de proteínas
sobre el anticuerpo. En una realización especialmente preferida, el
análisis de unión de proteínas sobre el anticuerpo se lleva a cabo
a un pH de 6,0 a 8,0. Además, los tampones contienen un exceso de
agentes secuestradores y quelantes tales como
etilendiamintetraacetato (EDTA) o etilenglicoltetraacetato (EGTA),
por ejemplo, entre 2 y 10 mmol/ml, para unir el Ca^{2+} libre. No
es necesario añadir iones Ca^{2+} para la digestión con la
proteinasa K, puesto que la concentración natural de calcio en el
suero es suficiente, para contrarrestar cualquier actividad
remanente de la proteasa. Finalmente, el tampón de dilución para el
análisis de unión de proteínas contiene del 0,5 al 10% en peso de
gelatina, preferentemente del 0,5 al 2% en peso de gelatina, así
como 1 mmol/l de \beta-mercaptoetanol. Por tanto,
el tampón de unión preferentemente contiene un tampón con 50 mmol/l
de tampón NaH_{2}PO_{4}/Na_{2}HPO_{4}, pH 6,0 a 10,0 (se
prefiere pH 8,0), 1 al 2% de gelatina (se prefiere del 0,05 al
0,5%), 2-5 mmol/l de EGTA,
\beta-mercaptoetanol 0,005-2 mM
(se prefiere el 0,005% en peso), así como, opcionalmente, un
inhibidor de la proteinasa K.
Opcionalmente, se puede añadir del 0,1 al 5% en
peso, preferentemente del 1 al 3% en peso, de ciclodextrina natural
y/o modificada químicamente, para evitar interferencias con ácidos
grasos libres, colesterol y otros lípidos en el análisis de unión.
En una realización preferida, los tampones de lavado y dilución
contienen por tanto ciclodextrina, para el secuestro y
enmascaramiento de moléculas que interfieran tales como ácidos
grasos, colesterol, etc. La ciclodextrina se añade preferentemente
del 0,1 al 10% en peso, preferentemente del 0,2 a 7,5% en peso, lo
más preferentemente del 1 al 5% en peso, basado en la concentración
final de la muestra. La ciclodextrina también puede estar
modificada químicamente, por ejemplo, con grupos metilo, etilo,
propilo, hidroxietilo, 2-hidroxipropilo, glicosilo,
maltosilo, carboximetilo. Las ciclodextrinas naturales y la
2-hidroxipropil-\beta-ciclodextrina
son especialmente preferidas.
El procedimiento según la invención es adecuado
para la determinación cuantitativa de la
25-hidroxivitamina D_{2}, la
25-hidroxivitamina D_{3}, y, en una realización
alternativa, para la determinación de la
1\alpha,25-dihidroxivitamina D_{2} y la
1\alpha,25-dihidroxivitamina D_{3}. Si se tiene
que determinar la concentración de la hormona D es necesaria la
purificación de la muestra, aparte de la forma de almacenamiento de
la vitamina D. La hormona D se identifica mediante la unión a un
anticuerpo, que es específico para las especies dihidroxi. Se
conocen anticuerpos monoclonales, que son específicos para la
hormona D, pero no para la 25-hidroxivitamina D.
El ensayo de unión a proteínas según la
invención se puede llevar a cabo en forma de ELISA (ensayo
inmunoabsorbente unido a enzimas) o de RIA (radioinmunoensayo). Se
prefieren especialmente sistemas no radiactivos basados en
marcadores fluorescentes y quimioluminiscentes (FIA o LIA). Si el
trazador de la vitamina D está acoplado a una enzima, por ejemplo,
a una fosfatasa alcalina o a un marcador fluorescente o
quimioluminiscente, entonces la fase sólida o la pared del vaso de
reacción normalmente está recubierta con anticuerpos contra el
compuesto de vitamina D a determinar.
En el procedimiento según la invención, es
ventajoso que la determinación cuantitativa de los metabolitos de
la vitamina D se pueda llevar a cabo directamente en una muestra
líquida tal como suero o plasma. La muestra no necesita preparación
como en el caso de la precipitación de proteínas, extracción
orgánica y/o cromatografía en columna problemáticas. En vez de eso,
los metabolitos de la vitamina D que se deben determinar se
desasocian de sus sitios de unión mediante digestión con la
proteasa K de las proteínas de unión a vitamina D (VDBP, albúmina y
muchas otras). Naturalmente, los compuestos salicílicos pueden
desasociar los metabolitos de la vitamina D de una proteína in
vitro, pero este procedimiento no puede evitar la participación
de proteínas derivadas en forma reactivada en los análisis de
unión. Nuestros análisis sugieren que el complejo proteína de unión
a vitamina D/salicilato también se absorbe sobre la pared y
posteriormente también se unirá al trazador de la vitamina D. Como
se ha mencionado previamente, las proteínas de unión a vitamina D no
sólo comprenden las VDBP altamente específicas
(Gc-globulina o componente específico de grupo),
sino también proteínas abundantes tales como albúmina,
\alpha-fetoproteína y muchas otras. Estas
proteínas también se pueden unir a la
25-hidroxivitamina D y a la
1\alpha,25-dihidroxivitamina D con mayor o menor
especificidad y afinidad. Si la purificación de las muestras de
vitamina D es comparativamente incompleta, como en el caso de la
precipitación de proteínas mediante etanol o por desnaturalización,
entonces las proteínas que permanecen en la disolución de muestra
se pueden unir al trazador de la vitamina D durante el ensayo de
unión por competición, y la determinación cuantitativa de vitamina
D depende de casualidades, tales como la completitud de la
precipitación de proteínas y de la cantidad de colesterol en la
muestra. La extracción orgánica y/o purificación cromatográfica de
los compuestos de vitamina D no mejora la determinación
cuantitativa, debido a que estas etapas también influyen y varían
la cantidad de vitamina D que puede rastrearse, dependiendo de las
propiedades de la muestra - entre otras, de cuántas proteínas de
unión a vitamina D están presentes en la muestra, o de si es
lipaémica, etc. Por otra parte, el procedimiento según la presente
invención tiene la ventaja de que no es necesaria una purificación
propensa a errores de los metabolitos de la vitamina D y de que el
ensayo de unión a proteínas se lleva a cabo directamente en el
plasma o suero.
La invención también comprende el uso de
derivados de la vitamina D con la fórmula I:
en la que Z es el átomo de oxígeno
o azufre de un grupo éter o un carbono; X es un resto hidrocarbonado
sustituido o no sustituido de 0,8 a 4,2 nm de longitud; Y es
hidrógeno o un grupo hidroxilo; A es una fase sólida (pared del
vaso, cuentas, partículas sólidas marcadas o partículas magnéticas),
o un grupo funcional, que puede estar unido mediante una proteína
que resiste a la proteinasa K con una alta afinidad, por ejemplo,
anticuerpos monoclonales o estreptavidina, para el acoplamiento del
derivado funcional de la vitamina D a la fase sólida; R es la
cadena lateral del metabolito de la vitamina D, preferentemente de
la cadena lateral 25-hidroxilada de la vitamina
D_{2} o la vitamina
D_{3}.
El enlazador X es un grupo C_{8} a C_{12},
que puede contener heteroátomos habituales tales como S, O, N o P,
un péptido, una cetona o un resto aminopoliéter sustituido o sin
sustituir con una longitud de 0,8 a 4,2 nm, preferentemente de 0,9
a 1,5 nm aproximadamente, lo más preferentemente un ácido
aminoundecanoico o un grupo enlazador hexamido, octamido o
decamido-amidopropilo. Este hueco entre el grupo A y
el determinante antigénico de la vitamina D, que comprende la
cadena lateral R y el grupo Y, permite que los anticuerpos
monoclonales se puedan unir sin interferencia de la fase sólida. Se
prefieren la 25-hidroxivitamina
D-3\beta-3-[6-N-(biotinil)hexamido]amidopropiléter
y el compuesto de 1\alpha,25-dihidroxivitamina D
biotina correspondiente, que están acoplados a la fase sólida a
través de la estreptavidina.
El procedimiento según la invención permite por
tanto una determinación cuantitativa no radiactiva de la
25-hidroxivitamina D y la
1\alpha,25-dihidroxivitamina D en suero o plasma
sin necesidad de una preparación compleja de la muestra. Por
consiguiente, el procedimiento es especialmente adecuado para la
prueba secuencial para la profilaxis de la osteoporosis.
Un aspecto adicional de la invención se refiere
a un kit de reactivos para la determinación de metabolitos de la
vitamina D tales como la 25-hidroxivitamina D y la
1\alpha,25-dihidroxivitamina D que comprende,
entre otros, un derivado funcional de la vitamina D y una
disolución apropiada de la proteinasa K. Opcionalmente, el kit
comprende anticuerpos anti-vitamina D, que significa
anticuerpos contra la 25-hidroxivitamina D_{2/3}
o la 1\alpha,25-dihidroxivitamina D_{2/3} o
metabolitos diferentes de la vitamina D, placas de microvaloración
recubiertas y/o micropartículas y reactivos magnéticos o
diferentes.
En principio, en lugar de muestras de plasma o
de suero, se pueden analizar directamente productos alimenticios,
tales como leche o queso, etc., para su contenido en vitamina D. En
ciertos casos, puede ser obvia la eliminación de sustancias que
interfieran mediante extracción o precipitación de la muestra,
dependiendo del carácter de la matriz. Las interferencias de las
proteínas de unión a vitamina D que permanecen después de la
purificación se pueden eliminar entonces mediante digestión con
proteinasa K.
Se acopló la 25-hidroxivitamina
D-3\beta-3-[6-N-(biotinil)hexamido]amidopropiléter
a una fase sólida a través de estreptavidina. Para ello, primero se
introdujeron porciones de 100 ng de estreptavidina en las cavidades
de una placa de microvaloración, disueltos en 200 \mul de
bicarbonato sódico 60 mM a pH 9,6, y la placa se incubó durante
toda la noche a 4ºC. A continuación se retiraron las disoluciones de
estreptavidina y las cavidades se lavaron 5 veces con 200 \mul de
la disolución tampón de lavado (tampón fosfato 50 mmol/l, pH 6,0,
Tween 20 al 0,05%). A continuación se introdujeron 250 \mul de
tampón de bloqueo (tampón fosfato, pH 6,0 con caseína al 0,5%,
gelatina al 1%, timerosal al 1%) en cada cavidad, se incubó durante
1 hora y a continuación se retiró, y cada cavidad se lavó de nuevo
5 veces con 200 \mul de tampón de lavado. A continuación, se
introdujeron 10 ng de
25-biotina-hidroxivitamina D en 200
\mul de tampón de lavado en cada una de las cavidades, se incubó
durante toda la noche en oscuridad con agitación de 2 a 8ºC, las
disoluciones de biotina-vitamina D se retiraron y
las cavidades se lavaron de nuevo 5 veces con 200 \mul de tampón
de lavado. A esto le siguió la unión de un anticuerpo de ratón
monoclonal (ID2) con vitamina D en presencia de
25-hidroxivitamina D del patrón líquido o de una
muestra.
Las muestras de suero y plasma sólo se
almacenaron durante un corto periodo de tiempo a temperatura
ambiente. Si el análisis se lleva a cabo en las 24 horas siguientes
a la recogida de la muestra, la muestra se almacena de 4 a 8ºC. En
otro caso, las muestras se almacenan a -20ºC hasta su análisis. Se
evita la congelación y descongelación múltiple de la muestra. La
hemólisis no interfiere con los resultados. No se puede usar sangre
completa como material de muestra. Las muestras lipémicas se
centrifugaron durante 10 minutos a 30.000 g aproximadamente, y la
fase acuosa se retiró a continuación a través de la capa grasa
sobrenadante usando una pipeta. En el caso de muestras altamente
lipaémicas, se usó un kit de deslipidación.
80 \mul de plasma o suero sanguíneo se
añadieron a 800 \mul de disolución de proteinasa K (200 \mug/ml
de proteinasa K en Tris\cdotHCl 50 mM, pH 8,0; CaCl_{2} 10 mM,
SDS al 10% o 1 mg/ml de 8-ANS), se mezcló bien y se
incubó durante 1 hora a 37ºC en un baño de agua. Durante este tiempo
la proteinasa K rompe las VDBP (Gc-globulina) y
otras proteínas séricas de unión a vitamina D tales como albúmina
hasta un grado en el que ya no se pueden unir a
25-hidroxivitamina D_{2/3} o dihidroxivitamina
D_{2/3}.
Se introdujeron 200 \mul de anticuerpo
monoclonal de ratón
anti-25-OH-vitamina
D (1:125.000) en tampón de lavado (tampón fosfato 50 mM, pH 8,0,
EGTA 2,0 mM, \beta-mercaptoetanol al 0,005%, 0,1%
(p/v) de gelatina, opcionalmente, del 0,5 al 10% de ácido
salicílico) y 20 \mul de patrón, de control o de muestra en cada
una de las cavidades. La placa de microvaloración se agitó durante
toda la noche en oscuridad de 8 a 10ºC. La
25-hidroxivitamina D en la muestra competiría con el
trazador de la vitamina D en la pared por los sitios de unión sobre
el anticuerpo monoclonal anti-vitamina D. A
continuación las disoluciones se retiraron de las cavidades y cada
una de las cavidades se lavó 5 veces con 250 \mul de tampón de
lavado.
El pH, la gelatina en el tampón y la retirada
del Ca^{2+} libre mediante el EGTA consiguieron que el anticuerpo
monoclonal no resultase roto por cualquier cantidad remanente de
proteinasa K durante el análisis de unión por competición. No
obstante, las proteínas de unión a vitamina D presentes en la
muestra, tales como la seroalbúmina, ya no se podían unir al
trazador de la vitamina D, que a menudo da lugar en el estado de la
técnica a contenidos en vitamina D erróneamente elevados.
Se disolvieron 200 \mul de conjugado (marcado
con anticuerpo de cabra
anti-ratón-MAB-peroxidasa)
a 1:2500 en tampón de lavado, se introdujeron en las cavidades, y
se incubaron durante una hora a temperatura ambiente mientras se
agitaba. A continuación las disoluciones se retiraron y cada una de
las cavidades se lavó 5 veces con 250 \mul de tampón de lavado.
Para la reacción de color, se introdujeron 200 \mul de una
disolución sustrato de tetrametilbencidina (TMB) (de BioFX
Laboratories Inc.) en las cavidades. Después de 20 minutos, la
generación de color se detuvo con la adición de 50 \mul de
H_{2}SO_{4} 2 M por cavidad. Las mediciones de la densidad
óptica se llevaron a cabo en un fotómetro a 450 nm con una longitud
de onda de referencia de 620 nm (o 690 nm).
Para determinar el límite de detección del
sistema de ensayo según la invención, esencialmente se llevó a cabo
la unión por competición y las mediciones del Ejemplo 1, excepto que
la muestra no contenía cantidades normales de metabolito de la
vitamina D o contenía cantidades normales de metabolito de la
vitamina definidas. Los resultados se presentan en la Tabla I
siguiente.
\vskip1.000000\baselineskip
La DO media para la muestra del blanco fue de
1,41, con una desviación estándar de 0,05 unidades de DO. El límite
de detección de la 25-hidroxivitamina D fue
únicamente de 2 nmol/l, que es de 0,8 ng/l aproximadamente (valor
medio - 2 x desviación estándar, insertado en las curvas de
calibración), que es completamente suficiente para la determinación
de un intervalo fisiológicamente relevante de concentraciones de
vitamina D en suero.
Se determinó la correspondencia entre las
mediciones independientes para el sistema proteolítico 1. La
precisión resulta de la desviación estándar y de las desviaciones
estándar relativas (los coeficientes de variación) entre los
valores discretos y la media. Se usó una muestra de suero patrón
como muestra de referencia positiva. La concentración media fue de
41,4 nmol de 25-OH-Vit.D/l. Para los
valores restantes, se usó el límite de detección determinado. Los
resultados para la muestra sérica se presentan en la Tabla II.
La precisión entre series de análisis separados
(inter-ensayos) representa las variaciones de uno o
más factores conocidos y desconocidos. Para conseguir esto, se
preparó la muestra anterior y se analizó 10 veces en días
diferentes. Los resultados se presentan en la Tabla III:
Por tanto, la varianza del
inter-ensayo es del 8,31%
Se determinó la precisión de las mediciones con
una correlación de los resultados cuantitativos procedentes de
sistemas de prueba diferentes para la detección de los mismos
analitos. El objeto del análisis de correlación era, por una parte,
el sistema proteolítico según la invención y, por otra, un ELISA
según los documentos DE 10144 905 y EP1097132. Los procedimientos
diferían principalmente en la preparación de las muestras. El
procedimiento proteolítico se llevó a cabo como se ha descrito en el
Ejemplo 1. La Figura 1 y la Tabla IV muestran una correlación de
las mediciones.
\vskip1.000000\baselineskip
El análisis de correlación muestra ventajas
diferentes para el protocolo proteolítico de la invención y la
medición directa en suero. Especialmente en el caso de suero
deficiente, se producen resultados de valores demasiado elevados
después de las disociaciones, en los que presumiblemente proteínas
séricas y plasmáticas de unión a la vitamina D, tales como las VDBP
(Gc-globulina) unen el trazador de la vitamina D a
la fase sólida. Por tanto, el nivel de Gc-globulina
en suero o plasma interfiere con la determinación de la vitamina D.
El análisis de correlación muestra una regresión de desviación a
valores bajos de vitamina D.
Además, el procedimiento según la invención se
comparó con un inmunoensayo enzimático de la vitamina D comercial
de IDS Ltd., RU. El kit de la 25-hidroxivitamina D
de IDS es un inmunoensayo enzimático para la determinación
cuantitativa de 25-hidroxivitamina D y otros
metabolitos hidroxilados en suero o plasma. En él, el patrón, los
controles y las muestras se tratan con un tampón de disociación
privado de IDS (que probablemente contiene warfarina como agente de
desplazamiento de la vitamina D), a continuación se añade una
cantidad conocida de 25-hidroxivitamina D como
competidor de unión, y las muestras diluidas de esta forma se
incuban durante 2 horas en las cavidades de una placa de
microvaloración, que están recubiertas con un anticuerpo específico
para la 25-hidroxivitamina D, a continuación se
aspiran y finalmente las placas se lavan. La unión de biotina
marcada con 25-hidroxivitamina D se detectó con
avidina marcada con peroxidasa de rábano, que se une selectivamente
a la biotina. Después de una etapa de lavado adicional, se llevó a
cabo el revelado del color en un sustrato cromogénico (TMB) como en
el Ejemplo 1. La absorción de la mezcla de reacción interrumpida se
midió en fotómetro de placas de microvaloración, en el que la
intensidad medida del color era inversamente proporcional a la
concentración de 25-hidroxivitamina D. El kit de
prueba de IDS usa un reactivo propiedad de la empresa no descrito
para la disociación de la 25-hidroxivitamina D y sus
metabolitos de las proteínas de unión en suero o plasma.
La Figura 2 muestra la correlación de los
resultados cuantitativos únicos (84 sueros) de los dos
procedimientos/prueba para la detección de
25-hidroxivitamina D y sus metabolitos hidrolizados.
Los resultados están alrededor y son paralelos a la recta de
identidad. El coeficiente de correlación R es de 0,969. No obstante,
la regresión está paralela. Por tanto, el ELISA de IDS con el
procedimiento de disociación produce valores demasiado elevados de
manera consistente.
La Figura 3 muestra una tabla de correlación de
dos procedimientos de referencia analíticos establecidos diferentes,
que se miden por HPLC y LC-MS/MS. Muestra que estos
dos procedimientos están en concordancia de manera que se pueden
usar como referencia para determinar la precisión de los valores
obtenidos mediante los inmunoensayos directos e indirectos de la
vitamina D.
Se analizó un grupo de 291 muestras usando el
ensayo comercial de IDS (véase Ejemplo 4) y los resultados se
compararon con los resultados obtenidos usando el análisis por
LC-MS/MS. La preparación de la muestra y el ELISA
se llevaron a cabo ciñéndose estrictamente a las instrucciones
suministradas con el kit de prueba. La Figura 4 es una gráfica
Bland y Altman que representa la diferencia relativa entre las
mediciones obtenidas por los dos procedimientos (Bland JM, Altman
DG (1986) Statistical method for assessing agreement between two
methods of clinical measurement. The Lancet, i,
307-310; Bland JM, Altman DG (1999) Measuring
agreement in method comparison studies. Statistical Methods in
Medical Research, 8, 135-160).
La distribución de las mediciones muestra que a
concentraciones más bajas (clínicamente relevantes), el
procedimiento de IDS lleva a sobreestimar el contenido en vitamina
D, mientras que a concentraciones más altas, el procedimiento de
IDS subestima el contenido en vitamina D.
Se analizó un grupo adicional de 40 muestras
usando el procedimiento según la presente invención y usando la
medición por HPLC. Los resultados se presentan en la Tabla 5.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
No hubo medición por HPLC para la muestra 6, que
por tanto se ignoró. Los dos grupos de mediciones se compararon
usando la prueba t de muestras emparejadas, como se presenta en la
Tabla VI.
La prueba t de muestras emparejadas muestra que
no hay diferencias significativas entre las mediciones obtenidas
mediante el procedimiento según la invención comparadas con las
mediciones de referencia por HPLC. La Figura 5 es una gráfica de
cajas y bigotes de las mediciones obtenidas mediante los dos
procedimientos, que muestra un patrón de distribución similar
obtenido por las mediciones usando el procedimiento de la invención
y el procedimiento de referencia. La Figura 6 es una gráfica de
correlación de los dos procedimientos, que visualiza la gran
concordancia de los valores obtenidos por los procedimientos. La
Figura 7 muestra la diferencia en porcentaje entre los resultados
usando el procedimiento de la invención comparado con las mediciones
de referencia por HPLC. Se demuestra una sobreestimación muy baja
(<2%) por el procedimiento proteolítico comparado con el de
referencia, y la consistencia de las mediciones.
Las muestras se analizaron adicionalmente usando
diferentes procedimientos comerciales. La distribución de los
resultados está representada en la gráfica de cajas y bigotes de la
Figura 8. Esta muestra que los ensayos de la vitamina D de DiaSorin
(LIA y RIA) (DiaSorin S.p.A.) y el ensayo de IDS proporcionan de
manera consistente resultados demasiado bajos comparados con las
mediciones de referencia por HPLC, mientras que el procedimiento de
la invención, así como el ensayo de prueba de la vitamina D de
Elecsys (Roche Diagnostics) proporciona lecturas comparables a las
de la referencia. No obstante, la prueba de Roche es un
procedimiento indirecto y requiere la preparación de la muestra, lo
que supone una desventaja comparado con el procedimiento de la
invención.
Estos resultados muestran claramente que el
procedimiento de medición directo según la invención proporciona
una mejor correlación con los procedimientos de referencia
establecidos comparado con la técnica anterior.
Claims (9)
1. Un procedimiento para cuantificar metabolitos
de la vitamina D directamente en plasma o suero sanguíneos, sin
necesidad de purificación previa de los metabolitos de la vitamina
D, que comprende las siguientes etapas:
(a) adición de una cantidad apropiada de una
serina proteasa con actividad endo y exoproteolítica a una muestra
que contiene plasma o suero sanguíneos y la digestión de las
proteínas de unión a vitamina D en el plasma o suero sanguíneos,
hasta que ya no puedan unir más metabolitos de la vitamina D;
(b) dilución de dicha muestra que contiene la
serina proteasa, los metabolitos de la vitamina D y las proteínas
plasmáticas o séricas digeridas usando un tampón de dilución, en el
que la serina proteasa es sustancialmente inactiva;
(c) proporción de una composición trazadora de
la vitamina D, que está acoplada a una fase sólida;
(d) proporción de un anticuerpo monoclonal
contra los metabolitos pertinentes de la vitamina D;
(e) combinación de la muestra con los
metabolitos de la vitamina D, la fase sólida con la composición
trazadora de la vitamina D y el anticuerpo monoclonal, y la
realización durante un periodo de tiempo predeterminado de una
reacción de unión competitiva entre los metabolitos de la vitamina
D, el trazador de la vitamina D unido a una fase sólida y el
anticuerpo monoclonal en un tampón de unión en el que la serina
proteasa es sustancialmente inactiva;
(f) separación de la fase sólida con el
compuesto trazador de la vitamina D y del anticuerpo monoclonal
unido del tampón de unión, y opcionalmente, el lavado de la fase
sólida; y
(g) determinación de la cantidad de anticuerpo
monoclonal sobre la fase sólida, y cuantificación de los metabolitos
de la vitamina D en el plasma o suero sanguíneos por correlación
con muestras patrón.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que la serina proteasa es proteinasa K.
3. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones 1 ó 2, en el que el anticuerpo monoclonal se une a
uno o más de 25-hidroxivitamina D_{3},
25-hidroxivitamina D_{2},
1\alpha,25-dihidroxivitamina D_{2} y
1\alpha,25-dihidroxivitamina D_{3}.
4. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que el metabolito de la vitamina D
medido directamente se selecciona del grupo constituido por
25-hidroxivitamina D_{2},
25-hidroxivitamina D_{3},
1\alpha,25-dihidroxivitamina D_{2} y
1\alpha,25-dihidroxivitamina D_{3}.
5. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que el ensayo de unión a proteínas es
uno de ELISA (ensayo inmunoabsorbente unido a enzimas), RIA
(radioinmunoensayo), FIA (inmunoensayo de fluorescencia), LIA
(inmunoensayo de luminiscencia), o ILMA (ensayo
inmunoluminométrico).
6. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que la digestión de la proteína de la
etapa a) se lleva a cabo dentro de un intervalo de pH de 6,0 a 10 en
presencia de 0,1 a 10 mg/ml de uno o más agentes desnaturalizantes
de proteínas y agentes de liberación de vitamina D seleccionados
entre ácido salicílico, ácido toluensulfónico, ácidos
naftalensulfónicos, ácidos anilinonaftalensulfónicos, dodecilsulfato
sódico, warfarina.
7. Kit de prueba para cuantificar metabolitos de
la vitamina D directamente en plasma o suero sanguíneos, que
comprende al menos
(i) uno o más anticuerpos específicos de
metabolitos de la vitamina D,
(ii) un trazador de la vitamina D que está
acoplado a una fase sólida,
(iii) proteinasa K en forma de disolución
madre,
(iv) un tampón para uso con la proteinasa K que
comprende uno o más agentes desnaturalizantes de proteínas y
agentes de liberación de vitamina D seleccionados entre ácido
salicílico, ácido toluensulfónico, ácidos naftalensulfónicos,
ácidos anilinonaftalensulfónicos, dodecilsulfato sódico,
warfarina;
(v) un tampón para uso con el ensayo de unión
competitivo que comprende adicionalmente un inhibidor de la
proteinasa K.
8. El kit de prueba de la reivindicación 7, en
el que el tampón (v) comprende EGTA de 0,1 a 50 mM y del 0,5 al 10%
(p/p) de compuestos salicílicos y sus derivados.
9. El kit de prueba de la reivindicación 7, en
el que el tampón (v) comprende agentes desnaturalizantes y agentes
de liberación de vitamina D en una cantidad para obtener una
concentración final de 0,1 a 10 mg/ml.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE102007005099 | 2007-02-01 | ||
| DE102007005099 | 2007-02-01 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2348126T3 true ES2348126T3 (es) | 2010-11-30 |
Family
ID=39262786
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES08708477T Active ES2348126T3 (es) | 2007-02-01 | 2008-01-30 | Determinación directa de la vitamina d en suero o plasma. |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7964363B2 (es) |
| EP (1) | EP2126586B1 (es) |
| JP (1) | JP5185291B2 (es) |
| AT (1) | ATE472734T1 (es) |
| AU (1) | AU2008209736B2 (es) |
| DE (1) | DE602008001667D1 (es) |
| DK (1) | DK2126586T3 (es) |
| ES (1) | ES2348126T3 (es) |
| HR (1) | HRP20100532T1 (es) |
| PL (1) | PL2126586T3 (es) |
| PT (1) | PT2126586E (es) |
| WO (1) | WO2008092917A1 (es) |
Families Citing this family (55)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP5143046B2 (ja) * | 2009-02-12 | 2013-02-13 | 富士フイルム株式会社 | 被験物質の測定方法及び該測定方法を実施するためのキット |
| GB0903469D0 (en) * | 2009-03-02 | 2009-04-08 | Axis Shield Diagnostics Ltd | Assay |
| EP2427484B1 (en) * | 2009-05-06 | 2016-07-06 | OPKO Ireland Global Holdings, Limited | Method and composition for measuring the amount of vitamin d derivatives |
| US20110097733A1 (en) | 2009-10-27 | 2011-04-28 | Michel Anciaux | Process for the production of a hybridoma and antibody obtained therefrom, able to recognize more than one vitamin d metabolite |
| EP2372365A1 (en) * | 2010-04-01 | 2011-10-05 | Future Diagnostics B.V. | Direct immunoassay for vitamin D |
| EP2572204B1 (en) | 2010-05-20 | 2017-12-27 | Roche Diagnostics GmbH | Release reagent for vitamin d compounds |
| WO2012091569A1 (en) * | 2010-12-28 | 2012-07-05 | Future Diagnostics B.V. | Release reagent for vitamin d |
| US9052308B2 (en) | 2011-01-07 | 2015-06-09 | The General Hospital Corporation | Assays and methods of treatment relating to vitamin D insufficiency |
| WO2014179737A2 (en) | 2013-05-03 | 2014-11-06 | The General Hospital Corporation | Assays and methods of treatment relating to vitamin d insufficiency |
| US9329190B2 (en) | 2011-01-07 | 2016-05-03 | The General Hospital Corporation | Assays and methods of treatment relating to vitamin D insufficiency |
| WO2012129650A1 (en) * | 2011-03-25 | 2012-10-04 | Nanospeed Diagnostics Inc. | Lateral flow immunoassay for detecting vitamins |
| US9140711B2 (en) | 2011-04-04 | 2015-09-22 | Immundiagnostik Ag | Determination of vitamin D metabolites in dried blood |
| US8785603B2 (en) | 2011-05-20 | 2014-07-22 | Siemens Healthcare Diagnostics Inc. | Antibodies to 25-hydroxyvitamin D2 and D3 and uses thereof |
| JP6038945B2 (ja) * | 2011-11-18 | 2016-12-07 | エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ | ビタミンｄ化合物に関する遊離試薬 |
| CA2862260A1 (en) | 2011-11-29 | 2013-06-06 | Academisch Ziekenhuis Groningen | Methods and kits for determining protein-bound biomarkers |
| JP6171333B2 (ja) * | 2012-12-26 | 2017-08-02 | 東ソー株式会社 | 安定化したビタミンｄ類標準液 |
| US10983136B2 (en) | 2013-01-28 | 2021-04-20 | Diasorin S.P.A. | Use of 1,25-dihydroxyvitamin D values in ratio with PTH as a prognostic biomarker |
| DK2759550T3 (en) * | 2013-01-28 | 2018-11-26 | Diasorin S P A | Method and kit for detecting vitamin 1,25-dihydroxy-D and related antibodies |
| US11261257B2 (en) | 2013-01-28 | 2022-03-01 | Diasorin S.P.A. | Methods for detecting 1,25-dihydroxyvitamin D and related antibodies |
| RU2621154C2 (ru) * | 2013-02-06 | 2017-05-31 | Фуджиребайо Инк. | Способ определения и набор для определения витамина d |
| US9618523B2 (en) * | 2013-02-28 | 2017-04-11 | Siemens Healthcare Diagnostics Inc. | Methods and reagents for determining isomeric analytes |
| US10073103B1 (en) | 2013-03-11 | 2018-09-11 | Theranos Ip Company, Llc | Rapid measurement of total vitamin D in blood |
| US20140273021A1 (en) * | 2013-03-14 | 2014-09-18 | Enzo Biochem, Inc. | Vitamin d assays |
| DE102013205055A1 (de) | 2013-03-21 | 2014-09-25 | Orgentec Diagnostika Gmbh | Verfahren und Reagenz zur Bestimmung von Vitamin D Metaboliten |
| ES2724537T3 (es) * | 2013-12-03 | 2019-09-11 | Immunodiagnostic Systems Ltd | Procedimiento para cuantificar un analito, y un dispositivo analítico automático configurado para poner en práctica dicho procedimiento |
| US20150212099A1 (en) | 2014-01-30 | 2015-07-30 | General Atomics | Methods and compositions for assaying vitamin d |
| AU2015220754A1 (en) | 2014-02-20 | 2016-08-25 | Immundiagnostik Ag | In vitro diagnostic and prognosis of contrast induced nephropathy (CIN) in patients undergoing coronary angiography |
| JP6456969B2 (ja) * | 2014-02-21 | 2019-01-23 | マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー | 膨張顕微鏡法 |
| ES2698518T3 (es) * | 2014-12-17 | 2019-02-05 | Siemens Healthcare Diagnostics Inc | Medición de ensayo precisa de analitos hapténicos hidrófobos |
| US10526649B2 (en) | 2015-04-14 | 2020-01-07 | Massachusetts Institute Of Technology | Augmenting in situ nucleic acid sequencing of expanded biological samples with in vitro sequence information |
| US10059990B2 (en) | 2015-04-14 | 2018-08-28 | Massachusetts Institute Of Technology | In situ nucleic acid sequencing of expanded biological samples |
| US11408890B2 (en) | 2015-04-14 | 2022-08-09 | Massachusetts Institute Of Technology | Iterative expansion microscopy |
| EP3332258B1 (en) | 2015-08-07 | 2020-01-01 | Massachusetts Institute of Technology | Protein retention expansion microscopy |
| CA2994958C (en) | 2015-08-07 | 2024-02-13 | Massachusetts Institute Of Technology | Nanoscale imaging of proteins and nucleic acids via expansion microscopy |
| US10852310B2 (en) | 2015-12-11 | 2020-12-01 | Opko Diagnostics, Llc | Fluidic systems involving incubation of samples and/or reagents |
| US10338084B2 (en) | 2016-04-07 | 2019-07-02 | Quidel Corporation | Processing reagent and use thereof in assays for detection of analytes associated with a binding protein |
| CA3031355C (en) | 2016-07-29 | 2023-05-23 | Diazyme Laboratories, Inc. | Methods and compositions for assaying vitamin d |
| WO2018136856A1 (en) | 2017-01-23 | 2018-07-26 | Massachusetts Institute Of Technology | Multiplexed signal amplified fish via splinted ligation amplification and sequencing |
| WO2018157048A1 (en) | 2017-02-24 | 2018-08-30 | Massachusetts Institute Of Technology | Methods for examining podocyte foot processes in human renal samples using conventional optical microscopy |
| US20180267065A1 (en) * | 2017-03-20 | 2018-09-20 | Trustees Of Boston University | Methods relating to the measurement of vitamin d and vitamin d metabolites |
| EP3602073B1 (en) | 2017-03-28 | 2023-10-18 | Roche Diagnostics GmbH | Generic pretreatment reagents for analyte determinations |
| US11180804B2 (en) | 2017-07-25 | 2021-11-23 | Massachusetts Institute Of Technology | In situ ATAC sequencing |
| EP3499235A1 (en) | 2017-12-13 | 2019-06-19 | Immundiagnostik AG | Method of measuring auto-antibodies in bodily fluids |
| DK3735591T3 (da) | 2018-01-03 | 2022-09-12 | Immundiagnostik Ag | Fremgangsmåde til måling af status af endocytisk vitamin D |
| US11873374B2 (en) | 2018-02-06 | 2024-01-16 | Massachusetts Institute Of Technology | Swellable and structurally homogenous hydrogels and methods of use thereof |
| WO2020190358A1 (en) * | 2019-03-19 | 2020-09-24 | Siemens Healthcare Diagnostics Inc. | Compositions, devices, and methods of mitigating lipoprotein interference in in vitro diagnostic assays for hydrophobic analytes |
| US11802822B2 (en) | 2019-12-05 | 2023-10-31 | Massachusetts Institute Of Technology | Multiplexed expansion (MultiExM) pathology |
| CN111024962B (zh) * | 2019-12-31 | 2023-09-19 | 复星诊断科技(上海)有限公司 | 一种用于从血清中检测叶酸含量的解离剂及检测方法 |
| CN113495159A (zh) * | 2020-03-20 | 2021-10-12 | 郑州达诺生物技术有限公司 | 一种系统反应液、一种25羟基维生素d定量检测试剂盒及其使用方法 |
| CN111521832A (zh) * | 2020-04-27 | 2020-08-11 | 四川沃文特生物技术有限公司 | 一种用于测定25-羟基-维生素d的试剂盒 |
| CN112098663B (zh) * | 2020-09-21 | 2023-03-31 | 上海科华生物工程股份有限公司 | 保持维生素d水溶液稳定的组合物及其制备方法和应用 |
| EP4222502A1 (en) | 2020-09-29 | 2023-08-09 | F. Hoffmann-La Roche AG | A method for determining the level of vitamin d and metabolites thereof |
| CN112485418B (zh) * | 2020-10-26 | 2023-04-11 | 北京利德曼生化股份有限公司 | 一种用于人体维生素b12含量检测的释放剂及其应用 |
| CN113884687B (zh) * | 2021-12-08 | 2022-02-11 | 南京岚轩生物科技有限公司 | 用于检测25-羟基维生素d含量的解离剂及其制备方法 |
| CN115078578A (zh) * | 2022-06-16 | 2022-09-20 | 广州市妇女儿童医疗中心 | 一种基于液质联用的血清维生素d相关代谢物的检测方法 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU685301B2 (en) * | 1994-07-01 | 1998-01-15 | Akzo Nobel N.V. | A method for monitoring performance of an incubator module, said incubator module being comprised in an automated systemfor assaying multiple samples and a kit suitable for use in said method |
| US6787660B1 (en) * | 1998-06-25 | 2004-09-07 | Immundiagnostik Ag | Functional vitamin D derivatives and a method for determining 25-hydroxy-vitamin D and 1α, dihydroxy-vitamin D |
| GB0029729D0 (en) * | 2000-12-06 | 2001-01-17 | Ids Ltd | Method for detection of vitamin D metabolites |
| US7087395B1 (en) * | 2001-01-16 | 2006-08-08 | Quest Diagnostics Investments Incorporated | Vitamin D assay |
| DE10144905C2 (de) | 2001-09-12 | 2003-07-31 | Immundiagnostik Ag | Bestimmung von Vitamin-D direkt in Serum oder Plasma |
| US20040132104A1 (en) | 2003-01-07 | 2004-07-08 | Sackrison James L. | Vitamin D assay |
-
2008
- 2008-01-30 DK DK08708477.8T patent/DK2126586T3/da active
- 2008-01-30 ES ES08708477T patent/ES2348126T3/es active Active
- 2008-01-30 JP JP2009547690A patent/JP5185291B2/ja active Active
- 2008-01-30 US US12/517,754 patent/US7964363B2/en active Active
- 2008-01-30 AU AU2008209736A patent/AU2008209736B2/en not_active Ceased
- 2008-01-30 AT AT08708477T patent/ATE472734T1/de active
- 2008-01-30 DE DE602008001667T patent/DE602008001667D1/de active Active
- 2008-01-30 WO PCT/EP2008/051162 patent/WO2008092917A1/en active Application Filing
- 2008-01-30 PT PT08708477T patent/PT2126586E/pt unknown
- 2008-01-30 EP EP08708477A patent/EP2126586B1/en active Active
- 2008-01-30 PL PL08708477T patent/PL2126586T3/pl unknown
-
2010
- 2010-09-28 HR HR20100532T patent/HRP20100532T1/hr unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK2126586T3 (da) | 2010-10-11 |
| EP2126586A1 (en) | 2009-12-02 |
| HRP20100532T1 (hr) | 2010-11-30 |
| DE602008001667D1 (de) | 2010-08-12 |
| JP5185291B2 (ja) | 2013-04-17 |
| AU2008209736B2 (en) | 2011-03-03 |
| JP2010518369A (ja) | 2010-05-27 |
| AU2008209736A1 (en) | 2008-08-07 |
| ATE472734T1 (de) | 2010-07-15 |
| PL2126586T3 (pl) | 2010-12-31 |
| US20100068725A1 (en) | 2010-03-18 |
| EP2126586B1 (en) | 2010-06-30 |
| PT2126586E (pt) | 2010-09-17 |
| US7964363B2 (en) | 2011-06-21 |
| WO2008092917A1 (en) | 2008-08-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2348126T3 (es) | Determinación directa de la vitamina d en suero o plasma. | |
| JP4130958B2 (ja) | ビタミンｄアッセイ | |
| ES2795849T3 (es) | Reactivo de liberación para compuestos de vitamina D | |
| ES2878036T3 (es) | Métodos y composiciones para el análisis de vitamina D | |
| US11187709B2 (en) | Release reagent for vitamin D compounds | |
| EP2638071A1 (en) | Hydroxycholesterol immunoassay | |
| Kip et al. | Vitamin D3 upregulates plasma membrane Ca2+-ATPase expression and potentiates apico-basal Ca2+ flux in MDCK cells | |
| US11156618B1 (en) | Rapid measurement of total vitamin D in blood | |
| JP6388941B2 (ja) | ビタミンｄ代謝物を測定するための２５−ｏｈビタミンｄ誘導体 | |
| Ranganathan et al. | Immunoreactive hephaestin and ferroxidase activity are present in the cytosolic fraction of rat enterocytes | |
| CA2833118A1 (en) | Method for determining prognosis of renal failure | |
| EP3234104B1 (en) | Accurate assay measurement of hydrophobic haptenic analytes | |
| US20150212099A1 (en) | Methods and compositions for assaying vitamin d | |
| JP6214449B2 (ja) | キナーゼ活性の測定方法 | |
| JP5997446B2 (ja) | 甲状腺ホルモン固定化担体の液体試薬およびその用途 | |
| Swami et al. | A new enzyme-linked immunosorbant assay for the measurement of human vitamin D receptor | |
| JP2009014695A (ja) | タイプｉｖコラーゲンｎｃ１測定キット | |
| Cordero et al. | A new UMELISA format for the quantification of maternal serum alpha-fetoprotein | |
| Manual | Cholic Acid ELISA Kit | |
| JP2012163343A (ja) | 甲状腺ホルモンの検出方法 | |
| JP2003315330A (ja) | 測定試薬 |