CN111024962B - 一种用于从血清中检测叶酸含量的解离剂及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于从血清中检测叶酸含量的解离剂及检测方法，包括蛋白变性剂、蛋白水解酶、表面活性剂和基础液，其中各组分的用量为：每100ml解离剂中含有蛋白变性剂3～8g，蛋白水解酶1000～3000U，表面活性剂0.2～0.8ml，余量为基础液。与现有技术相比，本发明具有方法简单，灵敏度高、检测结果准确等优点。
Description
技术领域
本发明属于体外诊断试剂技术领域，具体涉及一种用于血清中叶酸含量检测的解离剂。
背景技术
叶酸(Folic Acid)也叫维生素B9，是一种水溶性维生素，因绿叶中含量十分丰富而得名，不过叶酸受不了高温，因此只有生吃才最有效，在自然界中有几种存在形式，其母体化合物是由喋啶、对氨基苯甲酸和谷氨酸3种成分结合而成。叶酸最初于1931年，印度孟买产科医院的医生L.Wills等人发现，1941年，一位美国科学家从菠菜叶子中提纯了叶酸，并搞清了它的分子式。1946年科学家又成功地用人工合成的方法制造出了叶酸，并开始研究它的作用机理。研究结果表明，原来这个不起眼的小分子竟然是DNA复制过程中必须的一种辅酶，没有它，DNA就不能复，细胞便无法分裂，可是细胞中蛋白质的合成却不受影响，于是红血球中的蛋白便越积越多，体积自然也就越来越大，但数量却不见增长，这就是贫血症的病因。正在发育的胎儿每天都要进行大量的细胞分裂，需要很多叶酸，孕妇体内的叶酸被大量征用，结果便造成了自身的贫血。
叶酸(Folic Acid)是一组化学结构相似，生化特征相近的化合物的统称，由蝶啶、对氨基苯甲酸与1个或多个谷氨酸结合而成。叶酸亦称维生素M，是淡橙黄色结晶或是薄片，分子式是C19H19N7O6，分子量是441.4，熔点是250℃，溶于热稀盐酸和硫磺，略溶于乙酸、酚吡啶、氢氧化碱及碳酸碱溶液，在乙醇、丁醇、醚、丙酮、氯仿和苯溶液中不溶。进入机体的叶酸在二氢叶酸还原酶作用下转变为二氢叶酸，进而转化为四氢叶酸；在丝氨酸羟甲基转移酶的作用下，四氢叶酸活化为5，10-亚甲基四氢叶酸，该反应是可逆的；在亚甲基四氢叶酸还原酶的作用下，5，10-亚甲基四氢叶酸转化为5-甲基四氢叶酸；同型半胱氨酸、维生素B12，在蛋氨酸合成酶作用下，5-甲基四氢叶酸为其提供甲基，合成蛋氨酸。
总之叶酸最重要的功能就是制造红血球和白血球，增强免疫力，一旦缺乏叶酸，会发生严重贫血，因此叶酸又被称为“造血维生素”。叶酸大致具有以下几种作用：1、有助于预防神经缺陷(也叫做“神经管畸形”)，包括脊柱裂和无脑儿等非常严重的出生缺陷；2、可能还有助于降低宝宝其他类型的出生缺陷的风险，比如唇腭裂和某些心脏缺陷；3、预防孕妇贫血，孕妇的身体需要叶酸来制造正常的红细胞。4、对于DNA和细胞的基本结果都非常重要；5、服用含叶酸的多种维生素，可能会减少孕妇患先兆子痫的风险。
目前，测定叶酸的免疫学方法有放射性免疫法(RIA)、酶联免疫法(ELISA)、化学发光免疫分析等，例如RIA存在放射性污染、标记物半衰期短、对操作者具有放射性损伤，且操作繁琐，时间长等缺点；而ELISA灵敏度低，检测范围窄。化学发光免疫分析技术具有较高的检测灵敏度和准确性，但是如何将血清样品中的叶酸从结合蛋白中完全解离以获得准确的检测结果仍然是一项技术难题。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种用于从血清中检测叶酸含量的解离剂及检测方法。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：一种用于从血清中检测叶酸含量的解离剂，其特征在于，包括蛋白变性剂、蛋白水解酶、表面活性剂和基础液，其中各组分的用量为：
每100ml解离剂中含有蛋白变性剂3～8g，蛋白水解酶1000～3000U，表面活性剂0.2～0.8ml，余量为基础液。
所述的蛋白变性剂为尿素。尿素可以破坏血清中叶酸蛋白变性，让叶酸蛋白的肽链打开，从而使原来包藏在分子内部的-SH暴露。
所述的蛋白水解酶为蛋白酶K。蛋白酶K是一种非特异性蛋白内切酶，可以切割脂肪族氨基酸、疏水性氨基酸和芳香族氨基酸羧基端连接的酯键和肽键。
所述的表面活性剂为Tween-80。Tween-80作混悬剂的润湿剂，增加溶解性。
所述的基础液为磷酸盐缓冲液。为解离剂提供一种中性的缓冲体系溶剂环境。
采用所述解离剂从血清中检测叶酸含量的方法，使用化学发光试剂盒进行检测(来源上海复星长征医学科学有限公司)，包括以下步骤(均在检测仪器LUMIART-II上进行)：
一种采用如权利要求1～5中任一所述解离剂从血清中检测叶酸含量的方法，其特征在于，使用化学发光试剂盒进行检测，包括以下步骤：
(1)将待检测血清与解离剂按体积比1:1混合，在37℃条件下反应15min；
(2)在处理好的血清与解离剂的混合液中添加生物素标记的叶酸结合蛋白，在37℃条件下反应10min；
(3)向反应好的体系中添加碱性磷酸酶标记的叶酸，在37℃条件下反应10min；
(4)向反应好的体系中添加链霉亲和素标记的磁珠，在37℃条件下反应5min；
(5)进行清洗并加入化学发光液，机器测量发光信号，报值血清中叶酸浓度。
步骤(2)所述生物素标记的叶酸结合蛋白通过以下方法获得：，0.1mg的叶酸结合蛋白(选用北京百普赛斯ACRO Biosystems公司所售叶酸结合蛋白Recombinant HumanFOLR1 Protein原料，货号为FO1-H528b)中加入5ul 10mM生物素标记物(选用ThermoFisher Scientific的NHS-LC-Biotin(货号21336))在室温条件下反应30分钟后，使用PDSpinTrap G-25离心脱盐柱脱盐处理，脱盐过程中首先用PBS预处理脱盐柱，收集离心管中的混合液，加入等体积的甘油，混匀，-20℃保存。所述的生物素标记的叶酸结合蛋白的加入量与血清与解离剂的混合液的体积比为25：50000，具体依据生物素每批次标记的叶酸结合蛋白的活性而定。
步骤(3)所述的碱性磷酸酶标记的叶酸通过以下方法获得：取0.2mg碱性磷酸酶(ALP)，用纯化水配制成10mg/mL的浓度，加入与ALP溶液等体积的高碘酸钠(12.8mg/mL，纯化水溶解，现配现用)，4℃避光反应30分钟。加入与ALP溶液等体积的1％乙二醇溶液(现用现配)，4℃避光反应45分钟。加入0.1mg市售叶酸(选自北京华信行生物科技有限公司所售folic acid(FA)-BSA，货号为P6415)，混合，用PD SpinTrap G-25离心脱盐柱脱盐处理，脱盐过程中首先用PBS预处理脱盐柱，收集离心管中的混合液，按每毫克抗体20μl的量加入硼氢化钠溶液(5mg/mL，纯化水溶解，现配现用)，4℃避光反应2小时。缓慢加入等体积的饱和硫酸铵溶液，4℃反应2小时。离心(4℃，8000rpm，30分钟)，弃去上清。沉淀用适量PBS溶解，用PD SpinTrap G-25离心脱盐柱脱盐处理，脱盐过程中首先用PBS预处理脱盐柱，收集离心管中的液体，加入等体积的甘油，混匀，-20℃保存。所述的碱性磷酸酶标记的叶酸的加入量与血清与解离剂的混合液的体积比为25：50000，稀释比例为1:500，具体依据每批次碱性磷酸酶标记的叶酸活性而定。
步骤(4)所述的链霉亲和素标记的磁珠为GE公司市售Sera-Mag SpeedBeads磁珠，货号为21152104010350，所述的链霉亲和素标记的磁珠的加入量与血清与解离剂的混合液的体积比为25：100，磁珠的浓度为0.2mg/ml(使用磷酸盐缓冲液稀释)。
步骤(5)所述的化学发光液为武汉瀚海新酶生物科技有限公司市售底物发光液，货号为4-03，所述的化学发光液的加入量与血清与解离剂的混合液的体积比为100：100。
与现有技术相比，本发明解离剂能够提供叶酸合适的液体环境，保证叶酸结合蛋白的完全释放，并在解离过程中保证叶酸分子构象的完整性，便于后期的血清中叶酸含量的检测。方法简单，灵敏度高、检测结果准确。
附图说明
图1为使用解离剂检测对比结果；
图2为不加解离剂检测对比结果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
配制100mL能检测出血清中叶酸含量的解离剂：准确称量5g尿素，2000U蛋白酶K，0.5ml阴离子表面活性剂Tween-80，采用pH7.35的磷酸盐缓冲液作为基础液定容至100mL。
效果测试：为验证本发明制备的解离剂在反应过程中成功解离出血清中叶酸，采用于罗氏定值好的血清进行对照测试，本发明采用取50μl血清样品，加入50μl制备的叶酸解离剂，37℃反应15min，反应后的100μl使用化学发光检测试剂盒(来源自上海复星长征医学科学有限公司有限公司)进行检测；对照组采用50ul磷酸盐缓冲液，具体检测步骤如下：
使用化学发光试剂盒进行检测，包括以下步骤：
(1)将待检测血清与解离剂按体积比1:1混合，在37℃条件下反应15min；
(2)在处理好的血清与解离剂的混合液中添加生物素标记的叶酸结合蛋白，在37℃条件下反应10min；所述生物素标记的叶酸结合蛋白为北京百普赛斯ACRO Biosystems公司所售叶酸结合蛋白Recombinant Human FOLR1 Protein原料，货号为FO1-H528b，具体标记方法为：0.1mg的叶酸结合蛋白中加入5ul 10mMThermo Fisher Scientific的NHS-LC-Biotin(货号21336)在室温条件下反应30分钟后，使用PD SpinTrap G-25离心脱盐柱脱盐处理，脱盐过程中首先用PBS预处理脱盐柱，收集离心管中的混合液，加入等体积的甘油，混匀，-20℃保存。所述的生物素标记的叶酸结合蛋白的加入量为25ul，稀释比例为1:500，具体依据生物素每批次标记的叶酸结合蛋白的活性而定。
(3)向反应好的体系中添加碱性磷酸酶标记的叶酸，在37℃条件下反应10min；所述的碱性磷酸酶标记的叶酸北京华信行生物科技有限公司所售folic acid(FA)-BSA，货号为P6415，具体标记方法为：取0.2mg碱性磷酸酶(ALP)，用纯化水配制成10mg/mL的浓度，加入与ALP溶液等体积的高碘酸钠(12.8mg/mL，纯化水溶解，现配现用)，4℃避光反应30分钟。加入与ALP溶液等体积的1％乙二醇溶液(现用现配)，4℃避光反应45分钟。加入0.1mgfolic acid(FA)-BSA，混合，用PD SpinTrap G-25离心脱盐柱脱盐处理，脱盐过程中首先用PBS预处理脱盐柱，收集离心管中的混合液，按每毫克抗体20μl的量加入硼氢化钠溶液(5mg/mL，纯化水溶解，现配现用)，4℃避光反应2小时。缓慢加入等体积的饱和硫酸铵溶液，4℃反应2小时。离心(4℃，8000rpm，30分钟)，弃去上清。沉淀用适量PBS溶解，用PDSpinTrap G-25离心脱盐柱脱盐处理，脱盐过程中首先用PBS预处理脱盐柱，收集离心管中的液体，加入等体积的甘油，混匀，-20℃保存。所述的碱性磷酸酶标记的叶酸的加入量为25ul，稀释比例为1:500，具体依据每批次碱性磷酸酶标记的叶酸活性而定。
(4)向反应好的体系中添加链霉亲和素标记的磁珠，在37℃条件下反应5min；所述的链霉亲和素标记的磁珠GE公司市售Sera-Mag SpeedBeads磁珠，货号为21152104010350，所述的链霉亲和素标记的磁珠的加入量为25ul，磁珠的浓度为0.2mg/ml(使用磷酸盐缓冲液稀释)。
(5)进行清洗并加入化学发光液，机器测量发光信号，报值血清中叶酸浓度。所述的化学发光液为武汉瀚海新酶生物科技有限公司市售底物发光液，货号为4-03，所述的化学发光液的加入量为100ul。
对比结果如下：
以罗氏定值检测结果作为对照组，采用本发明的叶酸解离剂的检测结果的直线方程为y＝0.9794x+0.2232，相关系数为R2＝0.9818，而不添加叶酸解离剂剂处理的检测结果的直线方程为y＝-0.003x+3.0286，相关系数为R2＝0.000。说明采用本发明的叶酸解离剂处理后的样品与阳性对照具有较好的一致性(如图1～2所示)。
采用于罗氏定值好的血清进行重复检测，共检测10例样本分别检测10次，检验本解离剂检测结果的重复性偏差，检测结果如下：
采用本发明的叶酸解离剂的检测结果重复性较好，偏差基本不超过6％，说明采用本发明的叶酸解离剂处理后的样品检测结果准确。另本试剂盒检测叶酸范围可涵盖2-20ng/ml，相比于市面上的ELISA产品，能够对灵敏度显著提高，以及拓宽检测范围。
实施例2
配制100mL能检测出血清中叶酸含量的解离剂：准确称量3g尿素，1000U蛋白酶K，0.2ml阴离子表面活性剂Tween-80，采用pH7.35的磷酸盐缓冲液作为基础液定容至100mL。
采用所述解离剂从血清中检测叶酸含量的方法，包括以下步骤：
(1)将待检测血清50ul与解离剂按体积比1:1混合，在37℃条件下反应15min；
(2)在处理好的血清与解离剂的混合液中添加25ul生物素标记的叶酸结合蛋白，在37℃条件下反应10min；
(3)向反应好的体系中添加25ul的碱性磷酸酶标记的叶酸，在37℃条件下反应10min；
(4)向反应好的体系中添加25ul的链霉亲和素标记的磁珠，在37℃条件下反应5min；
(5)进行清洗并加入化学发光液，机器测量发光信号，报值血清中叶酸浓度。
实施例3
配制100mL能检测出血清中叶酸含量的解离剂：准确称量8g尿素，3000U蛋白酶K，0.8ml阴离子表面活性剂Tween-80，采用pH7.35的磷酸盐缓冲液作为基础液定容至100mL。
采用所述解离剂从血清中检测叶酸含量的方法，包括以下步骤：
(1)将待检测血清50ul与解离剂按体积比1:1混合，在37℃条件下反应15min；
(2)在处理好的血清与解离剂的混合液中添加25ul生物素标记的叶酸结合蛋白，在37℃条件下反应10min；
(3)向反应好的体系中添加25ul的碱性磷酸酶标记的叶酸，在37℃条件下反应10min；
(4)向反应好的体系中添加25ul的链霉亲和素标记的磁珠，在37℃条件下反应5min；
(5)进行清洗并加入化学发光液，机器测量发光信号，报值血清中叶酸浓度。
Claims (6)
1.一种用于从血清中检测叶酸含量的解离剂，其特征在于，包括蛋白变性剂、蛋白水解酶、表面活性剂和基础液，其中各组分的用量为：
每100ml解离剂中含有蛋白变性剂3~8g，蛋白水解酶1000~3000U，表面活性剂0.2~0.8ml，余量为基础液；
所述的蛋白变性剂为尿素；
所述的蛋白水解酶为蛋白酶K；
所述的表面活性剂为Tween-80；
所述的基础液为磷酸盐缓冲液。
2.一种采用如权利要求1所述解离剂从血清中检测叶酸含量的方法，其特征在于，使用化学发光试剂盒进行检测，包括以下步骤：
（1）将待检测血清与解离剂按体积比1:1混合，在37℃条件下反应15min；
（2）在处理好的血清与解离剂的混合液中添加生物素标记的叶酸结合蛋白，在37℃条件下反应10min；
（3）向反应好的体系中添加碱性磷酸酶标记的叶酸，在37℃条件下反应10min；
（4）向反应好的体系中添加链霉亲和素标记的磁珠，在37℃条件下反应5min；
（5）进行清洗并加入化学发光液，机器测量发光信号，报值血清中叶酸浓度。
3. 根据如权利要求2所述解离剂从血清中检测叶酸含量的方法，其特征在于，步骤（2）所述生物素标记的叶酸结合蛋白通过以下方法获得：0.1mg的叶酸结合蛋白中加入5ul10mM 生物素标记物在室温条件下反应30分钟后，使用离心脱盐柱脱盐处理，脱盐过程中首先用PBS预处理脱盐柱，收集离心管中的混合液，加入等体积的甘油，混匀，-20℃保存；步骤（2）中生物素标记的叶酸结合蛋白的加入量与血清与解离剂的混合液的体积比为25：50000，稀释比例为1:500。
4. 根据如权利要求2所述解离剂从血清中检测叶酸含量的方法，其特征在于，步骤（3）所述的碱性磷酸酶标记的叶酸具体标记方法为：取0.2mg碱性磷酸酶（ALP），用纯化水配制成10mg/mL的浓度，加入与ALP溶液等体积的高碘酸钠溶液，高碘酸钠溶液的浓度为12.8mg/mL， 4℃避光反应30分钟；加入与ALP溶液等体积的1%乙二醇溶液，4℃避光反应45分钟，加入0.1mg 叶酸-BSA，混合，用离心脱盐柱脱盐处理，脱盐过程中首先用PBS预处理脱盐柱，收集离心管中的混合液，按每毫克抗体20μl的量加入浓度为5mg/mL硼氢化钠溶液，4℃避光反应2小时，缓慢加入等体积的饱和硫酸铵溶液，4℃反应2小时，离心，弃去上清，沉淀用PBS溶解，用离心脱盐柱脱盐处理，脱盐过程中首先用PBS预处理脱盐柱，收集离心管中的液体，加入等体积的甘油，混匀，-20℃保存；步骤（3）中碱性磷酸酶标记的叶酸的加入量为与血清与解离剂的混合液的体积比为25：50000，稀释比例为1:500。
5.根据如权利要求2所述解离剂从血清中检测叶酸含量的方法，其特征在于，步骤（4）所述的链霉亲和素标记的磁珠的加入量为与血清与解离剂的混合液的体积比为25：100，磁珠的浓度为0.2mg/ml。
6.根据如权利要求2所述解离剂从血清中检测叶酸含量的方法，其特征在于，步骤（5）所述的化学发光液的加入量为与血清与解离剂的混合液的体积比为100：100。
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