CN111620931A - 万古霉素衍生物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种全新的万古霉素衍生物及其制备方法和应用,特别是使用该万古霉素衍生物制备得到高免疫原性的万古霉素人工抗原,进而免疫实验动物得到高效价的抗万古霉素特异性抗体;本发明还提供了使用该万古霉素衍生物制备得到万古霉素酶标偶联物。含有上述抗万古霉素特异性抗体与万古霉素酶标偶联物的万古霉素与去甲万古霉素免疫检测试剂可以实现在全自动生化分析仪上对万古霉素与去甲万古霉素含量的自动化测定,可以高通量、快速化、精确地测定生物样本中万古霉素与去甲万古霉素的含量,且具有操作简便、灵敏度高、特异性强、结果准确等优点,有效降低万古霉素与去甲万古霉素检测成本,有利于临床广泛推广使用。
Description
技术领域
本发明属于生物医学检验领域,具体涉及万古霉素衍生物及其制备方法和应用,特别是涉及万古霉素衍生物、其制备方法及其在万古霉素与去甲万古霉素免疫检测试剂中的应用。
背景技术
万古霉素(Vancomycin)是一种三环糖肽类抗生素,通过干扰细菌细胞壁结构中的关键组分肽聚糖来干扰细胞壁的合成,抑制细胞壁中磷脂和多肽的生成,其分子式为:C66H75C12N9O24,分子量是1485.74。万古霉素主要用于治疗革兰氏阳性细菌的感染,以及某些特殊的革兰氏阴性厌氧菌的感染,是治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)感染的一线用药。万古霉素在人体内基本不代谢,90%的剂量以原型药物通过肾脏排泄。万古霉素的半衰期一般约为6小时,主要经肾消除,相当于所给计量的90%在给药后24小时内从尿中排出。
去甲万古霉素是我国研制生产的糖肽类抗生素,其化学结构、药理性质和抗菌作用与万古霉素相似,但治疗成本明显低于万古霉素。去甲万古霉素主要用于葡萄球菌(包括产酶株和耐甲氧西林株)、肠球菌(耐氨苄西林株)、难辨梭状芽胞杆菌等所致的系统感染和肠道感染,如心内膜炎、败血症,以及假膜性肠炎等。万古霉素与去甲万古霉素对耐药金黄色葡萄糖球菌和表皮葡萄球菌感染有很好的疗效,且不易诱导细菌产生耐药性。
万古霉素与去甲万古霉素都具有一定耳毒性,及可能引发患者体内产生抗血小板抗体,引起血小板减少症以及由皮下红斑,瘀斑和紫癜引起的出血。此外,去甲万古霉素肾毒性较强,要尽量避免与其他肾毒性药物合用。对于合用肾损害药物(如氨基糖苷类药物)的患者、ICU患者、肥胖患者、烧伤患者、肾功能不全患者、儿童或老年患者、血液透析患者及合并肝疾病的患者,及时监测血清或血浆中万古霉素与去甲万古霉素水平,及时调整治疗剂量是至关重要的。
目前检测万古霉素与去甲万古霉素的实验室方法主要有微生物测定法、放射免疫测定法(RIA)、荧光偏振免疫测定法(FPIA)、化学发光微粒子免疫检测法(CMIA)、高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)等。这些方法都有其不可回避的缺点,如HPLC法常因操作繁琐,效率低,测定周期长及分析成本高的缺点限制了其在临床药物浓度监测中的广泛应用。
CN2012102751858公开了一种万古霉素半抗原及万古霉素胶体金免疫检测试剂条,该方法胶体金免疫检测试剂条不能用于全定量检测。
CN2019100200000也公开一种万古霉素人工抗原,以及检测万古霉素的时间分辨荧光免疫层析试纸条,该人工抗原由万古霉素经高碘酸钠处理后直接与牛血清白蛋白偶联得到。该方法在万古霉素免疫检测中,采用的万古霉素人工抗原结构会直接决定其免疫原性,从而影响抗体的灵敏度和特异性,最终影响试剂的检测效果,而上述现有技术公开的万古霉素人工抗原均不能获得性能最佳的抗万古霉素特异性抗体,从而导致试剂的检测质量不佳。
目前市场上缺乏稳定性好、灵敏度高、特异性强的万古霉素与去甲万古霉素检测试剂,尤其是质量好的高通量自动化检验试剂。因此,研发一种质量达到临床要求、实用性强、性价比高,可应用于全自动生化分析仪的万古霉素与去甲万古霉素检测试剂已成为国内外治疗药物监测试剂行业的热点。
发明内容
为解决现有技术存在的上述问题,本发明目的是提供一种能够实现在全自动生化分析仪上对万古霉素与去甲万古霉素的高通量、快速化检测的的检测试剂,以满足国内日益增长的检测试剂使用需求。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:本发明第一方面提供了一种万古霉素衍生物,其结构式如下述式(Ⅰ)所示:
其中,R1为连接基团,所述连接基团为-CO-(CH2)n-COOH、-(CH2)n-COOH、-O-(CH2)n-COOH、-S-(CH2)n-COOH、-NH-(CH2)n-COOH、-CS-(CH2)n-COOH、-(CH2)n-NH-COOH或中的一种;
其中n为1至10之间的任意整数,所述1至10之间的任意整数包括1,2,3,4,5,6,7,8,9和10,进一步优选地,n为3。
上述结构式如式(Ⅰ)所示的万古霉素衍生物中,优选地,所述连接基团R1为-CO-(CH2)n-COOH;其中n为1至10之间的任意整数,所述1至10之间的任意整数包括1,2,3,4,5,6,7,8,9和10,进一步优选地,n为3。
进一步的,更优选,上述结构式如式(Ⅰ)所示的万古霉素衍生物中,所述连接基团R1为-CO-(CH2)3-COOH。
在本发明的另一个优选实施方式中,提供了一种万古霉素衍生物,其结构式如式(II)所示:
本发明第二方面还提供了一种结构式如式(Ⅰ)所示的万古霉素衍生物的制备方法,包括,
将化合物1与能够引入上述连接基团R1的化合物R1-X反应,制备得到:
上述方法中,优选地,将化合物1、化合物R1-X、三乙胺加入二甲基甲酰胺中溶解,将此溶液在室温下搅拌,得到的反应产物进行纯化,优选采用高效液相色谱进行浓缩和纯化,得到式(Ⅰ)所示的万古霉素衍生物,所述化合物R1-X为能够引入上述连接基团R1的相应有机酸或酸酐。
进一步优选地,化合物1、化合物R1-X和三乙胺依次加入二甲基甲酰胺中溶解,其中,化合物1与化合物R1-X的摩尔比为1:1~1.5,优选1:1.1;化合物1与三乙胺的摩尔比为1:2~2.5,将此溶液在室温下搅拌适当的时间(例如10~12h),得到的反应产物用高效液相色谱进行浓缩和纯化,得到式(Ⅰ)所示的万古霉素衍生物。
进一步的,本发明提供一种式(Ⅱ)所示万古霉素衍生物的制备方法包括以下步骤:
将化合物1、戊二酸酐和三乙胺加入到二甲基甲酰胺中溶解,将此溶液在室温下搅拌,反应结束后,将反应得到的反应产物纯化,得到式(Ⅱ)所示的万古霉素衍生物;
优选地,反应结束后,将反应得到的反应产物用高效液相色谱进行浓缩和纯化;
进一步优选地,化合物1与戊二酸酐的摩尔比为1:1~1.5,优选1:1.1;化合物1与三乙胺的摩尔比为1:2~2.5。
在本发明的一个更具体的实施方式中,提供了一种式(II)所示万古霉素衍生物的制备方法,包括如下步骤:
将5g化合物1、433mg戊二酸酐和697mg三乙胺依次加入5mL二甲基甲酰胺中溶解,将此溶液在室温下搅拌12小时,得到的反应产物用高效液相色谱进行浓缩和纯化,得到式(Ⅱ)所示的万古霉素衍生物。
本发明第三方面,提供了一种万古霉素人工抗原,由前述结构式(I)所示万古霉素衍生物与载体连接而成,其结构式如式(Ⅲ)所示:
其中,R2为连接基团,所述连接基团为-CO-(CH2)n-CO-、-(CH2)n-CO-、-O-(CH2)n-CO-、-S-(CH2)n-CO-、-NH-(CH2)n-CO-、-CS-(CH2)n-CO-、-(CH2)n-NH-CO-或中的一种;
其中n均为1至10之间的任意整数,优选的,n为3。
上述结构式(Ⅲ)中,进一步优选地,所述连接基团为-CO-(CH2)n-CO-,n为1至10之间的任意整数,优选地,n为3。
上述结构式(Ⅲ)中,更优选地,所述连接基团为-CO-(CH2)3-CO-;
所述载体为血清白蛋白、免疫球蛋白、纤维蛋白原、卵清蛋白、甲状腺球蛋白、血蓝蛋白、多聚赖氨酸中的一种,优选为血清蛋白,更优选为牛血清白蛋白。
本发明第四方面,提供了一种抗万古霉素特异性抗体,其由结构式如式(Ⅲ)所示的万古霉素人工抗原免疫实验动物后分离纯化得到。
进一步的,所述的抗万古霉素特异性抗体,为采用结构式如式(Ⅲ)所示的万古霉素人工抗原对实验动物加强免疫所获得的多克隆抗体,或者为采用结构式如式(Ⅲ)所示的万古霉素人工抗原免疫实验动物后经体细胞杂交获得的单克隆抗体;所述的宿主动物为兔、山羊、绵羊、大鼠、小鼠、豚鼠或马中的一种。
本发明第五方面,提供了一种万古霉素与去甲万古霉素免疫检测试剂,所述检测试剂包含试剂R1,试剂R2和定标液,其中,
所述试剂R1:包含本发明提供的抗万古霉素特异性抗体和R1缓冲液,所述R1缓冲液由牛血清白蛋白、葡萄糖-6-磷酸、氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸与Tris缓冲液组成;
所述试剂R2:包含万古霉素酶标偶联物和R2缓冲液,所述万古霉素酶标偶联物由结构式如式(I)所示的万古霉素衍生物与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶连接而成,所述R2缓冲液由牛血清白蛋白与Tris缓冲液组成。
所述定标液:包含万古霉素定标液和去甲万古霉素定标液。
本发明第六方面,提供了一种万古霉素与去甲万古霉素免疫检测试剂的制备方法,包括以下步骤:
制备R1试剂:将抗万古霉素特异性抗体以1∶100-1∶10000的体积比加入到R1缓冲液中混匀,再用盐酸调节pH至6.0-9.0,制成R1试剂;
优选地,所述R1缓冲液是通过以下方法制备:将牛血清白蛋白、葡萄糖-6-磷酸及氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依次加入Tris缓冲液中搅拌溶解制成;进一步优选的,所述牛血清白蛋白为0.25%牛血清白蛋白,所述葡萄糖-6-磷酸,氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和Tris缓冲液的摩尔浓度为均为50mmol/L。
制备R2试剂:将万古霉素酶标偶联物以1∶100-1∶10000的体积比加入到R2缓冲液中混匀,再用盐酸调节pH至6.0-9.0,制成R2试剂;
优选地,所述R2缓冲液是通过以下方法制备:将牛血清白蛋白加入Tris缓冲液中搅拌溶解制成;进一步优选地,所述牛血清白蛋白为0.25%牛血清白蛋白,所述Tris缓冲液浓度为100mmol/L。
制备万古霉素定标液:将万古霉素纯品粉末分别加入到6份Tris-HCl缓冲液中,搅拌溶解,至终浓度分别为0.0μg/mL、3.5~6.5μg/mL、7.0~13.0μg/mL、14.0~26.0μg/mL、28.0~48.0μg/mL、50.0~100.0μg/mL,然后在每份溶液中分别加入氯化钠、牛血清白蛋白、乙二胺四乙酸、叠氮钠,搅拌均匀,制得万古霉素定标液。
制备去甲万古霉素定标液:将去甲万古霉素纯品粉末分别加入到6份Tris-HCl缓冲液中,搅拌溶解,至终浓度分别为0.0μg/mL、3.5~6.5μg/mL、7.0~13.0μg/mL、14.0~26.0μg/mL、28.0~48.0μg/mL、50.0~100.0μg/mL,然后在每份溶液中分别加入氯化钠、牛血清白蛋白、乙二胺四乙酸、叠氮钠,搅拌均匀,制得去甲万古霉素定标液。
进一步优选地,所述万古霉素与去甲万古霉素免疫检测试剂的制备方法包括以下步骤:
制备R1试剂:将0.25%牛血清白蛋白、50mmol/L葡萄糖-6-磷酸及50mmol/L氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依次加入50mmol/L Tris缓冲液中搅拌溶解制成R1缓冲液,再将抗万古霉素特异性抗体以1∶500-1∶5000的体积比加入到上述R1缓冲液中混匀,再用6mol/L的盐酸调节pH至8.0,制成R1试剂;
制备R2试剂:将0.25%牛血清白蛋白加入100mmol/L Tris缓冲液中搅拌溶解制成R2缓冲液,再将万古霉素酶标偶联物以1∶1000-1∶8000的体积比加入到上述R2缓冲液中混匀,再用6mol/L的盐酸调节pH至7.6,制成R2试剂;
制备万古霉素定标液:将万古霉素纯品粉末分别加入到6份浓度为50mmol/L pH=7.2的Tris-HCl缓冲液中,搅拌溶解,至终浓度分别为0.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL、20.0μg/mL、40.0μg/mL、80.0μg/mL,然后在每份溶液中分别加入质量分数为0.5%的氯化钠、1.0%的牛血清白蛋白、0.75%的乙二胺四乙酸、0.05%的叠氮钠,搅拌均匀,制得万古霉素定标液。
制备去甲万古霉素定标液:将去甲万古霉素纯品粉末分别加入到6份浓度为50mmol/L pH=7.2的Tris-HCl缓冲液中,搅拌溶解,至终浓度分别为0.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL、20.0μg/mL、40.0μg/mL、80.0μg/mL,然后在每份溶液中分别加入质量分数为0.5%的氯化钠、1.0%的牛血清白蛋白、0.75%的乙二胺四乙酸、0.05%的叠氮钠,搅拌均匀,制得去甲万古霉素定标液。
上述方法中,所述抗万古霉素特异性抗体的制备包括以下步骤:
A.将结构式(I)所示的万古霉素衍生物置于容器中,并依次加入二甲基酰胺、乙醇、磷酸钾缓冲液、1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺,搅拌溶解;
B.将牛血清白蛋白溶解于磷酸缓冲液中;
C.将步骤A活化的万古霉素衍生物滴加到步骤B所得的牛血清白蛋白溶液中,在2~8℃条件下搅拌8-24小时,将反应后的溶液用透析袋进行透析纯化;制得万古霉素人工抗原;
D.将步骤C合成的万古霉素人工抗原用磷酸缓冲液稀释,将稀释后的万古霉素人工抗原溶液与弗氏完全佐剂混合,对实验动物进行注射,14-28天后,再将相同的万古霉素人工抗原溶液与弗氏不完全佐剂混合,对实验动物注射一次,之后每隔14-28天注射一次,从实验动物进行初次注射开始,经过3-6个月后对实验动物采血,分离纯化获得抗体。
上述方法中,优选地,所述抗万古霉素特异性抗体的制备包括以下步骤:
A.将10mg结构式(I)所示的万古霉素衍生物置于容器中,并依次加入二甲基酰胺、乙醇、磷酸钾缓冲液、1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺,搅拌溶解;
优选地,结构式(I)所示的万古霉素衍生物与1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺的摩尔比为:1:3~5,结构式(I)所示的万古霉素衍与N-羟基硫代琥珀酰亚胺的摩尔比为1:35~45;所述二甲基酰胺:乙醇:磷酸钾缓冲液的体积比为:1:1.5~2:2~3,所述磷酸钾缓冲液浓度为10mmol/L,pH值为5.5~6.5;
B.将牛血清白蛋白溶解于pH为8.5的磷酸缓冲液中;
优选地,所述磷酸缓冲液的浓度为0.2mol/L;
C.将步骤A活化的万古霉素衍生物滴加到步骤B所得的牛血清白蛋白溶液中,在2~8℃条件下搅拌12-16小时,将反应后的溶液用孔径为8KD的透析袋进行透析纯化,制得万古霉素人工抗原;
D.将步骤C合成的万古霉素人工抗原用10mmol/L,pH7.4的磷酸缓冲液稀释至1.0mg/mL,然后将万古霉素人工抗原溶液与弗氏完全佐剂混合,对实验动物兔进行注射,21天后,再将相同的万古霉素人工抗原溶液与弗氏不完全佐剂混合,对实验动物兔注射一次,之后每隔21天注射一次,从兔子进行初次注射开始,经过4个月后对兔子进行采血,分离纯化获得抗体。
上述方法中,所述万古霉素酶标偶联物的制备包括以下步骤:
a.将葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶解于Tris缓冲液中,然后依次加入还原型辅酶Ⅰ、葡萄糖-6-磷酸、卡必醇和二甲基亚砜,搅拌溶解;
优选地,葡萄糖-6-磷酸脱氢酶与还原型辅酶Ⅰ的重量比为1:15~16;葡萄糖-6-磷酸脱氢酶与葡萄糖-6-磷酸的重量比为1:9~10;卡必醇与Tris缓冲液与的体积比为1:16,二甲基亚砜与Tris缓冲液与的体积比为1:5~6;
b.将结构式(I)所示的万古霉素衍生物溶解于二甲基亚砜和二甲基酰胺组成的混合溶液中,所述混合溶液再加入三丁胺和氯甲酸异丁酯,在2~8℃条件下搅拌30-120分钟;
c.将步骤b所得溶液逐滴加入到步骤a所得溶液中,在2~8℃条件下用磁力搅拌器搅拌30-120分钟,将反应后的溶液用葡聚糖凝胶色谱柱进行纯化,得到万古霉素酶标偶联物。
在本发明的另一个更具体的优选实施方案中提供了一种所述万古霉素酶标偶联物制备的方法,包括以下步骤:
a.将15mg葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶解于12mL Tris缓冲液中,然后依次加入225mg还原型辅酶Ⅰ、135mg葡萄糖-6-磷酸、0.75mL卡必醇和2.25mL二甲基亚砜;所述Tris缓冲液pH为9.0,各组分浓度为:0.05mol/LTris、3.3mmol/L氯化镁,145.4mmol/L氯化钠;
b.将10mg结构式(I)所示的万古霉素衍生物溶解于420μL二甲基亚砜和180μL二甲基酰胺组成的混合溶液中,所述混合溶液加入6μL三丁胺和3μL氯甲酸异丁酯,在2~8℃条件下搅拌30分钟;
c.将步骤b所得溶液逐滴加入到步骤a所得溶液中,在2~8℃条件下用磁力搅拌器搅拌60分钟,将反应后的溶液用G-50葡聚糖凝胶色谱柱进行纯化,得到万古霉素酶标偶联物。
本发明第七方面提供了一种万古霉素与去甲万古霉素免疫检测试剂的应用,将所述万古霉素与去甲万古霉素免疫检测试剂用于组装成试剂盒产品,该试剂盒产品用于生物样本中万古霉素或去甲万古霉素含量的测定,所述生物样本为人体或动物的液体生理样本,所述液体生理样本为血清、血浆、全血、尿液、唾液、淋巴液、组织液、脑脊液、羊水或泪液。
本发明提供了一种新型万古霉素衍生物及其制备方法,利用该新型万古霉素衍生物研制的抗万古霉素特异性抗体可以用于制备灵敏度高、特异性强、检测效果好的万古霉素与去甲万古霉素免疫检验试剂。本发明还提供了万古霉素与去甲万古霉素免疫检验试剂的制备方法及相应的使用方法。本发明提供的万古霉素与去甲万古霉素免疫检测试剂使用方便、检测快速、结果准确、灵敏度高、特异性强,能够对人体血清、血浆等样本中的万古霉素与去甲万古霉素含量进行定量检测。克服了现有技术中万古霉素与去甲万古霉素检测方法存在的操作复杂、自动化程度低等缺陷,能有效指导临床个体化合理用药。
附图说明
图1是利用万古霉素与去甲万古霉素免疫检验试剂进行万古霉素样本检测的反应标准曲线图;
图2是利用万古霉素与去甲万古霉素免疫检验试剂进行去甲万古霉素样本检测反应标准曲线图。
具体实施方式
下面结合附图以及具体实施方式,对本发明做进一步描述,这些附图均为简化的示意图,仅以示意方式说明本发明的基本结构,因此其仅显示与本发明有关的构成。除非特别指明,以下实施例中所用的试剂、仪器、设备、耗材均可从正规渠道商购买获得。
实施例1:万古霉素衍生物的制备
万古霉素衍生物的结构式如式(Ⅱ)所示:
上述万古霉素衍生物的具体制备步骤如下:
将5g化合物1、433mg戊二酸酐和697mg三乙胺依次加入5mL二甲基甲酰胺中溶解,将此溶液在室温下搅拌12小时,得到的反应产物用高效液相色谱进行浓缩和纯化,得到1g白色固体状的万古霉素衍生物,产率18.5%。
采用类似方法制备当R1为本发明所述其他连接基团时的式(I)所示万古霉素衍生物。
实施例2:万古霉素与去甲万古霉素免疫检验试剂的制备
万古霉素与去甲万古霉素免疫检测试剂的具体制备步骤如下:
(1)将0.25%牛血清白蛋白、50mmol/L葡萄糖-6-磷酸及50mmol/L氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依次加入50mmol/L Tris缓冲液中搅拌溶解制成R1缓冲液,再将抗万古霉素特异性抗体以1∶1500的体积比加入到上述R1缓冲液中混匀,再用6mol/L的盐酸调节pH至8.0,制成R1试剂;
(2)将0.25%牛血清白蛋白加入100mmol/L Tris缓冲液中搅拌溶解制成R2缓冲液,再将万古霉素酶标偶联物以1∶3000的体积比加入到上述R2缓冲液中混匀,再用6mol/L的盐酸调节pH至7.6,制成R2试剂;
(3)将万古霉素纯品粉末分别加入6份浓度为50mmol/L pH=7.2的Tris-HCl缓冲液中,搅拌溶解,至终浓度分别为0.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL、20.0μg/mL、40.0μg/mL、80.0μg/mL,然后在每份溶液中分别加入质量分数为0.5%的氯化钠、1.0%的牛血清白蛋白、0.75%的乙二胺四乙酸、0.05%的叠氮钠,搅拌均匀,制得万古霉素定标液。
(4)将去甲万古霉素纯品粉末分别加入6份浓度为50mmol/L pH=7.2的Tris-HCl缓冲液中,搅拌溶解,至终浓度分别为0.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL、20.0μg/mL、40.0μg/mL、80.0μg/mL,然后在每份溶液中分别加入质量分数为0.5%的氯化钠、1.0%的牛血清白蛋白、0.75%的乙二胺四乙酸、0.05%的叠氮钠,搅拌均匀,制得去甲万古霉素定标液。
其中,步骤(1)中所述抗万古霉素特异性抗体的制备包括以下具体步骤:
A.将10mg实施例一制备的万古霉素衍生物置于容器中,并依次加入2.5mL二甲基酰胺、4.5mL乙醇、7mL磷酸钾缓冲液、400mg1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺和50mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺;所述磷酸钾缓冲液浓度为10mmol/L,pH值为5.5;
B.将100mg牛血清白蛋白溶解于100ml浓度为0.2mol/L的pH为8.5的磷酸缓冲液中;
C.将步骤A活化的万古霉素衍生物滴加到步骤B所得的牛血清白蛋白溶液中,在2~8℃条件下搅拌12-16小时,将反应后的溶液用孔径为8KD的透析袋进行透析纯化,制得万古霉素人工抗原;
D.将步骤C合成的万古霉素人工抗原用10mmol/L,pH7.4的磷酸缓冲液稀释至1.0mg/mL,然后将万古霉素人工抗原溶液与弗氏完全佐剂混合,对实验动物兔进行注射,21天后,再将相同的万古霉素人工抗原溶液与弗氏不完全佐剂混合,对实验动物兔注射一次,之后每隔21天注射一次,从兔子进行初次注射开始,经过4个月后对兔子进行采血,分离纯化获得抗体。
其中,步骤(2)中所述万古霉素酶标偶联物的制备包括以下具体步骤:
a.将15mg葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶解于12mL Tris缓冲液中,然后依次加入225mg还原型辅酶Ⅰ、135mg葡萄糖-6-磷酸、0.75mL卡必醇和2.25mL二甲基亚砜;所述Tris缓冲液pH为9.0,各组分浓度为:0.05mol/LTris、3.3mmol/L氯化镁,145.4mmol/L氯化钠;
b.将10mg实施例一制备的万古霉素衍生物溶解于420μL二甲基亚砜和180μL二甲基酰胺组成的混合溶液中,所述混合溶液加入6μL三丁胺和3μL氯甲酸异丁酯,在2~8℃条件下搅拌30分钟;
c.将步骤b所得溶液逐滴加入到步骤a所得溶液中,在2~8℃条件下用磁力搅拌器搅拌60分钟,将反应后的溶液用G-50葡聚糖凝胶色谱柱进行纯化,得到万古霉素酶标偶联物。
实施例3:利用万古霉素与去甲万古霉素免疫检验试剂进行万古霉素样本检测
1.制作标准曲线:
(1)设置迈瑞BS480全自动生化分析仪反应参数(表1)。
(2)操作步骤为:先加R1试剂,再加入定标液,最后加入R2试剂。加入试剂R2后,测定不同时间点的OD340nm吸光值,算出不同定标液浓度时的反应速率,实际操作过程中需不断调整R1试剂和R2试剂的体积比例,同时调整测光点,最后得出最佳的反应标准曲线图,如图1所示。
表1迈瑞BS480全自动生化分析仪检测万古霉素的反应参数
2.样本检测:利用本发明的万古霉素与去甲万古霉素免疫检验试剂得到的标准曲线,重复测定低、中、高浓度质控样本10次,上述质控样本为:将万古霉素标准品溶解于空白人造血浆中,至浓度分别为7.50,15.00,30.00μg/mL。检测结果及数据分析见表2。
表2万古霉素样本测定值及精密度和回收率评估
血液样本 | 低 | 中 | 高 |
样本浓度(μg/mL) | 7.50 | 15.00 | 30.00 |
1 | 7.34 | 15.74 | 31.91 |
2 | 7.56 | 15.30 | 30.13 |
3 | 7.68 | 15.45 | 30.60 |
4 | 7.55 | 15.82 | 29.78 |
5 | 7.39 | 14.76 | 29.89 |
6 | 7.45 | 15.91 | 30.33 |
7 | 7.57 | 15.23 | 29.54 |
8 | 7.52 | 14.57 | 30.16 |
9 | 7.68 | 15.66 | 30.35 |
10 | 7.51 | 15.05 | 30.42 |
平均值(μg/mL) | 7.53 | 15.35 | 30.31 |
标准差(SD) | 0.11 | 0.45 | 0.65 |
精密度(CV%) | 1.46 | 2.93 | 2.14 |
回收率(%) | 100.40 | 102.33 | 101.03 |
检测结果:本发明的万古霉素与去甲万古霉素免疫检验试剂能精确测定万古霉素的含量,回收率均在95%-105%之间;变异系数CV均低于5%。
实施例4:利用万古霉素与去甲万古霉素免疫检验试剂进行去甲万古霉素样本检测
1.制作标准曲线:
(1)设置迈瑞BS480全自动生化分析仪反应参数(表3)。
(2)操作步骤为:先加R1试剂,再加入定标液,最后加入R2试剂。加入R2试剂后,测定不同时间点的OD340nm吸光值,算出不同定标液浓度时的反应速率,实际操作过程中需不断调整R1试剂和R2试剂的体积比例,同时调整测光点,最后得出最佳的反应标准曲线图,如图2所示。
表3迈瑞BS480全自动生化分析仪检测去甲万古霉素的反应参数
2.样本检测:利用本发明的万古霉素与去甲万古霉素免疫检验试剂得到的标准曲线,重复测定低、中、高浓度质控样本10次,上述质控样本为:将去甲万古霉素标准品溶解于空白人造血浆中,至浓度分别为7.50,15.00,30.00μg/mL。检测结果及数据分析见表4。
表4去甲万古霉素样本测定值及精密度和回收率评估
血液样本 | 低 | 中 | 高 |
样本浓度(μg/mL) | 7.50 | 15.00 | 30.00 |
1 | 7.41 | 15.28 | 30.45 |
2 | 7.62 | 15.05 | 31.31 |
3 | 7.89 | 15.88 | 30.03 |
4 | 7.51 | 15.59 | 28.98 |
5 | 7.79 | 14.34 | 29.94 |
6 | 7.51 | 15.01 | 30.86 |
7 | 7.50 | 15.53 | 29.87 |
8 | 7.20 | 14.69 | 31.25 |
9 | 7.80 | 15.20 | 30.50 |
10 | 7.45 | 15.67 | 30.63 |
平均值(μg/mL) | 7.57 | 15.32 | 30.38 |
标准差(SD) | 0.21 | 0.52 | 0.70 |
精密度(CV%) | 2.77 | 3.39 | 2.30 |
回收率(%) | 100.93 | 102.13 | 101.27 |
检测结果:本发明的万古霉素与去甲万古霉素免疫检验试剂能精确测定去甲万古霉素的含量,回收率均在95%-105%之间;变异系数CV均低于5%。
实施例5:常见药物干扰试验
选取62种常见药物作为干扰物进行干扰试验,将62种常见药物纯品粉末配制成浓度为100.0μg/mL的溶液作为待测干扰物样本,采用实施例2制备的万古霉素与去甲万古霉素免疫检验试剂进行检测:将待测干扰物样本与实施例2制备的R1试剂接触反应,再加入R2试剂;检测上述混合溶液的OD340吸光值,根据图1的标准曲线得出相应物质的浓度。62种常见药物名称以及检测结果见表5。
表5常见药物干扰试验检测结果
测定结果显示:上述62种常见药物采用实施例2制备的万古霉素与去甲万古霉素免疫检验试剂进行检测,实际检测值均为0.00μg/mL。由此可见,本发明的抗万古霉素特异性抗体具有较强的抗原识别特异性,与62种常见药物无任何交叉反应。
实施例6:使用不同连接基团的万古霉素衍生物制备的试剂性能验证
为了说明本发明使用其它不同连接基团的万古霉素衍生物都能用于制备万古霉素与去甲万古霉素免疫检验试剂,并且都具有性能优越性,采用各种不同连接基团的万古霉素衍生物,按照实施例2所述的方法制备相应的万古霉素与去甲万古霉素免疫检验试剂,并对所制备的万古霉素与去甲万古霉素免疫检验试剂按照实施例3-5所述方法进行实验,各实验方案所采用的万古霉素衍生物的连接基团结构及试剂性能验证结果见表6:
表6使用不同连接基团的万古霉素衍生物制备的试剂性能验证结果
实验结果表明:本发明使用其它不同连接基团的万古霉素衍生物都能用于制备万古霉素与去甲万古霉素免疫检验试剂,并且都具有性能优越性。
以上所述仅为本发明的实施例,并非因此限制本发明的保护范围,凡是利用本发明说明书所作的等效结构或等效流程变换,或直接或间接运用在其他相关的技术领域,均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (10)
2.一种结构式如式(Ⅰ)所示的万古霉素衍生物的制备方法,其特征在于,由化合物1与能够引入连接基团R1的化合物R1-X反应,制备得到,包括以下步骤:
将化合物1、化合物R1-X、三乙胺加入二甲基甲酰胺中溶解,将此溶液在室温下搅拌,得到的反应产物进行纯化;
优选地,采用高效液相色谱进行浓缩和纯化,得到式(Ⅰ)所示的万古霉素衍生物,所述化合物R1-X为能够引入连接基团R1的相应有机酸或酸酐;
上述方法中,进一步优选地,化合物1、化合物R1-X和三乙胺依次加入二甲基甲酰胺中溶解,其中,化合物1与化合物R1-X的摩尔比为1:1~1.5,优选1:1.1;化合物1与三乙胺的摩尔比为1:2~2.5,将此溶液在室温下搅拌10~12h,得到的反应产物用高效液相色谱进行浓缩和纯化,得到式(Ⅰ)所示的万古霉素衍生物;
更优选地,所述万古霉素衍生物的结构式如式(II)所示:
进一步优选地,式(Ⅱ)所示万古霉素衍生物的制备方法包括以下步骤:
将化合物1、戊二酸酐和三乙胺加入到二甲基甲酰胺中溶解,将此溶液在室温下搅拌,反应结束后,将反应得到的反应产物纯化,得到式(Ⅱ)所示的万古霉素衍生物;
优选地,反应结束后,将反应得到的反应产物用高效液相色谱进行浓缩和纯化;
进一步优选地,化合物1与戊二酸酐的摩尔比为1:1~1.5,优选1:1.1;化合物1与三乙胺的摩尔比为1:2~2.5。
3.万古霉素人工抗原,其特征在于,由权利要求1所述的万古霉素衍生物与载体连接而成,其结构式如式(Ⅲ)所示:
其中,R2为连接基团,所述连接基团为-CO-(CH2)n-CO-、-(CH2)n-CO-、-O-(CH2)n-CO-、-S-(CH2)n-CO-、-NH-(CH2)n-CO-、-CS-(CH2)n-CO-、-(CH2)n-NH-CO-或中的一种;
优选地,所述连接基团为-CO-(CH2)n-CO-;
更优选地,所述连接基团为-CO-(CH2)3-CO-;
其中n为1至10之间的任意整数;
所述载体为血清白蛋白、免疫球蛋白、纤维蛋白原、卵清蛋白、甲状腺球蛋白、血蓝蛋白、多聚赖氨酸中的一种,优选为血清蛋白,更优选为牛血清白蛋白。
4.抗万古霉素特异性抗体,其特征在于,由权利要求3所述的万古霉素人工抗原免疫实验动物后分离纯化得到。
5.根据权利要求4所述的抗万古霉素特异性抗体,其特征在于:所述的抗体为采用权利要求3所述的万古霉素人工抗原对实验动物加强免疫所获得的多克隆抗体;
或者,为采用权利要求3所述的万古霉素人工抗原免疫实验动物后经体细胞杂交获得的单克隆抗体;
优选地,所述的宿主动物为兔、山羊、绵羊、大鼠、小鼠、豚鼠或马中的一种。
6.一种万古霉素与去甲万古霉素免疫检测试剂,其特征在于,包含试剂R1,试剂R2和定标液,其中,
试剂R1:包含权利要求4-5任一项所述的抗万古霉素特异性抗体与R1缓冲液,所述R1缓冲液由牛血清白蛋白、葡萄糖-6-磷酸、氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸与Tris缓冲液组成;
试剂R2:包含万古霉素酶标偶联物与R2缓冲液,所述万古霉素酶标偶联物由权利要求1所述的万古霉素衍生物与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶连接而成,所述R2缓冲液由牛血清白蛋白与Tris缓冲液组成;
定标液:包含万古霉素定标液和去甲万古霉素定标液。
7.一种权利要求6所述的万古霉素与去甲万古霉素免疫检测试剂的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)将牛血清白蛋白、葡萄糖-6-磷酸及氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸加入Tris缓冲液中搅拌溶解制成R1缓冲液,再将权利要求4-5任一项所述的抗万古霉素特异性抗体以1∶100-1∶10000的体积比加入到上述R1缓冲液中混匀,再用盐酸调节pH至6.0-9.0,制成R1试剂;
(2)将牛血清白蛋白加入Tris缓冲液中搅拌溶解制成R2缓冲液,再将权利要求6中所述的万古霉素酶标偶联物以1∶100-1∶10000的体积比加入到上述R2缓冲液中混匀,再用盐酸调节pH至6.0-9.0,制成R2试剂;
(3)将万古霉素纯品粉末分别加入到6份Tris-HCl缓冲液中,搅拌溶解,至终浓度分别为0.0μg/mL、3.5~6.5μg/mL、7.0~13.0μg/mL、14.0~26.0μg/mL、28.0~48.0μg/mL、50.0~100.0μg/mL,然后在每份溶液中分别加入氯化钠、牛血清白蛋白、乙二胺四乙酸、叠氮钠,搅拌均匀,制得万古霉素定标液;
(4)将去甲万古霉素纯品粉末分别加入到6份Tris-HCl缓冲液中,搅拌溶解,至终浓度分别为0.0μg/mL、3.5~6.5μg/mL、7.0~13.0μg/mL、14.0~26.0μg/mL、28.0~48.0μg/mL、50.0~100.0μg/mL,然后在每份溶液中分别加入氯化钠、牛血清白蛋白、乙二胺四乙酸、叠氮钠,搅拌均匀,制得去甲万古霉素定标液。
8.根据权利要求7所述的万古霉素与去甲万古霉素免疫检测试剂的制备方法,其特征在于,步骤(1)所述抗万古霉素特异性抗体的制备包括以下步骤:
A.将权利要求1所述的万古霉素衍生物置于容器中,并依次加入二甲基酰胺、乙醇、磷酸钾缓冲液、1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺,搅拌溶解;
B.将牛血清白蛋白溶解于磷酸缓冲液中;
C.将步骤A活化的万古霉素衍生物滴加到步骤B所得的牛血清白蛋白溶液中,在2~8℃条件下搅拌8-24小时,将反应后的溶液用透析袋进行透析纯化,制得万古霉素人工抗原;
D.将步骤C合成的万古霉素人工抗原用磷酸缓冲液稀释,将稀释后的万古霉素人工抗原溶液与弗氏完全佐剂混合,对实验动物进行注射,14-28天后,再将相同的万古霉素人工抗原溶液与弗氏不完全佐剂混合,对实验动物注射一次,之后每隔14-28天注射一次,从实验动物进行初次注射开始,经过3-6个月后对实验动物采血,分离纯化获得抗体。
9.根据权利要求7所述的万古霉素与去甲万古霉素免疫检测试剂的制备方法,其特征在于,步骤(2)所述万古霉素酶标偶联物的制备包括以下步骤:
a.将葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶解于Tris缓冲液中,然后依次加入还原型辅酶Ⅰ、葡萄糖-6-磷酸、卡必醇和二甲基亚砜,搅拌溶解;
b.将权利要求1所述的万古霉素衍生物溶解于二甲基亚砜和二甲基酰胺组成的混合溶液中,所述混合溶液再加入三丁胺和氯甲酸异丁酯,在2~8℃条件下搅拌30-120分钟;
c.将步骤b所得溶液逐滴加入到步骤a所得溶液中,在2~8℃条件下用磁力搅拌器搅拌30-120分钟,将反应后的溶液用葡聚糖凝胶色谱柱进行纯化,得到万古霉素酶标偶联物。
10.权利要求6所述的万古霉素与去甲万古霉素免疫检测试剂的应用,其特征在于,将所述万古霉素与去甲万古霉素免疫检测试剂用于组装成试剂盒产品,该试剂盒产品用于生物样本中万古霉素或去甲万古霉素含量的测定,所述生物样本为人体或动物的液体生理样本,所述液体生理样本为血清、血浆、全血、尿液、唾液、淋巴液、组织液、脑脊液、羊水或泪液。
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN112649598A (zh) * | 2020-12-29 | 2021-04-13 | 上海云泽生物科技有限公司 | 一种测定万古霉素的胶乳增强免疫比浊试剂盒 |
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CN111620931B (zh) | 2021-12-17 |
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