CN115078578A - 一种基于液质联用的血清维生素d相关代谢物的检测方法 - Google Patents

一种基于液质联用的血清维生素d相关代谢物的检测方法 Download PDF

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吴利兰
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Abstract

本发明公开了一种基于液质联用的血清维生素D相关代谢物的检测方法，包括如下步骤：向待测样品中加入胰蛋白酶，然后加入甲基叔丁基醚进行萃取；取有机相，加入4‑(4'‑二甲氨基苯基)‑1,2,4‑三唑琳‑3,5‑二酮进行衍生化处理；使用液相色谱质谱联用进行检测。该方法提高了维生素D相关代谢物的提取效率，确保了维生素D代谢物在液相‑质谱联用中有充分的离子化效率，克服了现有技术中检测效果不佳或不真实的问题，有效提高维生素D或其相关代谢物分析灵敏度和检测下限。

Description

一种基于液质联用的血清维生素D相关代谢物的检测方法
技术领域
本发明属于检测分析领域，具体涉及一种基于液质联用的血清维生素D相关代谢物的检测方法。
背景技术
维生素D是人体必需微量元素，维生素D及其代谢产物属于脂溶性物质，主要起调节激素分泌、细胞增殖和分化的作用，会影响肌肉、心血管、代谢、免疫、妊娠等多个生理和病理过程。
维生素D主要由7-脱氢胆固醇经紫外线照射后合成，少量由食物或补充剂提供。合成或吸收的维生素D与维生素D结合蛋白(vitamin D binding protein,VDBP)和白蛋白结合进入循环系统，运输至肝脏并在肝脏中被转换成为25-羟基维生素D(25OHD)，而后在肾脏中被转化为1,25-羟基维生素D(1,25OHD)，再经过肝脏及肾脏两步羟化成有生物活性的1,25OHD。血循环系统中，1％维生素D代谢物25OHD、1,25OHD是游离方式存在；80％-90％主要与VDBP结合，约10％-15％与白蛋白结合。VDBP与25OHD亲和力非常高，而同白蛋白的结合则较弱。VDBP浓度变化可能会改变25OHD的释放，因此，维生素D生物活性受血清VDBP浓度的影响。
孕妇VDBP水平显著高于普通人群，因此，妊娠女性人群也普遍会缺乏维生素D，而母体维生素D水平影响胎儿体内维生素D水平，对孕妇和胎儿生长发育以及胎儿成年后的营养状况都有一定的影响。为了精确阐明维生素D缺乏，结合型的维生素D浓度应该被纳入分析，基于此，在相关技术中缺乏对于多种维生素代谢物检测时的低灵敏度和VDBP结合型蛋白干扰的解决手段的情况下，准确和高通量的维生素D代谢产物检测方法的开发就显得尤为重要。
相关技术中存在的维生素D检测技术存在较多缺陷，如检测的种类有限或灵敏度、特异性较低，检测不准确。相关技术中已发现约50种维生素D代谢产物，但可实现的商业化测定方法只对其中的一小部分实现了检测。而且维生素D水平的测定目前较多集中在25OHD水平测定上，对维生素D代谢产物水平检测较少涉及。但维生素D代谢物的定量检测对于探讨孕妇补充不同剂量维生素D能否改善母婴相关妊娠情况具有重要意义。
此外，实验室检测25OHD主要是免疫法、放射免疫法、液相色谱法以及液相色谱一串联质谱联用法等。但上述方法均存在一定的限制性或使用缺陷，如液质联用方法往往采用有机溶剂(甲醇/乙睛)沉淀血清中免疫球蛋白，然后基于液液萃取或固相萃取小柱(SPE)提取维生素D相关代谢物，但该策略会使维生素D相关代谢物被血清中的蛋白质包裹，影响维生素D相关代谢物测定的准确度。而且维生素D相关代谢物的疏水性强，在液质分析过程中，离子化效率低，也会影响其液质分析的灵敏度。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种基于液质联用的血清维生素D相关代谢物的检测方法，该检测方法能够有效克服现有技术中对于血清等样本中维生素D或其相关代谢物检测效果不佳的缺陷，实现高灵敏度的维生素D或其相关代谢物检测。
本发明的第一个方面，提供一种维生素D或其代谢物的检测方法，包括如下步骤：
向待测样品中加入胰蛋白酶，然后加入有机萃取剂进行萃取；
取有机相，加入4-(4'-二甲氨基苯基)-1,2,4-三唑琳-3,5-二酮进行衍生化处理；
使用液相色谱质谱联用进行检测。
在本发明中，发明人使用胰蛋白酶固体酶制剂用与将检测样品中的蛋白质降解成肽段，释放维生素D及其相关代谢产物，有效的避免了现有技术中因为蛋白质沉淀而导致的检测效果不准确等缺陷。同时，基于维生素D相关代谢产物的结构特征性(在5-6、7-8两个共轭双键，其中，所示位置可以参考式I)，提出采用4-(4'-二甲氨基苯基)-1,2,4-三唑琳-3,5-二酮(PTAD)对维生素D代谢物进行衍生化，引入易于获得质子的氨基，提高维生素D代谢物的分析灵敏度。
Figure BDA0003697899700000021
在本发明的一些实施方式中，所述有机萃取剂包括甲基叔丁基醚、己烷、氯仿中的任意一种。
在本发明的一些实施方式中，所述有机萃取剂为甲基叔丁基醚。
在本发明的一些实施方式中，所述胰蛋白酶来自固体酶制剂。
在本发明的一些实施方式中，每mg固体酶制剂中固定有>50μg的胰蛋白酶，高浓度胰蛋白酶通过共价键结合于硅胶颗粒表面形成固体酶制剂。
在本发明的一些实施方式中，所述固体酶制剂购自广州科福技术有限公司。
当然，本领域技术人员也可以采用其他含有胰蛋白酶的酶制剂进行替代使用，包括但不限于上述固体酶制剂。
在本发明的一些实施方式中，每1μL待测样品中的胰蛋白酶的添加量至少为2.5μg。
在本发明的一些实施方式中，每1μL待测样品中的胰蛋白酶的添加量为2.5～25μg。
现有技术中使用有机溶剂沉淀蛋白来处理样本会使维生素D结合蛋白、免疫球等物质快速沉淀，而这些物质中会包裹有维生素D或其相关代谢物，从而会影响维生素D及其相关代谢物的提取效率，进而影响检测结果。而本发明首次提出使用含有高浓度胰蛋白酶的固体酶制剂消化样品中的蛋白，从而提高维生素D及其相关代谢物的提取效率，进而有效提高其实际检测准确度。
在本发明的一些实施方式中，所述待测样品与有机萃取剂的体积比为1：2～3。
在本发明的一些实施方式中，所述待测样品与有机萃取剂的体积比为1：2。
在本发明的一些实施方式中，所述待测样品与4-(4'-二甲氨基苯基)-1,2,4-三唑琳-3,5-二酮的体积比为1：1～1.5。
在本发明的一些实施方式中，所述待测样品与4-(4'-二甲氨基苯基)-1,2,4-三唑琳-3,5-二酮的体积比为1：1。
在本发明的一些实施方式中，所述4-(4'-二甲氨基苯基)-1,2,4-三唑琳-3,5-二酮的浓度为0.35～0.75mg/mL。
在本发明的一些实施方式中，所述4-(4'-二甲氨基苯基)-1,2,4-三唑琳-3,5-二酮的浓度为0.75mg/mL。
现有技术中常规的液质分析方法为：将提取到的维生素D相关代谢物直接用于液质分析。但发明人发现，维生素D相关代谢物超疏水、且无获得质子的官能团，因而直接对其采用液质分析的灵敏度非常低。而在本发明中，发明人基于维生素D相关代谢物结构特征，采用PTAD对维生素D相关代谢物进行衍生化，从而确保维生素D代谢物在液相-质谱联用中有充分的离子化效率，提高分析灵敏度和检测下限。
在本发明的一些实施方式中，所述液相色谱质谱联用中，液相条件为：
流动相A相为含甲酸的水溶液，流动相B相为含甲酸的甲醇溶液；色谱柱采用阳离子交换柱。
在本发明的一些实施方式中，流动相A相为含0.1％甲酸的水溶液。
在本发明的一些实施方式中，流动相B相为含0.1％甲酸的甲醇溶液。
在本发明的一些实施方式中，所述阳离子交换柱为强阳离子交换柱。
在本发明的一些实施方式中，所述阳离子交换柱为Waters ACQUITY UPLC BEH色谱柱C18柱，柱子尺寸为1.7μm，2.1×100mm。
在本发明的一些实施方式中，所述阳离子交换柱能吸附多肽，但不会吸附维生素D或其代谢物。
在本发明的一些实施方式中，所述液相的洗脱梯度为：
0～3min，85％～97％B相；
3～12min，95～97％B相；
12～15min，84％～85％B相。
在本发明的一些实施方式中，所述液相的洗脱梯度为：
0～3min，85％～97％B相；
3～12min，97％B相；
12～15min，85％B相。
在本发明的一些实施方式中，所述液相色谱质谱联用中，质谱条件为：
离子源为HESI，Full MS扫描模式，辅助气加热温度250℃；
正离子模式为：鞘气体积流量40μL/min，辅助气流速10μL/min，喷雾电压1.5kV，毛细管温度250℃；
扫描包括一级(分辨率35000FWHM)，扫描范围为m/z 150～2000。
在本发明的一些实施方式中，所述待测样品包括血清、食品、药品。
在本发明的一些实施方式中，所述维生素D包括维生素D2、维生素D3。
在本发明的一些实施方式中，所述代谢物包括25羟基维生素D、1,25-二羟基维生素D。
本发明的第二个方面，提供一种维生素D或其代谢物检测试剂盒，所述检测试剂盒包括胰蛋白酶、有机萃取剂和4-(4'-二甲氨基苯基)-1,2,4-三唑琳-3,5-二酮。
在本发明的一些实施方式中，所述有机萃取剂包括甲基叔丁基醚、己烷、氯仿中的任意一种。
在本发明的一些实施方式中，所述有机萃取剂为甲基叔丁基醚。
人血清中大部分维生素D处于与蛋白质结合状态，其中约88％与DVBP结合，约12％与白蛋白结合。结合蛋白在血清中的浓度约为250-400mg/L，且孕妇DVBP水平显著高于普通人群，基于其与维生素D的多种代谢产物均有较高的高亲和力，因此，采用常规检测的方式并不能得到实际的维生素D及其代谢产物含量。而在本发明中，所述检测试剂盒中的试剂可将25羟基维生素D从结合蛋白上有效释放，从而准确测量血清中维生素D浓度。
本发明的第三个方面，提供本发明第二个方面所述检测试剂盒在制备维生素D或其代谢物检测产品中的应用。
现有技术中的维生素D或其代谢物检测产品通常采用传统有机溶剂沉淀蛋白质的提取方法进行提取检测，其存在诸多明显缺陷，如VDBP属于蛋白质，会与血清中其他蛋白质一起被沉淀；蛋白质快速沉淀会包裹部分维生素D一起沉淀；需要结合血清中VDBP和白蛋白浓度检测才能有效对维生素D进行浓度校正。因此，其实际上并不便于常规使用，而本发明中的检测方法能够有效克服上述问题，其测定的维生素D浓度不再低于血清中实际浓度，能够直接、高灵敏度的反映出血清中的真实维生素D浓度，具有极高的实用价值。
本发明的有益效果是：
本发明中的检测方法中使用含有高浓度胰蛋白酶的固体酶制剂消化血清等样品中的蛋白，提高了维生素D相关代谢物的提取效率；而且还基于维生素D相关代谢物结构特征，使用PTAD对维生素D相关代谢物进行衍生化，确保了维生素D代谢物在液相-质谱联用中有充分的离子化效率。从而有效的克服了现有技术中检测效果不佳或不真实的问题，提高分析灵敏度和检测下限。
附图说明
图1为基于PTAD的衍生化处理示意图，其中，a为衍生化处理后的峰图，b为未经衍生化的峰图。
图2为5种维生素D代谢物标准品的质谱峰图。
图3为5种维生素D代谢物标准品的标准曲线图。
图4为实施例1与对比例1中的处理方法处理后的血清样品变化实物图。
图5为实施例1(固体酶法)与对比例1(蛋白沉淀法)中的检测方法测定司骨化醇的对比图。
图6为实施例1(固体酶法)与对比例1(蛋白沉淀法)中的检测方法测定1,25(OH)2-D3的对比图。
图7为实施例1(固体酶法)与对比例1(蛋白沉淀法)中的检测方法测定25-二羟基维生素D2的对比图。
图8为实施例1(固体酶法)与对比例1(蛋白沉淀法)中的检测方法测定25-羟基维生素D3的对比图。
图9为实施例1(固体酶法)与对比例1(蛋白沉淀法)中的检测方法测定25-羟基维生素D2的对比图。
具体实施方式
为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。
所使用的实验材料和试剂，若无特别说明，均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。
实施例1一种基于液质联用的血清维生素D相关代谢物的检测方法
本实施例中的基于液质联用的血清维生素D相关代谢物的检测方法包括如下步骤：
取100μL待测血清样品，加入50μg固体酶制剂(每mg固体酶制剂中固定有>50μg的胰蛋白酶，高浓度胰蛋白酶通过共价键结合于硅胶颗粒表面形成固体酶制剂，该固体酶制剂购自广州科福技术有限公司)，37℃恒温孵育30min。然后加入200μL甲基叔丁基醚萃取维生素D代谢物。取有机相，氮气吹干，加入100μL 0.75mg/mL的PTAD(4-(4'-二甲氨基苯基)-1,2,4-三唑琳-3,5-二酮)进行化学衍生化。室温反应1h后，4℃过夜反应。使用静电场轨道阱(Orbitrap)系列高分辨质谱仪(Q Exactivee)进行检测，其中，液相条件为：流动相包括A相和B相，A相为含0.1％甲酸的水溶液，B相为含0.1％甲酸的甲醇。柱子型号为WatersACQUITY UPLC BEH色谱柱C18柱(1.7μm，2.1×100mm)对维生素D相关代谢产物进行分离。洗脱梯度为：0～3min，85％～97％B相；3～12min，97％B相；12～15min，85％B相。质谱条件为：离子源为HESI(heated ESI)，Full MS扫描模式，辅助气加热温度250℃，正离子模式为：鞘气体积流量40μL/min，辅助气流速10μL/min，喷雾电压1.5kV，毛细管温度250℃。扫描包括一级(分辨率35000FWHM)，扫描范围为m/z 150～2000。
维生素D及其代谢物的化学衍生化验证
为了验证上述实施例1中对于维生素D及其代谢物可以成功进行衍生化，以及其衍生化对于检测效果的提升作用，发明人以维生素D代谢物(1,25(OH)2-D3，CAS号为32222-06-3)标准品作为试验对象，进行下述验证试验。
具体试验步骤为：
取1,25(OH)2-D3标准品，按照实施例1中所述方法，使用100μL 0.75mg/mL的PTAD(4-(4'-二甲氨基苯基)-1,2,4-三唑琳-3,5-二酮)进行化学衍生化，室温反应1h后，4℃过夜反应。使用静电场轨道阱(Orbitrap)系列高分辨质谱仪(QExactivee)进行检测，其中，液相条件为：流动相包括A相和B相，A相为含0.1％甲酸的水溶液，B相为含0.1％甲酸的甲醇。柱子型号为waters,ACQUITY UPLC@BEH C18 1.7μm 2.1×100mm Column。洗脱梯度为：0～3min，85％～97％B相；3～2min，97％B相；12～15min，85％B相。质谱条件为：离子源为HESI(heated ESI)，Full MS扫描模式，辅助气加热温度250℃，正离子模式为：鞘气体积流量40μL/min，辅助气流速10μL/min，喷雾电压1.5kV，毛细管温度250℃。扫描包括一级(分辨率35000FWHM)，扫描范围为m/z 150～2000。以未经衍生化处理的1,25(OH)2-D3标准品为对照。
结果如图1所示。
可以发现，基于PTAD的衍生化处理在衍生化过程中引入了更多的杂原子(如N、O)，使得1,25(OH)2-D3在反相色谱上出峰提前，色谱保留变弱。而且，引入的杂原子(如N、O)1,25(OH)2-D3在离子化的过程中更容易获得质子，从而使衍生化处理后，1,25(OH)2-D3的质谱信号获得了近10倍的提高，有效提高了检测的灵敏度，相比于未进行衍生化处理的检测方法显示出了极好的技术优势。
基于液质联用的血清维生素D相关代谢物的检测方法的检测效果验证
为了充分证明上述实施例1中的检测方法的有效性，发明人分别使用25-羟基维生素D2(25-羟麦角甾醇，CAS号：21343-40-8)标准品、25-羟基维生素D3(骨化二醇，Calcifediol，CAS号为63283-36-3)标准品、25-二羟基维生素D2(CAS号为60133-18-8)标准品、1,25(OH)2-D3(CAS号为32222-06-3)标准品和司骨化醇(Secalciferol，CAS号为55721-11-4)标准品为样本，采用上述实施例1中的检测方法进行检测。
结果如图2和表1所示。
图2为5种维生素D代谢物的质谱峰图。
表1为5种维生素D代谢物的浓度与峰面积对应数据。
表1 5种维生素D代谢物的浓度与峰面积
Figure BDA0003697899700000071
可以发现，上述实施例1中的检测方法能够准确测定出0.01ng/mL的维生素D代谢物，具有极好的灵敏度。
以浓度为X轴，峰面积为Y轴，绘制各维生素D代谢物的标准曲线，结果如图3所示，以用于定量测定。
对比例1血清维生素D相关代谢物的传统检测方法(有机相沉淀蛋白法)
具体试验步骤为：
取100μL待测血清样品，加入300μL乙睛，以沉淀血清中的蛋白质。取上清，加入200μL甲基叔丁基醚萃取维生素D代谢物。取有机相，氮气吹干，加入100μL 0.75mg/mL的PTAD进行化学衍生化。室温反应1h后，4℃过夜反应。
同时，以上述实施例1中的方法作为对照，对比实施例1与对比例1中的检测效果差异。
结果如图4所示。
可以发现，当采用对比例1中的方法进行沉淀处理后，血清样品中会产生大量蛋白质沉淀，这会显著影响维生素D相关代谢物的提取效率。而基于实施例中的处理方法，在加入固体酶处理后，血清仍然很澄清，这会显著提高甲基叔丁基醚对于血清中维生素D相关代谢物的提取效率。
实施例1与对比例1的检测效果对比
分别采用实施例1和对比例1中的检测方法分别对6例不同孕期的孕妇血清样本(血清样本来自广州市妇女儿童医疗中心，具体为检验科中常规生化检测后剩余样本)进行检测，对比两者在不同的维生素D代谢物检测中的检测差异。
(1)司骨化醇的检测对比：
实施例1和对比例1中的检测方法同上，结果如表2和图5所示。
表2司骨化醇检测结果
Figure BDA0003697899700000081
可以发现，在相同的样本量的基础上，采用实施例1中的检测结果与对比例1中的检测结果存在显著差异性，最大差异倍数可以达约6.5倍，实施例1中的检测方法能够有效释放出结合蛋白上的司骨化醇，从而更加真实的显示出血清中的实际司骨化醇含量。
(2)1,25(OH)2-D3的检测对比：
实施例1和对比例1中的检测方法同上，结果如表3和图6所示。
表3 1,25(OH)2-D3检测结果
Figure BDA0003697899700000091
可以发现，在相同的样本量的基础上，采用实施例1中的检测结果与对比例1中的检测结果存在显著差异性，最大差异倍数可以达约8倍，实施例1中的检测方法能够有效释放出结合蛋白上的1,25(OH)2-D3，从而更加真实的显示出血清中的实际1,25(OH)2-D3含量。
(3)25-二羟基维生素D2的检测对比：
实施例1和对比例1中的检测方法同上，结果如表4和图7所示。
表4 25-二羟基维生素D2检测结果
Figure BDA0003697899700000092
可以发现，在相同的样本量的基础上，采用实施例1中的检测结果与对比例1中的检测结果存在显著差异性，最大差异倍数可以达约2倍，实施例1中的检测方法能够有效释放出结合蛋白上的25-二羟基维生素D2，从而更加真实的显示出血清中的实际25-二羟基维生素D2含量。
(4)25-羟基维生素D3的检测对比：
实施例1和对比例1中的检测方法同上，结果如表5和图8所示。
表5 25-羟基维生素D3检测结果
Figure BDA0003697899700000093
可以发现，在相同的样本量的基础上，采用实施例1中的检测结果与对比例1中的检测结果存在显著差异性，最大差异倍数可以达约2倍，实施例1中的检测方法能够有效释放出结合蛋白上的25-羟基维生素D3，从而更加真实的显示出血清中的实际25-羟基维生素D3含量。
(5)25-羟基维生素D2的检测对比：
实施例1和对比例1中的检测方法同上，结果如表6和图9所示。
表6 25-羟基维生素D2检测结果
Figure BDA0003697899700000101
可以发现，在相同的样本量的基础上，采用实施例1中的检测结果与对比例1中的检测结果存在差异性，最大差异倍数可以达约1.3倍，实施例1中的检测方法能够有效释放出结合蛋白上的25-羟基维生素D2，从而更加真实的显示出血清中的实际25-羟基维生素D2含量。
综上所述，可以发现，以上述5种维生素D代谢物为例，实施例1中的检测方法相比于传统方法(对比例1)具有更为准确的检测效果，从而能够有效的显示出样本中的实际维生素D代谢物含量，对于维生素D及其代谢物相关功能及关联性疾病的机理研究提供了极好的技术支持。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种维生素D或其代谢物的检测方法，包括如下步骤：
向待测样品中加入胰蛋白酶，然后加入有机萃取剂进行萃取；
取有机相，加入4-(4'-二甲氨基苯基)-1,2,4-三唑琳-3,5-二酮进行衍生化处理；
使用液相色谱质谱联用进行检测。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，每1μL待测样品中的胰蛋白酶的添加量至少为2.5μg。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述待测样品与有机萃取剂的体积比为1：2～3。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述待测样品与4-(4'-二甲氨基苯基)-1,2,4-三唑琳-3,5-二酮的体积比为1：1～1.5，所述4-(4'-二甲氨基苯基)-1,2,4-三唑琳-3,5-二酮的浓度为0.35～0.75mg/mL。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述液相色谱质谱联用中，液相条件为：流动相A相为含甲酸的水溶液，流动相B相为含甲酸的甲醇溶液；色谱柱采用阳离子交换柱。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述液相的洗脱梯度为：
0～3min，85％～97％B相；
3～12min，95～97％B相；
12～15min，84％～85％B相。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述液相色谱质谱联用中，质谱条件为：离子源为HESI，FullMS扫描模式，辅助气加热温度240～250℃；
正离子模式为：鞘气体积流量40～42μL/min，辅助气流速10～11μL/min，喷雾电压1.4～1.5kV，毛细管温度240～250℃；
扫描包括一级，分辨率35000FWHM，扫描范围为m/z 150～2000。
8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述维生素D包括维生素D2、维生素D3；所述代谢物包括25羟基维生素D、1,25-二羟基维生素D。
9.一种维生素D或其代谢物检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括胰蛋白酶、有机萃取剂和4-(4'-二甲氨基苯基)-1,2,4-三唑琳-3,5-二酮。
10.权利要求9所述检测试剂盒在制备维生素D或其代谢物检测产品中的应用。
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Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008092917A1 (en) * 2007-02-01 2008-08-07 Immundiagnostik Ag Direct determination of vitamin d in serum or plasma
US20110183429A1 (en) * 2010-01-25 2011-07-28 Dh Technologies Development Pte. Ltd. Quantitative analysis of vitamin d3, vitamin d2, and metabolites thereof
US20150308987A1 (en) * 2012-11-30 2015-10-29 Waters Technologies Corporation Methods and apparatus for the analysis of vitamin d metabolites
CN110174477A (zh) * 2019-06-11 2019-08-27 中国医学科学院北京协和医院 液相色谱串联质谱测定样品中游离维生素d的方法
US20210072263A1 (en) * 2018-01-03 2021-03-11 Immundiagnostik Ag Method of measuring the endocytic vitamin d status
CN113311080A (zh) * 2021-05-10 2021-08-27 中国医学科学院北京协和医院 多种维生素d代谢物联合检测方法及其检测试剂盒和应用

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008092917A1 (en) * 2007-02-01 2008-08-07 Immundiagnostik Ag Direct determination of vitamin d in serum or plasma
US20110183429A1 (en) * 2010-01-25 2011-07-28 Dh Technologies Development Pte. Ltd. Quantitative analysis of vitamin d3, vitamin d2, and metabolites thereof
US20150308987A1 (en) * 2012-11-30 2015-10-29 Waters Technologies Corporation Methods and apparatus for the analysis of vitamin d metabolites
US20210072263A1 (en) * 2018-01-03 2021-03-11 Immundiagnostik Ag Method of measuring the endocytic vitamin d status
CN110174477A (zh) * 2019-06-11 2019-08-27 中国医学科学院北京协和医院 液相色谱串联质谱测定样品中游离维生素d的方法
CN113311080A (zh) * 2021-05-10 2021-08-27 中国医学科学院北京协和医院 多种维生素d代谢物联合检测方法及其检测试剂盒和应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
PAVEL A，ET AL: "Metabolic profiling of major vitamin D metabolites using Diels–Alder derivatization and ultra-performance liquid chromatography–tandem mass spectrometry", ANAL BIOANAL CHEM *

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