CN109709220B - 一种用于诊断膀胱癌的联合标志物及试剂盒和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及血清样品中小分子代谢物甘磷酸胆碱、胱氨酸、十二碳烯酸、二十碳烯酸和鹅去氧胆酸作为联合标志物在制备用于诊断受试者中膀胱癌的试剂盒中的新应用。本发明还涉及检测受试者中的膀胱癌的试剂盒,通过检测来自受试者的血清样品中上述联合标志物各自的浓度,基于二元逻辑回归方程计算所述联合标志物变量,再基于确定的截点值,判断所述受试者是否患有膀胱癌。所述试剂盒可实现高灵敏、高效检测本发明涉及的几种小分子代谢物,且具有检测成本低,重复性好的特点。上述几种小分子代谢物联合使用,可在膀胱癌的辅助诊断中得到应用。
Description
技术领域
本发明涉及已知代谢物的新用途。具体地,本发明涉及血清中的甘磷酸胆碱、胱氨酸、十二碳烯酸、二十碳烯酸和鹅去氧胆酸联合用作诊断膀胱癌的标志物,并且涉及检测受试者中的膀胱癌的试剂盒和系统。
背景技术
膀胱癌(Bladder cancer,BC)是第二常见的影响泌尿系统的人类恶性肿瘤,也是全球范围内最致命的癌症之一,近几十年其发病率和死亡率逐渐上升。膀胱癌的发生发展机制至今尚未阐明,其风险因素涉及多基因遗传、环境因素及生活方式的综合作用。膀胱癌早期发现是提高患者生存率的关键,对于早期患者其存活率高达95%;然而对于晚期患者存活率降低到50%左右。但是膀胱癌早期并无明显症状,导致其诊断十分困难。目前的标准临床诊断方法包括膀胱镜和尿细胞学检查:膀胱镜作为一种侵入性的方法,是在膀胱的直接观察,但不能显现某些部位和癌某些情况下的原位;尿细胞学检查包括显微镜观测尿涂片检查异常细胞,血液和其他标记。虽具有无创性和高度特异性,但它缺乏检测低级别肿瘤的敏感性。(文献1:GAO Zhen-Yu,XIANG Min,Anti Infect Pharm 2016,13(4):725-728)。因此,为了提高膀胱癌早期临床诊断的灵敏度和特异性,开发新的诊断方法势在必行。
已有研究表明,膀胱癌的发生发展与多种小分子代谢物紊乱密切相关,例如氨基酸代谢,脂质代谢,胆汁酸代谢等。本发明通过液相色谱质谱联用的代谢组学方法检测血中的代谢物,经过生物信息学分析,筛选目标代谢物,有望在膀胱癌的诊断中有应用。而且,色谱质谱联用技术为小分子代谢物的检测提供了快速、灵敏的重复性好、成本低的检测方法。色谱质谱联用技术检测小分子代谢物在疾病诊断中的应用已有成功的案例。如液质谱联用技术检测肌氨酸判别前列腺癌(文献2:Sreekumar,A.;Poisson,L.M.;Rajendiran,T.M.;Khan,A.P.;Cao,Q.;Yu,J.;Laxman,B.;Mehra,R.;Lonigro,R.J.;Li,Y.;Nyati,M.K.;Ahsan,A.;Kalyana-Sundaram,S.;Han,B.;Cao,X.;Byun,J.;Omenn,G.S.;Ghosh,D.;Pennathur,S.;Alexander,D.C.;Berger,A.;Shuster,J.R.;Wei,J.T.;Varambally,S.;Beecher,C.;Chinnaiyan,A.M.,Nature 2009,457,(7231),910-914);以及液质谱联用技术检测血清中甘磷酸胆碱等13个差异代谢物作为联合标志物进行膀胱癌辅助诊断(文献3:CHEN Yong-Jing,WANG Xiao-Hua,HUANG Zhen-Zhen,LIN Lin,GAO Yao,ZHU Er-Yi,XINGJin-Chun,ZHENG Jia-Xin,HANG Wei.Chinese J.Anal.Chem.,2012,40(9):1322-1328)等。
本发明确定的甘磷酸胆碱、胱氨酸、十二碳烯酸、二十碳烯酸和鹅去氧胆酸都是人体重要的代谢物,参与人体多种病理生理过程。甘磷酸胆碱是合成乙酰胆碱的原料,是一种支持人类激素生产的神经递质。胆碱目前被认为是一个重要的维生素,涉及到脂质代谢和葡萄糖体内平衡调节(文献4:F.P.Martin et al.,J.Proteome Res.9,5284(2010))。胱氨酸具有促进细胞氧化还原的功能,与细胞能量代谢密切相关。十二碳烯酸和二十碳烯酸均为游离不饱和脂肪酸。游离脂肪酸是人体内的储能物质,其浓度异常与临床上很多疾病的发生发展密切相关。(文献5:Roden M,Price T B,Perseghin G,Petersen K F,Rothman DL,Cline G W,Shulman G I.J.Clin.Invest.,1996,97(12):2859-2865)。鹅去氧胆酸是一种具有杀菌、抗炎作用的胆汁酸。它不仅参与机体脂质的乳化吸收和运输,还通过多种细胞膜、胞内蛋白共同作用所介导的信号事件在机体的糖代谢、脂代谢以及能量代谢中起着重要的调节作用(文献6:Pellicoro A,Faber KN.Aliment Pharmacol Ther,2007,26(2):149-160)。但到目前为止甘磷酸胆碱、胱氨酸、十二碳烯酸、二十碳烯酸和鹅去氧胆酸尚无研究将其作为联合标志物应用于膀胱癌。
发明内容
本发明的目的是针对膀胱癌诊断复杂、灵敏度低的临床问题,提供一种组合的小分子代谢物在膀胱癌辅助诊断中的应用,并提供可用于上述组合的小分子代谢物的分析检测方法。
为实现上述目的,本发明采用的技术方案如下:
(1)利用高效液相色谱质谱联用的代谢组学技术,对正常人和膀胱癌患者血清进行了非靶向代谢组学分析,发现并定性35种代谢物在正常人和膀胱癌患者中存在显著性差异;
(2)使用数据统计软件SPSS,通过二元逻辑回归分析方法(文献7:1.Bewick V,Cheek L,Ball J,Critical care 2005,9(1):112-118),结合代谢物生理功能在35个差异代谢物中随机组合,回归为联合标志物变量,然后用受试者工作特征曲线ROC(receiveroperating characteristic)的曲线下面积AUC(Area Under Curve)来评价联合标志物的灵敏度和特异性。ROC曲线是根据一系列不同的二分类方式,以灵敏度为纵坐标,特异度为横坐标绘制的曲线,其中灵敏度是将实际有病的人正确地判定为真阳性的比例,特异度是将实际无病的人正确地判定为真阴性的比例。灵敏度和特异性均较高,同时兼顾简便性(即参与组合的代谢物个数比较少)的组合可以作为联合标志物;
(3)应用另外一批正常人和膀胱癌患者血清样本对组合代谢标志物进行验证,确定甘磷酸胆碱、胱氨酸、十二碳烯酸、二十碳烯酸和鹅去氧胆酸可作为辅助诊断膀胱癌的联合标志物;
(4)联合标志物的使用:在膀胱癌病人中甘磷酸胆碱、胱氨酸、二十烯酸的含量显著性上调,而十二碳烯酸和鹅去氧胆酸的含量显著性下调。使用数据统计软件SPSS,通过二元逻辑回归分析方法,将甘磷酸胆碱、胱氨酸、十二碳烯酸、二十碳烯酸和鹅去氧胆酸回归为联合标志物变量P,优选地,二元逻辑回归方程如下:
方程1:
P=1/1+e-(0.103×a+1.534×b-2.353×c+2.554×d-1.489×f+0.431)
其中,a为血清样品中甘磷酸胆碱浓度,b为血清样品中胱氨酸浓度,c为血清样品中十二碳烯酸浓度,d为血清样品中二十碳烯酸浓度,f为血清样品中鹅去氧胆酸浓度。
所得变量P在膀胱癌中增高,该变量的值可用于辅助判定膀胱癌。在此,基于试验涉及的样本,根据诊断灵敏度和特异性最佳的原则,即ROC曲线下面积(AUC)最大的原则,该联合标志物变量的截点值(cut-off值)设为0.500,高于该截点值则有可能为膀胱癌。也可以根据实验者的实际结果通过二元逻辑回归得到新的方程,并定义该实验室的最佳截点值。
(5)诊断系统所包括的装置:色谱柱为SeQuant ZIC HILIC色谱柱,检测仪器为超高效液相色谱串联质谱仪,使用正、负离子检测模式;
(6)确定试剂盒最佳组成:
a.标准品:甘磷酸胆碱、胱氨酸、十二碳烯酸、二十碳烯酸和鹅去氧胆酸(均购自sigma公司)。甘磷酸胆碱、胱氨酸、十二碳烯酸、二十碳烯酸和鹅去氧胆酸标准品用于对应的血清代谢物的定性和定量标准曲线绘制。
b.用于血清样品预处理的提取液:包含内标1-13C-缬氨酸、D4-鹅脱氧胆酸、D3-棕榈酸的甲醇溶液,用于血清样本预处理。1-13C-缬氨酸用于校正甘磷酸胆碱和胱氨酸,D3-棕榈酸用于校正十二碳烯酸和二十碳烯酸,D4-鹅脱氧胆酸用于校正鹅去氧胆酸;
c.洗脱液:包含10mM乙酸铵和0.02%(v/v)乙酸的95%(v/v)乙腈水溶液和包含10mM乙酸铵和0.02%(v/v)乙酸的水溶液。通常来说,推测的未知代谢物的结构需要同标准品比对才能最终确认其结构;
(7)试剂盒应用于超高效液相色谱串联质谱仪还可以同时检测20多种氨基酸、游离脂肪酸、核苷酸、磷酸糖等极性代谢物,可更为全面的透视膀胱癌的代谢异常;
(8)采用血清样本测试本发明的应用效果。分别采用2批次的正常人和膀胱癌患者的血清样本。使用联合标志物,正常人和膀胱癌患者可得到很好的区分,灵敏度和特异性及曲线下面积(AUC)见下表1。
表1.
具体来说,本发明提供下述各项:
1联合标志物在制备用于诊断膀胱癌的试剂盒中的用途,其中所述联合标志物包括甘磷酸胆碱、胱氨酸、十二碳烯酸、二十碳烯酸和鹅去氧胆酸。
一种检测受试者中的膀胱癌的试剂盒,所述试剂盒包括:
(1)标准品:包括甘磷酸胆碱、胱氨酸、十二碳烯酸、二十碳烯酸和鹅去氧胆酸,所述标准品分别用于绘制对应的血清代谢物的定性和定量标准曲线;
(2)用于预处理来自受试者的血清样品的提取液:包含内标1-13C-缬氨酸、D4-鹅脱氧胆酸、D3-棕榈酸的甲醇溶液;
(3)用于洗脱色谱柱的洗脱液。
所述的试剂盒,其中所述标准品溶液浓度依次为:0.001μg/mL、0.005μg/mL、0.01μg/mL、0.025μg/mL、0.05μg/mL、0.1μg/mL、0.25μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL。所述提取液包含4×10-3mg/ml的1-13C-缬氨,1.49×10-3mg/ml的D4-鹅脱氧胆酸,2.5×10-3mg/ml的D3-棕榈酸。
所述的试剂盒,其中所述用于洗脱色谱柱的洗脱液是用于洗脱SeQuant ZICHILIC色谱柱的洗脱液。
所述的试剂盒,其中所述洗脱液包括:
流动相A:包含10mM乙酸铵和0.02%(v/v)乙酸的95%(v/v)乙腈水溶液;
流动相B:包含10mM乙酸铵和0.02%(v/v)乙酸的水溶液。
一种计算受试者的血清样品中的联合标志物变量的方法,其中所述联合标志物包括甘磷酸胆碱、胱氨酸、十二碳烯酸、二十碳烯酸和鹅去氧胆酸,所述方法包括下述步骤:
(1)利用甘磷酸胆碱、胱氨酸、十二碳烯酸、二十碳烯酸和鹅去氧胆酸作为标准品,加入内标1-13C-缬氨酸、D4-鹅脱氧胆酸、D3-棕榈酸,将溶液上样到色谱柱,洗脱,质谱检测记录所述甘磷酸胆碱、胱氨酸、十二碳烯酸、二十碳烯酸、鹅去氧胆酸及内标1-13C-缬氨酸、D4-鹅脱氧胆酸、D3-棕榈酸的洗脱峰强度;分别绘制相甘磷酸胆碱、胱氨酸、十二碳烯酸、二十碳烯酸和鹅去氧胆酸的定量标准曲线,其对应横坐标为浓度,纵坐标为代谢物峰与内标峰的相对强度;
(2)用提取液预处理来自受试者的血清样品,其中所述提取液为包含内标1-13C-缬氨酸、D4-鹅脱氧胆酸、D3-棕榈酸的甲醇溶液;沉淀血清样品中的蛋白,将上清液冷冻干燥,然后用乙腈:水=1:1(v/v)复溶,上样到色谱柱,洗脱,质谱记录所述血清样品中的甘磷酸胆碱、胱氨酸、十二碳烯酸、二十碳烯酸和鹅去氧胆酸的洗脱峰强度;
(3)根据步骤(1)的定量标准曲线和步骤(2)的洗脱峰强度,计算所述受试者的血清样品中的甘磷酸胆碱、胱氨酸、十二碳烯酸、二十碳烯酸和鹅去氧胆酸的浓度,最后基于二元逻辑回归方程计算联合标志物变量,通过这个数值的大小判断疾病的可能性。
所述的方法,其中基于下述二元逻辑回归方程计算所述联合标志物变量P:
P=1/1+e-(0.103×a+1.534×b-2.353×c+2.554×d-1.489×f+0.431)
其中,a表示受试者血清样品中的甘磷酸胆碱的浓度,b表示受试者血清样品中的胱氨酸的浓度,c表示受试者血清样品中的十二碳烯酸的浓度,d表示受试者血清样品中的二十碳烯酸的浓度,f表示受试者血清样品中鹅去氧胆酸的浓度。
所述的方法,其中步骤(2)的提取液包含4×10-3mg/ml的1-13C-缬氨酸,1.49×10-3mg/ml的D4-鹅脱氧胆酸,2.5×10-3mg/ml的D3-
所述的系统,其中所述分离装置包括SeQuant ZIC HILIC色谱柱和超高效液相色谱串联质谱仪。
一种诊断试者中的膀胱癌的方法,所述方法包括下述步骤:
(1)利用甘磷酸胆碱、胱氨酸、十二碳烯酸、二十碳烯酸和鹅去氧胆酸作为标准品,加入内标1-13C-缬氨酸、D4-鹅脱氧胆酸、D3-棕榈酸,分别绘制相对应的血清代谢物甘磷酸胆碱、胱氨酸、十二碳烯酸、二十碳烯酸和鹅去氧胆酸的定量标准曲线;
(2)所述受试者前一天空腹过夜,于次日早晨采血。用提取液预处理所述血清样品,其中所述提取液为包含内标1-13C-缬氨酸、D4-鹅脱氧胆酸、D3-棕榈酸的甲醇溶液;沉淀血清样品中的蛋白,将上清液冷冻干燥,然后用乙腈:水=1:1(v/v)复溶,上样到色谱柱,洗脱,记录所述血清样品中的甘磷酸胆碱、胱氨酸、十二碳烯酸、二十碳烯酸和鹅去氧胆酸的洗脱峰强度;
(3)根据步骤(1)的定量标准曲线和步骤(2)的洗脱峰强度,计算所述血清样品中的甘磷酸胆碱、胱氨酸、十二碳烯酸、二十碳烯酸和鹅去氧胆酸的浓度,其中所述血清样品中的甘磷酸胆碱的浓度表示为a,胱氨酸的浓度表示为b,十二碳烯酸的浓度表示为c,二十碳烯酸的浓度表示为d,鹅去氧胆酸的浓度表示为f,基于适当的二元逻辑回归方程计算联合标志物变量P;
(4)根据试验者对诊断灵敏度和特异性的要求,或ROC曲线下面积最大的原则,设定合适的截点值,当步骤(3)计算的联合标志物变量P大于该截点值时,判断所述受试者患有膀胱癌。
所述的方法,其中步骤(3)所用的计算所述联合标志物变量P的二元逻辑回归方程为:
P=1/1+e-(0.103×a+1.534×b-2.353×c+2.554×d-1.489×f+0.431)
所述的方法,其中步骤(2)的提取液包含4×10-3mg/ml的1-13C-缬氨酸,1.49×10- 3mg/ml的D4-鹅脱氧胆酸,2.5×10-3mg/ml的D3-棕榈酸。
本发明具有的效果是:血清样品中小分子代谢物甘磷酸胆碱、胱氨酸、十二碳烯酸、二十碳烯酸和鹅去氧胆酸可以联合用于膀胱癌病人的识别。通过本发明涉及的上述几种小分子代谢物的检测试剂盒,可以实现高灵敏、高效检测,且具有检测成本低,重复性好的特点。上述几种小分子代谢物的联合使用可用于辅助诊断膀胱癌。
附图说明
从下面结合附图的详细描述中,本发明的上述特征和优点将更明显,其中:
图1显示本发明的分析策略流程。
图2显示甘磷酸胆碱(A)、胱氨酸(B)、十二碳烯酸(C)、二十碳烯酸(D)、鹅去氧胆酸(E)在正常对照组(Normal control,NC)、膀胱癌组(Bladder cancer,BC)血清样本中的含量变化,及联合标志物在正常人和膀胱癌病人之间的差异(F)。
图3(A)联合标志物在用于第一批正常对照组和膀胱癌组血清样本中的ROC曲线,AUC=0.825;(B)联合标志物在用于第二批正常对照组和膀胱癌组血清样本中的ROC曲线,AUC=0.888。
具体实施方式
下面参照具体的实施例进一步描述本发明,但是本领域技术人员应该理解,本发明并不限于这些具体的实施例。
利用甘磷酸胆碱、胱氨酸、十二碳烯酸、二十碳烯酸和鹅去氧胆酸作为标准品,加入内标1-13C-缬氨酸、D4-鹅脱氧胆酸、D3-棕榈酸,将溶液上样到色谱柱,洗脱,质谱检测记录所述甘磷酸胆碱、胱氨酸、十二碳烯酸、二十碳烯酸、鹅去氧胆酸及内标1-13C-缬氨酸、D4-鹅脱氧胆酸、D3-棕榈酸的洗脱峰强度;分别绘制相甘磷酸胆碱、胱氨酸、十二碳烯酸、二十碳烯酸和鹅去氧胆酸的定量标准曲线,其对应横坐标为浓度,纵坐标为代谢物峰与内标峰的相对强度;
其中所述标准品溶液浓度依次为:0.001μg/mL、0.005μg/mL、0.01μg/mL、0.025μg/mL、0.05μg/mL、0.1μg/mL、0.25μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL。所述提取液包含4×10-3mg/ml的1-13C-缬氨,1.49×10-3mg/ml的D4-鹅脱氧胆酸,2.5×10-3mg/ml的D3-棕榈酸。
其中所述用于洗脱色谱柱的洗脱液是用于洗脱SeQuant ZIC HILIC色谱柱的洗脱液。
其中所述洗脱液包括:
流动相A:包含10mM乙酸铵和0.02%(v/v)乙酸的95%(v/v)乙腈水溶液;
流动相B:包含10mM乙酸铵和0.02%(v/v)乙酸的水溶液。
洗脱过程及条件同下述实施例。
实施例1
1.血清样品收集
采集前,纳入研究的所有志愿者签署知情同意书。
96例膀胱癌患者和49例正常对照组均是前一天空腹过夜,于次日早晨采血。采集的血样静置30分钟,4500rpm/min 4℃离心15分钟后,取血清置于-80℃冰箱保存备用。
2.分析方法
2.1血清样本预处理
血样在4℃下解冻,取100μL血清样本,加入400μL包含内标的提取液(即包含内标1-13C-缬氨酸、D4-鹅脱氧胆酸、D3-棕榈酸的甲醇溶液,内标的浓度参见表2)沉淀蛋白;震荡后,14000g,4℃,离心15分钟;取上清400μL平均分装于2个1.5mL离心管中冷冻干燥,保存在-80℃冰箱中。进样前,样品用50μL乙腈:水=1:1(v/v)复溶;震荡后,14000g,4℃,离心10分钟;取上清40μL用于进样。
表2.提取液中内标的浓度
2.2超高效液相色谱质谱分析
(1)液相条件:色谱仪为AcquityTM UPLC液相色谱仪(美国Waters公司);色谱柱为SeQuant ZIC-HILIC(150mm×2.1mm,3μm)(德国Merk公司);流动相A为包含10mM乙酸铵和0.02%(v/v)乙酸的95%(v/v)乙腈水溶液,流动相B为包含10mM乙酸铵和0.02%(v/v)乙酸的水溶液;洗脱梯度:0~8min为100%A相,8~20min线性变化到75%A相(v/v),20~25min线性变化到43%A相,25~25.1min变化到初始100%A相并保持10min;流动相流速为0.3mL/min;柱温维持在40℃;进样量为5μL。
(2)质谱条件:质谱仪为TripleTOF 5600质谱仪(美国AB SCIEX公司);采用电喷雾电离正、负离子模式分别检测;质谱扫描范围m/z 50~1000,质量偏差为50mDa。正离子模式下离子源雾化气和辅助气都为344.75Pa,气帘气为241.33Pa,温度为500℃,喷雾电压为5500V,去簇电压为80V,碰撞能为30eV;负离子模式下离子源雾化气和辅助气都为379.23Pa,气帘气为241.33Pa,温度为600℃,喷雾电压为-4500V,去簇电压为-100V,碰撞能为-30eV。
2.3血清测试结果及辅助诊断方法
定量分析甘磷酸胆碱、胱氨酸、十二碳烯酸、二十碳烯酸和鹅去氧胆酸。甘磷酸胆碱、胱氨酸、十二碳烯酸、二十碳烯酸和鹅去氧胆酸在正常对照组、膀胱癌组血清样本中的含量如图2A-E所示。相对于正常对照组,在膀胱癌病人中甘磷酸胆碱、胱氨酸、二十烯酸的含量显著性上调,而十二碳烯酸和鹅去氧胆酸的含量显著性下调。
根据步骤定量标准曲线和血清测试结果的洗脱峰强度,计算所述血清样品中的甘磷酸胆碱、胱氨酸、十二碳烯酸、二十碳烯酸和鹅去氧胆酸的浓度;
运用二元逻辑回归(即,方程1(见“发明内容”部分),参见文献7:1.Bewick V,Cheek L,Ball J,Critical care 2005,9(1):112-118),联合标志物在正常人和膀胱癌病人之间的差异如图2F所示。当联合标志物使用0.500的截点值时,使用结果如下表3。联合标志物用于区分正常人和膀胱癌患者,具有较高的灵敏度和特异性。
表3.
实施例2
采集了另外一批血清样本对膀胱癌的联合标志物进行了验证,包括32例膀胱癌患者和17例正常对照。
1.血清样品收集
样品收集方法同实施例1。
2.分析方法
2.1血清样品预处理方法同实施例1。
2.2超高效液相色谱质谱分析
液相与质谱条件同实施例1。
2.3验证结果。
甘磷酸胆碱、胱氨酸、十二碳烯酸、二十烯酸和鹅去氧胆酸的含量在膀胱癌患者组和正常对照组中有明显不同。使用二元逻辑回归方程,当联合标志物使用0.500的截点值时,使用结果如下表4。
表4.
第二批验证结果与第一批发现的结果基本吻合。甘磷酸胆碱、胱氨酸、十二碳烯酸、二十烯酸和鹅去氧胆酸作为联合标志物用于诊断受试者中的膀胱癌,其灵敏度和特异性均较高,具有较好的应用前景。
本发明检测受试者中的膀胱癌的试剂盒,通过检测来自受试者的血清样品中上述联合标志物各自的浓度,基于二元逻辑回归方程计算所述联合标志物变量,再基于确定的截点值,判断所述受试者是否患有膀胱癌。所述试剂盒可实现高灵敏、高效检测本发明涉及的几种小分子代谢物,且具有检测成本低,重复性好的特点。上述几种小分子代谢物联合使用,可在膀胱癌的辅助诊断中得到应用。
应该理解,尽管参考其示例性的实施方案,已经对本发明进行具体地显示和描述,但是本领域的普通技术人员应该理解,在不背离由后附的权利要求所定义的本发明的精神和范围的条件下,可以在其中进行各种形式和细节的变化,可以进行各种实施方案的任意组合。
Claims (7)
1.一种用于诊断膀胱癌的联合标志物,包括甘磷酸胆碱、胱氨酸、十二碳烯酸、二十碳烯酸和鹅去氧胆酸。
2.联合标志物在制备用于诊断受试者中的膀胱癌的试剂盒中的应用,其中所述联合标志物包括甘磷酸胆碱、胱氨酸、十二碳烯酸、二十碳烯酸和鹅去氧胆酸。
3.一种检测受试者中的膀胱癌的试剂盒,所述试剂盒包括:
(1)标准品:包括甘磷酸胆碱、胱氨酸、十二碳烯酸、二十碳烯酸和鹅去氧胆酸,所述标准品分别用于绘制对应的血清代谢物甘磷酸胆碱、胱氨酸、十二碳烯酸、二十碳烯酸和鹅去氧胆酸的定性和定量标准曲线;
(2)用于预处理来自受试者的血清样品的提取液:包含内标1-13C-缬氨酸、D4-鹅脱氧胆酸、D3-棕榈酸的甲醇溶液;
(3)用于洗脱色谱柱的洗脱液。
4.根据权利要求3所述的试剂盒,其中所述用于洗脱色谱柱的洗脱液是用于洗脱SeQuant ZIC-HILIC色谱柱的洗脱液。
5.根据权利要求3所述的试剂盒,其中所述洗脱液包括:
流动相A:包含10 mM 乙酸铵和0. 02%(v/v)乙酸的95%(v/v)乙腈水溶液;
流动相B:包含10 mM 乙酸铵和0. 02%(v/v)乙酸的水溶液。
6.根据权利要求3-5任一所述试剂盒,其特征在于:所述试剂盒使用方法包括下述步骤:
(1) 利用甘磷酸胆碱、胱氨酸、十二碳烯酸、二十碳烯酸和鹅去氧胆酸标准品配制混合标准溶液并逐级稀释,之后加入内标1-13C-缬氨酸、D4-鹅脱氧胆酸、D3-棕榈酸;将溶液上样到色谱柱,洗脱,质谱检测记录所述甘磷酸胆碱、胱氨酸、十二碳烯酸、二十碳烯酸、鹅去氧胆酸及内标1-13C-缬氨酸、D4-鹅脱氧胆酸、D3-棕榈酸的洗脱峰强度;分别绘制相甘磷酸胆碱、胱氨酸、十二碳烯酸、二十碳烯酸和鹅去氧胆酸的定量标准曲线,其对应横坐标为浓度,纵坐标为代谢物峰与内标峰的相对强度;
(2) 用提取液预处理来自受试者的血清样品,其中所述提取液为包含内标1-13C-缬氨酸、D4-鹅脱氧胆酸、D3-棕榈酸的甲醇溶液;沉淀血清样品中的蛋白,将上清液冷冻干燥,然后用乙腈:水=1:1(v/v)复溶,上样到色谱柱,洗脱,记录所述血清样品中的甘磷酸胆碱、胱氨酸、十二碳烯酸、二十碳烯酸、鹅去氧胆酸及内标的洗脱峰强度;
(3) 根据步骤(1)的定量标准曲线和步骤(2)的洗脱峰强度,计算所述受试者的血清样品中的甘磷酸胆碱、胱氨酸、十二碳烯酸、二十碳烯酸及鹅去氧胆酸的浓度;最后基于二元逻辑回归方程计算联合标志物变量。
7.根据权利要求6所述试剂盒,其特征在于:其中分离装置包括SeQuant ZIC-HILIC色谱柱和超高效液相色谱串联质谱仪。
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