CN113049696B - 一种诊断受试者是否患阿尔茨海默病的代谢产物及其用途 - Google Patents

Abstract

本申请公开了一种诊断受试者是否患阿尔茨海默病的代谢产物，以及用于确定生物样品中生物标志物水平的试剂在制备试剂盒中的用途。本申请的试剂盒能够替代传统的脑脊液检测，通过11种代谢产物实现对AD的诊断，并且，不仅能够区分AD患者与正常人员，还能够区分AD患者与其他痴呆患者。

Description

一种诊断受试者是否患阿尔茨海默病的代谢产物及其用途

技术领域

本申请涉及医药领域、病毒学领域和免疫学领域，特别是免疫学诊断领域。本申请具体涉及一种诊断受试者是否患阿尔茨海默病的试剂盒，以及用于确定生物样品中生物标志物水平的试剂在制备试剂盒中的用途。

背景技术

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是最常见的引起痴呆的神经系统退行性疾病。随着人口老龄化加重，AD带来了严重的社会和经济负担。目前脑脊液和神经影像学中的生物标记物是常规临床诊疗中最有效的AD生物标记物。然而，多为侵入性的且成本昂贵，难以在临床实践中普遍应用。此外，AD与其他类型的痴呆，如血管性痴呆(vasculardementia,VaD)，帕金森病性痴呆(Parkinson’s disease dementia,PDD)，行为变异性额颞叶痴呆(behavioral variant frontotemporal dementia,bvFTD)和路易体痴呆(dementiawith Lewy body,DLB)等可有相似的临床表现、病理和生物标志物，往往导致临床诊断困难。因此，发现外周生物标志物来区分AD与其他类型的痴呆是非常必要的。

代谢产物是参与生物化学途径的小分子，包括脂类、氨基酸、多肽、核酸和有机酸。这些代谢物是细胞、组织或整个有机体复杂生物过程中的产物，因此是可能反映疾病表型的潜在物质。代谢组学是对于代谢产物集体量化的一种分析方法，是发现新的生物标志物的有力工具，并且有助于我们理解AD的机制途径。

基于上述问题，急需一种能够有效诊断AD的方法。

发明内容

本申请发明人通过三个阶段的研究，分析了AD患者与正常人员以及其他痴呆患者的代谢产物的差异并使用差异代谢产物组来建立AD诊断模型，这个模型的鉴别能力已经在多个独立人群中得到验证。因此，本申请的代谢产物有助于AD的诊断，并且，可以区分AD患者和其他类型痴呆。

因此，在第一方面，本申请提供了一种用于诊断受试者是否患阿尔茨海默病的风险的方法，其包括：

(1)从受试者获得包含生物标志物的生物样品；

(2)测定生物样品中生物标志物的水平；

(3)基于所述生物标志物的水平，诊断受试者是否患阿尔茨海默病；

其中，所述生物标志物为己酰肉碱AcCa(6：0)，4-癸烯肉碱AcCa(10：1)，十四碳烯肉碱AcCa(14：2)，胡椒碱，癸酰肉碱AcCa(10：0)，L-乙酰肉碱，5-羟色胺，甘油磷酸胆碱，天冬氨酸，羟基棕榈酸和胆碱。

在某些实施方案中，所述生物样品选自全血，血清，血浆或脑脊液。在某些实施方案中，所述生物样品选自全血，血清和血浆。

在某些实施方案中，在步骤(2)，通过光谱、液相或气相色谱、质谱、与质谱联用的液相或气相色谱来测定所述生物样品中生物标志物的水平。

在某些实施方案中，极性代谢产物通过色谱柱(例如，Acquity HSS C18柱)进行分析。在某些优选的实施方案中，二元流动相为0.1％甲酸-水和0.1％甲酸-乙腈。

在某些实施方案中，第二馏分通过色谱柱(例如，Acquity BEC Amide色谱柱)进行分析。在某些优选的实施方案中，通过水和含5毫米碳酸氢铵的乙腈/甲醇混合物洗脱。

在某些实施方案中，脂质组通过色谱柱(例如，Accucore C30核壳色谱柱)进行分析。在某些优选的实施方案中，二元流动相为60％乙腈在水中和10％乙腈在异丙醇中。

在某些实施方案中，在步骤(3)中，通过将所述生物标志物的水平与参考值进行比较，从而诊断受试者是否患阿尔茨海默病。在此类实施方案中，优选地，所述参考值是所述生物标志物在获自正常人群的生物样品中的水平或范围。在某些实施方案中，通过色谱和/或质谱法的测定、荧光测定、电泳、免疫亲和、杂交、免疫化学、紫外光谱(UV)、荧光分析、放射化学分析、近红外光谱(近IR)、核磁共振光谱(NMR)、光散射分析(LS)和比浊法来测定所述生物样品中生物标志物的水平。

在某些实施方案中，相对于参考值，甘油磷酸胆碱，天冬氨酸，羟基棕榈酸和胆碱的水平的升高表明，受试者患有AD。在某些实施方案中，相对于参考值，己酰肉碱AcCa(6：0)，4-癸烯肉碱AcCa(10：1)，十四碳烯肉碱AcCa(14：2)，胡椒碱，癸酰肉碱AcCa(10：0)，L-乙酰肉碱，5-羟色胺的水平的降低表明，受试者患有AD。

在某些实施方案中，在步骤(3)中，使用弹性网络回归对所述4种生物标志物的水平进行岭回归，从而获得预测模型；然后，使用所述预测模型诊断受试者是否患有AD。

在某些实施方案中，所述受试者为哺乳动物，例如人。

在某些实施方案中，所述己酰肉碱AcCa(6：0)的CAS号为22671-29-0。在某些实施方案中，所述4-癸烯肉碱AcCa(10：1)的CAS号为98930-66-6。在某些实施方案中，所述十四碳烯肉碱AcCa(14：2)的CAS号为25597-07-3。在某些实施方案中，所述胡椒碱的CAS号为202-348-0。在某些实施方案中，所述癸酰肉碱AcCa(10：0)的CAS号为1492-27-9。在某些实施方案中，所述L-乙酰肉碱的CAS号为3040-38-8。在某些实施方案中，所述5-羟色胺的CAS号为50-67-9。在某些实施方案中，所述甘油磷酸胆碱的CAS号为28319-77-9。在某些实施方案中，所述天冬氨酸的CAS号为56-84-8。在某些实施方案中，所述胆碱的CAS号为123-41-1。在本申请中，所述羟基棕榈酸因羟基取代位置的不同，有多达13种同分异构体。本申请使用的质谱技术方法只能将其鉴定为羟基棕榈酸(Hydroxyhexadecanoic acid)，而不能明确其具体取代位置，但无论哪种同分异构体，都不影响其生物功能。即，均能够与其余代谢产物共同作为AD的生物标志物。因此，在本申请中，羟基棕榈酸包括但不限于其的13种同分异构体。

在某些实施方案中，所述方法能够诊断受试者是否患阿尔茨海默病。

在第二方面，提供了一种用于确定生物样品中生物标志物水平的试剂在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于诊断受试者是否患阿尔茨海默病的风险；其中，所述生物标志物为己酰肉碱AcCa(6：0)，4-癸烯肉碱AcCa(10：1)，十四碳烯肉碱AcCa(14：2)，胡椒碱，癸酰肉碱AcCa(10：0)，L-乙酰肉碱，5-羟色胺，甘油磷酸胆碱，天冬氨酸，羟基棕榈酸和胆碱。

在某些实施方案中，其中，所述试剂(例如第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十和/或第十一试剂或试剂组合)通过以下方法测定所述生物样品中生物标志物的水平：色谱和/或质谱法的测定、荧光测定、电泳、免疫亲和、杂交、免疫化学、紫外光谱(UV)、荧光分析、放射化学分析、近红外光谱(近IR)、核磁共振光谱(NMR)、光散射分析(LS)和比浊法。

在某些实施方案中，所述试剂通过光谱、液相或气相色谱、质谱、与质谱联用的液相或气相色谱来测定所述生物样品中生物标志物的水平。

在某些实施方案中，所述试剂盒还包括用于光谱的试剂和/或耗材，用于色谱的试剂和/或耗材，用于质谱的试剂和/或耗材，或其任何组合。

在某些实施方案中，所述用于色谱的试剂和/或耗材选自色谱柱，乙腈水溶液(例如，10％乙腈水溶液，50％乙腈水溶液，60％乙腈水溶液)，乙酸铵，甲酸铵，甲酸，或其任何组合。

在某些实施方案中，所述用于质谱的试剂和/或耗材选自质谱柱，甲酸，乙腈，或其任何组合。

在某些实施方案中，所述生物样品为获自受试者的全血，血清，血浆或脑脊液。在某些实施方案中，所述生物样品选自全血，血清和血浆。

在某些实施方案中，所述生物样品包含外泌体。

在某些实施方案中，所述试剂盒还包含，对生物样品进行预处理的预处理试剂或试剂组合。

在某些实施方案中，所述预处理试剂或试剂组合用于对所述生物样品(例如全血，血清或血浆)进行预处理，以获得外泌体。

在某些实施方案中，所述预处理试剂或试剂包含外泌体沉淀溶液，以及任选的缓冲液。

在某些实施方案中，其中，所述受试者为哺乳动物，例如人。

在某些实施方案中，所述试剂盒用于区分患阿尔茨海默病的受试者和正常受试者。在某些实施方案中，所述试剂盒用于区分患阿尔茨海默病的受试者和患其他痴呆的受试者。

在某些实施方案中，其中，所述其他痴呆包括血管性痴呆(VaD)、帕金森病性痴呆(PDD)、行为变异性额颞叶痴呆(bvFTD)和路易体痴呆(DLB)。

在某些实施方案中，所述己酰肉碱AcCa(6：0)的CAS号为22671-29-0。在某些实施方案中，所述4-癸烯肉碱AcCa(10：1)的CAS号为98930-66-6。在某些实施方案中，所述十四碳烯肉碱AcCa(14：2)的CAS号为25597-07-3。在某些实施方案中，所述胡椒碱的CAS号为202-348-0。在某些实施方案中，所述癸酰肉碱AcCa(10：0)的CAS号为1492-27-9。在某些实施方案中，所述L-乙酰肉碱的CAS号为3040-38-8。在某些实施方案中，所述5-羟色胺的CAS号为50-67-9。在某些实施方案中，所述甘油磷酸胆碱的CAS号为28319-77-9。在某些实施方案中，所述天冬氨酸的CAS号为56-84-8。在某些实施方案中，所述胆碱的CAS号为123-41-1。在本申请中，所述羟基棕榈酸因羟基取代位置的不同，有多达13种同分异构体。本申请使用的质谱技术方法只能将其鉴定为羟基棕榈酸(Hydroxyhexadecanoic acid)，而不能明确其具体取代位置，但无论哪种同分异构体，都不影响其生物功能。即，均能够与其余代谢产物共同作为AD的生物标志物。因此，在本申请中，羟基棕榈酸包括但不限于其的13种同分异构体。

在本申请的第三方面，一种用于诊断受试者是否患阿尔茨海默病的试剂盒，所述试剂盒包含用于确定生物样品中生物标志物水平的试剂，所述生物标志物为己酰肉碱AcCa(6：0)，4-癸烯肉碱AcCa(10：1)，十四碳烯肉碱AcCa(14：2)，胡椒碱，癸酰肉碱AcCa(10：0)，L-乙酰肉碱，5-羟色胺，甘油磷酸胆碱，天冬氨酸，羟基棕榈酸和胆碱。

在某些实施方案中，其中，所述试剂(例如第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十和/或第十一试剂或试剂组合)通过以下方法测定所述生物样品中生物标志物的水平：色谱和/或质谱法的测定、荧光测定、电泳、免疫亲和、杂交、免疫化学、紫外光谱(UV)、荧光分析、放射化学分析、近红外光谱(近IR)、核磁共振光谱(NMR)、光散射分析(LS)和比浊法。

在某些实施方案中，所述试剂通过光谱、液相或气相色谱、质谱、与质谱联用的液相或气相色谱来测定所述生物样品中生物标志物的水平。在某些实施方案中，所述试剂盒还包括用于光谱的试剂和/或耗材，用于色谱的试剂和/或耗材，用于质谱的试剂和/或耗材，或其任何组合。

在某些实施方案中，所述用于色谱的试剂和/或耗材选自色谱柱，乙腈水溶液(例如，10％乙腈水溶液，50％乙腈水溶液，60％乙腈水溶液)，乙酸铵，甲酸铵，甲酸，或其任何组合。

在某些实施方案中，所述用于质谱的试剂和/或耗材选自质谱柱，甲酸，乙腈，或其任何组合。

在某些实施方案中，所述生物样品为获自受试者的全血，血清，血浆或脑脊液。在某些实施方案中，所述生物样品选自全血，血清和血浆。

在某些实施方案中，所述生物样品包含外泌体。在某些实施方案中，所述试剂盒还包含，对生物样品进行预处理的预处理试剂或试剂组合。在某些实施方案中，所述预处理试剂或试剂组合用于对所述生物样品(例如全血，血清或血浆)进行预处理，以获得外泌体。在某些实施方案中，所述预处理试剂或试剂包含外泌体沉淀溶液，以及任选的缓冲液。

在某些实施方案中，其中，所述受试者为哺乳动物，例如人。

在某些实施方案中，所述试剂盒用于区分患阿尔茨海默病的受试者和正常受试者。在某些实施方案中，所述试剂盒用于区分患阿尔茨海默病的受试者和患其他痴呆的受试者。

在某些实施方案中，所述试剂盒通过上文所述的方法诊断受试者是否患阿尔茨海默病。

在某些实施方案中，其中，所述其他痴呆包括血管性痴呆(VaD)、帕金森病性痴呆(PDD)、行为变异性额颞叶痴呆(bvFTD)和路易体痴呆(DLB)。

在某些实施方案中，所述己酰肉碱AcCa(6：0)的CAS号为22671-29-0。在某些实施方案中，所述4-癸烯肉碱AcCa(10：1)的CAS号为98930-66-6。在某些实施方案中，所述十四碳烯肉碱AcCa(14：2)的CAS号为25597-07-3。在某些实施方案中，所述胡椒碱的CAS号为202-348-0。在某些实施方案中，所述癸酰肉碱AcCa(10：0)的CAS号为1492-27-9。在某些实施方案中，所述L-乙酰肉碱的CAS号为3040-38-8。在某些实施方案中，所述5-羟色胺的CAS号为50-67-9。在某些实施方案中，所述甘油磷酸胆碱的CAS号为28319-77-9。在某些实施方案中，所述天冬氨酸的CAS号为56-84-8。在某些实施方案中，所述胆碱的CAS号为123-41-1。在本申请中，所述羟基棕榈酸因羟基取代位置的不同，有多达13种同分异构体。本申请使用的质谱技术方法只能将其鉴定为羟基棕榈酸(Hydroxyhexadecanoic acid)，而不能明确其具体取代位置，但无论哪种同分异构体，都不影响其生物功能。即，均能够与其余代谢产物共同作为AD的生物标志物。因此，在本申请中，羟基棕榈酸包括但不限于其的13种同分异构体。

术语解释

如本文中所使用的，术语“神经退行性疾病”是一类进行性发展的疾病，以特异性神经元的大量丢失为主要特征。主要包括帕金森病(PD)，阿尔茨海默病(AD)，轻度认知功能障碍(MCI)和肌肉萎缩侧缩硬化症(ALS)等。

如本文中所使用的，术语“阿尔茨海默病(AD)”是老年人常见的神经退行性疾病，以认知功能障碍为主要临床特征。对于AD的诊断可采用磁共振成像(MRI)、正电子发射断层显像(PET)和生物标志物诊断等方法。

如本文中所使用的，术语“外泌体(exosome)”是指直径大约为30-150nm的微小膜泡，由多种细胞分泌，含有特定的蛋白质(例如，外泌体膜上富含参与外泌体运输的跨膜蛋白家族CD63,CD81和CD9)、脂质、细胞因子或遗传物质。多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体，它们广泛存在于血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁等体液中，被视为特异性分泌的膜泡，参与细胞间通讯。

如本文中所使用的，术语“生物标志物(Biomarker)”是指可以标记系统、器官、组织、细胞及亚细胞结构或功能的改变或可能患的改变的生化指标，具有非常广泛的用途。生物标志物可用于疾病诊断、判断疾病分期或者用来评价新药或新疗法在目标人群中的安全性及有效性。

如本文中所使用的，术语“参考值”是指生物标志物的预定值，其是根据对照样品(例如获自正常人群的生物样品)的生物标志物的水平得出的。参考值可以用作阈值，以区分可能存在疾病风险的受试者和不存在该疾病风险的受试者。参考值可以是相对值，有上限和下限的数值范围，平均值，中间值等。本领域技术人员根据现有技术中公开的方法可以选择合适的对照样品、测定并获得参考值。上述方法可以参见，例如，Burtis C.A.et al.,2008,Chapter 14,section“statistical treatment of reference values，其以全部引用方式并入本文。

如本文中所使用的，术语“受试者”包括但不限于各种动物，特别是哺乳动物，例如人。

如本文中所使用的，术语“ApoEε4基因型”是指ApoE基因的一种变异形式，APOE基因有多种可能的变异形式，例如，ε2ε2、ε3ε3、ε4ε4、ε2ε3、ε2ε4和ε3ε4。一些研究表明，携带APOE基因ε4变异体的人群在晚年更容易发展为阿尔茨海默病。

如本文中所使用的，术语“代谢物”或“代谢产物”是指在人体化学或物理过程中产生的物质。其包括代谢过程的任何化学或生物化学产物，诸如通过生物分子的加工、裂解或消耗产生的任何化合物。这样的分子的实例包括但不限于：酸和相关化合物；单、二和三羧酸类(饱和、不饱和以及脂族和环状、芳基、烷芳基)；醛酸类、酮酸类；内酯形式；赤霉素；脱落酸；醇、多元醇、衍生物和相关化合物；乙醇、苄醇、甲醇；丙二醇、甘油、植醇；肌醇、糠醇、薄荷醇；醛、酮、醌、衍生物和相关化合物；乙醛、丁醛、苯甲醛、丙烯醛、糠醛、乙二醛；丙酮、丁酮；蒽醌；碳水化合物；单糖、二糖、三糖；生物碱、胺和其他碱；吡啶(包括烟酸、烟酰胺)；嘧啶(包括胞嘧啶、胸腺嘧啶)；嘌呤(包括鸟嘌呤、腺嘌呤、黄嘌呤/次黄嘌呤、激动素)；吡咯；喹啉(包括异喹啉)；吗啡喃、托烷、辛可宁类(cinchonans)、核苷酸、寡核苷酸、衍生物和相关化合物；鸟苷、胞嘧啶、腺苷、胸苷、肌苷；氨基酸、寡肽、衍生物和相关化合物；酯；酚类和相关化合物；杂环化合物和衍生物；吡咯、四吡咯；黄酮类；吲哚；脂质(包括脂肪酸和甘油三酯)、衍生物和相关化合物；类胡萝卜素、八氢番茄红素和固醇、类异戊二烯类，包括萜烯；和上述分子的修饰形式。在一些实施方案中，代谢物是内源性物质的代谢的产物。在一些实施方案中，代谢物是外源物质的代谢的产物。在一些实施方案中，代谢物是内源物质和外源物质的代谢的产物。

发明的有益效果

本申请的方法能够替代传统的脑脊液检测，通过11种代谢产物实现对AD的诊断，并且，不仅能够区分AD患者与正常人员，还能够区分AD患者与其他痴呆患者(例如，血管性痴呆(VaD)、帕金森病性痴呆(PDD)、行为变异性额颞叶痴呆(bvFTD)、路易体痴呆(DLB))。并且，本申请的方法仅取静脉血即可完成检测，相较传统的腰椎穿刺脑脊液检测，本申请方法具有以下有益技术效果：(1)具有几乎无创伤，低风险等优势；(2)具有成本低的优势，无需在医院或专业医疗机构完成，可在社区或简易的医疗机构完成，受检测人员无需住院；(3)可在大范围人群中筛查AD，使得大范围的老年人口筛查成为可能。

附图说明

图1显示了获得的部分代谢谱图。其中，图1A为在Acquity HSS C18色谱柱上分析的极性代谢物提取物的第一部分，图1B为在Acquity BEH C18色谱柱上分析的第二部分，图1C为通过极性相互作用色谱法在Acuity BEH Amide柱上分析的第三极性组分。

图2显示了获得的部分代谢谱图，具体为在Accucore C30核壳色谱柱上完成脂质组的色谱分离。

图3显示了代谢物差异分析的质量控制结果。其中，图3A显示了在无监督主成分分析(PCA)得分图中紧密分散的QC样品表明在分析批次中维持稳定的分析性能。红点：质控样品；蓝点：所有样本。图3B显示了分析批次中主要成分1的时间序列图。图3C显示了分析批次中第一个和最后一个QC样品的Spearman相关分析。图3D显示了QC样品中代谢物强度的RSD％分布。评估了插入的同位素内标物的质谱响应值。其中，内标物的相对标准偏差(RSD)％值的范围为4.09％至8.19％。图3E代谢物的质量评价结果。

图4显示了数据集1中的代谢组学结果。其中，图4A为AD和对照组中847种代谢产物的为火山图，图4B为代谢产物水平的检测结果。

图5显示了在AD组中下调和上调的代谢产物。

图6显示了在数据集1中，对7个上调和77个下调代谢产物进行分层聚类后的热图。

图7显示了差异代谢物的富集分析结果。其中，图7A为使用基于途径的代谢物组(HMDB SMPDB，小分子途径数据库)，其包含基于正常人代谢途径的99种代谢物组。图7B为使用基于正常人代谢途径的包含84种代谢物的途径相关代谢物组(KEGG)。

图8显示了差异代谢物的富集分析结果。其中，图8A为使用定量富集分析方法对所有代谢物进行基于位置的代谢物集富集分析，使用了基于位置的代谢物组库，该库包含基于器官，组织和亚细胞定位的73个代谢物组。图8B为使用过量表达方法的差异代谢物的途径分析结果。

图9显示了数据集2中代谢物的测定结果。其中，AD为阿尔茨海默氏病患者；FC为倍数变化。

图10显示了数据集2中阿尔茨海默病诊断组建立。图10A为结合11种代谢物进行受试者工作特征(ROC)曲线分析，图10B为每个代谢物的ROC分析结果。AUC为曲线下面积。

图11显示了数据集3中AD，VaD，PDD，bvFTD和DLB中miRNA的测量结果。具体测量了甘油磷酸胆碱(A)，天冬氨酸(B)，羟基棕榈酸(C)，胆碱(D)，己酰肉碱AcCa(6：0)(E)，4-癸烯肉碱AcCa(10：1)(F)，十四碳烯肉碱AcCa(14：2)(G)，胡椒碱(H)，癸酰肉碱AcCa(10：0)(I)，L-乙酰肉碱(J)，和5-羟色胺(K)的水平。其中，AD为阿尔茨海默病患者；VaD为血管性痴呆患者；PDD为帕金森病患者；bvFTD为行为变异性额颞叶痴呆患者；DLB为路易体痴呆患者；FC为倍数变化。

图12显示了数据集3的受试者的工作特征曲线分析结果。其中图12A为AD与对照组的ROC值，图12B为AD与非AD的ROC值，图12C为AD与其他类型痴呆的ROC值。AUC为曲线下面积。非阿尔茨海默病指的是对照组和其他类型痴呆症的结合。其他类型的痴呆表现为血管性痴呆、帕金森病性痴呆、行为变异性额颞叶性痴呆和路易体性痴呆。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：数据集与统计方法

1.1研究的数据集

本研究共纳入3个数据集。

数据集1从北京中心地区招募受试者(n＝55例，其中包括AD患者28例、健康对照组27例)，用来分析代谢产物的差异。

数据集2从山东、河南和广西各省的研究中心招募受试者(n＝185例，其中包括AD患者93例、健康对照组92例)，来验证差异性以及建立诊断模型。

数据集3的数据来源于北京中心地区招募受试者(n＝357例，健康对照组76例，AD患者76例，VaD患者50例，PDD患者52例，bvFTD患者52例，DLB患者51例)来验证这个模型。

AD的诊断标准依据2011年美国国家衰老研究院-阿尔茨海默协会(NationalInstitute on Aging-Alzheimer’s Association,NIA-AA)诊断标准。此外，根据脑脊液P-tau/Aβ42(临界值取0.14)的比值确定AD和正常对照，该值是根据我们之前发表的数据计算得出的，与其他研究报道一致(参见Jia L,Qiu Q,Zhang H,Chu L,Du Y,Zhang J,etal.Concordance between the assessment of Abeta42,T-tau,and P-T181-tau inperipheral blood neuronal-derived exosomes and cerebrospinal fluid.AlzheimersDement.2019；15:1071-80)。根据ATN框架，低水平的脑脊液Aβ42是AD关键的病理改变。因此我们使用了已经报道的脑脊液Aβ42临界值500pg/ml作为另一个确定AD和正常对照的标准(参见Jia L,Qiu Q,Zhang H,Chu L,Du Y,Zhang J,et al.Concordance between theassessment of Abeta42,T-tau,and P-T181-tau in peripheral blood neuronal-derived exosomes and cerebrospinal fluid.Alzheimers Dement.2019；15:1071-80)。VaD、PDD、bvFTD和DLB诊断基于既往推出的标准(具体参见，[1]Roman GC,Tatemichi TK,Erkinjuntti T,Cummings JL,Masdeu JC,Garcia JH et al.Vascular dementia:diagnostic criteria for research studies.Report of the NINDS-AIRENInternational Workshop.Neurology.1993；43:250-60.[2]Goetz CG,Emre M,DuboisB.Parkinson's disease dementia:definitions,guidelines,and researchperspectives in diagnosis.Ann Neurol.2008；64Suppl 2:S81-92.[3]Rascovsky K,Hodges JR,Knopman D,Mendez MF,Kramer JH,Neuhaus J,et al.Sensitivity ofrevised diagnostic criteria for the behavioural variant of frontotemporaldementia.Brain.2011；134:2456-77.[4]McKeith IG,Boeve BF,Dickson DW,Halliday G,Taylor JP,Weintraub D,et al.Diagnosis and management of dementia with Lewybodies:Fourth consensus report of the DLB Consortium.Neurology.2017；89:88-100.)。所有受试者或其法定监护人均已取得充分知情并签署书面同意书。本研究获得首都医科大学宣武医院机构审查委员会的批准。

1.2参与者特征

如下所示，表1-3列出了研究对象的特征。

表1.数据集1参与者的特征

表2.数据集2参与者的特征

表3.数据集3参与者的特征

注：年龄、发病前估计年份和MMSE的值以平均值(标准差)表示。缩写:MMSE，简易精神状态检查；PSEN，presenilin；SD，标准差；*P<0.05与对照组相比。

如上表所示，在所有三个数据集中，AD组和对照组在年龄和性别方面没有观察到显著差异，而携带ApoEε4人数比例、MMSE评分、脑脊液Aβ42、T-tau和P-tau均有显著差异(P＜0.05)。数据集3中显示VaD患者携带ApoEε4的百分比也有所增加(P＜0.05)。VaD、PDD、FTD、DLB组Aβ42、T-tau水平较对照组略有降低或升高(P<0.05)。

实施例2：代谢产物的提取与分析

2.1脑脊液收集和检测

依照国际指南收集脑脊液标本，简单地说，受试者在清晨空腹(禁食12小时)状态下取左侧卧位，选择L3-L5椎间隙作为穿刺部位。用防止损伤的20号穿刺针收集10ml脑脊液，于室温下2,000×g离心10min，依据已经推出的标准来检验Aβ42,T-tau和P-tau。

2.2血液样本的采集和准备

采集所有受试者的清晨空腹(禁食12小时)10ml血液样本。每个血清样本分为两部分，提取极性代谢物用于非靶向代谢组学分析和非极性脂质分子用于非靶向脂质组学分析。简单地说，以含有多种同位素标记化合物的400uL甲醇-乙腈溶液中作为提取标准，对100uL的极性代谢物提取液进行脱蛋白处理。将得到的上清液转移到聚丙烯96孔板上，在离心浓缩器(美国密苏里州堪萨斯市Labconco公司)中干燥。然后将提取物溶解在甲醇-水混合物中进行代谢组学分析。如下所述，将溶液分为三部分，分别用于不同的分析方法。对于非极性脂质提取，使用甲醇和甲基叔丁基醚进行液-液分配，从50μL等分试样的血清样品中提取血清脂质体30。将上层萃取液转移到聚丙烯管中，并在Centrivap浓缩器中真空干燥。然后将脂质组提取物重新溶解在含有乙腈和异丙醇的溶液中，以进行脂质组分析。

2.3代谢组学分析

使用meta-PhenotyperTM高分辨代谢组学对样本进行分析，其中采用了5种基于UPLC-HRMS的互补分析方法。非靶向代谢组学分析是在一个Ultimate TM 3000UHPLC系统上进行的，该系统与一个Q ExactiveTM四极轨道质谱仪(Thermo Scientific,San Jose,CA,USA)相结合。简单地说，极性代谢产物提取物的第一部分在Acquity HSS C18柱(WatersCorporation,Milford,MA,USA)上进行分析，0.1％甲酸-水和0.1％甲酸-乙腈为二元流动相，然后在电喷雾正模式下进行检测(图1A)。第二馏分采用Acquity BEH C18柱(Waters公司)进行分析，用水和含5毫米碳酸氢铵的乙腈/甲醇混合物洗脱，并在负电喷雾模式下检测(图1B)。通过极性相互作用色谱在Acuity BEH Amide色谱柱(Waters公司)上进行测量，并在负电喷雾电离模式下进行检测(图1C)，其中二元流动相由10％的乙腈水溶液和50％的乙腈水溶液组成。使用含10mM乙酸铵作为缓冲盐的溶液。在同一分析仪器上进行非靶向脂质组学分析，该仪器在正/负极性切换模式下进行脂质分子检测。脂质组的色谱分离是在Accucore C30核壳色谱柱(Thermo Scientific)上完成的。使用由60％乙腈在水中和10％乙腈在异丙醇中组成的二元流动相，其中含有10mM甲酸铵和0.1％甲酸，洗脱脂质分子(图2A，B)。

在所有采用的分析方法中，使用XCalibur软件(Thermo Scientific)获取了70,000个全宽全扫描数据相关的MS/MS光谱数据以下的全扫描质谱数据。

2.5代谢组学数据分析

对于极性代谢物，使用Compound Discoverer 2.1软件(Thermo Scientific)分析了代谢峰提取。通过搜索人类代谢组数据库(HMDB)进行了进一步的结构注释。使用真实的标准和在线mzCloud库(www.mzcloud.org)创建了专有的MS/MS频谱库。代谢物的结构注释中包括多种化学细节，例如前体的确切质量，同位素模式拟合得分，MS/MS谱图相似性和保留时间。LipidSearch软件(Thermo Scientific)执行了包括峰提取和脂质鉴定在内的非靶向脂质组学数据处理，在此过程中，通过计算机在计算机上搜索获得的MS/MS光谱，以预测各种内源脂质类别的光谱。提议的识别结果将进一步单独进行人工检查，以消除误报。使用TraceFinder软件(Thermo Scientific)提取曲线下的峰面积作为带注释的代谢物和脂质的相对定量信息。最后，在进行统计分析之前，对所有测量的结果数据矩阵进行归一化，合并和修剪。使用SIMCA-P软件(德国Sartorius Umetrics)进行了多元分析，包括主成分分析和正交偏最小二乘判别分析。其他单因素分析包括独立样本t检验、p多重检验控制方法(FDR)调整、代谢富集分析和通路分析需要在MetaboAnalyst网站上进行。

2.6统计分析

统计分析使用IBM SPSS Statistics for Windows,version 22.0(IBM公司，阿蒙克，纽约，美国)和GraphPad Prism 8(GraphPad Software，圣地亚哥，加州，美国)。每个数据集的数据被独立分析。用χ2检验分析分类资料(如性别、临床亚组、APOEε4载体分布)的组间差异。使用Welch st检验分析数字数据的组间差异，如生物标志物水平。在数据集2和数据集3中，采用以年龄、性别、受教育年限或APOEε4状态为协变量的二元logistic回归模型计算预测值，随后用于ROC曲线分析。通过分析公差、用变易膨胀因子(VIFs)、特征值和条件指数来估计各代谢物之间的多重共线性。所有检验均为双尾检验，显著性差异水平设置为P<0.05。

2.7代谢产物的差异分析

在数据集1中进行代谢物的差异分析。质量控制实验表明，本项目获得的代谢物数据质量优良，满足进一步统计分析的要求(图3)。

结果显示，AD患者和对照组的血液中有847种代谢物，可分为23类(图4A)。t检验显示，AD组中77种代谢物水平降低(图6和图4B)。

下调的前10位代谢产物分别为己酰肉碱AcCa(6：0)，4-癸烯肉碱AcCa(10：1)，丙酰基肉碱AcCa(3：0)，十四碳烯肉碱AcCa(14：2)，胡椒碱，癸酰基肉碱AcCa(10：0)，辛酰基肉碱AcCa(8：0)，对黄嘌呤，L-乙酰肉碱，5-羟色胺；上调的前7位谢产物分别为甘油磷酸胆碱，天冬氨酸，X236，LysoPI(18：0/0：0)，LysoPI(0：0/18：0)，羟基棕榈酸和胆碱。将在数据集2中进行进一步分析以建立AD诊断数据集。有变化的代谢物的化学类别包括21类，例如酰基肉碱，溶血磷脂(LPC)，甘油三酸酯，氨基酸，溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)，脂肪酸，神经酰胺，磷脂酰乙醇胺(PE)，胆碱，溶血磷脂酰肌醇(LPI)，维生素，胆固醇酯，溶血磷脂酰丝氨酸(LPS)，肽，磷脂酰甘油(PG)，磷脂酰肌醇(PI)，多胺，磷脂酰丝氨酸(PS)和鞘氨醇(图4B)。

利用基因集富集分析(GSEA)方法，通过不同数据库中的定量富集分析进行代谢物组富集分析。代谢途径分析也使用过度代表法进行。我们的数据表明，差异代谢物富含磷脂的生物合成，叶酸代谢，脂肪酸降解以及牛磺酸和低牛磺酸代谢(图7A，B)。基于位置的代谢物组富集分析显示，差异代谢物富集于大脑，神经元和神经细胞中(图8A)。通路分析表明，不同的代谢物在烟酸，烟酰胺，甘油磷脂，丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代谢的途径中富集(图8B)。

实施例3：代谢物的诊断模型

一个相对较大的样本(数据集2)被收集用于进一步确认差异代谢物。数据集1中下调的前10个和上调的7个代谢产物在数据集2中都得到了证实，这支持了差异代谢产物的意义。通过Logistic分析来评估他们区分AD患者和对照组的能力。将前10个下调的代谢产物和7个上调的代谢产物作为协变量，诊断(AD或对照)作为因变量。在调整了年龄，性别，受教育年限和APOEε4的状态后，一组11种代谢产物(下调：己酰肉碱AcCa(6：0)，4-癸烯肉碱AcCa(10：1)，十四碳烯肉碱AcCa(14：2)，胡椒碱，癸酰肉碱AcCa(10：0)，L-乙酰肉碱和5-羟色胺；上调：甘油磷酸胆碱，天冬氨酸，羟基棕榈酸和胆碱)与AD相关(图9A-K)。

Logistic模型显示年龄，性别，受教育年限和APOEε4状况P值>0.05，因此被排除在进一步分析之外。我们通过分析来评估AD患者和对照组中11种代谢物之间的多重共线性。所有公差均>0.1，VIFs<10，特征值>0，且条件指数<30，表明11种代谢物之间没有明显的多重共线性。使用逻辑分析的预测值，使用受试者工作特征(ROC)曲线分析评估了11种代谢物的诊断能力。我们的数据显示曲线下面积(AUC)值显着较高(AUC＝0.97，P<0.001，图10A)，表明代谢物组可以成功区分AD和对照组。还评估了单个miRNA的诊断能力，结果显示auc较差(0.63至0.73，图10B)，表明需要将这11种代谢产物结合起来才能获得有效的诊断。

实施例4：代谢物的预测模型

我们使用了第三个数据集来评估该模型在临床实践中的诊断能力，受试者包括对照，AD和其他类型的痴呆症，例如VaD，PDD，bvFTD和DLB，获得了与数据集1和2相似的结果。在AD患者中己酰肉碱AcCa(6：0)，4-癸烯肉碱AcCa(10：1)，十四碳烯肉碱AcCa(14：2)，胡椒碱，癸酰肉碱AcCa(10：0)，L-乙酰肉碱和5-羟色胺的水平降低；而甘油磷酸胆碱，天冬氨酸，羟基棕榈酸和胆碱水平升高(P<0.001；图11A-K)。在诊断为VaD、PDD、bvFTD和DLB的患者中，11种代谢物中的大多数没有改变(均P＞0.05；除PDD中的甘油磷酸胆碱(图11A)、DLB中的天冬氨酸(图11B)、VaD中的胆碱(图11D)和bvFTD中的5-羟色胺(图11K)外。

进一步的ROC分析显示AUC非常高(0.96至0.97，P<0.001，图12)，表明该诊断组对区分AD与对照(图12A)，非AD(对照和其他痴呆症的组合)(图12B)和其他类型的痴呆(图12C)非常有效。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公开的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (36)

1.用于确定生物样品中生物标志物水平的试剂在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于诊断受试者是否患阿尔茨海默病的风险；其中，所述生物标志物为己酰肉碱AcCa(6：0)，4-癸烯肉碱AcCa(10：1)，十四碳烯肉碱AcCa(14：2)，胡椒碱，癸酰肉碱AcCa(10：0)，L-乙酰肉碱，5-羟色胺，甘油磷酸胆碱，天冬氨酸，羟基棕榈酸和胆碱。

2.权利要求1所述的用途，其中，所述试剂通过以下方法测定所述生物样品中生物标志物的水平：色谱和/或质谱法的测定、荧光测定、电泳、免疫亲和、杂交、免疫化学、紫外光谱(UV)、荧光分析、放射化学分析、近红外光谱(近IR)、核磁共振光谱(NMR)、光散射分析(LS)和比浊法。

3.权利要求1所述的用途，其中，所述试剂通过光谱、液相或气相色谱、质谱、与质谱联用的液相或气相色谱来测定所述生物样品中生物标志物的水平。

4.权利要求1所述的用途，其中，所述试剂盒还包括用于光谱的试剂和/或耗材，用于色谱的试剂和/或耗材，用于质谱的试剂和/或耗材，或其任何组合。

5.权利要求4所述的用途，其中，所述用于色谱的试剂和/或耗材选自色谱柱，乙腈水溶液，乙酸铵，甲酸铵，甲酸，或其任何组合。

6.权利要求4所述的用途，其中，所述用于质谱的试剂和/或耗材选自质谱柱，甲酸，乙腈，或其任何组合。

7.权利要求5所述的用途，其中，所述乙腈水溶液为10％乙腈水溶液，50％乙腈水溶液或60％乙腈水溶液。

8.权利要求1所述的用途，其中，所述生物样品为获自受试者的全血，血清，血浆或脑脊液。

9.权利要求1所述的用途，其中，所述生物样品选自全血，血清和血浆。

10.权利要求1所述的用途，其中，所述生物样品包含外泌体。

11.权利要求1所述的用途，其中，所述试剂盒还包含，对生物样品进行预处理的预处理试剂或试剂组合。

12.权利要求11所述的用途，其中，所述预处理试剂或试剂组合用于对所述生物样品进行预处理，以获得外泌体。

13.权利要求11所述的用途，其中，所述预处理试剂或试剂组合包含外泌体沉淀溶液，以及任选的缓冲液。

14.权利要求1所述的用途，其中，所述受试者为哺乳动物。

15.权利要求1所述的用途，其中，所述受试者为人。

16.权利要求1所述的用途，其中，所述试剂盒用于区分患阿尔茨海默病的受试者和正常受试者。

17.权利要求1所述的用途，其中，所述试剂盒用于区分患阿尔茨海默病的受试者和患其他痴呆的受试者。

18.权利要求17所述的用途，其中，所述其他痴呆包括血管性痴呆(VaD)、帕金森病性痴呆(PDD)、行为变异性额颞叶痴呆(bvFTD)和路易体痴呆(DLB)。

19.一种用于诊断受试者是否患阿尔茨海默病的试剂盒，所述试剂盒包含用于确定生物样品中生物标志物水平的试剂，所述生物标志物为己酰肉碱AcCa(6：0)，4-癸烯肉碱AcCa(10：1)，十四碳烯肉碱AcCa(14：2)，胡椒碱，癸酰肉碱AcCa(10：0)，L-乙酰肉碱，5-羟色胺，甘油磷酸胆碱，天冬氨酸，羟基棕榈酸和胆碱。

20.权利要求19所述的试剂盒，其中，所述试剂通过以下方法测定所述生物样品中生物标志物的水平：色谱和/或质谱法的测定、荧光测定、电泳、免疫亲和、杂交、免疫化学、紫外光谱(UV)、荧光分析、放射化学分析、近红外光谱(近IR)、核磁共振光谱(NMR)、光散射分析(LS)和比浊法。

21.权利要求19所述的试剂盒，其中，所述试剂通过光谱、液相或气相色谱、质谱、与质谱联用的液相或气相色谱来测定所述生物样品中生物标志物的水平。

22.权利要求19所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括用于光谱的试剂和/或耗材，用于色谱的试剂和/或耗材，用于质谱的试剂和/或耗材，或其任何组合。

23.权利要求22所述的试剂盒，其中，所述用于色谱的试剂和/或耗材选自色谱柱，乙腈水溶液，乙酸铵，甲酸铵，甲酸，或其任何组合。

24.权利要求22所述的试剂盒，其中，所述用于质谱的试剂和/或耗材选自质谱柱，甲酸，乙腈，或其任何组合。

25.权利要求23所述的试剂盒，其中，所述乙腈水溶液为10％乙腈水溶液，50％乙腈水溶液或60％乙腈水溶液。

26.权利要求19所述的试剂盒，其中，所述生物样品为获自受试者的全血，血清，血浆或脑脊液。

27.权利要求19所述的试剂盒，其中，所述生物样品选自全血，血清和血浆。

28.权利要求19所述的试剂盒，其中，所述生物样品包含外泌体。

29.权利要求19所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包含，对生物样品进行预处理的预处理试剂或试剂组合。

30.权利要求29所述的试剂盒，其中，所述预处理试剂或试剂组合用于对所述生物样品进行预处理，以获得外泌体。

31.权利要求29所述的试剂盒，其中，所述预处理试剂或试剂包含外泌体沉淀溶液，以及任选的缓冲液。

32.权利要求19所述的试剂盒，其中，所述受试者为哺乳动物。

33.权利要求19所述的试剂盒，其中，所述受试者为人。

34.权利要求19所述的试剂盒，其中，所述试剂盒用于区分患阿尔茨海默病的受试者和正常受试者。

35.权利要求19所述的试剂盒，其中，所述试剂盒用于区分患阿尔茨海默病的受试者和患其他痴呆的受试者。

36.权利要求35所述的试剂盒，其中，所述其他痴呆包括血管性痴呆(VaD)、帕金森病性痴呆(PDD)、行为变异性额颞叶痴呆(bvFTD)和路易体痴呆(DLB)。

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