CN110333310B - 一组用于诊断受试者中的ad或确定受试者中发生ad的风险的生物标志物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一组用于诊断受试者中的AD或确定受试者中发生AD的风险的生物标志物，所述诊断标志物是胆酸、鹅脱氧胆酸、别胆酸、吲哚‑3‑乳酸及色氨酸。本发明还提供了上述诊断标志物在制备阿尔兹海默症的鉴别诊断试剂中的应用以及一种试剂盒。通过血浆样本收集→血浆样本预处理→超高效液相色谱质谱分析的方法，对AD患者、MCI患者、Ctrl和NDC人群的血浆指纹图谱分析，来检测上述五种诊断标志物的含量，从而应用于阿尔兹海默症的诊断、疗效评价相关产品的制备中。所述标志物能够对阿尔兹海默症早期进行测评，准确率高、检测速度快、成本低、创伤小、患者易于接受，为阿尔兹海默症提供了科学有效的治疗方案，有很好的应用前景。

Description

一组用于诊断受试者中的AD或确定受试者中发生AD的风险的 生物标志物及其应用

技术领域

本发明涉及生物标志物技术领域，具体地说，是一组用于诊断受试者中的AD或确定受试者中发生AD的风险的生物标志物及其应用。

背景技术

阿尔茨海默症(Alzheimer's disease，AD)是一种原发性的中枢神经系统退行性疾病，是最常见的痴呆类型。AD的主要临床症状是缓慢的认知功能减退，包括记忆、逻辑推理能力和语言功能的进行性丟失，最后发展为重度痴呆。AD的最大风险因素是年龄。随着我国人口老龄化的加剧，AD的发病率日益升高，但目前AD的发病机制尚不明确，并且缺乏有效的临床诊断标志物。此外，大量证据表明AD在确诊前，即病人在出现症状之前其大脑内已发生广泛的病理变化，开发可靠的AD早期诊断新方法有助于对AD患者进行早期干预，进而防止由于阿尔兹海默症的发展对脑产生的不可逆损伤。因此，发现灵敏度高、特异性好的生物标志物以辅助AD的临床诊断、早期诊断、监测疾病进展对于改善AD患者的临床症状、提高生活质量、减轻患者负担至关重要。

目前不少学者已致力于AD生物标志物的研究，主要包括临床症状评价、功能神经影像学、遗传和生化指标检测等领域。由于临床症状表现存在波动、不同患者间具有个体差异等原因，单纯依靠临床症状的诊断灵敏度和特异性较低。功能神经影像学技术，操作方便但购置设备费用昂贵、操作技术要求高、特异性有限，从而限制了其临床应用。此外，95％以上的AD患者都是散发的，家族性AD仅占1～5％，因此，基因仅能解释少数AD的发病原因。目前被广泛接受的AD生物标志物有脑脊液中β-淀粉样蛋白(amyloidproteinβ，Aβ)和磷酸化tau蛋白，但脑脊液的采集具有创伤性，限制了其在临床上的应用。因此，近年来AD生物标志物的研究逐渐转向低侵袭性、取材方便的外周血液，发现稳定可靠的血液临床标志物对AD的诊断、监控和治疗具有重要意义。

代谢组学是对生物体系中的小分子化合物进行定性定量研究，是疾病生物标志物发现和发病机理研究的有效手段。应用代谢组学技术能够对生物体内的小分子及其代谢产物同时准确定性和定量，对多条代谢通路同时监控，近年来在肿瘤、代谢性疾病、心血管疾病、精神及神经系统疾病等生物标志物的发现及发病机理研究中发挥重要作用。基于基因以及细胞生物学等研究手段，研究人员已经发现AD的发病机理与机体代谢的异常密切相关，但是目前尚未发现能用于AD诊断的有效代谢生物标志物。

鉴于此，本发明基于代谢组学方法研究了与AD相关的血浆代谢组，旨在发现潜在的生物标志物用于AD的诊断。关于本发明一组用于诊断受试者中的AD或确定受试者中发生AD的风险的生物标志物及其应用目前还未见有相关报道。

发明内容

本发明的第一个目的是针对现有技术的不足，提供一组用于诊断受试者中的阿尔兹海默症或确定受试者中发生阿尔兹海默症的风险的生物标志物。

本发明的第二个目的是针对现有技术的不足，提供如上所述标志物的用途。

本发明的第三个目的是针对现有技术的不足，提供一种诊断受试者中的阿尔兹海默症或确定受试者中发生阿尔兹海默症的风险的试剂。

本发明的第四个目的是针对现有技术的不足，提供如上所述试剂的用途。

本发明的第五个目的是针对现有技术的不足，提供一种诊断受试者中的阿尔兹海默症或确定受试者中发生阿尔兹海默症的风险的试剂盒。

为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：

一组用于诊断受试者中的阿尔兹海默症或确定受试者中发生阿尔兹海默症的风险的生物标志物，所述生物标志物包括胆酸、鹅脱氧胆酸、别胆酸、吲哚-3-乳酸及色氨酸。

作为本发明的一个优选实施方案，胆酸、鹅脱氧胆酸和别胆酸的水平或量均随疾病进展呈正相关，吲哚-3-乳酸和色氨酸的水平或量均随疾病进展呈负相关。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：

如上所述的生物标志物在制备诊断受试者中的阿尔兹海默症或确定受试者中发生阿尔兹海默症的风险的试剂中的应用。

为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：

一种诊断受试者中的阿尔兹海默症或确定受试者中发生阿尔兹海默症的风险的试剂，所述的试剂包含检测如上所述生物标志物的物质。

作为本发明的一个优选实施方案，所述的试剂包含如上所述生物标志物标准品及超高效液相色谱中作为流动相的试剂。

为实现上述第四个目的，本发明采取的技术方案是：

如上所述试剂在制备诊断受试者中的阿尔兹海默症或确定受试者中发生阿尔兹海默症的风险的试剂盒中的应用。

作为本发明的一个优选实施方案，所述试剂盒用来检测阿尔兹海默症的指标为：胆酸、鹅脱氧胆酸和别胆酸水平或量均显著上升，且吲哚-3-乳酸和色氨酸水平或量较正常受试者均显著降低。

为实现上述第五个目的，本发明采取的技术方案是：

一种诊断受试者中的阿尔兹海默症或确定受试者中发生阿尔兹海默症风险的试剂盒，所述试剂盒包括检测物质和说明书，其中检测物质包括检测胆酸的物质、检测鹅脱氧胆酸的物质、检测别胆酸的物质、检测吲哚-3-乳酸的物质及检测色氨酸的物质，所述说明书记载了诊断受试者的流程和指标；

所述试剂盒用于诊断受试者中的阿尔兹海默症或确定受试者中发生阿尔兹海默症的风险或用于确定受试者中严重阿尔兹海默症的存在。

作为本发明的一个优选实施方案，所述说明书记载如下所述使用方法，所述使用方法包括：

a)使用试剂盒测定来自受试者的生物样品中的阿尔兹海默症生物标志物的水平或量；和

b)基于所述生物标志物的水平或量，以高的特异性确定或诊断阿尔兹海默症的存在或发生阿尔兹海默症的风险，其中所述阿尔兹海默症生物标志物是胆酸、鹅脱氧胆酸、别胆酸、吲哚-3-乳酸及色氨酸，并且其中胆酸、鹅脱氧胆酸和别胆酸的增加，和吲哚-3-乳酸、色氨酸的降低指示阿尔兹海默症的存在或发生阿尔兹海默症的风险。

作为本发明的一个优选实施方案，将所述样品中的阿尔兹海默症生物标志物的水平或量与所述生物标志物的参比水平或量进行比较，其中所述参比水平是：

a)从未患有阿尔兹海默症的群体获得的平均水平；和/或

b)来自包括阿尔兹海默症患者的个体的组的平均或中值水平，并且其中分别在预定的相对或绝对界限水平或量之上或之下，所述生物标志物的水平或量指示阿尔兹海默症的存在或发生阿尔兹海默症的风险或者指示严重阿尔兹海默症的存在。

作为本发明的一个优选实施方案，所述生物样品选自血浆。

本发明优点在于：

1、提供了阿尔兹海默症测评标志物，能够对阿尔兹海默症测评，通过血浆样本收集→血浆样本预处理→超高效液相色谱质谱分析的方法，对AD患者、MCI患者、Ctrl和NDC人群的血浆指纹图谱分析，来检测诊断标志物的含量，从而应用于阿尔兹海默症的诊断、疗效评价相关产品的制备中。能够对阿尔兹海默症早期进行测评，准确率高、检测速度快、成本低、创伤小、患者易于接受，为阿尔兹海默症提供了科学有效的诊断方案。

2、可将检测胆酸、鹅脱氧胆酸、别胆酸、吲哚-3-乳酸及色氨酸的试剂组成试剂盒，该试剂盒将有效解决目前临床阿尔兹海默症测评的难题，有助于更早确立科学的治疗方案，缓解病人痛苦，有很好的应用前景。

附图说明

附图1是五种代谢物在各组人群中的相对浓度。

附图2是五种代谢物随疾病进展的相关性分析。

附图3是受试者工作曲线。其中，5-Meta：胆酸、鹅脱氧胆酸、别胆酸、吲哚-3-乳酸和色氨酸；2-Meta：胆酸和鹅脱氧胆酸。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

本研究基于代谢组学方法研究了与AD相关的血浆代谢组，旨在从代谢重编程角度研究AD的发病机制并发现潜在的生物标志物。通过收集AD患者、轻度认知障碍(MCI)、非AD神经系统疾病(NDC)患者和匹配的健康人群(Ctrl)的血浆样品。采用基于超高效液相色谱与质谱联用的非靶向代谢组学方法对其中的代谢组进行分析。利用多变量和单变量统计分析、途径富集分析来揭示与AD发病和过程有关的代谢变化，并结合相关性分析研究代谢特征之间及其与患者临床参数之间的相关性。

1资料

1.1 AD组患者入组标准

(1)参考美国精神疾病协会《精神疾病诊断与统计手册》第4修订版(DSM-IV-R)痴呆诊断标准和美国神经病学、语言障碍和卒中-老年痴呆和相关疾病学会工作组(NINCDS-ADRDA)的“很可能”AD的诊断标准。核心标准为：

①达到痴呆诊断标准；

②起病隐袭，症状随时间进展逐渐出现；

③有明确的认知损害病史；

④表现为遗忘综合征或非遗忘综合征。

(2)简易精神状况检查量表(Mini-mental State Examination,MMSE)得分≤23，蒙特利尔认知评估量表(MontrealCognitiveAssessment,MoCA)得分≤14。

(3)Hachinski缺血指数量表(Hachinski Ischemic Score,HIS)得分＜4，除外血管性认知障碍等及混合性痴呆。

1.2 MCI组患者入组标准

依据美国精神疾病协会《精神疾病诊断与统计手册》第4修订版(DSM-IV-R)和Peterson2005年修订的关于MCI的诊断标准：

①具有患者自诉或了解情况者证实的记忆下降；

②总体认知水平正常，不影响日常生活能力；

③经神经心理学系统检测后发现与其年龄不相符的记忆力减退；

④MMSE评分≥24分，未达到痴呆标准。

1.3 AD组和MCI组排除标准

(1)伴有与认知障碍相关的卒中史，或伴有严重的白质脱髓鞘改变；有其他类型痴呆或原发性进行性失语的核心症状；

(2)脑血管疾病、肿瘤、颅脑外伤、颅内感染、焦虑抑郁等神经或精神疾病病史；

(3)其他影响认知或情绪的疾病，如甲状腺功能异常、贫血等；

(4)特殊药物、毒物接触史，或中毒史等；

(5)未经处理的气胸或肋骨骨折，胸壁开放性创伤；

(6)空洞型肺结核，有咳血史；

(7)经规范药物治疗后血压超过160/100mmHg；

(8)严重肺炎、哮喘、肺心病、慢性阻塞性肺疾病等影响通气功能；

(9)在试验过程中不配合或不能有效完成本研究者。

1.4 Ctrl组入组标准

在性别、年龄、受教育程度等方面均与AD组匹配的大连医科大学附属第一医院体检中心健康查体人群。入组人群均符合健康人的诊断标准且排除以下情况：既往有神经系统疾病或精神疾病史，近期内(4周)有各种感染者，有严重不良生活习惯者。

1.5 NDC组入组标准

在性别、年龄、受教育程度等方面均与AD组和Ctrl组匹配的在大连医科大学附属第一医院神经内科就诊或住院的非AD患者。其中包括10例癫痫、10例偏头痛、9例周围神经病和2例特发性震颤等神经疾病患者。

各组受试者的临床信息见表1。

表1、受试者的临床信息

收集AD患者30例，轻度认知功能障碍(Mild Cognitive Impairment,MCI)患者13例，健康对照人群(Ctrl)43例，非AD神经系统疾病对照人群(NDC)31例，共117人参与本研究。

2方法

2.1血浆样本收集

血浆样品收集采集前，纳入研究的所有志愿者签署知情同意书。所有人均是在禁食8小时以上后，次日早晨采血，采集的血样静置30分钟，3000rpm/min离心5分钟后，取血浆，置于-80℃冰箱保存备用。

2.2分析方法

2.2.1血浆样本预处理

血浆在4℃下解冻，取60μL血浆样本，加入240μL包含内标的提取液(即，包含内标D3-乙酰基肉碱、D3-癸酰基肉碱、D3-十六酰基肉碱、D5-苯丙氨酸、D3-亮氨酸、D5-色氨酸、D4-鹅脱氧胆酸、D4-胆酸、D3-棕榈酸、D3-硬脂酸、十三酸的甲醇溶液，具体浓度参见表2)沉淀蛋白；震荡后，14000g，4℃，离心15分钟；取上清液冷冻干燥，保存于-80℃冰箱中。进样前，样品用60μL甲醇：水＝1：4(v/v)复溶；震荡后，14000g，4℃，离心15分钟；取上清5μL用于分析。

表2、提取液中的内标浓度

2.2.2超高效液相色谱质谱分析

(1)液相条件：色谱仪为Waters超高效液相色谱(UPLC，UK)。在正离子模式下，采用ACQUITY2.1×100mm，1.7μm，BEHC8色谱柱(Waters,Ireland)；流动相A为0.1％甲酸的水溶液，流动相B为0.1％甲酸的乙腈溶液；洗脱梯度：0～1min为5％B相，1min～24min线性变化到100％B相，保持4min，28min～28.1min线性变化为5％B相并平衡1.9min；流动相流速为0.35mL/min；柱温为50℃；进样量为5μL。在负离子模式下，采用ACQUITY2.1×100mm，1.8μm，HSST3色谱柱(Waters,Ireland)；流动相C为6.5mM碳酸氢铵水溶液，流动相D为6.5mM碳酸氢铵甲醇/水溶液(甲醇：水＝95：5，v/v)；洗脱梯度：0～1min为2％D相，1min～18min线性变化到100％D相，保持4min，22min～22.1min线性变化为2％D相并平衡2.9min；流动相流速为0.35mL/min；柱温为50℃；进样量为5μL。

(2)质谱条件：质谱仪为tripleTOFTM5600plus(AppliedBiosystems,FosterCity,CA)系统。参数设置如下，GS1，50psi；GS2，50psi；CUR，35psi；离子源温度，500℃；离子源电压为5500V(正离子模式下)，-4500V(负离子模式下)。

3血浆测试结果及辅助诊断方法

通过对AD患者、MCI患者、Ctrl和NDC人群的血浆指纹图谱分析，最终发现5种代谢物在AD与Ctrl，以及AD与NDC之间均具有显著差异。相比健康人群和神经系统疾病对照患者，AD和MCI患者表现出显著的胆酸(CA)，鹅脱氧胆酸(CDCA)和别胆酸(allocholic acid)的累积及吲哚-3-乳酸(indolelactic acid)及色氨酸(tryptophan)的降低，如图1所示。

基于Spearman相关性分析，我们发现CDCA和别胆酸随疾病进展呈现正相关，而吲哚乳酸和色氨酸随疾病进展呈现负相关(图2)，这表明，我们发现的潜在生物标志物具有指示疾病进展的潜力。

对这5种代谢物进行二元逻辑回归方程拟合，采用受试者工作曲线(ROC)评价拟合后的组合生物标志物区分AD与Ctrl及NDC的能力。结果表明，组合标志物在区分AD与Ctrl时，具有良好的判别效果，曲线下面积为0.819，灵敏度和特异性分别为83.7％和73.3％。并且，该组合标志物在区分AD与Ctrl和NDC时，同样具有良好的判别能力，曲线下面积为0.795，灵敏度和特异性分别为79.7％和73.3％(图3A～3B，表3)。因此，我们确定的基于五种代谢物的分类模型，对区分AD患者与健康和非AD神经疾病对照，具有良好的应用前景。

此外，我们发现胆汁酸CA和CDCA在MCI患者种升高的更为明显，并且联合采用CA和CDCA从健康人群及健康人群和神经系统疾病对照人群中区分MCI具有很好的判别效果，曲线下面积分别为84.8％和83.7％(图3C～3D，表3)。上述结果表明，胆汁酸水平的改变可能是早期AD患病的风险因素。

表3、组合标志物的诊断性能参数

4、结论

本研究发现多不饱和脂肪酸(PUFA)、酰基肉碱、色氨酸降解相关代谢物在AD患者中显著累积，而胆汁酸水平显著降低。随后通过在一个独立的队列中进行验证，我们进一步发现胆酸、鹅去氧胆酸、别胆酸、吲哚乳酸和色氨酸在AD中特异性变化，并且这些代谢物的水平与疾病进展、年龄和几个临床参数具有高度相关性。

通过对AD的代谢组分析，我们发现PUFAs代谢异常，线粒体β-氧化，胆汁酸合成和色氨酸代谢的改变是AD发生发展过程中的关键事件。通过在两个单独的队列中发现和确认，我们最终确定了基于五种代谢物的分类模型，对区分AD患者与健康和非AD神经疾病对照，具有良好的应用前景。此外，AD和MCI组中胆汁酸水平的改变可能是早期AD患病的风险因素。

本发明可将检测胆酸、鹅脱氧胆酸、别胆酸、吲哚-3-乳酸及色氨酸的试剂组成试剂盒，该试剂盒将有效解决目前临床阿尔兹海默症诊断的难题，有助于更早确立科学的治疗方案，缓解病人痛苦，有很好的应用前景。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.生物标志物组合在判别阿尔兹海默症/轻度认知功能障碍、非AD神经系统疾病和健康人群中的应用，其特征在于，所述生物标志物组合是由胆酸、鹅脱氧胆酸、别胆酸、吲哚-3-乳酸及色氨酸共同组成，其中，胆酸、鹅脱氧胆酸和别胆酸的水平或量均随疾病进展呈正相关，吲哚-3-乳酸和色氨酸的水平或量均随疾病进展呈负相关。

2.权利要求1所述的生物标志物组合在制备诊断受试者中的阿尔兹海默症或确定受试者中发生阿尔兹海默症的风险的试剂中的应用。

3.一种诊断受试者中的阿尔兹海默症或确定受试者中发生阿尔兹海默症的风险的试剂，其特征在于，所述的试剂包含检测权利要求1所述生物标志物组合的物质。

4.权利要求3所述试剂在制备诊断受试者中的阿尔兹海默症或确定受试者中发生阿尔兹海默症的风险的试剂盒中的应用。

5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述试剂盒用来检测阿尔兹海默症的指标为：胆酸、鹅脱氧胆酸和别胆酸的水平或量均显著上升，且吲哚-3-乳酸和色氨酸的水平或量均显著降低。

6.一种用于判别阿尔兹海默症/轻度认知功能障碍、非AD神经系统疾病、健康人群的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测物质和说明书，其中检测物质是检测胆酸的物质、检测鹅脱氧胆酸的物质、检测别胆酸的物质、检测吲哚-3-乳酸的物质及检测色氨酸的物质，所述说明书记载了诊断受试者的流程和指标；

所述试剂盒用于诊断受试者中的阿尔兹海默症或确定受试者中发生阿尔兹海默症的风险或用于确定受试者中严重阿尔兹海默症的存在。

7.根据权利要求6所述试剂盒，其特征在于，所述说明书记载如下所述使用方法，所述使用方法包括：

a)使用试剂盒测定来自受试者的生物样品中的阿尔兹海默症生物标志物的水平或量；和

b)基于所述生物标志物的水平或量，以高的特异性确定或诊断阿尔兹海默症的存在或发生阿尔兹海默症的风险，其中所述阿尔兹海默症生物标志物是胆酸、鹅脱氧胆酸、别胆酸、吲哚-3-乳酸及色氨酸，并且其中胆酸、鹅脱氧胆酸和别胆酸的增加，和吲哚-3-乳酸、色氨酸的降低指示阿尔兹海默症的存在或发生阿尔兹海默症的风险。

8.根据权利要求7所述试剂盒，其特征在于，将所述样品中的阿尔兹海默症生物标志物的水平或量与所述生物标志物的参比水平或量进行比较，其中所述参比水平是：

a)从未患有阿尔兹海默症的群体获得的平均水平；和/或

b)来自包括阿尔兹海默症患者的个体的组的平均或中值水平，并且其中分别在预定的相对或绝对界限水平或量之上或之下，所述生物标志物的水平或量指示阿尔兹海默症的存在或发生阿尔兹海默症的风险或者指示严重阿尔兹海默症的存在。

9.根据权利要求7所述试剂盒，其特征在于，所述生物样品选自血浆。

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