CN109709235A

CN109709235A - 阿尔茨海默病或轻度老年认知障碍的早期诊断、预测生物标志物组合、应用及其测定方法

Info

Publication number: CN109709235A
Application number: CN201910137465.4A
Authority: CN
Inventors: 马红华
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2019-02-25
Filing date: 2019-02-25
Publication date: 2019-05-03

Abstract

本发明公开了用于阿尔茨海默病或轻度老年认知障碍的早期诊断、预测生物标志物组合，应用及其测定方法，包括花生四烯酸，胸腺嘧啶，亚油酸，棕榈酸，棕榈油酸，肉豆蔻酸，岩芹酸，甘氨石胆酸，胆酸，去氧胆酸及其组合作为阿尔茨海默病或轻度老年认知障碍的早期发现、诊断和预测的生物标志物、应用及测定方法。本发明的技术方案采用阿尔茨海默病或轻度老年认知障碍患者的血清(或血浆)进行液相/气相色谱质谱联用分析方法。本发明技术方案的诊断标志物可制备成试剂盒，检测方法具有高灵敏度和高特异性的特点，对于轻度老年认知障碍诊断也具有较高的灵敏度和特异性。

Description

阿尔茨海默病或轻度老年认知障碍的早期诊断、预测生物标志物组合、应用及其测定方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及阿尔茨海默病或轻度老年认知障碍的早期诊断、诊断和预测的生物标志物组合、应用及其测定方法。

背景技术

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一种进行性神经退行性疾病，构成老年痴呆症的主要原因，约占老年性痴呆患者的60-70％。《2018年世界阿尔茨海默病报告》显示，全球约有4680万名AD患者，预计每20年患病人数将翻一倍，到2030年将达到7470万人。我国AD患者已超过千万，居世界首位。

阿尔茨海默病(AD)的病因尚不清楚，但一般认为主要的发病机制包括淀粉样蛋白前体蛋白代谢改变，tau蛋白过度磷酸化，神经炎症，线粒体功能障碍和氧化应激。由于AD的发病机制尚无定论，目前临床上缺乏有效治疗手段，患者人群巨大，已经成为社会负担最重的疾病之一。近年来，使用神经影像学，基因检测和体液神经化学的测试进行了多项研究，取得了相当大的进展，然而这些方法要么是侵入性的，要么耗时、昂贵。因此，用于MCI和AD的准确诊断，用于预测对象发生AD的风险，或用于鉴定具有发生AD的高风险的对象的的生物标志物仍然是非常紧急和重要。

轻度认知障碍(mild cognitive impairment，MCI)是正常认知与AD之间的中间状态。研究显示，轻度认知障碍(MCI)在65岁以上人群中患病率为10％至20％，向AD转化的累积概率为33％。因此，对于AD以及AD前期的MCI的早期诊断和及时干预，将把防治AD疾病的关口前移，可望有效延缓AD疾病的进展，降低家庭的负担，对于整个社会和医学发展都有意义。

代谢组学是一种新兴的组学技术，在生物学研究中发挥着越来越重要的作用，因为它能够揭示机体细胞代谢的独特化学指纹特征。代谢组学作为一种无偏的小分子代谢物研究方法，为发现更多的AD生物标志物提供了希望。越来越多的证据表明AD伴随着胆汁酸，脂肪酸和氨基酸的紊乱。并且这些结果证明代谢紊乱可能预示着认知障碍的发生，因此，找到一种易于检测的无创性生物标志物诊断方法，来预测和诊断阿尔茨海默病，有助于识别具有更高风险的个体。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种阿尔茨海默病或轻度老年认知障碍的早期发现、诊断和预测的生物标志物组合、应用及其测定方法。

为达到上述目的，本发明采用如下的技术方案：

本发明提供一组可用于早期发现、诊断或预测阿尔茨海默病或轻度老年认知障碍的生物标志物，进一步提供包含该等生物标志物的用于诊断或预测阿尔茨海默病或轻度老年认知障碍的试剂盒及其使用方法。

一方面提供了一种阿尔茨海默病或轻度老年认知障碍诊断和预测生物标志物组合，为血清或血浆代谢物，包括2-氨基己二酸(2-Aminoadipic acid)，2-丁烯二酸(2-Butenedioic acid)，4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸(4,7,10,13,16,19-Docosahexaenoic acid)，5-羟脯氨酸(5-Oxoproline)，6-氨基己酸(6-Aminocaproicacid)，肾上腺酸(Adrenic acid)，阿拉伯呋喃糖(Arabinofuranose)，花生四烯酸(Arachidonic acid)，丁二酸(Butanedioic acid)，顺式-5,8,11,14,17-二十碳五烯酸(cis-5,8,11,14,17-Eicosapentaenoic acid)，柠檬酸(Citric acid)，胱氨酸(Cystine)，胞苷(Cytidine)，二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid)，乙二酸(Elaidic acid)，果糖(Fructose)，葡萄糖酸(Gluconic acid)，谷氨酸(Glutamic acid)，谷氨酰胺(Glutamine)，甘油磷酸(Glycerolphosphate)，牛磺酸(Hypotaurine)，次黄嘌呤(Hypoxanthine)，异亮氨酸(Isoleucine)，亚油酸(Linoleic acid)，苹果酸(Malic acid)，甘露糖(Mannose)，N，N-二甲基甘氨酸(N,N-dimethylglycine)，十八烷酸(Octadecanoic acid)，油酸(Oleicacid)，棕榈酸(Palmitic acid)，棕榈油酸(Palmitoleic acid)，十五烷酸(Pentadecanoicacid)，脯氨酸(Proline)，山梨糖(Sorbose)，牛磺酸(Taurine)，十四烷酸(Tetradecanoicacid)，胸腺嘧啶(Thymine)，创伤性酸(Traumatic acid)，尿苷(Uridine)，木糖醇(Xylitol)，肉豆蔻酸(Myristic acid)，岩芹酸(Petroselinic acid)，甘氨石胆酸(GLCA)，去氧胆酸/胆酸(DCA/CA)，胆酸(CA)，牛磺去氧胆酸(TDCA)，牛磺石胆酸(TLCA)，甘氨去氧胆酸(GDCA)，去氧胆酸(DCA)，甘氨去氧胆酸/胆酸(GDCA:CA)，牛磺去氧胆酸/胆酸(TDCA:CA)，甘氨石胆酸/鹅去氧胆酸(GLCA:CDCA)中的一种或多种的组合。

优选的，所述生物标志物包括花生四烯酸(Arachidonic acid)，胞苷(Cytidine)，谷氨酸(Glutamic acid)，谷氨酰胺(Glutamine)，亚油酸(Linoleic acid)，N，N-二甲基甘氨酸(N,N-dimethylglycine)，棕榈酸(Palmitic acid)，棕榈油酸(Palmitoleic acid)，胸腺嘧啶(Thymine)，肉豆蔻酸(Myristic acid)，岩芹酸(Petroselinic acid)，甘氨石胆酸(GLCA)，去氧胆酸/胆酸(DCA/CA)，胆酸(CA)，甘氨去氧胆酸(GDCA)，去氧胆酸(DCA)，甘氨去氧胆酸/胆酸(GDCA:CA)，甘氨石胆酸/鹅去氧胆酸(GLCA:CDCA)中的一种或多种的组合。

更优选的，所述生物标志物包括花生四烯酸(Arachidonic acid)，胸腺嘧啶(Thymine)，亚油酸(Linoleic acid)，棕榈酸(Palmitic acid)，棕榈油酸(Palmitoleicacid)，肉豆蔻酸(Myristic acid)，岩芹酸(Petroselinic acid)，甘氨石胆酸(GLCA)，胆酸(CA)，去氧胆酸(DCA)中的一种或多种的组合。

另一方面，提供了阿尔茨海默病或轻度老年认知障碍诊断和预测的生物标志物组合的应用，用于诊断和预测阿尔茨海默病或轻度老年认知障碍的试剂盒。所述试剂盒包含花生四烯酸(Arachidonic acid)，胸腺嘧啶(Thymine)，亚油酸(Linoleic acid)，棕榈酸(Palmitic acid)，棕榈油酸(Palmitoleic acid)，肉豆蔻酸(Myristic acid)，岩芹酸(Petroselinic acid)，甘氨石胆酸(GLCA)，胆酸(CA)，去氧胆酸(DCA)的标准溶液和一种内标标准溶液，所述内标标准溶液指同位素标记的诊断标志物棕榈酸(Palmitic acid)，棕榈油酸(Palmitoleic acid)，肉豆蔻酸(Myristic acid)，岩芹酸(Petroselinic acid)，甘氨石胆酸(GLCA)，胆酸(CA)，去氧胆酸(DCA)，同位素标记方式可以是2H或13C。试剂盒还包含萃取液，萃取液由甲醇和乙腈组成，甲醇和乙腈的体积比为：1：1-5：1，以及进一步可包含700μL的96孔板、350μL的V型96孔板、封板硅胶、96孔密封铝膜。

优选的，诊断和预测生物标志物的诊断样品是血清或血浆。

另一方面，提供了阿尔茨海默病或轻度老年认知障碍诊断的生物标志物组合的测定方法，包括以下步骤：

步骤1，取阿尔茨海默病或轻度老年认知障碍病人临床血清或血浆样本和健康人对照血清或血浆样本；

步骤2，通过色谱质谱联用代谢组学分析方法分析鉴定阿尔茨海默病或轻度老年认知障碍病人临床血清或血浆样本和健康人对照血清或血浆样本的初步差异性代谢物；

步骤3，将步骤2中测定得到的生物标志物的浓度输入随机森林模型模型进行计算，按照分值对受试体进行判定。

优选的，所述步骤1中包括不同地区的阿尔茨海默病或轻度老年认知障碍病人临床血清或血浆样本和健康人对照血清或血浆样本。

优选的，所述步骤2中的色谱质谱联用代谢组学分析方法包括液相/气相色谱质谱联用代谢组学分析方法。

优选的，所述步骤2中气相色谱质谱联用测试的色谱条件包括：Rxi-5ms毛细管柱，载气：超纯氦气，流量：1.0mL/min，进样口温度：260℃，传输线温度：260℃，离子源温度：210℃，进样量：1μL，进样方式：不分流进样，升温程序：从80℃开始并持续3min，以10℃/min的升温速度升至220℃，之后以5℃/min的升温速度升至240℃，再以25℃/min的升温速度升至290℃，最后在290℃持续9min，质谱离子源：EI源，电子轰击能量：70eV，质谱扫描范围：m/z，40-600，全扫描方式。

优选的，所述步骤2中液相色谱质谱联用测试的色谱条件包括：Agilent ZORBAXEclipse XDB-C18柱(4.6×150mm,5μm)或者WatersUPLC BEH C18色谱柱(100mm×2.1mm,1.7μm)，柱温：30℃。流动相A：水(0.1％甲酸)，B：乙腈(0.1％甲酸，)，流动相洗脱梯度为0-25min：1-100％B，流速：0.4mL/min，进样量：5μL。飞行时间质谱优化条件为：(1)正离子模式(ES+)，毛细管电压3500V，喷雾器45psig，干燥气温度325℃，干燥器流速11L/min；(2)负离子模式(ES-)，毛细管电压3000V，其他参数与正离子模式一致。

优选的，所述步骤2中气相色谱质谱联用测试的血清或血浆样本前处理包括：取50μL血清或血浆，加入10ul氯苯丙氨酸(0.1mg/mL，水溶)和10μL十七酸(1mg/mL，醇溶)作为内标来监测样本的重现性；再加入175μL氯仿甲醇混合溶剂(1:3，v/v)，涡旋振荡30s；置离心管于-20℃放置10min以促进蛋白沉淀；然后13000rpm离心10min，取上清200μL于高回收进样瓶中，室温下真空干燥得到样本品。

优选的，所述步骤2中样本品经抽干后使用两步法进行衍生，首先加入50μL甲氧胺(15mg/mL，吡啶溶)，涡旋振荡30s，在30℃下反应90min，然后再加入50μL BSTFA(含1％TMCS)在70℃反应60min，静置后进行GC-TOFMS分析。

优选的，所述步骤2中液相色谱质谱联用测试的血清或血浆样本前处理包括：取50μl血清或血浆样本，加入200μL甲醇乙腈混合溶剂(1:9，v:v)，涡旋振荡2min；置离心管于-20℃放置10min以促进蛋白沉淀，12000rpm4℃离心15min。取上清20μL，室温下真空干燥。在干燥后的离心管中加入100μL甲醇水混合溶剂(1:1，v:v，含1μg/mL二氯苯丙氨酸作为内标)复溶后分析。

相对于现有技术，本发明的技术方首次提出花生四烯酸(Arachidonic acid)，胸腺嘧啶(Thymine)，亚油酸(Linoleic acid)，棕榈酸(Palmitic acid)，棕榈油酸(Palmitoleic acid)，肉豆蔻酸(Myristic acid)，岩芹酸(Petroselinic acid)，甘氨石胆酸(GLCA)，胆酸(CA)，去氧胆酸(DCA)作为阿尔茨海默病或轻度老年认知障碍诊断的生物标志物，对阿尔茨海默病或轻度老年认知障碍的诊断具有高灵敏度和高特异性，可用于阿尔茨海默病或轻度老年认知障碍的早期发现，为患者争取时间，使患者尽早、有效获得治疗，提高患者的临床疗效和生存质量。。同时通过运用液相色谱质谱联用仪(LC-TQMS)和气相色谱质谱联用仪(GC-TOFMS)对阿尔茨海默病或轻度老年认知障碍病人及健康人对照血清或血浆进行代谢物分析测试，结合生物信息学工具，寻找差异性代谢物，并通过验证确定其作为阿尔茨海默病或轻度老年认知障碍的诊断生物标志物，可以用于阿尔茨海默病或轻度老年认知障碍的早期发现和诊断，提高阿尔茨海默病或轻度老年认知障碍治疗效果。

附图说明

构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1显示的是本发明实施例的阿尔茨海默病病人、轻度老年认知障碍及正常对照血清样本用LC-TQMS和GC-TOFMS检测的代谢物的OPLS-DA图。(A)70％训练集数据的OPLS-DA图；(B)30％测试集数据的OPLS-DA图。

图2显示的是鉴定代谢物及其诊断、预测能力。(A)70％训练集数据的ROC曲线图(包含8个代谢物和一个代谢物比值(分别是：花生四烯酸(Arachidonic acid)，胸腺嘧啶(Thymine)，亚油酸(Linoleic acid)，棕榈酸(Palmitic acid)，棕榈油酸(Palmitoleicacid)，肉豆蔻酸(Myristic acid)，岩芹酸(Petroselinic acid)，甘氨石胆酸(GLCA)，去氧胆酸(DCA)/胆酸(CA))。(B)30％测试集数据的ROC曲线图(包含8个代谢物和一个代谢物比值(分别是：花生四烯酸(Arachidonic acid)，胸腺嘧啶(Thymine)，亚油酸(Linoleicacid)，棕榈酸(Palmitic acid)，棕榈油酸(Palmitoleic acid)，肉豆蔻酸(Myristicacid)，岩芹酸(Petroselinic acid)，甘氨石胆酸(GLCA)，去氧胆酸(DCA)/胆酸(CA))。

具体实施方式

除非另有定义，本发明使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属技术领域普通技术人员通常理解的含义相同。通常，本发明使用的命名及下述实验方法都是本领域公知的或常用的。

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

以下将结合附图对本发明的实施例做具体阐释。

本发明的实施例应用色谱质谱联用技术，检测血清样本的代谢物，找到阿尔茨海默病或轻度老年认知障碍的诊断和预测生物标志物。具体优选包括：

收集阿尔茨海默病或轻度老年认知障碍病人及健康人的血清样本，其中阿尔茨海默病68例，轻度老年认知障碍患者107例、健康对照450例。样本经处理后通过色谱质谱联用仪检测分析，通过建立多维统计模型可视化地显示阿尔茨海默病或轻度老年认知障碍病人及健康对照之间的代谢谱差异，获得差异性代谢物。

本发明的测定方法可以全面、综合地体现阿尔茨海默病或轻度老年认知障碍病人及健康人之间的代谢产物的变异状况，找到阿尔茨海默病或轻度老年认知障碍的诊断生物标志物，为阿尔茨海默病或轻度老年认知障碍的早期诊断和预后提供有利的技术支持。

一、实验材料和测试方法：

1.血液样本情况

采集空腹血清样本，其中包括：

阿尔茨海默病68例，轻度老年认知障碍患者107例、健康人对照450例。

其中70％样本作为训练集，30％样本作为测试集。

诊断标准：

以下为受试组的入选标准及其他详细情况：

一、阿尔茨海默病组(AD):

1.记忆或认知功能损害逐渐出现6个月以上，且进行性恶化。

2.精神状态检查或神经心理学测评提供认知功能损害的客观证据，如中文版简易精神状态检查(MMSE)不同教育程度分界值：文盲组≤19分、小学组≤22分、初中及高中组≤23、高等教育组≤26分，平均≤23分。

3.工作或日常生活能力受损，如中文版工具性日常生活活动量表(IADL)得分≥16分。

4.整体状态评价为轻度老年痴呆及以上，如痴呆评定量表(CDR)得分≥0.5分。

5.神经影像学证据：海马体积缩小，如MRI显示左侧海马体积≤1.96cm3，右侧海马体积≤2.01cm3。

6.除外其他病因：认知损害发生或加重在明确的卒中后3个月内，或存在多发梗死或严重白质高信号等血管性痴呆的典型特征；或具有波动性认知损害、形象生动的视幻觉及自发的帕金森综合征等路易体痴呆的核心特征；或具有行为变异和额叶和(或)前颞叶明显萎缩等额颞叶痴呆的突出特征；或其他可逆原因如激素或代谢异常，甲状腺功能减退或叶酸/维生素B12缺乏；或谵妄或其他精神及情感疾病，如精神分裂症、抑郁症。

二、轻度老年认知障碍组(MCI):

1.认知功能下降，而且客观检查有认知损害的证据和(或)客观检查证实认知功能较以往减退，临床痴呆评定量表<0.5分，中文版简易精神状态检查(MMSE)≥24分

2.日常基本能力正常，复杂的工具性日常能力可以有轻微损害，但患者仍可进行这些活动。

3.无痴呆

2.血清样本前处理：

(1)气相色谱质谱联用仪(GC-TOFMS)测试样本前处理

取50μL血清于1.5mL的离心管中，分别加入10ul氯苯丙氨酸(0.1mg/mL，水溶)和10μL十七酸(1mg/mL，醇溶)作为内标来监测样本的重现性。再加入175μL氯仿甲醇混合溶剂(1:3，v/v)，涡旋振荡30s；置离心管于-20℃放置10min以促进蛋白沉淀。然后13000rpm离心10min，取上清200μL于高回收进样瓶中，室温下真空干燥。样本品经抽干后使用两步法进行衍生，首先加入50μL甲氧胺(15mg/mL，吡啶溶)，涡旋振荡30s，在30℃下反应90min，然后再加入50μL BSTFA(含1％TMCS)在70℃反应60min。反应产物在室温下静置1h后进行GC-TOFMS分析。

(2)液相色谱质谱联用仪(LC-TQMS)测试样本前处理取50μL血清，加入200μL甲醇乙腈混合溶剂(1:9，v:v)，涡旋振荡2min；置离心管于-20℃放置10min以促进蛋白沉淀，12000rpm4℃离心15min。取上清20μL，室温下真空干燥。在干燥后的离心管中加入100μL甲醇水混合溶剂(1:1，v:v，含1μg/mL二氯苯丙氨酸作为内标)复溶后分析。

3.分析仪器测试：

(1)气相色谱质谱联用仪(GC-TOFMS)测试

GC-TOFMS：Leco Pegasus HT气相色谱串联飞行时间质谱(力可公司，美国)，色谱柱：Rxi-5ms毛细管柱(填充5％联二苯/95％二甲基聚硅氧烷,Restek,宾夕法尼亚州,美国)，载气：超纯氦气，流量：1.0mL/min，进样口温度：260℃，传输线温度：260℃，离子源温度：210℃，进样量：1uL，进样方式：不分流进样，升温程序：从80℃开始并持续2min，以10℃/min的升温速度升至220℃，之后以5℃/min的升温速度升至240℃，再以25℃/min的升温速度升至290℃，最后在290℃持续8min。质谱离子源：EI源，电子轰击能量：70eV，质谱扫描范围：m/z，40-600，全扫描方式。数据分析处理使用ChromaTOF软件(v4.33,力可公司，美国)。

(2)液相色谱质谱联用仪(LC-TQMS)定量测定

采用沃特斯超高效液相色谱系统(沃特斯公司，美国)，配备二元溶剂控制器和样本控制室。采用沃特斯XEVO三重四级杆质谱仪(沃特斯公司，美国)，配备双电喷雾离子源。

色谱条件：采用UPLC BEH C18色谱柱(100mm×2.1mm,1.7um)；柱温40℃；流动相A为水，流动相B为乙腈/异丙醇(体积比为8:2)；流速为0.4mL/min；进样量为5uL；梯度洗脱条件：0-2min:70％B,2-5min:70％-75％B,5-10min:75％-80％B,10-13min:80％-90％B,13-16min:90％-100％B,16-21min:100％B,21-22.5min:100％-70％B，22.5-24min:70％B。总分析时间为24min。

质谱条件：电喷雾离子源采用负离子扫描模式(ESI^-)，具体条件如下：毛细管电压2.5kV,锥孔电压55V,萃取锥孔电压4V,离子源温度120℃,脱溶剂气温度450℃,反向锥孔气流50L/h,脱溶剂气650L/h,低质量区分辨率4.7,高质量区分辨率15,检测器电压2390V,扫描时间0.35s,扫描时间间隔0.02s,质荷比范围:m/z 50-1000。锁定质量数为554.2615。

二、结果：

所有阿尔茨海默病或轻度老年认知障碍和健康对照样本通过LC-TQMS和GC-TOFMS进行代谢物全谱定量分析测试，在血清样本中分别检测到170种和161种代谢物。利用血清代谢物建立了正交偏最小方差判别分析(OPLS-DA)模型，在阿尔茨海默病或者轻度老年认知障碍血清样本中能很好的识别并区分阿尔茨海默病人，轻度老年认知障碍及正常人(如图1A所示)，这一结果在30％验证集血清样本中也得到了很好的验证(如图1B中所示)。通过多维OPLS-DA模型提供的变量权重VIP值(VIP＞1)及Mann-Whitney U检验所提供的P值(P＜0.05)的选择标准，从训练集样本中得到用于区分阿尔茨海默病或轻度老年认知障碍及正常对照的52种差异性代谢物，包括2-氨基己二酸(2-Aminoadipic acid)，2-丁烯二酸(2-Butenedioic acid)，4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸(4,7,10,13,16,19-Docosahexaenoic acid)，5-羟脯氨酸(5-Oxoproline)，6-氨基己酸(6-Aminocaproicacid)，肾上腺酸(Adrenic acid)，阿拉伯呋喃糖(Arabinofuranose)，花生四烯酸(Arachidonic acid)，丁二酸(Butanedioic acid)，顺式-5,8,11,14,17-二十碳五烯酸(cis-5,8,11,14,17-Eicosapentaenoic acid)，柠檬酸(Citric acid)，胱氨酸(Cystine)，胞苷(Cytidine)，二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid)，乙二酸(Elaidic acid)，果糖(Fructose)，葡萄糖酸(Gluconic acid)，谷氨酸(Glutamic acid)，谷氨酰胺(Glutamine)，甘油磷酸(Glycerolphosphate)，牛磺酸(Hypotaurine)，次黄嘌呤(Hypoxanthine)，异亮氨酸(Isoleucine)，亚油酸(Linoleic acid)，苹果酸(Malic acid)，甘露糖(Mannose)，N，N-二甲基甘氨酸(N,N-dimethylglycine)，十八烷酸(Octadecanoic acid)，油酸(Oleicacid)，棕榈酸(Palmitic acid)，棕榈油酸(Palmitoleic acid)，十五烷酸(Pentadecanoicacid)，脯氨酸(Proline)，山梨糖(Sorbose)，牛磺酸(Taurine)，十四烷酸(Tetradecanoicacid)，胸腺嘧啶(Thymine)，创伤性酸(Traumatic acid)，尿苷(Uridine)，木糖醇(Xylitol)，肉豆蔻酸(Myristic acid)，岩芹酸(Petroselinic acid)，甘氨石胆酸(GLCA)，去氧胆酸/胆酸(DCA/CA)，胆酸(CA)，牛磺去氧胆酸(TDCA)，牛磺石胆酸(TLCA)，甘氨去氧胆酸(GDCA)，去氧胆酸(DCA)，甘氨去氧胆酸/胆酸(GDCA:CA)，牛磺去氧胆酸/胆酸(TDCA:CA)，甘氨石胆酸/鹅去氧胆酸(GLCA:CDCA)。

利用逻辑回归模型进行验证，发现其中的8个代谢物和一个代谢物比值(分别是：花生四烯酸(Arachidonic acid)，胸腺嘧啶(Thymine)，亚油酸(Linoleic acid)，棕榈酸(Palmitic acid)，棕榈油酸(Palmitoleic acid)，肉豆蔻酸(Myristic acid)，岩芹酸(Petroselinic acid)，甘氨石胆酸(GLCA)，去氧胆酸(DCA)/胆酸(CA))作为阿尔茨海默病或轻度认知障碍生物标志物的作用尤为重要。RF模型在区分MCI/AD组与保持健康的健康个体中方面表现出良好的分类性能，随后进一步评估该模型在预测发展为阿尔茨海默病的健康个体的早期诊断能力，应用诊断性能曲线(ROC)曲线得到了满意的结果，AUC的中位数为0.944(95％置信区间CI＝0.931-0.957)，灵敏度＝90.0％和特异性＝82.4％(图2A)。采用同样的模型在测试样本集中同样具有很好的正确率，应用ROC曲线得到了满意的结果，AUC为0.867(95％CI＝0.834-0.901，灵敏度＝80.0％，特异性＝0.78.0)(图2B)。

本实施例的这8个代谢物和一个代谢物比值(分别是：花生四烯酸(Arachidonicacid)，胸腺嘧啶(Thymine)，亚油酸(Linoleic acid)，棕榈酸(Palmitic acid)，棕榈油酸(Palmitoleic acid)，肉豆蔻酸(Myristic acid)，岩芹酸(Petroselinic acid)，甘氨石胆酸(GLCA)，去氧胆酸(DCA)/胆酸(CA))是很好的阿尔茨海默病或轻度老年认知障碍的早期诊断生物标志物，可用于临床诊断中，能提高阿尔茨海默病或轻度老年认知障碍的早期检出率，改善阿尔茨海默病或轻度老年认知障碍的临床治疗效果，减轻病人的痛苦，提高临床病人的生存率。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims

1.一种阿尔茨海默病或轻度老年认知障碍早期诊断、预测的生物标志物组合，其特征在于，该生物标志物组合为血清或血浆代谢物，包括2-氨基己二酸(2-Aminoadipic acid)，2-丁烯二酸(2-Butenedioic acid)，4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸(4,7,10,13,16,19-Docosahexaenoic acid)，5-羟脯氨酸(5-Oxoproline)，6-氨基己酸(6-Aminocaproicacid)，肾上腺酸(Adrenic acid)，阿拉伯呋喃糖(Arabinofuranose)，花生四烯酸(Arachidonic acid)，丁二酸(Butanedioic acid)，顺式-5,8,11,14,17-二十碳五烯酸(cis-5,8,11,14,17-Eicosapentaenoic acid)，柠檬酸(Citric acid)，胱氨酸(Cystine)，胞苷(Cytidine)，二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid)，乙二酸(Elaidic acid)，果糖(Fructose)，葡萄糖酸(Gluconic acid)，谷氨酸(Glutamic acid)，谷氨酰胺(Glutamine)，甘油磷酸(Glycerolphosphate)，牛磺酸(Hypotaurine)，次黄嘌呤(Hypoxanthine)，异亮氨酸(Isoleucine)，亚油酸(Linoleic acid)，苹果酸(Malic acid)，甘露糖(Mannose)，N，N-二甲基甘氨酸(N,N-dimethylglycine)，十八烷酸(Octadecanoic acid)，油酸(Oleicacid)，棕榈酸(Palmitic acid)，棕榈油酸(Palmitoleic acid)，十五烷酸(Pentadecanoicacid)，脯氨酸(Proline)，山梨糖(Sorbose)，牛磺酸(Taurine)，十四烷酸(Tetradecanoicacid)，胸腺嘧啶(Thymine)，创伤性酸(Traumatic acid)，尿苷(Uridine)，木糖醇(Xylitol)，肉豆蔻酸(Myristic acid)，岩芹酸(Petroselinic acid)，甘氨石胆酸(GLCA)，去氧胆酸/胆酸(DCA/CA)，胆酸(CA)，牛磺去氧胆酸(TDCA)，牛磺石胆酸(TLCA)，甘氨去氧胆酸(GDCA)，去氧胆酸(DCA)，甘氨去氧胆酸/胆酸(GDCA:CA)，牛磺去氧胆酸/胆酸(TDCA:CA)，甘氨石胆酸/鹅去氧胆酸(GLCA:CDCA)中的一种或多种的组合。

2.如权利要求1所述的阿尔茨海默病或轻度老年认知障碍的早期诊断、预测生物标志物组合的应用，其特征在于，用于检测阿尔茨海默病或轻度老年认知障碍患者血清或血浆的试剂盒。

3.如权利要求2所述阿尔茨海默病或轻度老年认知障碍的早期诊断、预测生物标志物组合的应用，其特征在于，所述试剂盒包含花生四烯酸(Arachidonic acid)，胸腺嘧啶(Thymine)，亚油酸(Linoleic acid)，棕榈酸(Palmitic acid)，棕榈油酸(Palmitoleicacid)，肉豆蔻酸(Myristic acid)，岩芹酸(Petroselinic acid)，甘氨石胆酸(GLCA)，胆酸(CA)，去氧胆酸(DCA)的标准溶液和一种内标标准溶液，所述内标标准溶液指同位素标记的诊断标志物棕榈酸(Palmitic acid)，棕榈油酸(Palmitoleic acid)，肉豆蔻酸(Myristicacid)，岩芹酸(Petroselinic acid)，甘氨石胆酸(GLCA)，胆酸(CA)，去氧胆酸(DCA)，同位素标记方式可以是2H或13C，试剂盒还包含萃取液，萃取液由甲醇和乙腈组成，甲醇和乙腈的体积比为：1：1-5：1，试剂盒还包含700μL的96孔板、350μL的V型96孔板、封板硅胶、96孔密封铝膜，试剂盒还包含一个随机森林模型，通过测定受试体的生物样本中代谢物水平并将这些测定值输入随机森林模型得到截断值进行判别。

4.如权利要求1所述的阿尔茨海默病或轻度老年认知障碍的早期诊断、预测生物标志物组合的测定方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1，取阿尔茨海默病或轻度老年认知障碍病人临床血清或血浆样本；

步骤2，通过色谱质谱联用分析方法分析鉴定阿尔茨海默病或轻度老年认知障碍病人临床血清或血浆样本中的代谢物；

步骤3，将步骤2中测定得到的生物标志物的浓度输入随机森林模型进行计算，按照分值对受试体进行判定。

5.如权利要求4所述的阿尔茨海默病或轻度老年认知障碍的早期诊断、预测生物标志物组合的测定方法，其特征在于，所述步骤2中的色谱质谱联用代谢组学分析方法包括液相/气相色谱质谱联用代谢组学分析方法。

6.如权利要求5所述的阿尔茨海默病或轻度老年认知障碍的早期诊断、预测生物标志物组合的测定方法，其特征在于，所述步骤2中气相色谱质谱联用测试的色谱条件包括：Rxi-5ms毛细管柱，载气：超纯氦气，流量：1.0mL/min，进样口温度：260℃，传输线温度：260℃，离子源温度：210℃，进样量：1uL，进样方式：不分流进样，升温程序：从80℃开始并持续3min，以10℃/min的升温速度升至220℃，之后以5℃/min的升温速度升至240℃，再以25℃/min的升温速度升至290℃，最后在290℃持续9min，质谱离子源：EI源，电子轰击能量：70eV，质谱扫描范围：m/z，40-600，全扫描方式。

7.如权利要求5所述的阿尔茨海默病或轻度老年认知障碍的早期诊断、预测生物标志物组合的测定方法，其特征在于，所述步骤2中液相色谱质谱联用测试的色谱条件包括：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18柱或者WatersUPLC BEH C18色谱柱，柱温：30℃，流动相A：含0.1％甲酸的水，B：含0.1％甲酸的乙腈，流动相洗脱梯度为0-25min：1-100％B，流速：0.4mL/min，进样量：5μL，飞行时间质谱优化条件为：(1)正离子模式(ES+)，毛细管电压3500V，喷雾器45psig，干燥气温度325℃，干燥器流速11L/min；(2)负离子模式(ES-)，毛细管电压3000V，其他参数与正离子模式一致。

8.如权利要求5所述的阿尔茨海默病或轻度老年认知障碍的早期诊断、预测生物标志物组合的测定方法，其特征在于，所述步骤2中气相色谱质谱联用测试的血清或血浆样本前处理包括：取50μL血清或血浆，加入10ul，0.1mg/mL，水溶的氯苯丙氨酸和10μL，1mg/mL，醇溶的十七酸作为内标来监测样本的重现性；再加入175μL，v/v＝1:3的氯仿甲醇混合溶剂，涡旋振荡30s；置离心管于-20℃放置10min以促进蛋白沉淀；然后13000rpm离心10min，取上清200μL于高回收进样瓶中，室温下真空干燥得到样本品。

9.如权利要求5所述的阿尔茨海默病或轻度老年认知障碍的早期诊断、预测生物标志物组合的测定方法，其特征在于，所述步骤2中样本品经抽干后使用两步法进行衍生，首先加入50μL，15mg/mL，吡啶溶的甲氧胺，涡旋振荡30s，在30℃下反应90min，然后再加入50μL，含1％TMCS的BSTFA在70℃反应60min，静置后进行GC-TOFMS分析。

10.如权利要求5所述的阿尔茨海默病或轻度老年认知障碍的早期诊断、预测生物标志物组合的测定方法，其特征在于，所述步骤2中液相色谱质谱联用测试的血清或血浆样本前处理包括：取50μl血清或血浆样本，加入200μL，v:v＝1:9的甲醇乙腈混合溶剂，涡旋振荡2min；置离心管于-20℃放置10min以促进蛋白沉淀，12000rpm4℃离心15min，取上清20μL，室温下真空干燥，在干燥后的离心管中加入100μL甲醇水混合溶剂复溶后分析，所述甲醇水混合溶剂的v:v＝1:1，含1μg/mL二氯苯丙氨酸作为内标。