CN111721882B - 一种自组装检测术后谵妄的代谢组学标记物试剂盒以及应用 - Google Patents

一种自组装检测术后谵妄的代谢组学标记物试剂盒以及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及分子生物学领域，具体是一种自组装术后谵妄的代谢组学标记物试剂盒及其应用。本发明中预测术后谵妄的试剂盒含多种代谢组学相关的分子，能够迅速检测老年患者的代谢物的水平，有效区别并对术后谵妄作出预测。同时本发明已成功应用于术后谵妄患者血清中代谢物的检测，检测结果表明术后谵妄患者(n＝15)与术后非谵妄患者(n＝41)血清中十种代谢物的水平差别具有统计学意义(P<0.05)。

Description

一种自组装检测术后谵妄的代谢组学标记物试剂盒以及应用
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体地说，是一种自组装术后谵妄的代谢组学标记物试剂盒及其应用。
背景技术
术后谵妄是老年患者的术后常见的并发症，指术后1周内出现注意力、意识和认知的下降症状，符合第五版神经障碍手册诊断，通常高发于术后24-72小时，需要辅助专业的神经心理学量表测定诊断。术后谵妄发病率高达52％，不仅延长患者的住院时间、增加治疗成本，而且还增加患者死亡率。目前，术后谵妄的诊断主要根据第五版神经障碍手册诊断以及神经心理学评估量表，耗时长，尚无明确的实验室诊断指标。因此，迫切需要一种灵敏度高，特异性强，操作简便，经济实用的方法来早期诊断术后谵妄。
代谢组学是一种有高效、高通量检测代谢产物水平的技术，为机体生物提供正常或病理生理状态表型潜在的信息。并可以揭示细胞代谢过程中特有的化学指标。代谢组学平台对代谢组学生物标记物的发现以及疾病的早期诊断及预后判断等可能具有重要意义。
然而，目前代谢组学筛选的分子均为非靶向的检测，检测的分子多，既耗时长，成本也较高。因此，限制了它的使用。
发明内容
本发明的目的在于为了克服现有技术的缺陷，提供一种自组装代谢组学标记物试剂盒，有助于提高术后谵妄早期诊断的灵敏度和准确性。本发明的另一目的在于提供本发明试剂盒在术后谵妄诊断方面的应用，尤其是早期诊断，利用本发明检测术后谵妄诊断的灵敏度和准确性。
为了克服现有技术的缺陷，我们发现术后谵妄组患者血浆中十种代谢标记物与正常组相比具有显著的统计学差异，因此十种代谢标记物有效的用作术后谵妄疾病的标记物。
本发明中预测术后谵妄的试剂盒含多种代谢组学相关的分子，能够迅速检测老年患者的代谢物的水平，有效区别并对术后谵妄作出预测。同时本发明已成功应用于术后谵妄患者血清中代谢物的检测，检测结果表明术后谵妄患者(n＝15)与术后非谵妄患者(n＝41)血清中十种代谢物的水平差别具有统计学意义(P<0.05)。
本发明的第一方面，提供一组代谢标记物在制备诊断或预测术后谵妄疾病试剂盒中的应用，所述的代谢标记物为油酰胺、单甘油酯180/00/00(Monoglycerides 180/00/00，一种食品乳化剂)、L-组氨酸、L-亮氨酸、单磷酸鸟苷、亚磷酸二氢神经鞘氨醇-1、溶血磷脂酰胆碱150、L-谷氨酰胺、L-酰基肉碱、尿酸中的一种或两种以上。
进一步的，所述的试剂盒检测血清中所述的代谢标记物的表达水平。检测时，患者术后血浆中十种代谢物的表达水平任一个较术前水平变化(升高或降低)即可预测患者术后谵妄。
本发明的第二方面，提供检测血清中油酰胺、单甘油酯180/00/00、L-组氨酸、L-亮氨酸、单磷酸鸟苷、亚磷酸二氢神经鞘氨醇-1、溶血磷脂酰胆碱150、L-谷氨酰胺、L-酰基肉碱、尿酸中的一种或两种以上表达水平的试剂在制备诊断或预测术后谵妄疾病试剂盒中的应用。
本发明的第三方面，提供一种诊断或预测术后谵妄疾病的试剂盒，所述的试剂盒中包含检测血清中的油酰胺、单甘油酯180/00/00、L-组氨酸、L-亮氨酸、单磷酸鸟苷、亚磷酸二氢神经鞘氨醇-1、溶血磷脂酰胆碱150、L-谷氨酰胺、L-酰基肉碱、尿酸中的一种或两种以上目标代谢物的表达水平的试剂。
进一步的，所述的试剂为通过Agilent 1290Infinity LC超高效液相色谱系统进行分离，而后进行质谱分析的检测血清中目标代谢物表达水平的试剂。
进一步的，所述的试剂盒中还包括代谢物的标准品、乙腈、甲酸、甲醇。
进一步的，所述的试剂盒的检测方法包括以下步骤：
(A)血清在4℃环境下缓慢解冻后，分别取100μL，加入400μL预冷甲醇/乙腈溶液(1:1，v/v)，涡旋混合，-20℃静置30min，14000g 4℃离心20min；
(B)取(A)离心后上清，真空干燥，质谱分析时加入100μL乙腈水溶液(乙腈：水＝1:1，v/v)复溶，涡旋，14000g 4℃离心15min，取上清液进样分析；
(C)样品采用Agilent 1290Infinity LC超高效液相色谱系统进行分离；
(D)采用5500QTRAP质谱仪(AB SCIEX)在正离子模式下进行质谱分析；
(E)采用Multiquant软件提取色谱峰面积及保留时间；采用代谢标记物的标准品矫正保留时间，即可检测目的代谢标记物的表达水平。
本发明优点在于：
本发明利用自组装十种代谢标记物试剂盒(油酰胺、单甘油酯180/00/00、L-组氨酸、L-亮氨酸、单磷酸鸟苷、亚磷酸二氢神经鞘氨醇-1、溶血磷脂酰胆碱150、L-谷氨酰胺、L-酰基肉碱、尿酸)，提升对术后谵妄的诊断敏感度。应用所述的十种代谢标记物水平差异水平可以区别正常患者和术后谵妄患者，实现对老年患者血清样品中十种代谢标记物水平高灵敏度和高特异度的检测，实际检测结果表明该方法可有效用于早期诊断术后谵妄。
附图说明
图1.两组患者代谢标记物最小二乘法判别分析；
A、B图术后谵妄组患者术前和术后样本的PLS分析，C、D图术后谵妄和术后非谵妄组患者术后样本的PLS分析；横纵坐标分别是PLS分析主成分得分；图中的☆A代表术后谵妄组患者术前样本、△B代表术后谵妄组患者术后样本、◇C代表术后非谵妄组患者术后样本。
图2.两组患者代谢物不同表达水平；
A图术后谵妄组患者术前和术后样本代谢物热点图(阳离子)，B图术后谵妄组患者术前和术后样本代谢物热点图(阴离子)，C图术后谵妄和术后非谵妄组患者术后样本代谢物热点图(阳离子)，D图术后谵妄和术后非谵妄组患者术后样本代谢物热点图(阴离子)；红色代表升高，绿色代表降低。
图3.使用SVM模型筛选出术后谵妄预测的代谢物。
A图SVM模型不同数字特征的预测准确性；B图代谢物的预测重要性分级；C图两组患者样本SVM分析；D图SVM模型的特异性和敏感性。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
下述实施例中使用到的试剂和实验仪器介绍如下：
1、主要仪器
5500QTRAP质谱仪(AB SCIEX)；
Agilent 1290Infinity LC超高效液相色谱系统；
低温高速离心机(Eppendorf5430R)；
色谱柱Zic-HILIC 3.5μm,2.0mm×150mm column。
2、主要试剂
甲酸(Fluka，06450)；
乙腈(Merck，1499230-935)；
甲醇(Merck，144282)；
十种代谢物的标准品。
实施例1：
留取两组患者外周血，而后分离血清，置于-80℃冰箱保存。血清在4℃环境下缓慢解冻后，分别取100μL，加入400μL预冷甲醇/乙腈溶液(1:1，v/v)，涡旋混合，-20℃静置30min，14000g 4℃离心20min。取离心后上清，真空干燥，质谱分析时加入100μL乙腈水溶液(乙腈：水＝1:1，v/v)复溶，涡旋，14000g 4℃离心15min，取上清液进样分析。
实施例2：
为利用从所述<实施例1>患者的血清检测目标代谢标记物的表达水平而执行下述实验。
具体而言，<实施例1>中患者样品采用Agilent 1290Infinity LC超高效液相色谱系统进行分离。流动相：A液为25mM甲酸铵+0.08％FA水溶液，B液为0.1％FA乙腈。样品置于4℃自动进样器中，柱温40℃，流速为250μL/min，进样量2μL。相关液相梯度如下：0-12min，B液从90％线性变化到70％；12-18min，B液从70％线性变化到50％；18-25min，B液从50％线性变化到40％；30-30.1min，B液从40％线性变化到90％；30.1-37min，B液维持在90％。样本队列中每间隔一定数量的实验样本设置一个QC样本，用于检测和评价系统的稳定性及重复性。采用5500QTRAP质谱仪(AB SCIEX)在正离子模式下进行质谱分析。5500QTRAP ESI源条件如下：source temperature 500℃，ionSource Gas1(Gas1)：40，Ion Source Gas2(Gas2)：40，Curtaingas(CUR)：30，ionSapary Voltage Floating(ISVF)5500V；采用MRM模式检测待测离子对。采用Multiquant软件提取色谱峰面积及保留时间。采用代谢标记物标准品矫正保留时间，进行代谢物鉴定。
图1A、B图显示：两种主成分将术后谵妄组患者术前和术后样本分开，说明术前血样差异小、术后血样差异小且术前和术后血样之间有差异；C、D图显示：两种主成分将术后谵妄组和术后非谵妄组患者标本分开，说明两组患者组内标本差异小，两组患者组间标本差异大。
图2A、B图显示：术后谵妄组患者术前和术后样本代谢物的不同表达水平；C、D图显示：术后谵妄组和术后非谵妄组患者术后样本代谢物的不同表达水平。
实施例3：
利用从所述<实施例2>中获得的代谢物的鉴定，构建模型。通过支持向量机制(SVM)建立了学习模型，以对两组进行分类。分别使用数字2、3、5、10、20、26特征分别构建SVM模型，这些模型使用基于C分类的径向基核函数构建。训练和测试组，分别将每种特征模型重复40次不同采样。进而列出了所有模型中代谢物的选择频率。最终，我们选择了十种特征物质构建最终的SVM模型。在此参数下，预测精度达到83.8％，曲线下面积为0.91，表明模型性能良好。由此确认十种代谢标记物(油酰胺、单甘油酯180/00/00、L-组氨酸、L-亮氨酸、单磷酸鸟苷、亚磷酸二氢神经鞘氨醇-1、溶血磷脂酰胆碱150、L-谷氨酰胺、L-酰基肉碱、尿酸)可用作新颖的术后谵妄疾病的标记物。
图3A图显示：数字2、3、5、10、20、26特征SVM模型预测的准确性；B图显示：代谢物的预测重要性分级，其中油酰胺的预测性较好；C、D图显示：构建的SVM模型预测精度达到83.8％，曲线下面积为0.91，表明模型性能良好)。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (5)

1.一组代谢标记物的标准品在制备诊断或预测术后谵妄疾病试剂盒中的应用，其特征在于，所述代谢标记物为油酰胺、单甘油酯180/00/00、L-组氨酸、L-亮氨酸、单磷酸鸟苷、亚磷酸二氢神经鞘氨醇-1、溶血磷脂酰胆碱150、L-谷氨酰胺、L-酰基肉碱和尿酸。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂盒用于检测血清中所述代谢标记物的表达水平。
3.一种诊断或预测术后谵妄疾病的试剂盒，所述试剂盒中包含检测血清中目标代谢物的表达水平的试剂，其特征在于，所述目标代谢物为油酰胺、单甘油酯180/00/00、L-组氨酸、L-亮氨酸、单磷酸鸟苷、亚磷酸二氢神经鞘氨醇-1、溶血磷脂酰胆碱150、L-谷氨酰胺、L-酰基肉碱和尿酸，所述试剂包括所述目标代谢物的标准品。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂通过Agilent 1290InfinityLC超高效液相色谱系统进行分离，而后进行质谱分析以检测血清中目标代谢物表达水平。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括乙腈、甲酸、甲醇。
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